Infezione toxoplasmica nel cane: indagine sierologica ... · la reale importanza di questa...

UNIVERSITÀ DI PISA

Dipartimento di Scienze Veterinarie

Corso di Laurea Specialistica in Medicina Veterinaria

Infezione toxoplasmica nel cane: indagine

sierologica retrospettiva su cani viventi in

Toscana e Liguria

Candidato: Tempori Chiara Relatore: Prof.ssa Francesca Mancianti

Correlatore: Dott.ssa Simona Nardoni

ANNO ACCADEMICO 2013-2014

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indice

RIASSUNTO……………………………………………………...pag. 4

ABSTRACT……………………………………………………….pag. 5

Capitolo 1 Definizione, riferimenti storici e importanza….pag. 6

1.1 Definizione……………………………………….pag. 6

1.2 Riferimenti Storici………………………………..pag. 7

1.3 Diffusione nel mondo…………………………….pag. 9

1.4 Importanza dell’infezione umana……………….pag. 12

Capitolo 2 Ciclo biologico e morfologia…………………..pag. 15

2.1 Ciclo biologico……………..

2.2 Morfologia……………………………………...pag. 18

2.3 Genotipi………………………………………...pag. 26

Capitolo 3 Modalità di trasmissione………………………pag. 27

3.1 Ingestione delle oocisti sporulate……………….pag. 27

3.2 Ingestione dei bradizoiti………………………...pag. 27

3.3 Ingestione dei tachizoiti………………………...pag. 28

3.4 Trasmissione transplacentare…………………...pag. 28

3.5 Modalità di trasmissione in ambiente acquatico..pag. 29

Capitolo 4 Immunità anti-toxoplasma e patogenesi……...pag. 31

4.1 Immunità anti T.gondii………………………….pag. 31

4.2 Patogenesi……………………………………....pag. 32

3

Capitolo 5 Sintomi clinici…………………………………..pag. 33

5.1 Sintomi clinici nell’infezione congenita………..pag. 33

5.2 Sintomi clinici nell’infezione post-natale……….pag. 33

5.3 Reperti anatomopatologici e lesioni istologiche..pag. 35

Capitolo 6 Diagnosi………………………………………...pag. 36

6.1 Diagnosi diretta……………………………...….pag. 36

6.2 Diagnosi indiretta……………………………….pag. 37

6.2.1 Tecnica IFAT………………………..pag. 39

Capitolo 7 Terapia e prevenzione…………………………pag. 43

7.1 Trattamento farmacologico……………………..pag. 44

7.2 Profilassi vaccinale…………………………...…pag. 44

Capitolo 8 Scopo del lavoro………………………………..pag. 45

Capitolo 9 Materiali e metodi……………………………...pag. 46

9.1 Campionamento………………………………...pag. 46

9.2 Immunofluorescenza indiretta…………………..pag. 47

9.3 Leishmania Infantum e Neospora Caninum….....pag. 48

Capitolo 10 Risultati……………………………………..….pag. 50

Capitolo 11 Discussione e conclusioni……………………...pag. 59

Bibliografia………………………………………………………pag. 66

Ringraziamenti…………………………………………………..pag. 96

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RIASSUNTO

Parole chiave: Toxoplasma gondii, cane, IFAT, sierologia, Toscana.

La toxoplasmosi è una zoonosi cosmopolita, diffusa in tutto il mondo e con forte impatto sulla

salute pubblica. L’agente eziologico, Toxoplasma gondii, è un protozoo ,parassita obbligato

delle cellule nucleate degli animali omeotermi, circa 200 specie di mammiferi (uomo compreso)

e 62 specie di uccelli. L’epidemiologia della toxoplasmosi del gatto è ampiamente conosciuta

sono invece pochi i dati sul cane e gli articoli presenti in bibliografia riguardano solamente paesi

esteri. Gli studi sulla toxoplasmosi canina in Italia sono pochi e non recenti, assenti quelli sulla

prevalenza del parassita in Toscana.

