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INSTITUTO DOMINICANO DE
INVESTIGACIONES AGROPECUARIAS Y
FORESTALES
7mo Congreso de la Sociedad Dominicana de
Investigadores Agropecuarios y Forestales (SODIAF)
PROYECTO
CONIAF-UASD
Bávaro, Punta Cana,
República Dominicana.
10 de noviembre de 2016
“Efectividad in vitro de 18 cepas nativas de Trichoderma spp.
en el manejo de Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Athelia
rolfsii y Phytophthora capsici, patógenos de suelos bajo
ambiente protegido
Socorro García, Graciela Godoy Lutz, Colmar A. Serra
INTRODUCCIÓN
El cultivo de ají (Capsicum annuum L.) en invernaderos de la
R. D., es afectado por fitopatógenos de suelos, entre los
cuales están:
• Fusarium spp.,
• Rhizoctonia solani,
• Phytophthora capsici y
• Athelia rolfsii.
El uso continuo de fungicidas químico-sintéticos
• Aumento aparición resistencias, • Contaminación ambiental
• Incremento en el costo de producción
• Disminución rentabilidad y
• Presencia residuos en cosechas
(García et al, 2006).
INTRODUCCIÓN
La utilización del manejo biológico con el hongo Trichoderma
es una de las herramientas mas promovidas para el control de
los fitopatógenos de suelos (Cholango 2009).
Cepas de Trichoderma spp. suprimieron significativamente en
platos de Petri el crecimiento micelial de Fusarium solani,
Phytophthora spp., Pythium spp., Rhizoctonia spp., y Athelia
rolfsii (Moya et al 2003) .
INTRODUCCIÓN
En invernadero de San José de Ocoa, Hubert (2008) reportó la
presencia en agua de riego y sustratos utilizados, los hongos:
• Fusarium (100%),
• Phythophthora (50%) y
• Rhizoctonia (41.5%)
En República Dominicana existen aprox. 520 hectáreas de
vegetales en invernadero, dedicadas principalmente:
• Ajíes (70%),
• Tomates (10%),
• Pepinos (15%),
• Hierbas aromáticas (5%), (PROMEFRIN, 2011).
En el año 2014 la producción estimada de los invernaderos fue
de 31.77 mil toneladas, 21.27 mil se exportaron y generaron
US$ 52.8 millones; el resto se comercializó internamente y
generó RD$ 449.0 millones (PROMEFRIN, 2014).
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
El uso de Trichoderma spp. para el manejo de estos
fitopatógenos, evita rechazo de exportaciones por
contaminación con residuos de plaguicidas. También se
podrían reducir los costos de producción (García et al. 2006).
El empleo de cepas nativas de Trichoderma spp. tiende a ser
mas ventajoso que las introducidas:
• Establecimiento de microempresas nacionales,
• Ahorrarían divisas, obtención de alimentos inocuos,
• Adaptadas al agroecosistema local.
OBJETIVO
Determinar el efecto antagonista in vitro de 18 cepas nativas y
2 comerciales de Trichoderma spp. comparado con fungicidas
comerciales uno orgánico y otro químico-sintético, sobre
fitopatógenos de suelos.
MATERIALES Y MÉTODOS
• Localización del estudio:
Estación Experimental del Instituto
Dominicano de Investigaciones
Agropecuarias y Forestales (IDIAF)
en Mata Larga, San Francisco de
Macorís, República Dominicana.
Altitud 150 msnm
Pluviometria
anual
1,450 mm
Temperatura
promedio
26.2 ˚C
LABORATORIO DE PROTECCIÓN VEGETAL
• Microorganismos antagónicos:
18 cepas nativas y 2 comerciales (introducidas) de Trichoderma.
Las nativas proceden de aislamientos en suelos, sustratos y raíces en
invernaderos de las provincias: La Vega, San José de Ocoa y Espaillat.
Fueron identificadas por secuenciación de la región ITS rADN.
Obtenidas bajo el proyecto, "Determinación de Alternativas Biológicas para
el Control de Patógenos de Suelos en la Producción de Vegetales en
Invernadero“.
