KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan 1

KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN

SEKOLAH FARMASI

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

1. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical Biotechnology, 2nd ed., CRC, Taylor & Francis, 83-1782. Kayser, O, 2001, Pharmaceutical Biotechnology, Wiley VCH, p 103

Tujuan Topik

• Mahasiswa mampu menjelaskan profil /sifat/karakter protein yang mungkin digunakan untuk mengkarakterisasi protein target

• Mahasiswa mampu menjelaskan metode analisis dan memilih metode yang sesuai untuk mengkarakterisasi protein target

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan2

PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN

untuk TERAPI (PROTEIN TERAPETIK)

Penyiapan host (kloning - TDR)

ProduksiProtein

Isolasi – Purifikasi –Karakterisasi Protein

Formulasi

BIOPROSES

(organisme hidup)


PRODUK REKOMBINAN

PROSES HULU(up stream)

PROSES HILIR(down stream)

PRODUKSI(FERMENTASI)

➢ Isolasi gen target

➢ Konstruksi vektorrekombinan

➢ Transformasi kesel inang

➢ Seleksi klon

➢ Pemisahan sel

➢ (lisis sel )

➢ Isolasi protein

➢ Pemekatanprotein

➢ Pemurnian

➢ Karakterisasi

➢ Formulasi

➢ Batch

➢ Fed-batch

➢ Continuous batch

Profil/Karakter Protein

1. Struktur protein

– Struktur primer, sekunder, tersier, kuarterner

– Monomer, homo-mer / hetero-mer

– Modifikasi /konjugasi

(glikoprotein, lipoprotein, ribonukleoprotein,

PEGilasi-polietilen glikol)

– Domain/daerah ikatan spesifik

(Ag – Ab, protein pengikat ke reseptor atau ligantertentu

–Globul / fiber


Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Produksi Protein Rekombinan 6

Struktur Protein


Profil/Karakter Protein

2. Urutan protein → sekuensing protein

3. Komposisi asam amino → analisis as. amino

4. Situs pemotongan protease → peptide mapping

5. Ukuran protein

– Panjang/jumlah asam amino

– Bobot molekul (kDa) → http://web.expasy.org/compute_pi/

6. Muatan protein (pI) → http://web.expasy.org/compute_pi/

7. Hidrofilisitas/hidrofobisitas→http://web.expasy.org/protscale


Sisi pemotongan protein

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Rekombinan 10

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Analysis of Recombinant Product 11

Karakter Protein

8. Stabilitas (pH, T, tekanan, dll)

9. Aktivitas biologis

– enzimatik (substrat → produk)

– proteolysis/protese, hemolysis

– faktor pertumbuhan

– dll


Aktivitas Biologis (hemolisis)


Tujuan Mengkarakterisasi Protein

• Jika sudah diketahui → uji dilakukan untuk mengkonfirmasi identitas / karakter protein target

• Jika belum diketahui → uji dilakukan untuk mengetahui karakter (karakterisasi) protein target


Karakterisasi Protein

Untuk mengetahui atau mengkonfirmasi :

• Identitas protein

• Kemurnian

• Cemaran/pengotor

• Jumlah/konsentrasi protein

• Stabilitas→ untuk penyimpanan/formulasi

• Aktivitas/Potensi

• Spesifisitas pengikatan/reaksi silang

• Sterilitas

• Kontaminasi


JENIS PENGOTOR (CEMARAN)TERKAIT INANG TERKAIT PROSES TERKAIT PRODUK

= VARIAN PRODUK

PROTEIN INANG KOMPONEN MEDIUM

PERTUMBUHAN

(ANTIBIOTIK)

SUBSTITUTSI / DELESI

ASAM AMINO

DNA INANG PEREAKSI PURIFIKASI AKIBAT KETIDAK

STABILAN FISIK

(PRODUK

TERDENATURASI,

AGREGAT)

