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Investigación de Librería de fósmidos para identificación de genes asociados a la

producción de bioplásticos

Valeria Reales, Ana López, Johana Husserl*

Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de los Andes Colombia, Bogotá D.C, Colombia.2014

*jhusserl@uniandes.edu.co

RESUMEN

Con el paso de los años, la disposición de los plásticos derivados del petróleo se ha convertido en

una problemática para el medio ambiente debido a su resistencia a la degradación y complicada

disposición final. Los bioplásticos aparecen entonces como un sustituto que, además de poder

desempeñar las mismas funciones que los plásticos derivados del petróleo, es fácilmente

biodegradable. La versatilidad de los bioplásticos generados por microorganismos, su manufactura

a partir de recursos 100% renovables, y sus altos costos de producción, son factores que han

desencadenado la búsqueda de estrategias para optimizar la producción de estos biopolímeros. Es

por esto último que la presente investigación buscó encontrar, mediante una librería de fósmidos

con clones de Escherichia coli, genes provenientes de bacterias de agua del río Bogotá (un

ecosistema con una inmensa diversidad microbiológica) que confieran a un microorganismo la

capacidad de producir bioplásticos. Los clones de la librería se sembraron y crecieron en medio de

cultivo LB (ideal para E. coli recombinante) con ácido butírico a concentración 10 mM con el fin de

obtener evidencia de generación de PHB. Se obtuvo al final de la investigación que 2 de 1500

clones estudiados podrían estar acumulando PHB en su membrana celular.

Palabras Clave: Librería de fósmidos, Escherichia coli, polihidroxialcanoatos, PHB,

fuente de carbono, río Bogotá.

ABSTRACT

Over the years, disposition of petroleum-derived plastics has become an environmental issue

because of its resistance to degradation and their complex final disposition. Bioplastics appear as a

substitute which, besides of being able to perform the same functions of petroleum-derived plastics,

is easily degradable. Versatility of bioplastics produced by microorganisms, its manufacture from

100% renewable resources and their high production costs, are then the main factors that have

triggered the search of strategies for optimization of the production of these biopolymers. The latter

is the reason why this research sought to find, by a fosmid library composed by clones of

Escherichia coli, genes from bacteria from the Bogotá river (ecosystem with a huge microbial

diversity) conferring microorganisms the ability to produce bioplastics. Library clones were plated

and grown in LB medium (ideal for recombinant E. coli) with a concentration of 10 mM of butyric

acid in order to obtain evidence of PHB generation. At the end of the research, we obtained 2 (out

of 1500 clones) that could be able to accumulate bioplastics within the cell membrane.

Keywords: Fosmid library, Escherichia coli, polyhydroxyalkanoates, PHB, carbon source,

Bogota river.

2

INTRODUCCIÓN

Problemática del uso de plásticos

Los plásticos son materiales derivados del

petróleo con propiedades físicas que los

hacen bastante versátiles y útiles. Su uso

en la industria se ha extendido

ampliamente debido a sus propiedades

como durabilidad y resistencia a la

degradación (1). Adicional a lo anterior,

su resistencia a la corrosión, poco peso y

procesamiento a baja temperatura

generalmente implican ahorro energético

(2). Debido en parte a que han

reemplazado a materiales como vidrio y

papel en la manufactura de empaques y, a

que son empleados esencialmente en la

mayoría de las industrias, su consumo

anual ha aumentado de 5 millones de

toneladas en 1950 a 200 millones de

toneladas hacia el año 2013 (1).

A pesar de lo anterior, son precisamente

su durabilidad y resistencia a la

degradación las características que han

generado que el uso de plásticos

derivados del petróleo sea una

problemática en términos

medioambientales. Se estima que los

desechos generados por su uso extensivo

se acumulan en el ambiente a una rata de

aproximadamente 25 millones de

toneladas al año. Una parte de estos

desechos es dispuesta en rellenos

sanitarios y la porción restante es arrojada

a ambientes marinos (1), dichas

alternativas tienen una serie de efectos

negativos asociados a ellas como lo son:

requerimiento de espacios (bastante

grandes) para su disposición,

contaminación visual, muerte de animales

que ingieran estos desechos

accidentalmente (1), etc.