MATERIALES Y MÉTODOS
a b c
d e f
MATERIALES Y MÉTODOS
Fig. 1. a)T.asperellum-1A; b) Tx-1D (no identificada); c)T. asperellum-2F; d)T. asperellum-6B; e) T. asperellum-
7A; f) T. asperellum-10A;
g h i
j k l
MATERIALES Y MÉTODOS
Fig. 2. g) T. asperellum-11A; h) T. longibrachiatum-12A; i) T. harzianum-13A; j) T. harzianum-16B; k) T.
harzianum-19B, l) T. asperellum-22C;
Fig. 3. m) T. asperellum-25B; n) T. asperellum-27A; o) T. asperellum-28A; p) T. asperellum-31C; q)
T.asperellum-36A; r) T. asperellum-37B.
m n o
p q r
MATERIALES Y MÉTODOS
• Material biológico comercial:
Fig. 4. T. lignorum (Mycobac ® ) Fig. 5.T. harzianum (PHC PlantShield ® )
MATERIALES Y MÉTODOS
Tabla 1. Fitopatógenos utilizados en los ensayos
Especie Código del ensayo Lugar de procedencia
Fusarium solani Fs Hermanas Mirabal
Rhizoctonia solani Rs Hermanas Mirabal
Athelia rolfsii Ar Hermanas Mirabal
Phytophthora capsici Pc Espaillat
MATERIALES Y MÉTODOS
Fig. 6. a) F. solani; b) R. solani; c) P. capsici; d) A. rolfsii
a b
c d
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
• Fungicidas:
Aceites orgánicos (Biomaster®), a base de varios aceites de plantas:
• aceite de clavo (6 %),
• aceite de sésamo (5 %),
• aceite de romero (3 %)
• aceite de tomillo (3 %),
• total aceites de tipo 25B (17 %).
Un fungicida químico sintético:
• (i.a. azoxystrobin o azoxistrobina);
• nombre comercial Criba 25 SC® (Mahomoya Lifesciences Pvt.. Ud., India).
MATERIALES Y MÉTODOS
• Medio de cultivo
Papa Dextrosa Agar (PDA)
-Antibiótico (Amoxicilina) 2 ml/litro
-Acido láctico (85%): 30 gotas/litro
Plato Petri: 86 mm de diámetro con 10 ml de PDA
Cultivo: Discos de micelios de 5 mm de diámetro
Incubación: 25-30°C. en la oscuridad
MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 7 Cultivo dual
A. rolfsii T. asperellum-10A
• Tratamientos:
Tabla 2. Descripción de los tratamientos en laboratorio (40 tratamientos)
n Tratamientos Descripción
4 Testigos relativos de patógenos Cada patógeno cultivado frente a un disco PDA
solo.
20 Trichoderma vs. patógenos Cada cepa de Trichoderma spp. enfrentada con
cada patógeno.
8
Aceites orgánicos vs patógenos
Cada patógeno sembrado en medio de cultivo
(PDA) dos dosis de los aceites orgánicos.
8 Fungicida químico-sintético vs.
patógenos
Cada patógeno enfrentado con el fungicida
químico sintético en un disco de papel filtro, y
además sembrado en PDA una dosis del fungicida
químico.
MATERIALES Y MÉTODOS
• Número de ensayos
El estudio se realizó en cuatros ensayos:
No.
Tratamientos
Patógenos Cepas nativas Cepas comerciales Fungicida
químico
Aceites
orgánicos
1 F. solani
T. asperellum (13)
T. harzianum (3)
T. longibrachiatum (1)
Trichoderma sp.
(1 no id. x)
T. lignorum (Mycobac ®10 WP)¹ T. harzianum
(PHC PlantShield® 1.15 WP)²
Azoxistrobina
(Criba® 25 EC) ³ Biomaster®4
2 R. solani " " " " 3 A. rolfsii " " " " 4 P. capsici " " " "
Tabla 3. Tratamientos en los ensayos con los cuatros hongos
fitopatógenos.
Leyenda: ¹Laverlam, S. A., Colombia, 2Plant Health Care, México, 3Mahomoya lifesciences Pvt. Ud., India, 4Global Bio Tecnologies &
Trading LLC, USA
MATERIALES Y MÉTODOS
• Diseño experimental
Completamente al azar (DCA)
4 repeticiones.
Unidad experimental: 1 plato de Petri.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
• Variables evaluadas:
1. Crecimiento micelial radial en mm.
Cada 24 horas hasta 192 horas
Figura 8. Crecimiento micelial radial.
Antagonista Patógeno
MATERIALES Y MÉTODOS
……Variables evaluadas
2. Nivel de supresión (Ns) del patógeno (%)
Se utilizó la fórmula de mortalidad corregida de Abbott (1925) modificada:
Ns (%) = (Cpt-CpT)
100
Cpt
donde :
Cpt= Crecimiento del patógeno en el testigo.
