Como la Proteina represora controla al Operon lac

En 1961, François Jacob y Jacques Monod utilizaron las mutaciones de los genes lac en E. coli para desarrollar un modelo general de control de la transcripción en bacterias.

Control de la Transcripción

Los mismos procesos que permiten el control del metabolismo celular también proporcionan los medios para regular cómo se expresan los genes. A nivel metabólico, compuestos celulares se unen a las proteínas enzimáticas específicas, cambiar su forma y por lo tanto su función. A nivel de la síntesis de ARNm, existe una serie similar de controles alostéricos (enzimas), que regula los genes que son transcritos y en qué medida.

La influencia de los controles de transcripción puede ser muy marcada, y de hecho se ha observado desde el cambio de siglo, pero hasta hace poco la naturaleza de estas influencias no se entendía. En 1900, F. Dienert informó de que las enzimas del metabolismo de la galactosa en la levadura estaban presentes sólo cuando la levadura utiliza galactosa como fuente de carbono, era como si la presencia de galactosa había "provocado" de la levadura las enzimas específicas necesarias para metabolizar el azúcar. Muchos informes similares de que los microbios podian "adaptarse" a su medio de crecimiento siguieron. Enzimas microbianas se agrupan en dos clases: las enzimas de adaptación, normalmente no presentes en las células y que se producen sólo cuando el sustrato de la enzima estaba presente en el medio de crecimiento, y las enzimas constitutivas, producidos normalmente por las células sin tener en cuenta la presencia o ausencia de sustrato.

La teoria de Yudkin

Fue casi 40 años antes, que una teoría se adelantó, podría explicar satisfactoriamente la adaptación enzimatica en bacterias. La teoría de la acción de masas propuesta por John Yudkin en 1938, aunque posteriormente se demostró que era incorrecta, parece sorprendentemente moderna en retrospectiva. Sugirió que existen enzimas dentro de las células en equilibrio dinámico con sus precursores, un equilibrio que favorece la formación de la enzima para las enzimas constitutivas, pero favorece los precursores inactivos en el caso de las enzimas de adaptación. La Unión del sustrato para enzimas de adaptación podría estabilizarse en la forma de enzima. Observado desde fuera, parece como si el sustrato había ordenado mágicamente su enzima activa.

Hipótesis de acción de masas de Yudkin fue refutada por dos líneas de evidencia, desarrollados a partir del estudio de la adaptación de las bacterias a la lactosa como fuente de carbono, un sistema que se ha convertido en el foco de una intensa investigación. La bacteria E. coli pueden crecer en los medios de cultivo con el disacárido lactosa como única fuente de carbono. La lactosa se divide en glucosa y galactosa por la enzima beta-galactosidasa, la galactosa, es subsecuentemente convertida es más glucosa, y la glucosa utilizada en el metabolismo primario. Las células bacterianas en crecimiento activo en lactosa contienen cada una varios miles de moléculas de beta-galactosidasa (hasta 5 por ciento de la proteína celular total). Sin embargo, cuando las mismas células se cultivan en un medio con una fuente de carbono diferente (como la glucosa), poca beta-galactosidasa está presente - menos de diez moléculas por célula. Betagalactosidasa era por tanto un caso clásico de una enzima "adaptativa”.

La primera línea de evidencia que contradice la hipótesis de Yudkin fue desarrollado por Jacques Monod en la década de 1950. Señaló que los compuestos además de lactosa podrían inducir la producción de beta-galactosidasa. Algunos de ellos, tales como isopropiltiogalactósido (IPTG), no

eran sustratos metabolizables incluso de la enzima. La existencia de tales inductores gratuitos argumentó en contra de la hipótesis de Yudkin, y sugirió que el inductor no puede interactuar directamente con la enzima después de todo.