En los últimos años se han probado

algunos métodos para controlar la

problemática de la acumulación de

plásticos, sin embargo ninguna ha sido

100% efectiva. Por un lado, la

incineración de estos materiales, además

de ser bastante costosa, es peligrosa en

tanto que químicos potencialmente

nocivos para la salud humana, como

ácido cianhídrico y cloruro de hidrógeno,

se liberan durante el proceso (3). Por otro

lado, en el caso del reciclaje, la presencia

de bastantes aditivos como pigmentos y

cubiertas limita el proceso, además de ser

complicado y consumir bastante tiempo

(1).

Teniendo en cuenta todo lo mencionado

anteriormente y el aumento del precio del

petróleo, que además es un recurso no

renovable (4), la sustitución de plásticos

no biodegradables por plásticos

degradables es un asunto de gran interés

para tomadores de decisiones y la

industria del plástico (3). Es importante

adicionar a esto último que se han

desarrollado nuevas técnicas de biología

molecular y que, en países desarrollados,

se ha generado un impuesto por usar

materiales no degradables derivados del

petróleo (4).

Alternativa amigable con el ambiente

Los bioplásticos son materiales

biodegradables con propiedades físicas

similares a las de plásticos obtenidos del

petróleo (1). Es importante aclarar que el

término bioplástico hace referencia a un

3

plástico producido a partir de una fuente

biológica; por otro lado, el término

biodegradable se refiere a un material que

puede ser degradado por microbios, de

forma relativamente rápida, en un

ambiente bio-activo bajo las condiciones

adecuadas (5). Por lo tanto, teóricamente,

todos los plásticos son biodegradables;

sin embargo, la mayoría de estos

materiales son degradados a tasas tan

bajas que se consideran no

biodegradables (5).

En el caso de los biopolímeros, entre las

ventajas que implica su uso se tiene que:

Siendo biomateriales, los

bioplásticos pueden ser asimilados

por varias especies

(biodegradabilidad) y no causan

efectos negativos en el huésped

(biocompatibilidad) lo que les

confiere una ventaja considerable

con respecto a otros productos

sintéticos (6).

Su estabilidad térmica y

viscosidad permiten el uso de

máquinas y tecnologías

convencionales sin mayores

adaptaciones (7).

El uso de polímeros

biodegradables protege el suelo y

asegura que la aplicación de

residuos biológicos químicamente

tratados aumente el nivel de

carbono en el suelo (7).

Los biopolímeros pueden ser obtenidos

mediante sistemas biológicos

(microorganismos, plantas y animales) o

sintetizados químicamente a partir de

materiales biológicos (azúcares, almidón,

grasas naturales o aceites, etc.) (7). El

enfoque de la presente investigación es

hacia la síntesis mediante sistemas

biológicos. En este tipo de sistemas, los

polímeros obtenidos (poliésteres y

polisacáridos neutros) son el resultado de

un proceso de fermentación que tiene

lugar cuando los microorganismos tienen

acceso a una fuente de carbono; dichos

polímeros son fácilmente biodegradables

y producidos a partir de recursos

renovables (7).

Más específicamente, los poliésteres, que

son monómeros de cadena simple de

carbono (7), son los polímeros

biodegradables más destacados dado que

su manufactura puede efectuarse

empleando un 100% de recursos

renovables y, ofrecen la posibilidad de

generar materiales con varias propiedades

y un mayor espectro de aplicación que el

polilactato PLA (obtenido químicamente)

(4). Como consecuencia de lo anterior,

polímeros como los polihidroxialcanoatos

PHA son más costosos y deseados (4),

razón por la cual se buscan métodos para

optimizar su producción. En general, los

PHAs son poliésteres constituidos

principalmente por unidades repetidas de

(R)-3-hidroxiácidos, lineales en su

mayoría; en su formación el grupo

carboxilo forma un enlace éster con el

grupo hidroxilo del monómero siguiente

(8) como se puede ver a continuación:

4

Figura 1. Síntesis típica de polihidroxialcanoatos. Tomado de (8).

