日本囊对虾 Na-K-2Cl 共同转运蛋白基因的克隆与组织表达分析

刘洪涛，王 军，毛 勇，乔 莹，钟声平，苏永全*（厦门大学海洋与地球学院，福建 厦门 361102）

摘要：本研究利用反转录 PCR(RT-PCR)和 cDNA 末端快速扩增（RACE）等技术在鰓组织中获得日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）Na-K-2Cl 共同转运蛋白 cDNA 全序列，包含14 bp 的 5’ 非编码区（UTR）、201 bp 的 3’ UTR 和 3183 bp 的开放阅读框（ORF）。ORF共编码 1060 个氨基酸，预测其分子质量为 117.051 ku，理论等电点为 6.57，命名为 Mj-NKCC。预测 Mj-NKCC 二级结构由 10 个跨膜结构组成，跨膜螺旋的氨基酸序列和布局均相对保守。同源对比结果显示，Mj-NKCC 的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾（Halocaridina rubra）的 Na-K-2Cl 共同转运蛋白相似性最高，为 77%。系统进化分析表明日本囊对虾 Na-K-2Cl 共同转运蛋白与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹（Callinectes sapidus）等甲壳动物的 Na-K-2Cl 共同转运蛋白聚为一支。实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）分析表明，该基因在肝胰腺、鳃、胃、肠、心、眼柄、肌肉和血细胞中均有表达，鳃组织中表达量最高；在盐度骤变时，该基因显著的表达变化表明其确实参与了对虾的渗透压调节，在对虾的渗透平衡中发挥重要作用。关键词：日本囊对虾；Na-K-2Cl 共同转运蛋白；基因克隆；组织表达；盐度骤变中图分类号：Q 785;S 917.4 文献标志码：A

日 本 囊 对 虾 （ Marsupenaeus japonicus ） 属 甲 壳 纲 （ Crustacea ） ， 十 足 目（Decapoda），对虾科（Penaeidae），囊对虾属（Marsupenaeus），在我国黄海、东海和南海海域均有分布，是我国重要的经济养殖虾类 [1]。日本囊对虾属海水广盐性对虾，适宜的盐度范围是 15~34，但对水体盐度的变化较为敏感。我国东南沿海日本囊对虾的养殖过程中常年受台风暴雨等影响，养殖水体盐度往往发生急剧变化，造成日本囊对虾大量死亡近年滨海盐碱地区、半咸水地区日本囊对虾的增养殖发展迅猛，养殖水体离子组成、碱度等复杂多变也造成许多问题[2]。陈坚等[3]研究发现低盐度对日本囊对虾生长和存活率的影响较为明显，李才文等[4]证实盐度变化能够影响对虾的免疫状况，盐度升降和偏离正常生存盐度范围均使对虾抗感染力降低，成为病毒病爆发的重要诱因。因此研究日本囊对虾对盐度的渗透调节机制具有重要的理论意义和生产应用价值。

Na-K-2Cl 共同转运蛋白（NKCC）是动物中广泛存在的一类电中性离子跨膜转运蛋白，基本上均以 1Na:1K:2Cl负责同向跨膜转运 Na、K、Cl 离子进出上皮细胞与非上皮细胞，转运强度和方向由转运离子的化学电势梯度总和决定，在上皮细胞离子转运、细胞体积和离子浓度的维持和调节、渗透压平衡和神经内分泌调控等方面均发挥重要生理功能[5]。NKCC基因在高等脊椎动物中研究已较为深入，而无脊椎动物中研究较少。Sun 等[6]研究果蝇（Drosophila melanogaster）时发现一个 CG4357 蛋白，其与 SLC12家族的第一分支存在较高的同源性，经验证证实其确为 NKCC 的昆虫同源类似物。目前在蓝蟹（Callinectes sapidus）、

收稿日期：2015-05-07基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA10A409）；国家虾产业技术体系岗位专家项