La segunda línea de evidencia, repetida muchas veces en diferentes formas, era la demostración de que la adaptación de las bacterias a la lactosa, la inducción de la enzima de beta-galactosidasa por el inductor lactosa, implica la síntesis de nuevas proteínas de enzimas en lugar de montaje de precursores como Yudkin había supuesto. Esto se demostró por el crecimiento de E. coli durante muchas generaciones en un medio de 35S (Azufre 35) sin un inductor presente, a continuación, transferir las células a un medio no radiactivo y la adición de un inductor. El b-galactosidasa inducida no contiene ningún 35S (Azufre 35). Este resultado demuestra que el b galactosidasa inducida está recién sintetizados (de novo) y no podría haber sido derivado de subunidades preexistentes, que habrían contenido cisteína y metionina marcadas con 35S (Azufre 35).

Cual es la base de la inducción enzimática?

Surgió rápidamente una serie de pistas. La primera ya ha sido discutido: inducción implica la síntesis de proteínas de novo. La segunda idea surgió de los estudios genéticos de Joshua Lederberg en la inducción de lactosa. Como todo buen genetista, se dispuso a obtener una colección de mutantes lac, con la esperanza de que al compararlos con los de tipo salvaje, pudiera empezar a describir las propiedades del sistema. Este enfoque de "mirar para ver lo que puede salir mal" puede ser muy poderoso (es sorprendente lo mucho que se puede aprender sobre el cableado de una casa, sacando los fusibles uno por uno y buscando el efecto). En el caso de los mutantes lac- (lac negativos) de Lederberg, se hizo evidente después de varios años de investigación que había más de una clase de mutante. Algunos eran lac- (lac negativos) porque carecían de actividad b-galactosidasa (llamados mutantes lacZ), mientras que otros tenían actividad b-galactosidasa en los extractos de células, pero no en las células intactas (estos fueron llamados mutantes lacY).

Actividad en los extractos se ensayó mediante el uso de un análogo de sustrato incoloro llamado o-nitrofenil-b-galactósido (ONPG), que es hidrolizado por la b-galactosidasa para producir o-nitrofenol intensamente amarillo. Actividad en las células intactas fue más convenientemente evaluada por las células que crecen en medio que contiene colorantes redox eosina y azul de metileno, un medio en el que las celulas lac- producen colonias incoloras mientras que las células normales lac + (que liberan iones de hidrógeno cuando hidrolizar la lactosa y así más bajo es el pH de la medio circundante) son rojos. Se ha demostrado que los mutantes tenían un lacZ una enzima b-galactosidasa defectuosa. Los mutantes de LacY tenian una normal b-galactosidasa, pero tenían una permeasa inactivo, enzima necesaria para el transporte de lactosa en las células bacterianas.

La segunda idea era que ambas enzimas fueron inducidos por la lactosa: hubo cambios (en concetraciones) paralelos en las actividades de ambas enzimas. Más tarde, una tercera enzima, transacetilasa galactosidasa (lacA), también se encontró que estaba inducida por la lactosa. Esta también cambió (en su concentración) en concierto con los otros.

La tercera pista vino en la década de 1950 más tarde, cuando tres tipos de mutantes de Lederberg (lacZ-, Lacy-, y lacA-) fueron sometidos a análisis genético. Es posible derivar un mapa genético de cromosomas bacterianos mediante el análisis de las frecuencias de recombinación, con la posición relativa de cada mutación encuentra. Tres mutantes de Lederberg fueron todos mapeados juntos.

Lo que estas tres pistas revelaron fue que la inducción enzimática de las sinstesis de novo de varias enzimas que eran contiguas una a la otra en el cromosoma bacteriano. Esto sugiere claramente que la interacción del inductor estaba en el nivel cromosómico.

El inductor mutante

La clave del enigma, como suele ser el caso, era un mutante revelador. Entre los muchos mutantes de Lederberg, fue uno con un fenotipo muy inusual: Este mutante siempre preentaba altos niveles de b-galactosidasa, permeasa y acetilasa, incluo en ausencia de lactosa. La mutación habia transformado a la célula, de ser Adaptativa, a ser Constitutiva. Debido a que carecia de la caracteristica de inducción, este mutante constitutivo fue etiquetado cono lac I -. El mapeo genético indica que lacI no era parte del grupo lacZ lacY y lacA, aunque se encuentra muy cerca. Lac I – por lo tanto parece ser una mutación reguladora de algún tipo.