En la actualidad se conocen algunos

microorganismos con la capacidad de

generar PHAs. Estos polímeros, además

de ser fuentes de energía para el proceso

de enquistamiento, de esporulación y para

la protección del complejo nitrogenasa en

las bacterias fijadoras de nitrógeno;

forman parte de la membrana

citoplasmática de algunas de las bacterias

(8). De hecho, el polihidroxibutirato

PHB, es un poliéster de reserva de

energía acumulado de forma natural por

algunos microorganismos como Ralstonia

eutropha (9), Azotobacter chroococcum

(10) y Bacillus mycoides (11) entre otros.

El PHB es el tipo de PHA más común y

tiene propiedades similares a las del

polipropileno, sin embargo los costos

asociados a su generación son bastante

altos en comparación con los de otros

polímeros derivados del petróleo (7), por

lo que es ideal encontrar alternativas más

costo-eficientes para la generación de

polímeros biodegradables. Una posible

alternativa es la modificación genética de

microorganismos que crezcan con mayor

facilidad en condiciones fácilmente

replicables, como Escherichia coli; con

genes que les permitan generar

biopolímeros. Esta última es la razón por

la cual se realizó la presente investigación

de una librería de fósmidos.

Librería de fósmidos con genes

extraídos de bacterias de una muestra

de agua del Río Bogotá

Una genoteca, o en este caso una librería

de fósmidos, es una colección de clones,

en la que cada clon contiene un vector al

que se insertó un fragmento de ADN.

Dicho ADN, es diferente del proveniente

del ADN o el ARN original de la célula o

tejido (12). En esta investigación, se

estudió la primera mitad de una librería

compuesta por aproximadamente 3000

clones de Escherichia coli (un

microorganismo abundante y con

condiciones óptimas de crecimiento

fáciles de replicar), a los que se insertaron

vectores que contenían fragmentos de

ADN de bacterias contenidas en una

muestra de agua del Río Bogotá. Lo

5

anterior, con el objetivo de determinar si

dicha librería contenía genes que provean

capacidad de generar

polihidroxialcanoatos y, en caso de

obtener resultados positivos, identificar

estos genes.

La muestra de ADN fue tomada del Río

Bogotá debido a que es un cuerpo hídrico

al que los aportes de aguas residuales no

tratadas de la ciudad de Bogotá D.C,

desde su nacimiento hasta su

desembocadura, generan niveles

crecientes de contaminación biológica,

química y física (13). En términos de

contaminación biológica:

El río presenta concentraciones

que alcanzan 143 miligramos por

litro de DBO (Demanda

Biológica de Oxígeno,

relacionada con la cantidad de

oxígeno consumida por

microorganismos) y picos de

hasta 79 millones de coliformes

en NMP/100 mL (Número más

probable sobre 100 mililitros);

este último relacionado con

contaminación con materia fecal

(Escherichia coli) (13).

Se han encontrado contenidos de

2.2 millones de coliformes y 7.4

millones de microorganismos

totales (NMP/100 mL) en leche

producida por vacas alimentadas

con pastos que fueron regados

con aguas del río Bogotá (13).

Todo lo anterior da cuenta de la vasta

diversidad microbiana que es posible

encontrar en dicho cuerpo hídrico. Es

entonces que surge el interés por realizar

la presente investigación, dado que el río

podría constituir una fuente renovable de

recursos para la generación de polímeros

biodegradables en caso de encontrar

genes en la librería que permitan a un

microorganismo generar bioplásticos.

ANTECEDENTES

Generación microbiana de PHB por

Ralstonia eutropha

R. eutropha es una bacteria Gram

negativa, quimiolitoautótrofa facultativa

que ha sido bastante estudiada durante los

últimos 50 años; de hecho, es la bacteria

generadora de PHB más estudiada (14).

Este bacilo es conocido por su capacidad

de acumular este polímero hasta más del

80% de su peso seco (15) con glucosa

como fuente de carbono y, por haber sido

reclasificado varias veces a lo largo de la

historia (16).

Sobre la vía clásica de síntesis de PHB se

sabe que están implicadas tres enzimas

codificadas por el operón phaABC. Dicha

vía está compuesta por tres reacciones

(17) y se encuentra resumido en la figura

2:

En la primera reacción, dos

moléculas de acetil coenzima A

(acetil-CoA) se condensan y

forman acetoacetil-CoA. “Esta

reacción es catalizada por la β-

cetoacil-CoA tiolasa que es

codificada por el gen phaA”.