目“日本囊对虾育种”（CARS-47）；厦门市南方海洋中心项目（14CZY033HJ07）*通信作者：yqs@xmu.edu.cn

岸蟹（Carcinus maenas）、张口蟹（Chasmagnathus granulata）和中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）等 4种蟹类和一种夏威夷海蚀洞虾类（Halocaridina rubra）中已获得 NKCC 基因序列，并报道其随盐度变化有上调表达[7-9]，尚未见对虾类 NKCC 有相关报道。本实验成功克隆日本囊对虾 NKCC 基因 cDNA 全序列，并分析其在日本囊对虾不同组织中的表达，以及在环境盐度发生骤变时的表达变化。可为研究甲壳动物离子通道与渗透调节机制积累基础资料。

1 材料与方法1.1 实验材料和试剂

实验用日本囊对虾购自福建省漳州市东山县，平均体长为 10.44±0.12 cm，平均体质量为（14.05±0.86） g，暂养于 2.5 m×2 m×1.5 m室内水泥池中。暂养一周后，随机选取 6尾身体完整无损伤的健康个体，取其肝胰腺、鳃、胃、肠、心、肌肉、眼柄和血细胞迅速置于液氮中保存备用。

RNAiso Plus 、 PrimeScript Reverse Transcriptase 、 pMD19-T Vector 、 TaKaRa Taq、Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)、TaKaRa Ex Taq、dATP、PrimerScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、SYBR® Premix Dimer Eraser™（Perfect Real Time）均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA纯化通用试剂盒、高效感受态细胞制备试剂盒购自厦门鹭隆生物有限公司；其他常用试剂耗材购自厦门太阳马生物有限公司。 1.2 引物设计以日本囊对虾转录组数据库中与 NKCC 基因高度相似的 unigene片段作为模板，利用

引物设计软件 Primer Premier 5.0[10, 11]{Kadowaki, 2011 #48}{任亮 , 2004 #73} 和 分 析软件Oligo 6.0设计中间片段扩增引物，并利用克隆获得的 cDNA片段分别设计 3，RACE 和5，RACE巢式引物。以日本囊对虾翻译延伸因子（EF1-α）作为内参基因，根据获得的日本囊对虾 NKCC 全长 cDNA 序列设计 qRT-PCR引物。所有引物(表 1)。引物由深圳华大基因有限公司合成。

表 1 日本囊对虾 NKCC 克隆与表达所用引物Tab.1 Primers used for clone and expression of NKCC in M. japonicus

引物 引物序列 应用1F86 TTCGCCATTACCTTACGC cDNA 中间片段扩增1R677 ATGGTGCCCACAATACGA cDNA 中间片段扩增2F552 TTCCATTGCTGCGGCTAC cDNA 中间片段扩增2R1204 CACAAGTTCCACCTCCTCC cDNA 中间片段扩增3F866 ACTTTGCGTCAGACTTTAGG cDNA 中间片段扩增3R1704 CACGAAGAGGTACAGGGTC cDNA 中间片段扩增4F1690 CTGTACCTCTTCGTGGCG cDNA 中间片段扩增

4R2271 AACAACGGGTGTATCTTC cDNA 中间片段扩增5F1991 CCCGTCATAAGATTCGTGC cDNA 中间片段扩增5R2850 TTCAACATTGCTCTTGGCTT cDNA 中间片段扩增FF1 TAAGGTAATGGCGAAGGGAC 3’RACEFF2RR1RR2

TTGCCCCGAAGGTTGGTTGC GATGGTGCCCACAATACGAGATTAGCGAGGGTAAACAT

3’RACE5’RACE5’RACE

RA AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC RACEOligo dT-RA AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN RT/RACERTF GAGTAACGCTCAGGCAGATA qRT-PCRRTR TAAGGTAATGGCGAAGGGAC qRT-PCREF1-α-RT-F AAGGAACTGGAGGCAGGACC qRT-PCR内参基因EF1-α-RT-R ACACCCACAGCCACCGTTTG qRT-PCR内参基因