ENDOTOKSIN MATERIAL KOLOM

PURIFIKASI

AKIBAT KETIDAK

STABILAN KIMIA

(PRODUK

TERDEAMIDASI,

TEROKSIDAS)

KOMPONEN LAIN DARI

SEL INANG

VARIASI GLIKOSILASI

Karakterisasi Protein 17Sekolah Farmasi ITB

Karakterisasi Protein 18

USP

Sekolah Farmasi ITB

Spesifikasi Farmakope (Monografi)

Sekolah Farmasi ITB Karakterisasi Protein 19

KUALITAS

KEAMANAN

EFIKASI

Spesifikasi (farmakope)

1. Identitas: kimia dan

konformasi

2. Kemurnian dan ketidak

kemurnian

3. Aktivitas biologis/potensi

Imunogenitas

Cemaran/Pengotor

Kontaminan

Identitas

Kemurnian

Aktivitas biologis/potensi

KARAKTERISASI PROTEIN

1. Identitas → konfirmasi struktur / komposisi molekular

– Ukuran protein, muatan, struktur, urutan, komposisi as. amino

– Posttranslational modification (profil glikosilasi)

– Amino acid analysis, Peptide mapping, MALDI-MS, ESI – MS (electrospray ionization), koefisien extinsi, pI, struktur kristal, NMR, spektrum CD (circular dichroism), HPLC, CE, PAGE

Karakterisasi Protein

2. Kemurnian dan Ketidak murnian→modifikasi ?

- Glikosilasi (hiper/hipo), ikatan disulfida (alternatif), deamidasi,

oksidasi, fosforilasi, asetilasi, sulfasi, sulfoksidasi, gamma-karboksilasi, pyroglutamat.

–Aktivitas/efikasi , toksisitas

–Peptide mapping, MS, SDS PAGE, RP-HPLC

Deamidasi Amino Acid

School of Pharmacy ITB Pharm. Biotechnology-FA4202 Vaksin Rekombinan 22


3. Penentuan Jumlah / Kuantifikasi Protein– Spektrometri UV, kolorimatri (Bradford, Lowry, BCA-

Bicinchoninic, biuret), Kjeldahl, Bioassay, Immunoassay

4. Stabilitas, Penyimpanan dan Sterilitas– Mempengaruhi kualitas, keamanan dan efikasi.

– Stabilitas fisik, kimia, biologi, mikrobiologi

5. Spesifisitas pengikatan dan Cross-reactivity– Produk antibodi

– Uji pengikatan, epitope mapping/kabohidrat

– In vitro + → in vivo

Karakterisasi Protein (software)


METODE UNTUK KARAKTERISASI PROTEIN

• Metode karakterisasi tergantung pada profil/ karakter protein target

• Karakter protein → sudah diketahui / belum ?

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Vaksin Rekombinan 26


1. Spektrometri UV → Absorbansi pad 280nm

Absorbance of aromatic amino acid, i.e. tryptophan, tyrosine, phenylalanine

Protein tanpa atau sedikit as. Amino aromatik?

1 Abs of 280 nm = 1 mg/mL protein

2. Kolorimetri→ absorbans pada sinar tampak/→ visible 400 – 700 nm, perlu kurva standar dari protein standar yang diketahui

jumlah/konsentrasinya (mis : BSA-bovine serum albumin)* Lowry Method :Reaksi biuret : Protein (Nitrogen) + copper (II) pada kondisi basa dapat direduksisehingga mengubah Folin Ciocalteu phosphomolybdicphosphotungstic acid →heteropolymolybdenum blue

PENENTUAN KONSENTRASI PROTEIN

Analisis asam amino

• Penentuan komposisi asam amino suatu protein target

• Identitas, kontaminan, modifikasi

ANALISIS ASAM AMINO



BERDASARKAN:

1. UKURAN → SDS-PAGE, Mass Spec

2. MUATAN → ISOELEKTRIC FOCUSING

3. Kombinasi Massa dan muatan → Elektroforesis 2D, CE

4. IMMUNOASSAY → Western blot/ ELISA



SDS - PAGE

➢ Protein didenaturasi – oleh SDS & ß-merkaptoetanol

tujuan : protein memiliki struktur yang seragam

struktur linier

➢ Protein bermuatan negatif

➢ Pada medan listrik: protein bermigrasi ke kutub positif

➢ Jarak migrasi berdasarkan bobot molekul

➢ membutuhkan media berpori → gel poliakrilamid


GEL AKRILAMID


Sebelum penambahan SDS

Setelah penambahan SDS

Bermuatan -

Daerah hidrofob

KERJA SDS TERHADAP PROTEIN


PERSENTASE AKRILAMID

KAPASITAS PEMISAHAN

15% 15 – 45 kDa

12,5% 15 – 50 kDa

10% 18 – 75 kDa

7,5% 30 – 120 kDa

5% 60 – 212 kDa

RESOLUSI GEL AKRILAMID


A. separating gel

PERSIAPAN SDS PAGE

B. stacking gel


Chemsrv0.pph.univie.ac.at/methods.htm

CHAMBER SDS-PAGE


205 kDa

116 kDa

97 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa

Pewarnaan Coomassie blue Silver (Ag) staining

LoD :

Coomassie : 36 - 47 ng Perak : 0,5 - 1,2 ng

CONTOH HASIL SDS-PAGE

SDS-PAGE NON-REDUCING

• TANPA -MERCAPTOETHANOL

• IKATAN DISULFIDE TIDAK TERPOTONG

• JIKA DILAKUKAN BERSAMA DENGAN SDS PAGE REDUCING DAPAT MEMBERIKAN INFORMASI MENGENAI ADA/TIDAKNYA JEMBATAN DISULFIDA


SDS-PAGE REDUCING DAN NON-REDUCING


Tereduksi Tidak tereduksi

Native-PAGE

• Tanpa penambahan SDS

• Protein tidak terdenaturasi

• Non-denaturing PAGE

• Migrasi protein pada gel berdasarkan konformasi protein


ELEKTROFORESIS

• KEMURNIAN DAN HOMOGENITAS

• DENATURASI, AGREGASI, OKSIDASI, DEAMIDASI

• SDS-PAGE NON-REDUCING : AGREGASI, OLIGOMERISASI

• KONTAMINAN

• STABILITAS PROTEIN: PERUBAHAN ASAM AMINO; HOMOGENITAS; DEAMIDASI GLUTAMIN & ASPARAGIN (LEBIH ASAM)

• GLIKOSILASI (ASAM SIALAT)


➢ Karakterisasi protein berdasarkan muatan totalnya

➢ Menggunakan gel akrilamid

➢ Dilakukan dengan gradient pH antara katoda dan anoda dalam larutan amfolit

➢ pI (titik isoelektrik) = pH → muatan total protein 0 →protein akan berhenti bermigrasi

ISOELECTRIC FOCUSING (IEF)

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 PRODUKSI PROTEIN SKALA BESAR 47


www.food.rdg.ac.uk/online/fs460/lecture4/lecture4.htm

ISOELECTRIC FOCUSING (IEF)

IEF (Isoelectro Focusing)

N C

Asp (acid)Normal/WT

N C

Arg (basic)Mutan

N C

Mutan Glu (neutral)


ALAT ISOELECTRIC FOCUSING


➢ Kombinasi IEF & SDS-PAGE

➢ Untuk mengkarakterisasi/membedakan protein dengan BM sama tapi muatan berbeda

➢ Untuk mengkonfirmasi kemurnian protein

Pertama : isoelectric focusing

Kedua : SDS-PAGE

ELEKTROFORESIS 2 DIMENSI


ELEKTROFORESIS 2 DIMENSI


HASIL ELEKTROFORESIS 2D

ELEKTROFORESIS KAPILER(Capillary Zone Electrophoresis)