Posteriormente, ocurre la reacción

de reducción de acetoacetil-CoA a

(R)-3-hidroxobutiril-CoA por una

acetoacetil-CoA deshidrogenasa

6

NADPH-dependiente, que es

codificada por el gen phaB.

Finalmente, se polimerizan los

monómeros de (R)-3-

hidroxobutiril-CoA en PHB por la

PHB polimerasa, codificada por el

gen phaC.

Figura 2. Biosíntesis de PHB. Tomado y modificado de (8).

Adicional a lo anterior, se conoce que el

proceso de generación de bioplásticos en

R. eutropha es favorecido bajo limitación

de nutrientes esenciales como nitrógeno,

fosfato u oxígeno (16); sin embargo, la

baja productividad del proceso de

fermentación es una de las principales

razones por las cuales los costos de

producción de biopolímeros son bastante

altos (18).

Generación microbiana de PHAs por

Escherichia coli

E. coli es una bacteria gram negativa (19)

conocida como indicador de

contaminación fecal (20), que no tiene la

capacidad de generar biopolímeros por si

sola. Sin embargo, se ha descubierto que

cepas de E. coli recombinantes acumulan

grandes cantidades de PHB mediante la

introducción de genes de biosíntesis de

PHA de R. eutropha. Esto ha

desencadenado el estudio intensivo de E.

coli recombinante para biosíntesis de

PHAs en los últimos años (21).

Existen rutas metabólicas innatas de E.

coli, implicadas en el metabolismo de

azúcares y ácidos grasos, que han sido

diseñadas metabólicamente para

sintetizar monómeros de PHA

eficientemente (21). Se ha probado que

las cepas de E. coli recombinante son las

más adecuadas para la biosíntesis de

PHAs como P(3HB) (21).

MÉTODOS Y MATERIALES

Obtención librería

7

Para la obtención de la librería de

fósmidos, se empleó un CopyControlTM

Fosmid Library Production Kit producido

por Epicentre®. En general se siguió el

protocolo indicado por el kit, dicho

protocolo contiene los siguientes pasos

(22)(Figuras 3, 4 y 5):

1. Purificar el ADN de la fuente

deseada, en este caso los

microorganismos contenidos en la

muestra de agua del río Bogotá.

2. Romper el ADN en fragmentos de

aproximadamente 40-kb.

3. Reparar las terminaciones de los

fragmentos rotos mediante la

adición de terminaciones 5’-

fosforiladas.

4. Aislar los fragmentos del tamaño

deseado de ADN reparado

mediante electroforesis en gel

agarosa LMP.

5. Purificar el ADN con

terminaciones rotas del gel

agarosa LMP.

6. Ligar el fragmento de ADN al

vector contenido en el kit.

7. Empacar e insertar el fragmento

de ADN ligado al vector en la

cepa EPI300-T1. Crecer los clones

durante la noche.

8. Tomar los clones de interés e

inducir sobreexpresión empleando

la solución autoinductora

contenida en el kit.

Figura 3. Pasos 1, 2 y 3 del procedimiento para

obtener la librería. Tomado de (22).

Figura 4. Pasos 4, 5 y 6 del procedimiento para

obtener la librería. Tomado de (22).

Figura 5. Pasos 7 y 8 del procedimiento para obtener

la librería. Tomado de (22).

Crecimiento de los clones

Los clones de E. coli fueron sembrados

en medio de cultivo LB (Luria Bertani),

medio empleado para el crecimiento

óptimo y mantenimiento de E. coli

recombinante (23). Una vez sembrados,

se incubaron a 37°C durante 24 y

posteriormente almacenados a 7°C hasta

el momento de las tinciones. El medio de

cultivo contenía solución autoinductora,

8

como está indicado en el kit de la librería

(22), y una concentración 10 mM de

ácido butírico, este último debido a que es

uno de los productos intermedios del

proceso metabólico mediante el cual se

genera el PHB (remitirse a Figura 1) y,

asegurar la disponibilidad de materia

prima para la generación del biopolímero.