1.3 日本囊对虾 NKCC cDNA 克隆参照 RNAiso Plus说明书提取日本囊对虾鳃组织总 RNA，取 5 μL RNA 进行 1%琼脂糖

凝胶电泳检测 ，并使用 ND-1000 超微量紫外分 光 光 度计测 定 OD 值。 用于 cDNA 的3’RACE 和 5’RACE模板参照孙田田等[12]实验方法制备。

利用 5 对引物扩增和验证日本囊对虾 NKCC 的中间片段，PCR 反应体系(50 μL)：无菌双蒸水(DDW) 37.5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP (2.5 mmol/L each) 4 μL，正反向引物分别 1 μL，Taq酶(2.5 U/μL) 0.5 μL，鳃丝 cDNA模板 1 μL。PCR 反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s, 55 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，36 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物通过 1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，将纯化产物连接至 pMD19-T载体，连接产物转化至 DH5α 感受态细胞，菌液涂布于添加氨苄青霉素（Amp+）的 LB固体平板上， 37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆测序即可获得目的片段序列。

利用 3’RACE 的巢式引物依次进行 3’末端序列的扩增，PCR 反应体系（50 μL）：DDW 37.5 μL，10×buffer 5 μL，dNTP (2.5 mmol/L each) 4 μL，RA(20 nmol/L)，巢式引物 FF1/FF2 1 μL，Ex Taq酶(2.5 U/μL) 0.5 μL, cDNA第一链模板/第一轮巢式 PCR稀释产物 1 μL。按照不同的引物设置适当的退火温度来进行扩增，第二轮巢式 PCR产物通过 1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，按照上文步骤进行克隆测序，所得即为 3，末端序列。

5,端扩增利用巢式引物 RR1、RR2 和 oligo dT-RA、RA，及同聚化加尾的 5，模板进行5，末端的巢式扩增，操作步骤同上所述。 1.4 生物信息学分析

利用 DNASTAR 5.0软件对所得片段进行拼接和重叠序列的去除，确定 ORF 区域并推导出相应氨基酸序列[13]。利用 GenBank 中 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对所得的 cDNA 序列与核酸数据库及蛋白质数据库进行比对分析[14]。利用 Clustal X 对核苷酸序列 和 氨 基 酸 序 列 进 行 多 重 序 列 比 对 分 析 [15] 。 利 用 ProtParam 程 序 (http://web.expasy.org/protparam/) 统计氨基酸含量、预测理论分子质量和等电点。利用在线分析软件 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析[16]。利用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de / ) 进 行 功 能 结 构 域 分 析 。 利 用 PSIPRED 和PredictProtein 分析二级结构及活性调控位点。利用 MEGA 6.06软件的邻接法(Neighbor-

Joining，NJ)构建系统发育树，分支置信度采用自展法(Bootstrap analysis, BP)重复检验 1000次[17]。1.5 日本囊对虾 NKCC mRNA 的组织分布按照上文实验步骤提取日本囊对虾肝胰腺、鳃、胃、肠、眼柄、心、肌肉、血细胞等

8种组织总 RNA，通过 ND-1000紫外分光光度计检测总 RNA浓度，并根据 RNA总浓度适量的添加模板，按照 PrimerScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（Prefect Real Time）说明书要求制备 cDNA模板。

实时荧光定量 PCR按照 SYBR® Premix Dimer Eraser™ (Prefect Real Time)说明书要求，在 ABI 7500 Fast Real-Time PCR System 上进行，每个样品的目的基因和内参基因分别重复3 次， 同 时设置阴性 对照， PCR 反应体 系 (20 μL)如下： SYBR® Premix Dimer Eraser™ （ 2× ） 10 μL ，引物 (10 μmol/L)各 0.6 μL ， ROX Reference Dye Ⅱ （ 50× ） 0.4 μL，cDNA模板 2 μL、DDW 6.4 μL。反应程序采用三步法：95 ℃预变性 30 s；95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40 个循环，采集荧光信号；Melt 60 ℃-95 ℃获得熔解曲线。采用2−ΔΔCT法[18]用 EXCEL软件分析表达数据，用 Origin7.0软件展示检测结果。