CpT=Crecimiento del patógeno vs. Trichoderma sp.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó análisis de varianza no paramétrica Kruskal-Wallis,
p.≤5 %, al no cumplir con los supuestos y análisis de
contrastes ortogonales, (programa estadístico Infostat 2013, Univ. Nac.
Cordoba, Argentina).
• Análisis Estadístico
Fig. 9. Porcentaje supresión crecimiento micelial de F. solani en presencia de los diferentes
tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas.
192 h
69.8 cdefgh
76.3 h
72.9 efgh
70.8 defgh
67.3 abcdef
74.0 efgh
75.3 fgh
67.2 bcdefgh
66.2 abcde
73.1 efgh
76.4 gh
67.3 cdefgh
76.3 h
68.5 bcdefg
69.7 cdefgh
72.9 efgh
59.4 abcde
71.0 defgh
69.6 cdefgh
21.3 a
26.7 ab
60.7 abcd
32.3 ab
52.7 abc
CV 9.54
p= 0.0001***
RESULTADOS
RESULTADOS
b a
c
Fig. 10. Cultivo dual entre T. asperellum- 28A (a) y F. solani (b);
Testigo= F. solani (c) a las 192 horas
Fig. 11. Cepas de Trichoderma spp. vs. Fusarium solani
RESULTADOS
Tabla 9. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento micelial de
F. solani en presencia de los diferentes tratamientosa las 48, 72 y 192 horas.
# Contrastes
(Gupo 1 vs. Gr. 2)
Tratamientos
(Gr. 1 vs. Gr. 2)
Significancia (P=)
48 h 72 h 192 h
1 Trichoderma spp. vs. Fungicidas
comerciales
T1-18, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios % 14.3-61.7 30.0-53.8 70.8-49.8
2 T. asperellum vs.
Fungicidas comerciales
T1, 3-7, 12-18 vs T21-23 <0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios % 13.5-67.7 32.6-53.8 71.7-49.8
3 T. harzianum vs.
Fungicidas comerciales
T9-11, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios % 8.1-61.7 20.2-53.8 68.0-49.8
4 T. asperellum vs.
T. harzianum
T1, 3-7, 12-18 vs. T9-11, 24 <0.0001*** 0.0002*** 0.0552 ns
Promedios % 13.5-8.1 32.6-20.2 71.6-68.0
P: nivel de probabilidad; ***= altamente significativo (P<0.001); ns= no significativo.
RESULTADOS
Fig. 12. Porcentaje supresión crecimiento micelial de R. solani en presencia de los
diferentes tratamientos en un périodo de 24 hasta 192 hora
a
192 h
75.6 defgh
78.1 gh
71.1 abcde
75.6 efgh
74.7 defgh
74.4 bcdefgh
76.4 fgh
75.2 defgh
71.5 abcde
74.8 defgh
74.4 cdefgh
74.7 defgh
77.2 fgh
74.0 bcdefg
70.3 abcd
78.0 gh
69.5 abcde
73.0 abcdef
78.0 h
51.2 abc
-0.03 a
78.8 fgh
35.3 a
48.8 ab
CV 4.16
p= 0.0001***
RESULTADOS
Fig. 13. Cultivo Dual entre T. asperellum-1A (a) y R. solani (b);
Testigo = R. solani (c) a las 192 horas
a
b c
RESULTADOS
Fig. 14. Cepas de Trichoderma spp. vs. Rhizoctonia solani
RESULTADOS
Tabla 7. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento micelial
de R. solani en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192 horas
#
Contrastes
(Grupo 1 vs. Gr. 2)
Tratamientos
(Grupo 1 vs. Gr. 2)
Significancia (p=)
48 h 72 h 192 h
1 Trichodermaspp. vs.
Fungicidas comerciales
T1-18, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios% 17.2-83.2 45.8-80.2 74.6-54.3
2 T. asperellum vs.
Fungicidas comerciales
T1, 3-7, 12-18 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios% 17.6-83.2 45.7-80.2 74.9-54.3
3 T. harzianum vs.
Fungicidas comerciales
T9-11, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios % 14.5-83.2 44.6-80.2 72.7-54.3
4 T. asperellum vs.
T. harzianum
T1, 3-7, 12-18 vs.
T9-11, 24
0.2824ns 0.5517ns 0.0124*
Promedios% 17.6-14.5 45.7-44.6 74.9-72.7
P: nivel de probabilidad; ***= altamente significativo (P<0.001); ns= no significativo.
RESULTADOS
Fig. 15. Porcentaje supresión crecimiento micelial de A. rolfsii en presencia de los
diferentes tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas.