Para la obtención de un litro de medio de

cultivo, se emplearon 10 gramos de

Triptona, 5 gramos de extracto de

levadura, 10 gramos de sal, 30 gramos de

agar bacteriológico y 100 mililitros de

solución de ácido butírico 1M con pH

neutro. El medio se esterilizó en

autoclave a 121°C durante 40 minutos.

Para identificar las colonias, en la

superficie exterior de cada una de las

cajas de Petri se adhirió una cuadrícula en

acrílico adhesivo de 10x10. La cuadrícula

fue rotulada con las letras A, B, C, D, E,

F, G, H, I y J en el borde superior y los

números del 1 al 10 en el borde izquierdo.

Adicional a la cuadrícula, a cada caja con

100 colonias se asignó un número, de

forma que para referirse a las diferentes

colonias se empleaba: Número de caja-

Fila (número)-Columna (letra). La

distribución de las colonias en cada caja

de Petri de acuerdo con lo anterior se

puede ver en la siguiente figura:

Figura 6. Distribución e identificación de colonias.

Identificación de genes asociados a la

producción de bioplásticos

Diferenciación por microscopía

En primera instancia, para el proceso de

identificación de los genes que pueden

conferir la capacidad de generar los

biopolímeros, fue necesario establecer

una metodología para la identificación de

clones capaces de producir PHAs. Para el

desarrollo de la metodología, se utilizaron

R. eutropha como control positivo y E.

coli EPI300 como control negativo. Se

realizaron tinciones de Gram y negro

Sudan con el objetivo de identificar su

morfología (Gram) y el patrón de

generación de biopolímeros (Negro

Sudan), además de confirmar la eficacia

de los tintes. Para ambos procesos de

tinción el primer paso fue extender el

microorganismo, esto se efectuó tomando

un poco de una colonia del mismo y

distribuyéndolo en una gota de agua que

se encontraba dispuesta en una lámina o

portaobjetos de vidrio previamente

esterilizado. Una vez se distribuyó de

forma uniforme el microorganismo en el

agua destilada, se procedió a secar la

lámina sobre el fuego de un mechero en la

cámara de extracción.

Tinción de Gram (24)

El proceso de tinción de Gram constó de

cuatro pasos:

Con el microorganismo fijado

sobre la lámina, se procedió a

aplicar un tinte llamado cristal

violeta, este estuvo en contacto

con el microorganismo durante 60

9

segundos y posteriormente se

enjuagó la lámina con agua

desionizada.

Posterior al cristal violeta se

aplicó lugol, se dejó actuar

durante 60 segundos y se enjuagó

la lámina nuevamente.

Se procedió entonces a aplicar

alcohol acetona que se mantuvo

en contacto con el

microorganismo durante 30

segundos y fue enjuagado.

Finalmente se cubrió el

microorganismo con fucsina por

15 segundos y se enjuagó

nuevamente la lámina.

Tinción con Negro Sudan (25)

Para la obtención del tinte negro Sudán,

se preparó en el laboratorio una solución

con 0,4 miligramos de Sudan Black B en

polvo, en 100 mililitros de etanol. Dicha

solución se calentó a 100°C durante

algunos minutos mezclando

constantemente y se dejó enfriar a

temperatura ambiente. Posteriormente, se

agitó la solución durante 6 a 8 horas con

una perla y plancha de agitación y se pasó

por un filtro de 20 micrómetros.

El proceso de tinción con Negro Sudan

constó de dos pasos:

Se cubrió totalmente el

microorganismo fijado con varias

gotas del tinte negro Sudán

durante 15 minutos y pasado este

tiempo se escurrió el exceso de

tinte de la lámina.

Una vez escurrido el negro Sudán

se cubrió el microorganismo con

safranina durante 30 segundos y

se enjuagó la lámina con agua

desionizada.

Identificación de positivos y negativos

Los 1500 clones cultivados pasaron por

un ensayo de microscopía, en el cual se

esperaba encontrar colonias de

microorganismos que, tras el proceso de

tinción con negro Sudán, presentaran

indicios de generación de PHB que

concordaran con los patrones observados

previamente en E. coli recombinante.