Lo scopo del lavoro è stato quello valutare la sieroprevalenza di T.gondii in uno studio

retrospettivo (gennaio 2012 a dicembre 2013), condotto su 1562 sieri di cane, pervenuti presso il

laboratorio di sierologia parassitaria del Dipartimento di Scienze veterinarie dell’Università di

Pisa, per il controllo sierologico della leishmaniosi, sono stati sottoposti alla tecnica IFAT per la

ricerca di anticorpi anti-toxoplasma; 9 degli animali esaminati sono risultati affetti da segni

clinici compatibili. Sui positivi è stata eseguita anche l’IFAT per Neospora caninum. 13 erano

positivi e l’analisi dei titoli anticorpali sembrava indicare una cross reazione con toxoplasma. I

dati ottenuti sono stati analizzati e confrontati con i dati riguardanti altri paesi, indicando una

buona corrispondenza. In Toscana T.gondii, così come N.caninum, è presente ma scarsamente

riconosciuto e spesso non vengono effettuati test diagnostici per attestarne la presenza.

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ABSTRACT

Key-words : Toxoplasma gondii, dog, IFAT, serology.

Toxoplasmosis is a cosmopolitan zoonosis, spread all over the world, which has a strong impact

on public health. The etiological agent, Toxoplasma gondii, is a protozoan, an obligate parasite

of the nucleated cells of homeothermic animals, around 200 species of mammals (including

humans) and 62 species of birds. The epidemiology of toxoplasmosis in cats is widely known,

there is little information concerning the toxoplasmosis in dogs instead, and the articles in the

bibliography only refer to foreign countries. Studies on canine toxoplasmosis in Italy are few and

are not recent, and the ones relating to the prevalence of the parasite are absent in Tuscany.

The purpose of this paper was to evaluate the seroprevalence of T. gondii in a retrospective study

(January 2012 to December 2013). The study was conducted on 1,562 dog sera, which were sent

to the parasitic serology laboratory of the Department of Veterinary Sciences of the University of

Pisa, for the serological test of leishmaniasis. The IFAT technique was performed for the

detection of anti-Toxoplasma antibodies. Nine of the examined animals were found to be

suffering from compatible clinical signs. On the positive samples was also performed IFAT for

the detection of Neospora caninum. Thirteen samples were positive and the analysis of antibody

titers seemed to indicate a cross-reaction with toxoplasma. The obtained data was analyzed and

compared with data concerning other countries, showing a good match. T. gondii, as well as N.

caninum, is present in Tuscany but is inadequately detected and often no diagnostic tests are

carried out in order to verify its presence.

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Capitolo 1 Definizione, riferimenti storici e importanza

1.1 Definizione

I protozoi (dal greco “protos”= primo e “zoon”= animale) rappresentano i progenitori di tutti gli

animali. L’organizzazione unicellulare in questi microrganismi ha raggiunto una struttura

citologica estremamente complessa.

Figura 1. Classificazione dei protozoi di interesse parassitologico (da Urquart et al., 1988).

Toxoplasma gondii è un parassita appartenente al Phylum “Apicomplexa” (Levine, 1970), classe

“Sporozoasida” (Leukart, 1879), subclasse “Coccidiasina” (Leukart, 1879), ordine

“Eimeriorina” (Leger, 1911) famiglia “Toxoplasmatidae” (Biocca, 1956),genere “Protozoa”, del

quale è l’unica specie.

T. gondii è un protozoo ubiquitario, parassita obbligato delle cellule nucleate degli animali

omeotermi, circa 200 specie di mammiferi (uomo compreso) e 62 specie di uccelli; l’infezione

sembra essere molto frequente tra gli animali selvatici, soprattutto canidi (Jakubek et al., 2007).

Gli ospiti definitivi sono il gatto e i felidi selvatici, considerati comunque “ospiti

completi”perché possono presentare la fase di sviluppo asessuata extraintestinale del

parassita,tipica dell’ospite intermedio. T.gondii ha una vasta gamma di ospiti secondari (Frenkel

et al., 1970): carnivori selvatici, suini d’allevamento, orsi, felidi, volpi, procioni, moffette fino

7

addirittura ai cervi selvatici, ungulati, marsupiali , scimmie e cetacei, lontra di mare colpita in

modo massivo nel 2005 (Hill, 2005).

1.2 Riferimenti Storici

Il nome toxoplasma deriva dal greco “toxòn”e “plasma” cioè forma ad arco, che descrive la

forma a mezzaluna assunta dal parassita nella fase del tachizoite; ”gondii” deriva invece dal

nome di un roditore nord-africano (Ctenodactylus gondii) da cui fu isolato per la prima volta.

