Investigación en chaperonas para pku
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UE/EU-FEDER/ERDF
Investigación en chaperonas para PKUJavier Sancho
Dep. Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Universidad de ZaragozaInst. de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI). Universidad de Zaragoza
Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. Universidad de Zaragoza
VI Congreso Regional de Enfermedades Metabólicas Hereditarias de la Región de Murcia 18-20 septiembre 2015. La Manga (Murcia)
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Mutaciones desestabilizantes en la enzima FAH
908 mutaciones conocidas(a 5 de septiembre de 2015)
1:10000 recien nacidos
Introducción
4 SUBUNIDADES
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Proteínaantes de plegarse(NO FUNCIONA)
Introducción
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ProteínaBien plegada
(SI FUNCIONA)
Introducción
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ProteínaBien plegada
(SI FUNCIONA)mutaciones PKU
Introducción
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ProteínaBien plegada
(SI FUNCIONA)
= Chaperona farmacológica
Kuvan
Tafamidis
Fenilcetonuria
Amiloidosis TTR
Introducción
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Temperatura
% Proteína inactiva
Tm
100
50
0
Introducción
Las proteínas emiten luz que cambia de color cuando se inactivan por el calor
T´m
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Omeprazol
Aspirina
Ibuprofeno
N+ N
I-
N
O
OHO
N
NS
O
Cl
NN+
-O
OO
NH2
O
O
N+
N
NO
S
-O
O
O
O
N
N
O
HO
SN O
O
O
Cl
Cl
NNH
O
OCl
N
N S
SNH
102 millones de compuestos químicos (4 sep 2015)
Usamos QUIMIOTECAS:selecciones representativas
Kuvan
Introducción
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Aceite mineralFenilalanina hidroxilasa+ 1 compuesto (o varios)
30 40 50 60 700
1
2
3
4
Fluo
resc
enci
a
Temperatura (º C)B7 D4 E11 G8 H11
40
44
48
52
T m
Compuestos candidatos
Tm
35 40 45 50 55 600.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Seña
l nor
mal
izada
Temperatura (º C)
Cribado rápido mediante ensayos de estabilidad
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas
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Temperatura ( o C)
30 40 50 60 70
Frac
ción
des
pleg
ada
0.0
0.5
1.0
N
N
HN
O
N
NH2
IN
N +
N N
N
O -
OII
N
N
NH2
O
NO 2
III N
NH
S S
N
OIV
Descubrimiento de 4 compuestosque estabilizan la FAH silvestre
greenred
cyan blue
PAHalone
Pey et al. 2008.Identification of pharmacological chaperones as potential therapeutic agents to treat phenylketonuria.Journal of clinical investigation 118: 2858-2867.
Prof. A. Martínez(U Bergen)
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas
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III IV
Aumenta la cantidad de proteína
III IV
Aumenta la actividad enzimática
Efecto de los compuestos III y IV en células que expresan FAH
silvestre o con mutaciones PKU
PAH
act
ivity
(nm
ol/m
in.m
g)
0
1
2
3
DMSO III IV
*
*
A
PAH
pro
tein
fold
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
DMSO III IV
B* *
DMSO III IV
Efecto de los compuestos III y IV tras administración oral a ratones sanos
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas
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Estructura de la unión entre la FAH y la chaperona IV
Torreblanca et al. 2012Structural and mechanistic basis of the interaction between a pharmacological chaperone and human phenylalanine hydroxylase ChemBioChem 13:1266-1269
Dr. Ramón HurtadoUniv. Zaragoza
Trabajo previo Búsqueda inicial de nuevas chaperonas
