Kísérleti állatok radioizotópos leképezése

Dr. Márián Teréz

NUKLEÁRIS MEDICINA INTÉZET DEOEC

2010

1

Izotópok alkalmazása az orvostudományban

kutatás diagnosztika terápia

anyagcsere folyamatoksejtosztódásnyomjelzéstérfogatméréskoncentráció mérésbiokémiai folyamatokgyógyszerkutatás

funkcionális vizsgálatokanyagcsere folyamatok

tumor diagnosztikaizotópeloszlás térképkétdimenziós térképháromdimenziós térkép

sugárterápiaradionuklid terápia

2

Új izotóppal jelzett ligandok biológiai tesztelése

Gyógyszerkutatás

Orvostudomány

Állatkísérletek:

In vitro: receptor kötıdési vizsgálatok

Ex vivo: szervi megoszlásos vizsgálatok

autoradiográfia

In vivo:

Funkcionális:PET, Mini-PET, SPECT,

Anatómiai: CT, MRI

3 4

Az állatkísérlet végzésének törvényi feltételei

Hol?a létesítményt a hatóságnak (területi Állategészségügyi Állomás) nyilvántartásba kell vennie(állatok tartása és gondozása, állatházi viszonyok, személyzet, berendezések, stb.)

Miért?a kutatási tevékenységet (projektet) engedélyeztetni kell a hatósággal(célja, indoka, tudományos alapjai, módszertana)

Hogyan?a kísérleti eljárásokat a MÁB-nak jóvá kell hagynia(mint elıbb, csak részletesebben, állatok faja és száma; fájdalom, szenvedés, tartós nélkülözés és károsodás értékelése; ezek megszüntetésére vagy minimalizálására tett intézkedések; a kísérlet idıtartama; stb.)

Ki?a kísérletet vezetı illetve abban résztvevı személyeknek megfelelı, a hatóság által elismert végzettséggel ill. gyakorlattal kell rendelkezniük

5

Feltételek

(2) Állatkísérlet kizárólag nyilvántartásba vett intézményben és engedély alapján végezhetı. (Ávt. 25. §)

(1) Állatkísérlet kizárólag olyan felelıs személy vezetésével végezhetı, aki külön jogszabályban meghatározott végzettséggel és gyakorlattal rendelkezik, és ismeri az állatkísérletek etikai elveit, jogi szabályait.

(2) Állatkísérletet az végezhet, a kísérleti állatot az gondozhatja, felügyelheti, aki erre képesítı oktatásban részesült. (Ávt. 30. §)

Kísérleti célra állatot tenyészteni (szaporítani), tartani, szállítani, valamint forgalomba hozni a tartás helye szerinti állategészségügyi hatóság engedélyével szabad. (Ávt. 31. § (1) bek.)

6

34. § (1) A MÁB feladata az intézménya) állatkísérleti szabályzatának (etikai kódexének) elkészítése;b) állatkísérleti szabályzata végrehajtásának ellenırzése;c) állatkísérleteinek szakmai-etikai felügyelete.

A MÁB feladata továbbá az intézményben az állatkísérlet végzésére jogosult személyek oktatásának, képzésének szervezése.

(2) A MÁB az intézmény belsı állatkísérleti szabályozásának megsértése esetén jogosult - az állat-egészségügyi hatóság egyidejő értesítése mellett - a kísérlet azonnali leállítására. (Ávt. 34. §)

(4) A MÁB nyilvántartást vezet az általa jóváhagyott kísérletekrıl, valamint az intézményben folyó állatvédelmi oktatásról (az oktatás tematikája, a résztvevık névsora). (Korm. rend. 9. §)

Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság (MÁB)

7

Állatkísérletek engedélyeztetése

Etikai engedély

Csak erre a célra tenyésztett állatokkal szabad kísérletezi

Egér

Patkány

Nyúl

Macska

Kutya

Sertés

Majom

8

Állatkísérletek izotóppal jelölt biomolekulákkal

In vitro autoradiográfia

Ex vivo autoradiográfia, szervi megoszlásos vizsgálatok

In vivo molekuláris képalkotó technikák

9

Az autoradiográfia nagy múltú

technika

Niepce St. Victor in 1867 – ben mutatta ki, hogy az uránium só

feketedést okoz az ezüst

klorid/bromid sót tartalmazó emulzión.

10

1904

E.H. London készítette az

elsı makro-autoradiográfiát, ahol egy

békát rádium izotóppal

jelölt meg, és rádium sugárzást, ami a békából

jött leképezte egy filmre.

11 12

Autoradiográfia-Fotoemulziós eljárás

A sugárforrás lefényképezése két vagy három dimenzióba egy fotográfiai emulzió segítségével

A sugárzásnak a fotoemulzióra gyakorolt hatása denzitométerrel mérhetı

Denzitométer: speciális fotométer, amely a fotoemulziók feketedését határozza meg, és széles tartományban arányos a sugárzás intenzitásával.