Nel 1908 Nicolle e Manceaux isolarono per caso Toxoplasma, durante delle ricerche sulla

presenza di Leishmania nei roditori del Nord Africa. Nello stesso anno,fu l’italiano Alfonso

Splendore a isolarlo nei conigli. Nel 1917 Chatton e Blanc ritennero Toxoplasma un parassita

ematico, trasmesso da un artropode, perché isolato nel sangue degli ospiti; studi svolti negli anni

successivi scoprirono le caratteristiche biologiche e morfologiche di Toxoplasma e fu compresa

la reale importanza di questa infezione sulla sanità pubblica (Dubey, 2009). Nel 1923 è stato

riportato il primo caso di infezione oculare da Toxoplasma nell’uomo (Janku, 1923). Nel 1938

Wolf e Cowen studiarono la forma congenita della toxoplasmosi in una neonata e questo aprì le

porte a ulteriori approfondimenti sulla trasmissione, che venne dimostrata in diverse specie

animali (Hartley e Marshall, 1957; Dubey, 2009a).

Nel 1948 si raggiunse uno dei più importanti step nel percorso di conoscenza del toxoplasma, la

realizzazione del “Dye Test”da parte di Sabin e Feldmann. Questo test era utilizzato per la

diagnosi nell’uomo mediante l’analisi di campioni di siero ed ha permesso di mettere in

evidenza la massiva diffusione del parassita nella popolazione umana. Tutto ciò ha portato i

ricercatori a valutare l’esistenza di altre vie di trasmissione, poiché la sola congenita, non poteva

essere responsabile di tale prevalenza (Innes, 2010). Nel 1960 Jacobs, insieme ad altri autori,

dimostrarono la trasmissione orizzontale del parassita, mettendo in evidenza come la parete della

ciste fosse distrutta dagli enzimi digestivi dell’ospite, mentre i bradizoiti all’interno venivano

rilasciati (Jacobs et al., 1960).

L’evento determinante nella “storia del toxoplasma” fu la scoperta delle oocisti nelle feci di

gatto, nel 1970,che permise anche la classificazione del parassita tra i Coccidi, vista la grande

similarità con la già nota ”Isospora bigemina” (Hutchison et al. 1969, 1970, 1971; Sheffield e

Melton, 1969; Frenkel et al., 1970; Weiland e Kuhn, 1970).

Hutchinson nel 1965 eseguì un esperimento con il quale verificò che l’infettività di T.gondii era

legata alle feci di gatto, cadendo però in errore poiché riteneva che la trasmissione avvenisse

attraverso le uova di T. cati. Il ricercatore infettò con cisti tissutali di toxoplasma un gatto già

colpito da T.cati, raccogliendo feci contenenti uova di nematodi; flottò, poi, le feci in soluzione

8

al 33% di solfato di zinco e le conservò in acqua per 12 mesi, in un recipiente senza tappo per

farle embrionare. Hutchinson infettò poi dei topolini, i quali svilupparono la toxoplasmosi.

(Hutchison, 1965). L’oocisti risultò essere la forma resistente all’acqua e nell’ambiente esterno,

mentre le forme note fino a quel momento erano sensibili all’acqua. L’esame microscopico delle

feci, però, rivelò apparentemente la presenza soltanto di uova di T. cati e di oocisti di Isospora.

Successivamente Hutchison ripetè l’esperimento su due gatti infettati con T. cati e due esenti

dall’infezione e Toxoplasma fu trasmesso solo in associazione con l’infezione con il nematode;

proprio per tali risultati il ricercatore ipotizzò che Toxoplasma fosse trasmesso con le uova di

Toxocara (Hutchison, 1965). Nel 1969 furono isolate oocisti di toxoplasma in feci di gatto non

infettate da Toxocara, cadde così la teoria della coniugazione nematode-toxoplasma (Frenkel et

al., 1969; Sheffield and Melton, 1969). Nel 1970 le oocisti furono caratterizzate dal punto di

vista morfologico e biologico (Dubey et al., 1970). Numerose specie animali furono infettate con

toxoplasma, ma solo i felidi emisero le cisti poiché esclusivamente questi mammiferi sono ospiti

definitivi. Successivamente furono eseguiti studi su alcune isole nell’Oceano Pacifico (Wallace,

1969), in Australia (Dubey et al., 1997) e negli USA (Munday, 1972) nelle quali non viveva il

gatto e non vi venne dimostrata neanche la presenza del Toxoplasma. I felidi hanno un ruolo

essenziale nella trasmissione del parassita infatti, a sostegno di tale ipotesi, fu riscontrato che

marsupiali australiani erano molto più sensibili alla toxoplasmosi clinica rispetto a altri

esemplari nati in America o nel vecchio mondo; questi ultimi, infatti, entrarono in contatto con il

gatto solo dopo la colonizzazione europea. Anche le scimmie mostrarono una forte sensibilità

verso il toxoplasma, poiché vivendo sugli alberi, venivano raramente a contatto con le feci di

gatto parassitate (Dubey e Beattie, 1988).