1.6 日本囊对虾 NKCC mRNA 在盐度骤变时的表达变化随机选取 100尾实验对虾于盐度为 25 的水泥硬池中暂养 2周，其他条件同 1.1。将实

验对 虾 平 均 分 为两 组 ， 分别 立即 转移 至盐 度 为 15 和 35 的 水 泥池 中 ， 于0，3，6，12，24，48，72，96h随机选取 5尾实验对虾，冰上解剖取鳃组织迅速置于液氮中保存备用。实时荧光定量 PCR 实验的设计和数据分析参照 1.5。

2 结 果2.1 日本囊对虾 NKCC cDNA 序列及氨基酸序列分析将测 序 结 果 进行比 对拼接获 得 日 本 囊 对 虾 NKCC 的 cDNA 全 序 列 (GenBank：

KR063275)，命名为 Mj-NKCC，其全长为 3398 bp (图 1)。Mj-NKCC cDNA 包括 5’ UTR 14 bp，3’ UTR 201 bp， ORF3183 bp，3’ UTR 包含典型的加尾信号序列(AATAAA)和 13 bp 的poly(A)序列。

左侧数字分别为核苷酸及氨基酸的编号；起始密码子(ATG)、终止密码子(TAA)用下划线标示；多聚腺苷酸加尾信号位点(AATAAA)用方框标示；10 个跨膜区用灰色阴影标示。

图 1 Mj-NKCC 的 cDNA 全长及推导的氨基酸序列Fig.1 The complete cDNA and deduced amino acid sequence of Mj-NKCC gene

Mj-NKCC 的 ORF 共编码 1060 个氨基酸(图 1)，包含有 92 个强碱性氨基酸（Arg+lys）和 95 个强酸性氨基酸（Asp+Glu）。ProtParam 预测显示，Mj-NKCC 分子质量为 117.052 ku，等电点为 6.57，预测 GRAVY值为 0.091，不稳定指数 (Ⅱ)为 36.90，脂肪族指数为98.70，表明该蛋白为稳定、耐热的疏水蛋白。Mj-NKCC存在多种功能位点，包括 13 个糖基化位点、3 个 cAMP-/cGMP-依赖蛋白激酶磷酸化位点、9 个蛋白激酶 C磷酸化位点、18个酪蛋白激酶 CKII磷酸化位点、16 个豆蔻酰化位点和 1 个亮氨酸拉链基序。

利用 SignalP4.1 预测显示 Mj-NKCC 编码蛋白的 N 端不存在信号肽，为非分泌蛋白。利用 PSIPRED 分析该蛋白的二级结构显示其中 α 螺旋占 43.30%；β折叠占 10.19%；无规则卷曲结构占 45.51%。利用 PredictProtein 预测该蛋白亚细胞定位为细胞膜，可信度为76%。它具有 10 个跨膜螺旋，分布在氨基酸序列的第 123～583号残基之间(跨膜位点依次为 123～140、145～165、199～216、245～262、267～284、326～343、362～379、441～458、500～524、559～583)，除第 2、9、10 跨膜片段为 21、25、25 个氨基酸残基外，每个跨膜片段均为 18 个氨基酸残基，大片段的 NH2-末端和 COOH-末端均位于膜内侧。膜外序列在第 5、6 跨膜螺旋之间存在 1 个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点。

利用 SMART 分析发现该蛋白第 120~634号氨基酸残基之间有一个典型的 Na-K-2Cl 共同转运蛋白 AA_permease/SLC12A domain 结构域（图 2）。