Memisahkan protein berdasarkan rasio massa/muatan


Maldi-Tof / Mass Spect / LC MS-MShttp://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture23/Lecture23.html


http://theravalues.com/english/services/pro_ms.html

Spektroskopi Massa(Mass Spectrometry)

❑ Penentuan berat molekul

❑ Lebih akurat dari SDS-PAGE

❑ Jumlah sampel yang dieprlukan lebih sedikit

Sekolah Farmasi ITB 56Karakterisasi Protein

Berbagai metode ionisasi:

❑ Atmospheric Pressure Chemical Ionisation

(APCI)

❑ Chemical Ionisation (CI)

❑ Electron Impact (EI)

❑ Electrospray Ionisation (ESI)

❑ Fast Atom Bombardment (FAB)

❑ Field Desorption / Field Ionisation (FD/FI)

❑ Matrix Assisted Laser Desorption

Ionisation (MALDI)

❑ Thermospray Ionisation (TSP)


Monoisotopic mass of neutral peptide Mr(calc):1099.6237



➢ Karakterisasi protein berdasarkan reaksi imun Antigen – Antibodi

➢ Untuk mendeteksi protein spesifik dalam campuran

➢ Bisa diperoleh informasi mengenai ukuran protein menggunakan rainbow protein marker

➢ Menggunakan antibodi spesifik anti-protein target (sebagai antibodi primer)

➢ Antibodi sekunder → terkonjugasi dengan enzim untuk visualisasi

contoh : horse radish peroxidase (HRP)

alkaline phosphatase (AP)

WESTERN BLOT


Protein ditransfer ke membrane nitroselusosa SDS-PAGE

Dilabel dengan Ab spesifik

Visualisasi

Ab 2o

Ab 1o

Membran nitroselulosa

Protein target

AP+ Nitro blue tetrazolium (NBT)

+ 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl phosphate

(BCIP)

Ab 2o

ungu

Hasil Western Blotrainbow protein marker

SDS-PAGE VS WESTERN BLOT


ELISA = Enzyme linked immunosorbant assay


ELISA vs WB?



• Sekuensing ujung N (10-15 asam amino pertama) – degradasi Edman

•Sekuensing ujung C – karboksi peptidase

•Pemetaan peptida - menggunakan protease

→ LC-MS/MS

KARAKTERISASI STRUKTUR PRIMER / URUTAN PROTEIN


N C

Sekuensing ujung amino

Pemetaan peptida

Sekuensing ujung karboksi

SEKUENSING PROTEIN

• IDENTITAS

• HOMOGENITAS (mAb)

• PRODUK PROTEOLITIK

PEMETAAN PEPTIDA (PEPTIDE MAPPING)

• Identitas

• Konfirmasi stabilitas genetik

• Konsistensi lot/batch produksi

• Peptida terglikosilasi (mAb)

• Perbedaan asam amino (1 atau >1)

Struktur 2D/3D Protein

• Difraksi X Ray

– Diperlukan kristal protein murni → Teknik tersendiri

• NMR

– Protein kecil 25kD

• Electron Micrograph

– Resolusi rendah

• Spektra CD


Kristalografi Sinar X


Spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

•Sampel dipaparkan pada medan magnet yang kuat

•Spin inti atom

•Penyerapan gelombang oleh inti-inti atom tertentu →

melepaskan radiasi

•H-NMR, C-NMR


Mikroskop Elektron

Mikroskop yang menggunakan

elektron untuk memperoleh

gambaran suatu sampel →

perbesaran

Dengan perbesaran mendekati 1

juta kali (106).


CIRCULAR DICHROISM (CD)

Spektroskopi Circular Dichroism (CD) merupakan metode optik yang dapat digunakan untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi kiralitas dalam suatu molekul.

Dasar tersebut dapat digunakan untuk memperoleh informasi mengenai struktur sekunder dan tersier dari suatu protein.

Circular dichroism mengukur perbedaan absorpsi cahaya terpolarisasi ke kanan dan kiri.