192 h
71.7 abcdef
67.3 abcd
73.7 cdefgh
79.3 ghi
70.1 abcde
77.7 fghi
76.1 efghi
81.3 hi
73.3 bcdefg
73.7 cdefgh
75.3 defghi
72.9 bcdefg
76.5 efghi
72.1 abcdef
76.1 efghi
77.7 fghi
52.2 abc
73.3 bcdefg
38.5 abc
-1.2 a
9.5 ab
95.2 i
85.7 fghi
100. i
CV 8.18
p= 0.0001***
RESULTADOS
Fig. 16. Cultivo Dual entre T. asperellum-22C (a) y A. rolfsii (b);
Testigo= A. rolfsii (c) a las 192 horas.
a b c
RESULTADOS
Fig. 17. Cepas de Trichoderma spp. vs. A. rolfsii
RESULTADOS
Tabla 8. Análisis de contrastes sobre el porcentaje de supresión del crecimiento
micelial de A. Rolfsii en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192
horas.
# Contrastes
(Grupo 1 vs. Gr. 2)
Tratamientos
(Grupo 1 vs. Gr. 2)
Significancia (p=)
48 h 72 h 192 h
1 Trichodermaspp. vs. Fungicidas
comerciales
T1-18, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios% 44.1-100.0 43.5-99.9 71.5-93.6
2 T.asperellum vs.
Fungicidas comerciales
T1, 3-7, 12-18 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios% 39.0-100.0 45.9-99.9 74.6-93.6
3 T. harzianum vs.
Fungicidas comerciales
T9-11, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios% 49.5-100 36.8-99.9 69.8-93.6
4 T. asperellum vs.
T. harzianum
T1, 3-7, 12-18vs.T9-11, 24 <0.0001*** <0.0001*** <0.0043**
Promedios% 39.0-49.5 45.9-36.8 74.6-69.8
P: nivel de probabilidad; *** o **= significancia alta o moderada (P<0.001 o <0.01); ns= no significativo.
RESULTADOS
192 h
77.7 cdefgh
77.1 cdefg
73.0 abcd
80.7 ghi
71.3 abc
79.5 fghi
74.8 abcdef
80.1 ghi
74.7 abcdefg
76.5 cdefg
76.6 bcdefg
74.8 abcdef
77.7 cdefgh
74.2 abcdef
75.5 abcdefg
79.5 efghi
78.9 defghi
74.6 abcde
80.7 ghi
53.7 ab
41.5 a
88.9 hi
100. i
100. i
CV 3.39
p= 0.0001*** Fig. 18. Porcentaje supresión crecimiento micelial de P. capsici en presencia de los
diferentes tratamientos en un periodo de 24 a 192 horas
RESULTADOS
Fig. 19. Cultivo Dual entre T. longibrachiatum-12A (a) y P. capsici (b);
Testigo P. capsici (c) a las 192 horas.
a b
c
RESULTADOS
Fig. 20. Cepas de Trichoderma spp. vs. P. capsici
RESULTADOS
Tabla 9. Análisis de contraste sobre el porcentajede supresión del crecimiento
micelial de P. capsici en presencia de los diferentes tratamientos a las 48, 72 y 192
horas
# Contrastes
(Grupo 1 vs. Gr. 2)
Tratamientos
(Grupo 1 vs. Gr. 2)
Significancia (P=)
48 h 72 h 192 h
1 Trichoderma spp. vs. Fungicidas
comerciales
T1-18, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios% 11.5-95.7 29.4-94.5 76.8-96.3
2 T. asperellum vs. Fungicidas
comerciales
T1, 3-7, 12-18 vs
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios% 13.6-95.7 27.0-94.5 76.3-96.3
3 T. harzianum vs. Fungicidas
comerciales
T9-11, 24 vs.
T21-23
<0.0001*** <0.0001*** <0.0001***
Promedios % 5.3-95.7 32.9-94.5 77.1-96.3
4 T. asperellum vs.
T. harzianum
T1, 3-7, 12-18vs.T9-11, 24 0.0129* 0.0151* 0.262 ns
Promedios % 13.6-5.3 27.0-32.9 76.3-77.1
P: nivel de probabilidad; *** o *= significancia alta o leve (P<0.001 o <0.05); ns= no significativo
RESULTADOS
Fig. 21. T- comercial PHC PlantSchield (T. harzianum) vs. fitopatogenos
RESULTADOS
Fig. 22. T-comercial Mycobac ( T. lignorum) vs. Fitopatogenos
RESULTADOS
Nivel de
Antagonismo
Fitopatógeno
F. solani R. solani A. rolfsii P. capsici
Unid. % Unid. % Unid. % Unid. %
Nulo ≤ 0
0 0 0 0 0 0 0 0
Bajo 1-25
0 0 0 0 0 0 0 0
Moderado 26-66 1 6 0 0 2 11 0 0
Alto 67-85 17 94 18 100 16 89 18 100
Muy alto ≥ 86 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 18 100 18 100 18 100 18 100
Tabla 10. Cepas de Trichoderma spp. según el nivel de antagonismo
contra los fitopatógenos.