Para agilizar el proceso de tinción, se

tiñeron 50 colonias diferentes en cada

ensayo. Para esto, se fijaron 5 colonias

por lámina, en dicho paso se procuró

distribuir las gotas alternando su

disposición hacia derecha e izquierda de

la lámina dispuesta verticalmente, con el

fin de evitar que se mezclaran las

diferentes colonias. Esto último se repitió

para 10 láminas en cada ensayo.

RESULTADOS

Librería de fósmidos

Se obtuvieron 3000 clones de E. coli

recombinante de los cuales se sembraron

y crecieron exitosamente 1500. En

términos generales, en los diferentes

ensayos de microscopía se pudo observar

que la morfología de los clones

corresponde a la de un bacilo (26), como

se puede ver en la figura 7:

10

Figura 7. Colonia de E. coli recombinante proveniente de la librería.

Identificación de genes asociados a la

producción de bioplásticos

Entre las 1500 colonias el patrón general

fue un tono rosado-rojizo al interior de las

bacterias y un tono oscuro delineando las

mismas. Sin embargo, en dos de las

colonias se pudo apreciar un tono oscuro

en la superficie de los individuos, dicha

coloración podría atribuirse a

acumulación de PHB en la membrana

citoplasmática:

Figura 8. Colonia 1.3-1-A

Figura 9. Colonia 1.6-8-H

Para disminuir la incertidumbre generada

por un posible error de tipo aleatorio en el

procedimiento, se efectuaron 3 ensayos

diferentes de la tinción con negro Sudán

en estas dos colonias y obtuvo el mismo

patrón al observar en el microscopio.

CONCLUSIONES Y

RECOMENDACIONES

Con los resultados obtenidos se concluye

que entre los 1500 clones de Escherichia

coli recombinante estudiados en la

presente investigación, únicamente dos

de los genes insertados mediante vectores

11

estarían asociados con la producción de

bioplásticos. Se llegó a dicha conclusión

dado que se pudo evidenciar un tono más

oscuro en la superficie de los individuos

de dichas colonias, lo anterior se tomó

como un indicador de presencia de PHB

que, como se mencionó en la introducción

de esta investigación, pueden formar parte

de la membrana citoplasmática de los

microorganismos. Es importante resaltar

que es de vital importancia estudiar los

clones correspondientes a la otra mitad de

la librería. Adicionalmente, se debe hacer

una cuantificación y una caracterización

del polímero producido por los dos clones

positivos.

Para terminar, se recomienda que para la

obtención del tinte negro Sudán, la

agitación se prolongue por al menos 12

horas y se proceda a filtrar

inmediatamente para evitar grumos en la

solución y/o la volatilización del etanol.

Adicional a esto, para efectos de

optimización del tiempo, es recomendable

teñir un total de 100 colonias, es decir una

caja completa, por ensayo de

microscopía.

AGRADECIMIENTOS

A Johana Husserl Orjuela agradezco

principalmente el haber depositado su

confianza en mí y, el haberme permitido

participar de este proyecto que me ayudó

a descubrir el área del conocimiento en

que quiero especializarme al terminar mis

estudios de pregrado. De igual forma le

agradezco poner su tiempo a disposición

de todos los estudiantes que en algún

momento necesitamos de su ayuda para

avanzar en nuestro proceso investigativo

y por ayudarme a descubrir varias de mis

capacidades que hasta el momento

desconocía.

A Ana María López Tamayo agradezco

su buena disposición para resolver todas

las dudas que surgieron durante la

investigación, por posponer sus propios

compromisos para ayudar a quienes lo

necesitamos y por encima de todo su

apoyo y colaboración para avanzar

durante las diferentes etapas de la

investigación.

No existen palabras suficientes para

agradecer a Sebastián Tirado Díaz y

María Claudia Pacheco por su apoyo y

ayuda incondicional, por sacrificar su

tiempo y compromisos para

acompañarme y asistirme durante los

ensayos de tinción y microscopía en el

laboratorio, por cada uno de los

momentos en que evitaron que perdiera la

fe y me motivaron a buscar la forma de

continuar con la investigación.

Finalmente, quiero agradecer a todos los

técnicos y personal del laboratorio, no

existe forma algún en que, sin su asesoría,

asistencia y ayuda, se lograra culminar

este proyecto investigativo.

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