图 2 Mj-NKCC 蛋白功能结构域分析Fig. 2 Functional domain analysis of Mj-NKCC with SMART

2.2 Mj-NKCC 多重比对及系统进化树分析Mj-NKCC 的 cDNA推导的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹等近缘动物 NKCC 蛋

白多重比对表明其跨膜区域及布局相对保守（图 3），C 端序列也相对保守，暗示这些片段在这些物种的生命活动中可能发挥重要作用。利用 BLAST 同源分析也发现，Mj-NKCC的氨基酸序列与其他物种 NKCC具有较高的同源性，其中 Mj-NKCC 与夏威夷海蚀洞虾的NKCC 同源性最高，为 77%。系统进化树 (图 4)显示其首先与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹、岸蟹等节肢动物的 NKCC 蛋白聚为一支，再与长牡蛎(Crassostrea gigas)等软体动物聚在一起并相对脊椎动物独立分支。

跨膜片段用字母“M”表示.

图 3 Mj-NKCC 氨基酸序列的多重比对Fig. 3 Amino acid sequences of Mj-NKCC aligned with the NKCC sequences from other species

图 4 基于NKCC 基因氨基酸序列构建的 NJ 系统发育树Fig. 4 The Neighbor-Joining(NJ) phylogenetic tree constructed based on NKCC amino acid sequences

2.3 Mj-NKCC mRNA 组织表达分析qRT-PCR检测 Mj-NKCC 在日本囊对虾肝胰腺、鳃丝、胃、肠、心、肌肉、眼柄和血

细胞等 8种组织中的表达，结果见图 5。Mj-NKCC mRNA 在 8种组织中均有表达，以肝胰腺中表达量为对照，其在鳃中表达量最高，其次为血淋巴、肠、胃，眼柄，心和肝胰腺，在肌肉中的表达水平最低。

1. 肝胰腺; 2. 鳃; 3. 胃; 4. 肌肉; 5. 心; 6. 眼柄; 7. 肠; 8. 血细胞图 5：Mj-NKCC mRNA 的组织表达分布

Fig. 5：Expression of Mj-NKCC mRNA in different tissues of M.japonicus

2.4 Mj-NKCC mRNA 在盐度骤变时的表达变化qRT-PCR检测 Mj-NKCC 在日本囊对虾在环境盐度发生骤变时的表达，结果见图 6。

盐度 25 骤降至 15，骤变后 3h 时 Mj-NKCC mRNA 相比 0h 对照组显著上调表达，约为对照组的 2.8倍，并维持表达量至 24h 时，相比 0h 对照组极显著上调表达，约为对照组的 8.4倍；后虽有下调，但相比对照组仍为极显著（P<0.01）；而在盐度 25 骤升至 35 时，表达量虽然出现变化，但除 72h 时 Mj-NKCC mRNA 表达量相比 0h 对照组表现出显著的上调外（P<0.05），其他时间点的表达量与对照组差异不显著。

（A）盐度由 25 骤降至 15；（B）盐都由 25 骤升至 35.

图 6：Mj-NKCC mRNA 在盐度骤变时的表达Fig. 6：Expression of Mj-NKCC mRNA after the salinity changes in M.japonicus

3 讨 论

NKCC 属于电中性的阳离子-氯转运家族(CCCs)，目前的研究表明该家族包括 9种转运子，7 个 Na/K 离子单独或共同与 Cl 离子共转运子和两个尚不清楚功能的新发现的膜蛋白[19,