Gli ultimi studi sulla trasmissione di toxoplasma hanno rivelato che i felidi possono infettarsi con

qualsiasi stadio del Toxoplasma, smentendo la precedente ipotesi secondo cui gli sporozoiti

contenuti nelle oocisti non infettavano i gatti, mentre anche una sola trasmetteva l’infezione

nell’uomo, nel suino e nei topi (Dubey et al., 1996).

Le ricerche effettuate su Toxoplasma erano rivolte alla ricerca di tachizoiti dal liquido ascitico di

topi infettati sperimentalmente attraverso l’inoculazione intraperitoneale di diversi stadi del

parassita, ma nuovi studi hanno evidenziato che nel liquido peritoneale sono presenti anche

bradizoiti e fasi di transizione (Dubey, 2005).

Nel 2007 Wainwright evidenziò la presenza di una membrana impermeabile intorno delle oocisti

che le rende resistenti a molti disinfettanti (Wainwright et al.,2007).Tra gli animali colpiti da

toxoplasma vengono attualmente considerati anche i mammiferi marini,morti di quest’infezione

acquisita dall’ingestione di acque dolci contaminate da oocisti,probabilmente defluite da terreni

con feci di gatto. (Miller et al., 2002; Dubey et al., 2003b; Conrad et al., 2005; Dubey e Jones,

9

2008). Toxoplasma non infetta animali a sangue freddo (Dubey e Beattie, 1988),tranne i

molluschi lamellibranchi che possono essere trasportatori delle oocisti (Miller et al.,

2002;Arkush et al., 2003; Lindsay et al., 2004).

1.3 Diffusione nel mondo

Figura 2. Sieroprevalenzo globale di T.gondii. Rosso scuro:prevalenza: 60%. Rosso chiaro: 40-60%.

Giallo: 20-40%. Blue:10-20%. Bianco: assenza (Toxoplasmosis snapshots: Global status of Toxoplasma

condii seroprevalence and implications for pregnancy and congenital toxoplasmosis.

2009 International journal parasitology: 1385-1394)

L’infezione da T. gondii è una delle zoonosi più importanti e ubiquitaria del mondo, è stata

evidenziata dall’Alaska all’Australia. L’uomo acquisisce l’infezione attraverso l’ingestione di

carne cruda o poco cotta, il contatto con feci di gatto e molto più raramente bevendo acqua

contaminata o attraverso trapianti con organi inquinati (Hill and Dubey, 2002). Nell’uomo

l’infezione è spesso subclinica, può talvolta essere confusa con una malattia virale poco virulenta

(Montoya e Liesenfeld, 2004). Si stima che oltre mezzo miliardo di persone nel mondo

presentino nel siero anticorpi specifici (Dubey, 1997) e quasi un terzo dell’umanità è stato

esposto al parassita. La prevalenza nell’uomo è massima nei paesi tropicali, forse a causa di

scarse condizioni igienico-sanitarie (70%). Numerosi studi hanno evidenziato un’ elevata

10

presenza del parassita in tutta l’America latina, in particolare in Brasile, dove la presenza di

valenza supera il 60% (Cabrale et al., 2008). Studi sulla sieroprevalenza realizzati nelle

popolazioni native americane, gli amerindi, hanno evidenziato lo stretto legame tra l’elevata

presenza del parassita con le abitudini alimentari e le pratiche sanitarie di questo popolo

(alimentazione a base di scimmie e topi) (Boia et al., 2008); le condizioni climatiche delle foreste

pluviali giocano un ruolo essenziale nella sopravvivenza ambientale del parassita (De la rosa et

al., 1999). Guatemala e Chile seguono l’andamento degli altri paesi dell’America Latina, con una

prevalenza maggiore per il primo (37,9%) (Conteras et al.,1996). Il Messico è invece

caratterizzato da una elevata prevalenza a sud, mentre il nord è poco interessato (Valasco

Castrejon et al., 1992). Tuttavia indagini più recenti hanno evidenziato una riduzione della siero-

prevalenza nello stato del Durango, nel Messico centro-settentrionale (Pappas et al., 2009).