¿Cómo podría funcionar? La hipotesis más obvia era que lacI + -> lacI - conduce a la producción de un inductor interno, por lo que la sinteis de lacZ, lacY y lacZ es siempre constitutiva. Esta hipotesis se sometió a una prueba clara: predijo que lacI – sería dominante sobre lacI +. en una célula que contiene los genes de lacI – y lacI+ , lacI - podría aun producir el inductor interno y la célula aun podría ser constitutiva.

La hipotesis de Jacob & Monod

Las bacterias son haploides que contienen un solo cromosoma. François Jacob y Monod tuvieron éxito en la obtención de células en las que los genes de agrupación de la lactosa habían sido transferidos de una bacteria a otra (las dos células se unen, uno dona su ADN a la otra, replica una copia a través de un proceso de replicación del ADN "círcular continuo”, y la transferencia de la copia a través de un puente citoplásmico estrecha a la célula receptora). Este procedimiento fue particularmente importante aquí, ya que por lo tanto fue posible construir líneas de células bacterianas que eran de hecho parcialmente diploide, mediante la transferencia de ADN del donante que lleva el gen lactosa a diferentes receptores bacterianos. Cuando Jacob y Monod probadon diploides parciales que eran lacI - Z + / lacI + Z -, no se encontró beta-galactosidasa a menos que se añadiera lactosa al medio de crecimiento. La síntesis se lo inducible, no constitutivo, y no lacIwas claramente dominante. Síntesis era inducible, por lo tanto, no constitutivo, y lacI eraclaramente no dominante.

Debido a qu lacI – no era dominante, y sin inductor interno nunca podría ser aislado, parecía probable que la acción del gen lacI estaba a nivel de la propia sintesis de mRNA. ¿Cómo podría funcionar? Como se sabía que lacI+ era dominante sobre lacI-, se asumió que lacI+ producía activament un producto de proteina que actúa para regular los genes lacZ, lacY y lacA. Había 2 alternativa, realmente opuestas, que tenían que ser consideradas:

1. En una hipotesis, el producto del gen lacI + podría ser un elemento esencial en la transcripción de los genes de la lactosa (talvez un factor de la RNA Polimerasa?), con el inductor lactosa siendo necesario para activar el proceso. La mutación lacI – podria ser constitutiva si es que el producto del gen lacI es liberado del control positivo del inductor.

2. Bajo la hipotesi alternativa, el producto del gen lacI + en realidad podría prevenir la transcripción de lo genes de la lactosa (tal vez por la unión en el ADN, en el sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa), con el inductor uniendose e inactivando al “represor” lacI +, de modo que la transcripción de la genes de lactosa podrían proceder. La mutación lacI sería constitutiva, porque el represor lacI – sería defectuoso y no podría unirse al ADN para ejercer el control negativo.

El experimento de Jacob y Monod.

En un intento de entender el modo de acción de la mutación lacI - de Lederberg, Jacob y Monod primero tuvieron que determinar si el gen hizo o no un producto, que a su vez actua sobre el operon lac (en vez de algún efecto estructural del gen en sí mismo), y si el gen lacI actua de una manera positiva (estimuladora) o negativa (inhibidora)

Ellos se dirigieron a la primera pregunta de la determinación de la conducta dominante de la mutación lacI. Ellos razonaron que un heterocgoto lacI + / I - debería ser constitutiva si el gen lacI eran de acción en cis (limitado en su acción para el mismo cromosoma), como los genes lacI del cromosoma tendria el fenotipo lacI – (constitutivo), siendo afectado por los genes lacI + de los otros cromosomas.

Alternativamente, un lacI + / I-heterocigoto debe ser inducible si el gen lacI produce un producto difusible, como los genes lacI - del cromosoma estarían expuestos a dicho producto y así tendrían el fenotipo lac + (inducible).

En el primer caso, lacI - parece dominante sobre lacI + en los heterocigotos, mientras que en el segundo caso, lacI - parece recesivo a lacI +.