20]。本实验利用 RT-PCR 和 RACE 等分子生物学技术，成功获得日本囊对虾 NKCC 基因全长 cDNA 序列（Mj-NKCC），在虾类中研究报道尚少，在对虾中尚属首次。NKCC 为一类跨膜糖蛋白，分子质量为 120～200ku，Mj-NKCC 预测分析其定位在细胞膜上，氨基酸序列中含有 13 个 N-糖基化位点，在胞内和胞外区域均有分布，与 Reshkin 等[21]在兔子腮腺中的研究发现基本一致。同源分析表明 Mj-NKCC 的氨基酸序列与夏威夷海蚀洞虾、蓝蟹、果蝇等相似性很高，其中与夏威夷海蚀洞虾的 NKCC 相似性最高为 77%。说明 NKCC 在不同物种间较为保守。进一步系统进化分析显示 Mj-NKCC首先与甲壳动物 NKCC 聚为一个分支，后与果蝇等节肢动物和长牡蛎、玻璃海鞘等软体动物的 NKCC 共同聚为一个大的分支，与高等脊椎动物明显的分开，表明借助 NKCC 的氨基酸序列对物种进行的分子进化研究与传统的生物学分类基本吻合。

研究表明，NKCC 的蛋白功能的激活或抑制与该蛋白的磷酸化状态息息相关。其活化后会促使其易位到胞膜上执行功能[22]。Darman 等[23]研究了 NKCC 氨基端磷酸化状态对其蛋白 的活性 调控的 影 响 ， 发现其 末 端存在 多 个磷酸 化位点 ，可以与 蛋 白磷酸酶的SPAK、RVXF 区域结合从而调控 NKCC 的活性；并发现 Thr189 对于 HEK-293 细胞表达的鲨鱼（Squalus acanthias）NKCC突变体蛋白的活性是必要条件，而 Thr184 和 Thr202则起调控作用。Flatman 等 [24]对磷酸化和蛋白间相互作用对 NKCC活性调控的研究中证实NKCC 中也存在蛋白激酶 A、蛋白激酶 C、酪蛋白激酶 CK2 的结合位点。Diecke 等[25]的研究还证实 MAPKs、CaMKII以及 cAMP/cGMP-PK 均可以使 NKCC磷酸化。Mj-NKCC 的氨基酸序列含有 3 个 cAMP-/cGMP-依赖蛋白激酶磷酸化位点、9 个蛋白激酶 C磷酸化位点、18 个酪蛋白激酶 CKII磷酸化位点、膜外序列在第 5、6 跨膜螺旋之间有 1 个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点。因此Mj-NKCC 的磷酸化/去磷酸化状态的调控，可能对其在日本囊对虾渗透压维持和调节、神经内分泌调控以及细胞周期等方面产生重要影响。

CCCs家族中 NKCC 与其他转运子在不同的物种间存在 25%～67%不等的同源相似性，但二级结构均较为相似，跨膜区域为 8~12 个由疏水性氨基酸构成螺旋，膜内区域由亲水性的氨基端和羧基端组成[26]。Mj-NKCC 包含 10 个跨膜螺旋，氨基端和羧基端均在细胞内侧。NKCC 跨膜亚基的氨基酸残基组成和分布均相对保守，研究发现其氨基端序列相差较大但羧基端序列相对保守，不同物种之间拥有 65%的相同氨基酸组成[27]。Mj-NKCC 与蓝蟹、果蝇等多重对比分析表明其跨膜序列和 C-端序列均较为保守，N 端序列不同物种间差异较大。跨膜区序列分析发现Mj-NKCC 序列与其他物种的相比第 2、9、10 跨膜片段长度变异较大，2、4、5、6、7 跨膜螺旋氨基酸差异较大，提示其可能与物种特异性有关。