KOMBINASI KARAKTER

Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA4202 Karakterisasi Protein Rekombinan78

Isolat Produsen CGTaseLab Bioteknologi Farmasi - SF ITB (2010)

E. coli LT1B

Agar Horikoshi

Hidrolisis pati & Aktivitas siklisasi-β

Hidrolisis pati Siklisasi-β

I2/KI

phenolphtalin

coomassie blue

Native-PAGE

Coomassie biru

Penetapan Bobot Molekul

I2/KIcoomassie blue

SDS-PAGE

97 kDa

66 kDa

45 kDa

M 1 2

Spesifisitas Produk

Inte

nsi

ty (

mV

)

Retention time (min)

Standard α:β:γ-CD = 1:5:5 (μg/μL)

α-CD β-CD γ-CD

Pregelatinated1% Soluble starch

Non-pregelatinated10% Soluble starch

Non-pregelatinated1% Soluble starch

Ratio = 0 : 81 : 18Amount = 0 : 4.48 : 1.02 (μg/μL)

Ratio = 0 : 1 : 0Amount = 0 : 0.33 : 0 (μg/μL)

Ratio of α : β : γ -CyclodextrinRatio = 0 : 83 : 18Amount = 0 : 2.85 : 0.6 (μg/μL)

HPLC-Refraction Index detectorColumn : Waters Spherisorb® 5,0 µm NH2 4,6 mm x 250 mmH20 : Acetonitrile (70:30), 1.0 ml/min

KuisReteplase akan diproduksi sebagai protein rekombinan. Reteplase (r-PA) adalah domain aktif human tissue plasminogen activator yang terdiri atas 357 asam amino, dengan 9 jembatan disulfida, dan pI 6.9. Agar protein dapat dimurnikan dengan kolom chitin, dipilihplasmid pYXC, dan gen disisipkan dengan enzim restriksi BamHI dan XbaI menggunakaninang S. cerevisiae. Reteplase dapat mengalami deamidasi pada asam amino Gln-21 dan Asn-267.

1. Setelah purifikasi dengan kolom chitin, protein dipotong dengan factor Xa dan fragmen dipisahkan. (a) Metode apa yang sesuai untuk memastikan kemurnianreteplase yang dihasilkan? (b) Ilustrasikan hasilnya. (c) Apa saja pengotor yang potensial ada, dan merupakan pengotor terkait apa?

Untuk reteplase sebagai API, (a) pilih metode karakterisasi yang sesuai untukmasingmasing aspek berikut, dan (b) ilustrasikan hasilnya.

1. Identitas (4 metode)

2. Kemurnian (2 metode)

3. Pengotor dengan bobot molekul lebih tinggi

4. Protein inang

5. Protein mutan

6. Protein terdeamidasi


• Apa yang dimaksud dengan splicing dan di mana proses tersebut terjadi? Apakah proses splicing terjadi di semua sel ? Apa implikasi proses tersebut dalam kloning gen


• Pada sistem operon Lac dimana laktosa berlaku sebagai induser, apa yang terjadi jika sel yang memiliki sistem tersebut ditumbuhkan pada kondisi (A) media tanpa laktosa dan (B) media dengan laktosa? Apa yang terjadi pada sel untuk kondisi A dan B jika urutan operator dimutasi?


• Bila kita akan menghasilkan protein rekombinan yang gen pengkodenya terdiri atas tiga ekson dan dua intron, bagaimana cara kita membuat DNA sisipannya? Jelaskan!


• Bila kita akan menghasilkan protein rekombinan di ragi, vektor apa yang digunakan? Jelaskan mengapa demikian?


• Bila protein yang akan dipurifikasi mempunyai muatan total negatif, bersifat hidrofil dan berukuran 54 kDa, sistem purifikasi apa yang saudara akan gunakan untuk memperoleh protein murni?


KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN

Documents

Transcript of KARAKTERISASI PROTEIN REKOMBINAN