Negli USA la sieroprevalenza è notevolmente ridotta (Jones et al., 2001), è più alta negli

afroamericani e nelle persone di origine messicana, soprattutto nei soggetti non nati negli USA.

La correlazione tra la presenza del toxoplasma e lo stato socio-economico, ha portato gli esperti

a proporre uno screening di massa per la trasmissione congenita del toxoplasma (Hotez, 2008).

In Canada la prevalenza si attesta intorno al 18,6% (Shuhaiber et al., 2003), mentre nella

popolazione “Inuit” la prevalenza sale al 59,8%, per il massivo consumo di carni di foca e di

caribù (Messier et al.,2009).

I dati riguardanti l’Europa sono molto variegati ma allo stesso tempo discontinui. Recentemente

è stato dimostrato come in Europa la sorveglianza epidemiologica per il toxoplasma congenito

sia limitato (Bernard et al., 2008); in realtà solo la Germania e la Francia hanno avviato

programmi di sorveglianza nazionale, mentre l’Austria sta intraprendendo questa strada,

abbandonata recentemente dalla Danimarca. Questi programmi sono organizzati da ”Eurotoxo”,

un progetto che riunisce scienziati che cooperano per analizzare tutti gli aspetti della

Toxoplasmosi congenita. Un ulteriore ostacolo a un’ interpretazione efficiente dei dati è

evidenziabile nelle continue variazioni che interessano la popolazione campionata, soprattutto a

causa dell’immigrazione dall’est-Europa, che interessa la Grecia e la Spagna, dove i tassi sono

elevati. Il paese con la più altra prevalenza in Europa è la Francia, con un tasso del 59% nel 1995

(Barile et al., 1999), sceso al 40%nel 2005, secondo studi dell’EFSA (EFSA, 2007) per il

consumo di carne cruda o poco cotta. L’est Europa è caratterizzata da una elevata siero

prevalenza, soprattutto Lituania, Estonia, Slovacchia e Repubblica Cieca (50%). Nei paesi del

nord, Svezia, Islanda, Danimarca i tassi restano sotto il 20%, mentre si alzano fino al 60% in

Ungheria (Szenasi et al.,1997).

11

Il Portogallo è caratterizzato da una prevalenza medio alta al nord, mentre il sud del paese

sembra essere quasi indenne, questo è causato da una minore consapevolezza della presenza

della malattia.

In Africa sono l’Egitto e la Tunisia ad avere la prevalenza maggiore, con il 59% ( Hussein et al.,

2001; Bouratbine et al., 2001); la Nigeria ha una prevalenza che sfiora il 20 % (Uneke et al.,

2005), mentre studi eseguiti sui donatori di sangue del Mali hanno evidenziato una prevalenza

del 21% (Maiga et al., 2001). In questi paesi la diffusione di T. gondii è collegato al consumo di

carne di ratto e al contatto con il suolo. Studi non recenti e sommari evidenziano una prevalenza

del 71,2% in Gabon (Nabias et al., 1998), 40,2%in Senegal (Faye et al., 1998), e dell’83% in

Madagascar (Lelong et al., 1995).

L’Asia è caratterizzata da un’elevata prevalenza in Turchia, Iran, Iraq e Kuwait, mentre l’Arabia

Saudita, Bahrain e Qatar sono interessata per un 25% (Al-Qurashi et al,2001; Al-Qurashi et

al.,2001; Tabbara and Saleh, 2005; Abu-Madi et al., 2008).In studi successivi, alcuni autori,

prospettarono il timore di un incremento della siero prevalenza in relazione alla presenza di quasi

2 milioni di gatti nella città di Doha, in Qatar; in realtà la prevalenza è molto maggiore nelle città

vicine, rispetto a quella zona che mantiene comunque un tasso esiguo. Il sud est asiatico è

interessato da un’elevata prevalenza, soprattutto Indonesia, Malesia,mentre il Vietnam e la

Tailandia hanno tassi meno elevati; questi dati variano molto in base all’etnia delle persone, in

Tailandia, per esempio, la prevalenza nell’etnia di origine cinese è molto minore rispetto alle

popolazioni aborigene, che sfiora il 40% (Fan et al., 2003). In Malesia, inoltre, il tasso più alto

interessa gli immigrati di origine Nepalese e i malesiani stessi, noti per essere amanti dei gatti e

cani, mentre altre etnie di immigrati sono meno interessate. In uno studio sulla Toxoplasmosi

congenita nel Massachusetts, USA (Jara et al., 2001) ha dimostrato che è molto più comune nei

bambini nati da madri Cambogia e del Laos.