Isenring 等[28]通过构建鲨鱼与人的 NKCC 的嵌合体进行点突变实验，发现 NKCC 基因的离子结合与转运及 bumetanide抑制结合的能力，都依赖相对保守的疏水跨膜结构域。该跨膜区域在不同亚型间且在不同物种间都是非常保守的[29]。各跨膜亚基的离子动力学特性不同，可能具有物种特异性，其中第 2号跨膜螺旋的氨基酸突变会影响对 Na、K 等阳离子的亲和力，而第 4～7号跨膜区的氨基酸组成则对 Cl 离子的亲和力起决定作用 [30]。Mj-NKCC具有与 CCCs家族 NKCC 高度同源的 AA_permease/SLC12A domain 结构域，且该结构域定位于氨基酸序列的跨膜区，并且根据上文分析 Mj-NKCC第 2，4，5，6，7 跨膜片段与其他物种差异较大，推测其跨膜区段的氨基酸变异是日本囊对虾广盐性适应的重要原因，Mj-NKCC各跨膜螺旋的具体功能尚需进一步研究。

海产甲壳动物，其对盐度的适应能力主要体现在对渗透压和离子浓度的调节能力上 ,而这种调节主要由鳃来完成。鳃的上皮含有颗粒细胞、肾原细胞、柱形细胞等多种细胞类型从而调控和维持外界水环境与血淋巴的渗透平衡，执行呼吸、排泄、渗透压调节甚至病害

防御等功能，而位于这些细胞基底侧质膜的 NKCC 的协同转运将发挥重要作用 [28, 29, 31, 32]。利用实时荧光定量 PCR 技术检测 NKCC 基因在日本囊对虾鳃丝、肝胰腺、肠、血细胞、胃、心、眼柄和肌肉 8种组织中的相对表达量，发现Mj-NKCC mRNA 在这些组织中均有表达，在鳃中表达量最高。进一步的盐度骤变实验表明，Mj-NKCC 在日本囊对虾在盐度发生骤变时表达量均出现显著变化，在盐度骤降时更是达到极显著水平，说明 Mj-NKCC 确实参与了日本囊对虾的渗透压调节过程。有研究报告对夏威夷海蚀洞虾多种渗透相关基因进行研究，发现NKCC除盐度 32 骤降至 2 时有显著的上调表达外，其他盐度骤变的实验组表达波动不显著，这可能与物种及环境不同有关，相比而言夏威夷海蚀洞虾的环境盐度变化更为剧烈与频繁[9]。综上所述可以认为 Mj-NKCC 确实在日本囊对虾鳃的离子转运和渗透平衡等发挥重要作用。

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Molecular Cloning and Expression Analysis of Na+/K+/2Cl--cotransporter from

Marsupenaeus japonicusLIU Hong-tao, WANG Jun, MAO Yong, QIAO Ying, ZHONG Sheng-

ping, SU Yong-quan*(College of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

Abstract: Na+/K+/2Cl--cotransporter gene (Mj-NKCC) from Marsupenaeus japonicus was

obtained using reverse transcription PCR （ RT-PCR ） and rapid amplication of cDNA ends

(RACE) in this study. Full-length cDNA sequence of Mj-NKCC consists of a 14 bp

5，untranslated regions (UTR) , a 201 bp 3 ，UTR and a 3183 bp open reading frame (ORF), the

deduced amino acids sequence is composed of 1060 amino acids and whose molecular weight and

isoelectric point are 117.051ku and 6.57, respectively. The predicted second structure of NKCC

from M. japonicus contained 10 transmembrane domains, which were highly conserved in

sequences and localization sites relative to other species. The amino acid multiple alignment

showed that Mj-NKCC had the highest homology with Callinectes sapidus (up to 78%). The

phylogenetic analysis indicated it was first clustered together with C.sapidus and Carcinus

maenas. The quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) results displayed that Mj-NKCC was

expressed in hepatopancreas, gills, stomach, muscle, heart, eyestalk, intestine and hemocytes, with

the highest expression level in gills. After the salinity changes, significant changes in the

expression of Mj-NKCC indicated that it did participate in osmotic balance of shrimps, and play

an important role in osmoregulation of shrimps.

Key words: Marsupenaeus japonicus; Na+/K+/2Cl--cotransporter (NKCC); molecular cloning; qRT-PCR; the salinity change