Kvantitálás (mennyiségi kiértékelés): a vizsgálandó emulzió feketedését un. normálsorozat feketedésével hasonlítjuk össze.

13

Autoradiográfia szerepe a biológiai kutatásokban

Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulákszervezetben, szervekben, sejthalmazon, sıt egyes sejtekenbelüli lokalizációja meghatározható

Gyógyszerkutatás

Élettani folyamatok nyomon követése

Molekuláris biológiai izotópos módszerek (génexpresszió,membrán fehérjék kimutatása, izotópos antitestjelölésekkel stb)

Kémiai analitikai módszerek

14

Autoradiográfia� Izotóp injektálása

� Állatok elıkészítése a metszésre

� A beágyazó anyag elıkészítése

� Beágyazás

� Metszés

� Elımetszés

� Metszés

� A metszetek kezélése (fagyasztva szárítás)

� A szeletek elıkészítése a detektáláshoz

� A szeletekben feldúsult radioaktivitás megjelenítése, film vagy foszfor imager technikával.

� Kiértékékelés

15

A metszetek fagyasztva szárítása

16

Izotópeloszlás detektálása sugárérzékeny

filmen,vagy beta imager technikával

17

LEICA CM 3600 cryomacrotom

18

Patkány modell

18FDG

Tumordiagnosztika,

terápia hatékonyságának

kimutatása állatkísérletekben

Megelızı Orvostani Intézet

TTK Molekuláris Biológiai Intézet

Egésztest autoradiográfia

19

Anatómia kép

20

Anatómiai kép (felsı) és emissziós FDG-PET kép (középsı)

fúziója (alsó kép)

21 22

A radioaktivitás detektálása film A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiávalautoradiográfiával

AgBr kristályból Ag kiválás a radioaktív sugárzás hatására

AgBr kristály

Zselatin

Radioactív halmozás

Minta (metszet)

A fényérzékeny anyag (film) egy szilárd hordozóra felvitt zselatinba ágyazott AgBr. Ha fény, vagy radioaktív sugár éri a kristályt, egy elektron kilökıdik, továbbhalad, majd egy hibahelyen befogódik.

23

A radioaktivitás detektálása film autoradiográfiávalA radioaktivitás detektálása film autoradiográfiával

Látens kép kialakítása Ag+ + e- = Ag folyamatban

keletkezı Ag atomok a látens kép prekurzorai

Instabil állapot

Látens kép stabilizálása: az expoziciót -70 oC-on végezzük

24

Elıhívás

Az elıhívó oldat az AgBr szemcsék kémiai redukcióját végzi, amelyet az ezüst atomok katalizálnak.

AgBr----Ag

Látens kép ----- ezüst szemcse

Elıhívás ------ itt jelenik meg gyorsabban a látható kép

A látens kép láthatóvá tétele

25

Fixálás

Autoradiogram

Az elıhívott kép rögzítése: Az elıhívás után a visszamaradó, redukálatlan AgBr-ot a fixirfürdıben eltávolítjuk

Mosás: sók eltávolítása a zselatinból26

Felbontóképesség: az a minimális távolság amikor még két különálló pont helyét meg tudjuk különböztetni a filmen

A felbontóképesség függ:

az izotóp energiájától

a minta rétegvastagságától

a fotoemulzió rétegvastagságától

a minta és a film közötti távolságtól

az expoziciós és elıhívási idıtıl stb.

27

Érzékenység: egységnyi aktivitás által egységnyi felületen (1 cm2) létrehozott Ag szemcsék száma

Optimalizálás

Denzitométerek: a filmen létrejött feketedések értékelése

Probléma: a feketedési értékek nem lineárisan változnak az aktivitással

Preflash– elıvilágítási technika

28

In vitro állatkísérletek: autoradiográfia

A szervekbıl készített szövettani metszetek jelölése a membránhoz kötıdı specifikus izotóppal jelölt ligandokkal:

Receptor-ligand kötıdés

Kompetíciós vizsgálatok

Specifikus – nem specifikus jelölıdések

29

100 nM 18FNECA 100 µM hideg FNECA

Coronális metszetek

18F NECA kötıdéseegéragyban

30

Radioluminescencia detektRadioluminescencia detektálásaálása� George Luckey 1975-ben fejlesztette ki- Gyors, regenerálható

detektálása a radioaktiv felhalmozódásnak az egyes metszetekben, gélekben, szeletekben stb.