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Objetivos:
Identificar y desarrollar nuevas chaperonas útiles para fenilcetonuria
Comparar su espectro de acción y su eficacia con los de Kuvan
FenilcetonuriaDiagnóstico y combate molecular de tres
enfermedades neurodegenerativas:
Parkinson, fenilcetonuria y amiloidosis TTR
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FenilcetonuriaAcciones
Diseño computacional de mejores chaperonas basadas en la chaperona IVJuan José Galano Frutos (Zaragoza)Dr. Rui Brito (Coimbra)
Síntesis química y ensayo in vitro de las nuevas chaperonas diseñadasMaría Galiana (Zaragoza)Míriam Alías (Zaragoza)MD Díaz de Villegas (Zaragoza)María Conde (Zaragoza)
Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas chaperonas
Sandra Salillas (Zaragoza)
Ensayos de toxicidad y eficacia encélulas humanas y en ratones sanos.Comparación con Kuvan María Conde
Dra. Marie-Lise Maddelein
Mejora racional de uno de los compuestos previamente encontrados (compuesto CIV)
N
NH
S S
N
OIV
Búsqueda de nuevas chaperonas ensayando quimiotecas mayores
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Cálculos “alquímicos” de energía de unión (AFEC)
ΔGbind(B)
ΔGbind(A)
ΔGA-BboundΔGA-B
unbound
ΔGbind(A) + ΔGA-Bbound - ΔGbind(B) - ΔGA-B
unbound = 0
ΔΔGB-A = ΔGA-Bbound - ΔGA-B
unbound
Juan José Galano
Diseño computacional de mejores chaperonas basadas en la chaperona IV
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Síntesis química y ensayo in vitro de las nuevas chaperonas diseñadas
María Galiana Dra. Míriam Alías Dra. MD Díazde Villegas
Cribado de una quimioteca
Estab. Térmica de FAH
Estruct. cristalinaenzima + chaperona
Estudio de la coordinaciónde chaperona y enzima
Modificación desustituyentes
IV
María Conde
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-4
-3
-2
-1
0
1
-8 -6 -4 -2 0 2
y = -0,18+ 0,52x R= 0,902au
men
to d
e en
ergí
a de
uni
ón M
ED
IDO
(kJ/
mol
)
aumento de energía de unión CALCULADO(kJ/mol)
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Nuevas posibles chaperonas más potentes
20 30 40 50 60 70 80-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Unfol
ded f
ractio
n
Temperature (؛C)
VP1 VP2 VP3 VP4 VP5 VP6 VP7 VP8 VP9 VP10 VP11 VP12 VP13 Control
Sandra Salillas
Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas potenciales chaperonas
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Comparación con Kuvan
20 30 40 50 60 70 80-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Unf
olde
d fra
ctio
n
Temperature (ºC)
Control VP13 Kuvan
Sandra Salillas
Cribado experimental de nuevas quimiotecas de mayor tamaño para descubrir nuevas potenciales chaperonas
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Compuestos que estabilizan a la enzima activa
¿tienen efecto estos compuestos en la estabilidad y plegamiento de distintos mutantes de la proteína?
I65TPKU
moderada
Y414CPKU leve
R241HPKU leve
V245LPKU clásica
E280KPKU clásica
V388MPKU moderada
A395PPKU clásica
R408QPKU leve
mutaciones que responden a Kuvanmutaciones que no responden a Kuvan
María Conde
Ensayos de toxicidad y eficacia en células transfectadas y en ratones sanos.Comparación con Kuvan
Dra M-L Maddelein(Francia)
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Compuestos que estabilizan a la enzima activa
¿tienen efecto estos compuestos en la estabilidad y plegamiento de distintos mutantes de la proteína?
¿son compuestos tóxicos en células humanas?
¿tienen efecto estos compuestos en células humanas?
¿tienen efecto estos compuestos en modelos animales de la enfermedad?