RESULTADOS
CONCLUSIONES
Las cepas nativas de Trichoderma spp. resultaron efectivas in vitro contra los
fitopatógenos F. solani, R. solani, A. rolfsii y P. capsici, mostrando niveles de
supresión desde moderado a alto.
Las cepas nativas y comerciales de Trichoderma spp. mostraron mayor efecto
antagónico que los fungicidas comerciales orgánicos y químico-sintéticos sobre los
fitopatógenos.
Las cepas nativas de Trichoderma spp. presentaron mayor efecto antagónico sobre
los fitopatógenos que las cepas comerciales T. harzianum y T. lignorum;
En los análisis de contraste, los grupos que mejores resultaron contra F. solani y R. solani fueron Trichoderma spp., T. asperellum y T. harzianum a las 192 horas. En cambio los fungicidas comerciales (azoxistrobina y aceites vegetales) fue el grupo que mayor eficiencia presentó contra A. rolfsii y P. capsici.
RECOMENDACIONES
Realizar experimentos probando la eficiencia de los aislados de Trichoderma frente a los fitopatógenos F. solani, R. solani, A. rolfsii y P. capsici a nivel de invernadero y campo.
Evaluar las mismas y otras cepas nativas de Trichoderma spp.,
in vitro y bajo condiciones de ambiente protegido, para el
control de hongos fitopatógenos de suelo.
AGRADECIMIENTOS
A Dios ante todo por haberme dado la fortaleza y perseverancia necesarias
para poder alcanzar esta meta y llegar a feliz termino.
Consejo Nacional de Investigaciones Agropecuarias y Forestales (CONIAF).
A mis asesores Dr. Colmar Serra y la Dra. Graciela Godoy de Lutz.
Al Ing. Elpidio Avilés por haberme permitido realizar esta investigación dentro
del proyecto del cual era líder financiado por el CONIAF, gracias.
A la Universidad Autónoma de Santo Domingo (UASD).
Al Instituto Dominicano de Investigaciones Agropecuarias y Forestales
(IDIAF).
A todos los profesores.
A todos mis compañeros de maestría.
REFERENCIAS
García, R; Riera, R; Zambrano, C; Gutiérrez, L. 2006.Desarrollo de un fungicida biológico a base de una cepa de
Trichoderma harzianum proveniente de la Región Andina Venezolana. Fitosanidad. 10(2): p. 115-121.
García, S., Moya, JD., Núñez, P., Andújar, F., Avilés, E. 2013. Efectividad in vitro de cepas de Trichoderma spp. en la
supresión del crecimiento micelial fitopatogenos de suelos. 6to. Congreso SODIAF. Resúmenes. Juan Dolio, San
Pedro de Macorís. República Dominicana. p.18.
García P. S., Moya J.D., Avilés E., Andújar F., Núñez P.A. 2015. Efectividad de Trichoderma spp. sobre el crecimiento
micelial de fitopatógenos de suelo en plato Petri. Sociedad Dominicana de Investigadores Agropecuarios y Forestales,
Revista APF, 4(2).
Hubert, R. 2008. Diagnostico de manejo e identificación de microorganismos patógenos presentes en el cultivo de ají
(Capsicum annuum L.) bajo invernadero en San José de Ocoa, República Dominicana. Tesis para optar por el título de
Máster en Ciencias Manejo Integrado de Plagas. Universidad Autónoma de Santo Domingo (UASD). 70 p.
Moya, J.D.; García, S.; González, J.L. 2003. Efecto de Trichoderma spp. en el crecimiento micelial de hongos fitopatógenos
de suelo en platos de Petri. XLIX reunión anual del Programa Cooperativo Centroamericano para el Mejoramiento de
Cultivos y Animales (PCCMCA), desde 27 abril al 3 mayo, Resúmenes, p. 68. La Ceiba, Honduras.
Samuels, G. 2004.Trichoderma: a guide to identification and biology. United States Department of Agriculture.Agricultural
Research Service.Systematic Botany and Mycology Laboratory.Beltsville, USA. 40 p.