La bacteria E. coli utilizadas en el estudio es normalmente haploides, pero Jacob y Monod tuvieron éxito en conseguir diploides parciales para lac mediante el aprovechamiento de dos hechos:

1. Cepas Hfr de E. coli podían transferir una copia de su cromosoma en la cepa F - receptora de E. coli en un proceso hacia abajo como conjugación. Esto proporcionó, al menos temporalmente, un organismo diploide que contiene tanto los beneficiarios como los donantes de ADN. Estos productos de conjugación fueron llamados meri-diploides, y proporcionan a Jacob y Monod un medio de examinar combinaciones de genes diploides dentro de E. Coli.

2. No todo el cromosoma donante fue transferido durante la conjugación. Esto significa que Jacob y Monod necesitan un medio para identificar y aislar las células que de hecho habían transferido los genes lac. Podrían, por supuesto, haber aislado y probado las células individuales, pero esto habría sido un proceso tedioso. En su lugar, se encuentra otro gen, prolina, situado muy cerca de lac en el cromosoma bacteriano. Cuando las células receptoras fueron PRO-, era una simple cuestión de seleccionar a los beneficiarios PRO +. En la obtención del gen PRO +, estas células es casi seguro que tenían los genes lac transferidos así.

Y ¿qué pasa con las células del donante PRO +? Si uno usa PRO + para seleccionar las células receptoras que han obtenido los genes lac, ¿cómo se distinguen de las células del donante PRO + original? Jacob y Monod utilizaron otro marcador – Sensibilidad al virus T6. Eligieron una cepa receptora a la que le faltara una apropiada proteina de superficie celular para el reconocimiento de T6 y así fue resistente a la infección y lisis por el virus T6. Después de PRO +, T6S (HFR) se mezcló con PRO-, T6R (F-), y la conjugación procedió durante un tiempo. A continuación se añadió virus T6, matando a todos de las células del donante. Las células restantes se extienden a continuación, y se dejaron crecer en una superficie de medio sintético sin prolina. Sólo las células que habían recibido la porción PRO + del cromosoma donante podrían crecer para formar colonias visibles. Por lo tanto, este procedimiento produce colonias que eran predominantemente diploides para la región LAC.

El comportamiento de dominancia del lacI - se puso a prueba en el apareamiento constitutiva entre

lacI - Z + (HFR) con un destinatario lacI +, que también era beta-galactosidasa negativo: lacI + Z-(F-). El diploide resultante era lacI - Z + / I + Z- , tuvo el fenotipo lacI +. Fue inducible en lugar de constitutiva. LacI-era por lo tanto recesiva a lacI +, lo que indica que el gen lacI + produce un producto difusible, que más tarde demostró ser una proteína.

Si este producto ha actuado de manera positiva o negativa podría entonces ser probado directamente por la repetición del análisis en la configuración genética opuesto. Jacob y Monod acoplaron una cepa lacI + Z + (HFR), con una cepa lac – Z - (F-) , y monitorearon el gen lacZ durante el proceso de conjugación. Las células se retiraron periódicamente, se rompieron, y se probó la capacidad de hidrolizar ONPG. Al principio, las células donantes no estaban haciendo beta-galactosidasa porque eran lacI + y crecen en un medio sin lactosa, mientras que las células receptoras no estaban haciendo beta-galactosidasa porque eran lacZ-.

Cuando el gen lacZ + se transfirió a la célula receptora, esa celula fue entonces lacZ + I – e inmediatamente inicio la sintesis de betagalactosidasa constitutiva.

Poco después, el gen lacI + se transfirió, la síntesis constitutiva se detuvo, y la síntesis de beta-galactosidasa se convirtió en inducible. La entrada de lacI + permite la producción de una sustancia que detiene la síntesis constitutiva a pesar de la presencia de lacI - . No sólo este resultado confirma que lacI + era dominante sobre lacI - , que también demostró inequívocamente que el producto del gen lacI ejerce el control negativo, que actúa para inhibir la síntesis de los genes lac en ausencia de inductor.