Ensayos de toxicidad y eficacia en células transfectadas y en ratones sanos.Comparación con Kuvan
María Conde
Dra M-L Maddelein(Francia)
![Page 22: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/22.jpg)
Ensayos de toxicidad y eficacia en células transfectadas y en ratones sanos.Comparación con Kuvan
María Conde
Dra M-L Maddelein(Francia)
![Page 23: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/23.jpg)
Mutaciones a
Mutaciones b
Mutaciones c
~ 900 mutaciones conocidas en la proteína FAH
Dietas bajas en Phe/ tratamiento con Kuvan
Chaperonas farmacológicas
Otras terapias
Cribado de alto
rendimiento
Validación in vitro de los compuestos
prometedores
Ensayos de toxicidad y efectividad in vivo con
células humanas
Ensayos in vivo con modelos de la enfermedad
Potencial chaperona
farmacológica
Perspectiva
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Otras enfermedades metabólicasMSUD como ejemplo
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El complejo de la deshidrogenasa de alfacetoácidos de cadena ramificada (BCKD)
![Page 26: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/26.jpg)
El complejo de la deshidrogenasa de alfacetoácidos de cadena ramificada (BCKD)
Es una enzima compleja formada con participación de 4 genes ( , , , )
![Page 27: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/27.jpg)
El complejo de la deshidrogenasa de alfacetoácidos de cadena ramificada (BCKD)
Es una enzima compleja formada con participación de 4 genes ( , , , )
E1
descarboxilasa
E2
transacilasaE3
deshidrogenasa
E2 /12 E1 /6 E3
EN TOTAL 84 SUBUNIDADES
Distintas mutaciones en cualquiera de esos cuatro genes reducen o eliminan la función de la enzima y hacen que se acumulen sustancias tóxicas que causan la enfermedad del jarabe de arce
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GEN proteína Variantes en OMIM
Descritas como
patológicas
PotencialmenteRecuperables con
chaperonas%
Enfermedad del jarabe de arce
BCKDHA Sub. α de la descarboxilasa (E1)
76 31 16 50 %
BCKDHB Sub. β de la descarboxilasa (E1)
81 35 17 50 %
DBT Sub. de la transacilasa (E2)
67 27 7 25 %
DLD Sub. de la deshidrogenasa (E3)
47 12 10 90 %
271 105 50 48 %
Fenilcetonuria
PAH Subunidad única 615 120 72 60 %
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Enfermedad Enzima defectuosa
Ubicación
PKU Mássencilla
citoplasma
Jarabe de arce
Máscompleja
mitocondrias
![Page 30: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/30.jpg)
Enfermedad Enzima defectuosa
Ubicación Terapia dereemp.
enzimático
PKU Mássencilla
citoplasma Más fácil
Jarabe de arce
Máscompleja
mitocondrias
Difícil
![Page 31: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/31.jpg)
Enfermedad Enzima defectuosa
Ubicación Terapia dereemp.
enzimático
Chaperonas farmacológicas
Hay cofactores?
PKU Mássencilla
citoplasma Más fácil Sí: BH4 (Kuvan)
Jarabe de arce
Máscompleja
mitocondrias
Difícil Sí:E1: TPPE2: Acido Lipoico, Co AE3: FAD, NAD
![Page 32: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/32.jpg)
Enfermedad Enzima defectuosa
Ubicación Terapia dereemp.
enzimático
Chaperonas farmacológicas
Hay cofactores?
Son posibles otras
chaperonas?
PKU Mássencilla
citoplasma Más fácil Sí: BH4 (Kuvan)
Sí
Jarabe de arce
Máscompleja
mitocondrias
Difícil Sí:E1: TPPE2: Acido Lipoico, Co AE3: FAD, NAD
Sí
![Page 33: Investigación en chaperonas para pku](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022081415/58f08fa11a28ab91428b4699/html5/thumbnails/33.jpg)
Enfermedad Enzima defectuosa
Ubicación Terapia dereemp.
enzimático
Chaperonas farmacológicas
Hay cofactores?
Son posibles otras
chaperonas?
Harán falta
varias?
PKU Mássencilla
citoplasma Más fácil Sí: BH4 (Kuvan)
Sí Menos probable
Jarabe de arce
Máscompleja
mitocondrias
Difícil Sí:E1: TPPE2: Acido Lipoico, Co AE3: FAD, NAD
Sí Masprobable
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