La Cina ha una delle minori prevalenze del mondo, 1%, nella provincia dello Shangdong (Chen

et al., 2005). L’India ha dati molto vari, 9,4% in Rajasthan 48.2% in Kerala (Dhumne et al.,

2007).In Oceania e Nuova Zelanda la prevalenza è diminuita notevolmente rispetto a studi

passati (Cursons et al., 1982).

Uno studio del 2002 ha dimostrato che il 16-40% della popolazione degli Stati Uniti e del Regno

Unito è infetta, mentre in Centro e sud Africa e in Europa questa percentuale arriva fino all’80%

(Hill and Dubey, 2002).

12

1.4 Importanza dell’infezione umana

Figura 3. Ciclo di T.gondii nell'uomo (da http://wwwcentroveterinariofioranese.blogspot.com)

Nel corso dell’evoluzione, T. gondii ha sviluppato una grande varietà di possibili vie di

trasmissione; nella maggior parte dei casi l’infezione umana è acquisita nella fase postnatale e

non è ancora chiara quale sia la più importante fonte di contagio dal punto di vista della salute

pubblica. I tachizoiti , che giocano un ruolo significativo nella trasmissione verticale, sono molto

sensibili alle condizioni ambientali e sono frequentemente uccisi fuori dall’ospite, percui questa

via non è epidemiologicamente rilevante. I tachizoiti sono stati isolati in numerosi fluidi corporei

come saliva, urina, lacrime, seme e latte della maggior parte degli ospiti intermedi (pecore,

capre, bovini e cammelli) ( Tenter et al., 2000; Dekhordi et al., 2013). Studi più recenti

dimostrano come il tachizoita sia stato isolato da uovo crudo di gallina, sperimentalmente

infettata (Jacobs e Melton,1966).

I tachizoiti sono comunque inattivati dagli enzimi proteolitici del tratto intestinale, che sono però

ridotti nei bambini e questo sembra spiegare l’infezione in quelli allattati al seno da madri che

hanno acquisito un’infezione primaria (Bonametti et al., 1997). In realtà l’infezione da tachizoiti

può interessare anche gli adulti, poiché alcuni cibi solidi alzano il pH dello stomaco fino a 5 per

alcune ore e il parassita può arrivare al piccolo intestino, penetrare la mucosa e arrivare al circolo

sanguigno e linfatico (Riemann et al.1975, Sacks et al. 1982, Johnson 1997). I tachizoiti sono

13

comunque in grado, almeno nel gatto, di attraversare le mucose. Fino ad oggi, la maggior parte

di casi clinici negli umani è stato causato dall’assunzione di latte di capra non pastorizzato

(Riemann et al., 1975, Sacks et al., 1982, De Andrade et al., 1984, Skinner et al., 1990), mentre il

rischio d’infezione con quella di vacca è molto inferiore (Jackson e

Hutchison, 1989, Dubey, 1991). Tuttavia non è possibile escludere il rischio d’infezione con il

latte di vacca: in Polonia, uno studio condotto su donne in età fertile, ha rivelato che bere latte

può comportare l’infezione per la trasmissione orizzontale (Paul, 1998). Le popolazioni nomadi

dei pastori del Sudan hanno una sieroprevalenza alta (67%), causata dall’assunzione di latte di

cammello crudo (Elamin et al., 1992).

Uno studio effettuato su campioni di latte di diverse specie, quali bovini, ovini, caprini, cammelli

e bufali in Iran, mediante test in vitro, ELISA e PCR, ha evidenziato come T.gondii fosse

presente nel latte di tutte le specie, con prevalenza nei caprini (10%) con picchi nella stagione

estiva (76%) ( Dehkordi FS,2014).

Non è possibile, perciò,escludere la trasmissione umana attraverso i tachizoiti; l’unico modo per

interrompere questa trasmissione è non consumare il latte crudo, ma bollito o pastorizzato e

cuocere le uova .