� BaFBr:Eu 2+

Energia csapda

Kiolvasás lazer fénnyel

31

Az izotóppal jelölt biológiailag aktív molekulák szervezeten belüli felhalmozódásának, kiürülésének, kötıdésének

vizsgálata szervi megoszlásos ex vivo állatkísérletekben

- Állatok injektálása a radiofarmakonnal

-Expoziciós idı eltelte után az állatok leölése

-Szervek kipreparálása

Szervek tömege és a radioaktivitás mérése

Gamma számláló, folyadék szcintillációs berendezés

ID%= 1 g szervben mért aktivitás normálva a beadott aktivitásra és a teljes tömegre

32

Szerv 10perc 30perc 45perc 60perc

plazma 0,339±0,060 0,268±0,002 0,198±0,069 0,195±0,029

vérsejt 0,266±0,100 0,189±0,050 0,097±0,030 0,104±0,040

lép 0,390±0,050 0,684±0,177 0,250±0,140 0,638±0,192

agy 0,506±0,100 0,350±0,040 0,280±0,060 0,205±0,030

tüdı 0,778±0,131 0,641±0,080 0,518±0,190 0,494±0,075

szív 1,687±0,314 0,914±0,039 0,747±0,092 0,572±0,039

gyomor 1,450±0,087 1,873±0,849 0,223±0,047 0,243±0,070

vastagbél 0,359±0,204 0,386±0,147 0,307±0,132 0,372±0,051

vékonybél 1,593±0,417 6,907±1,877 3,336±0,131 7,390±2,511

vizelet 1,036±0,411 2,846±1,508 1,779±0,922 4,282±1,347

máj 2,611±0,450 2,959±0,520 2,665±0,519 2,105±0,547

2.táblázat: [11C]ISC szervekben, szövetekben történı akkumulációja, egér modellben

n= 3 (átlag±S.D.)

33

Kutatási szintek egy biológiailag aktív molekula (ligand, gyógyszer)

életében

Alap kutatás Betegség

kutatás

Gyógyszer

felfedezés

Preklinikai

vizsgálatok

Klinikai

trial I,

II, III

Gyártás

Nem szabályozott GLP GCP GMP

(Good clinical practice)

(Good manufacturing practice)

34

In vivo állatkísérletek PET kamerával

35

A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok

nuklid T1/2 E keV

alkalmazás

11C 20.4 perc

960 Gyors szintézisben a legtöbb szerves vegyületbe beépíthetı. Nincs gyógy-szertani különbség a jelzett és a jelzetlen molekula között. Az izotóp effektus elhanyagolható.

36

A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok

nuklid T1/2 E keV

alkalmazás

13N 10 perc

1190 Gyors szintézis szükséges. N-tartalmú vegyületek esetén a jelzett és jelzetlen vegyület biológiai szempontból azonos. Fı alkalmazása ammónium ionként történik, szívizom perfuzió vizsgálatában.

37

A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok

nuklid T1/2 E keV

alkalmazás

15O 2.05 perc

1720 Igen gyors szintézisszükséges. Alkalmazás oxigén gázként, vízként,széndioxidként és n-butanolként az agy és a szívizom vérellatásának vizsgálatában.

38

A legfontosabb pozitron-sugárzó radionuklidok

nuklid T1/2 E keV

alkalmazás

18F 110 perc

635 A legkisebb pozitron energiájú PET izotóp. Igen szép a képalkotás. A fiziológiai folyamatok kvantitatív értékelését is lehetıvé teszi. Sokféle molekulába beépíthetı.

39

Funkcionális vizsgálatok PET izotóppal jelölt biomolekulákkal

Metabolikus anyagforgalom nyomjelzıi:

18FDG, 11C-kolin, 11C-metionin,

Targetspecifikus biomolekulák:

jelzett receptor-ligandok

Perfúziós tracerek:

15O-butanol

13N-ammónia

99mTc-MIBI (SPECT)

40

szív

béltraktus

szív

béltraktus

vese

hólyagtüdı

2. ábra: A receptor ligand aktivitás eloszlása dinamikus PET vizsgálat alatt, nyúlban (szaggitális sikok, transzmissziós vizsgálatra helyezett emissziós képek).

41

MiniPET-2 kamera

DEOEC NMIATOMKIMEDISO KFT

közös fejlesztés

42

MiniPET-2 kamera

Tulajdonságai:

hálózat alapú adatgyőjtés

teljes győrős, 5 cm axiális látóterő kamera

szoftveresen mozgatható ágy

felbontás: ~1mm

kristálytípus: LYSO

kristályméret: 1.27 x 1.27 x 12 mm3

kristályszám: 35 x 35

detektorszám: 12

axiális látómezı : ~50mm43 44

45

Patkány agy CT-FDG

46

A radioaktivitás mértékegységei

• Aktivitás (bomlás/másodperc)• [Bq] Becquerel

•SI mértékegység, 1Bq 1bomlás /másodperc• [Ci] Curie

•1gram tiszta 226Ra aktivitása1Curie=3,7x1010Bq10mCi=400MBq1MBq= 27uCi37MBq=1mCi

47