La trasmissione animali-uomo è prevalentemente causata dall’ingestione di cisti presenti nelle

carni e nelle frattaglie di animali infetti o per assunzione di acqua o alimenti contaminati da

oocisti sporulate, presenti nell’ambiente o, raramente, direttamente dalle feci di gatto. Le

categorie professionali maggiormente a rischio sono i macellai, i cacciatori e tutti coloro che

lavorano le carni. A differenza dei tachizoiti, i bradizoiti sono maggiormente resistenti agli

enzimi digestivi (Jacobs et al., 1960, Dubey, 1998), quali tripsina e pepsina e alle variazioni di

temperatura, rimanendo infettanti fino a 3 settimane nella carne tritata, mantenuta a temperatura

di refrigerazione; la maggior parte delle cisti tissutali è eliminata alla temperatura di -12, ma

alcuni ceppi di T. gondii resistono alla surgelazione e al congelamento (Grosklaus e

Baumgarten,1967, Kotula et al., 1991, Kuticic e Wikerhauser

1996, Dubey 2000). Alcuni studi hanno dimostrato come le cisti siano inattivate dalle consuete

procedure industriali di conservazione degli alimenti, come la salagione, dall’aggiunta di

saccarosio o l’affumicatura. Le oocisti sporulate, invece, sono molto resistenti nell’ambiente,

sopravvivono poco tempo alle basse temperature e alla disidratazione,ma resistono più di un

anno nel terreno o nella sabbia umida. Le oocisti, inoltre, sono impermeabili e resistono ai

disinfettanti comuni (Kuticic &e Wikerhauser, 1996, Frenkel, 2000). Nell’ambiente le oocisti

sono distribuite dal vento, dalla pioggia, dalle acque di superficie vertebrati coprofagi, ma si

possono comportare da vettori anche i vermi di terra, invertebrati coprofagi. L’importanza di

questa via di trasmissione per la sanità pubblica è evidenziato dall’alto tasso di sieroprevalenza

14

tra i vegetariani (24-47%) (Hall et al., 1999, Roghmann et al., 1999), che si infettano sia per

ingestione di verdure crude contaminate, sia nell’attività di giardinaggio (Cook et al., 2000). Uno

studio su donne gravide in Norvegia ha evidenziato la stretta connessione tra acquisizione della

parassitosi e l’assunzione di vegetali crudi e frutta non lavata (Kapperud et al., 1996).

L’infezione acquisita nell’uomo ha un decorso asintomatico e autolimitante; solo nel 10-20% dei

casi si manifesta con linfoadenopatia laterocervicale, ascellare e inguinale associata a febbre e

linfocitosi (Piergili Fioretti, 2004).

Nei soggetti immunocompetenti la parassitemia viene facilmente contrastata, ma le cisti possono

sopravvivere nei tessuti e, in seguito a compromissione del sistema immunitario, possono

riattivarsi come nel caso di pazienti affetti da HIV e pazienti sottoposti a trapianti d’organo; la

toxoplasmosi è, quindi, un problema rilevante di sanità pubblica per le categorie più deboli,

quali donne in gravidanza e soggetti immunodepressi colpiti da AIDS (Brandonisio 2006).

Nei pazienti colpiti da AIDS la toxoplasmosi rappresenta un’infezione secondaria , subdola e

mortale fino a qualche anno fa; con le nuove terapie antiretrovirali si è ridotta sia l’incidenza di

encefalite che della mortalità (Brandonisio 2006). Nei paesi con una bassa prevalenza di T.

gondii, la probabilità che una donna in gravidanza s’infetti per la prima volta è molto bassa, ma

se ciò avviene è rilevante il rischio di aborto o di infezione congenita; nei paesi con siero

prevalenza alta,al contrario, è molto probabile che una donna sia venuta a contatto con T. gondii

prima della gravidanza, eliminando ogni rischio di trasmissione al nascituro. Una sorveglianza

sulle donne a inizio gravidanza, con un semplice esame del sangue, soprattutto in queste zona ad

alta prevalenza, permetterebbe a molte donne di assumere comportamenti idonei a evitare la

trasmissione. Nella maggior parte dei paesi “sviluppati” è previsto uno screening prenatale sul

siero delle gestanti nei primi mesi di gravidanza, introdotto in Italia con il decreto ministeriale

del 1998 (G.U. 20/10/98), ma viene effettuato anche in Francia e l'Austria (Hill and Dubey,

2002).In Italia la percentuale di donne sieronegative in gravidanza è del 40%, quindi circa 600 su

1000 sono a rischio di contrarre l’infezione, l’infezione primaria attesa è di 1:10 su 1000

gravidanze (SNLG, 2010).

L’impatto sociale della toxoplasmosi è rilevante in tutto il mondo, sia per le sofferenze causate

direttamente dalla patologia, sia per i costi legati all’assistenza sanitaria delle persone colpite,

soprattutto bambini che presentano spesso i sintomi più importanti (il ritardo mentale e cecità) e i

malati di AIDS, nei quali la toxoplasmosi è l’infezione opportunistica più comune (Dubey et al.,

1998).

15

Capitolo 2 Ciclo biologico e morfologia

2.1 Ciclo biologico

Figura 4. Ciclo di T.gondii negli animali (da “Structures of Toxoplasma gondii Tachyzoites, Bradyzoites,

and Sporozoites and Biology and Development of Tissue Cysts” J. P. Dubey, D. S. Lindsay, and C. A.

Speer)

T. gondii è un parassita dixeno, compie infatti il ciclo biologico in due ospiti diversi uno

definitivo , nel quale svolge prevalentemente la prima fase del ciclo, fase sessuata intestinale

(entero-epiteliale) ed uno intermedio nel quale realizza la fase asessuata, extraintestinale

(tissutale); i felidi sono ospiti completi del parassita e vi possono avvenire entrambe la fasi,

mentre negli altri animali omeotermi (uccelli e mammiferi,uomo compreso) il parassita si

riproduce solo per via asessuata extraintestinale (Hill et al., 2005).

16

Ciclo intestinale

Nei felini T.gondii si comporta come un classico coccidio se l’infezione è contratta mediante

l’ingestione di ospiti intermedi contenenti cisti con bradizoiti e pseudocisti con tachizoiti. Altra

via di contagio è costituita dalle oocisti emesse con le feci e sporulate nell’ambiente. Il potere

infettante delle oocisti è molto inferiore alle altre forme (Dubey 2006); la via di trasmissione più

importante, infatti, è l’ingestione dei bradizoiti maturi contenuti nelle cisti,che causa il rilascio di

massive quantità di oocisti, molto più rilevanti rispetto alle altre vie di contagio (Urquhart et al.,

1998). Studi in materia rivelano che l’ingestione di cisti tissutali con bradizoiti da origine nel

97% dei casi a ulteriore emissione di oocisti; questa percentuale si abbassa notevolmente se il

contagio avviene tramite oocisti sporulate o tachizoiti (16-20% ) (Dubey, 1996 ). Dopo

l’ingestione di un ospite intermedio infetto, in genere un roditore, gli enzimi proteolitici dello

stomaco dell’ospite definitivo digeriscono la parete delle cisti tessutali ed i bradizoiti

raggiungono le cellule epiteliali del piccolo intestino. Alcuni bradizoiti penetrano la lamina

propria e si moltiplicano come tachizoiti, disseminandosi per via ematica o linfatica ai tessuti

extraintestinali del gatto; altri penetrano nelle cellule epiteliali e iniziano un ciclo schizogonico,

con varie generazioni di schizogonie fino allo stadio di schizonte (Dubey e Frenkel, 1972). Nello

schizonte si ha la formazione di numerosi merozoiti (4-32), fino alla rottura della cellula

intestinale che lo ospita . I merozoiti rilasciati invadono altri enterociti, dove iniziano nuovi cicli

schizogonici ; secondo un meccanismo non ancora conosciuto questi cicli si interrompono

quando alcuni merozoiti si differenziano in micro e macro gameti. Il microgamete, una volta

maturo, si stacca dal citoplasma residuo e appare come una struttura allungata con nucleo

anteriore,un mitocondrio e i corpi basali dei 2 flagelli ; questo gamete è detto maschile per la

forte similitudine con una cellula spermatica (Ferguson et al., 1974;Dubey et al., 1998). Il

macrogamete ha un’importanza determinante per la formazione dello zigote, perché sintetizza e

stocca gli elementi nutrizionali per la sporulazione nell’ambiente esterno e sostiene la

sopravvivenza degli sporozoiti fino ad un anno; sintetizza , inoltre, componenti necessari per la

formazione della parete. Il microgamete distrugge l’enterocita, entra nell’enterocita parassitato

dal gamete femminile e lo fertilizza, dando origine allo zigote. La nuova cellula, originata

dall’unione del macro e microgamete, ancora all’interno della cellula intestinale, e si circonda di

una parete cistica, diventando oocisti; la cellula che le accoglie si rompe, l’oocisti si riversa nel

lume intestinale ed è eliminata nell’ambiente esterno con le feci per circa 15 giorni. Il periodo di

prepatenza può essere breve (3-10giorni) se l’animale ingerisce cisti tissutali, lungo (18-49

giorni) se ingerisce oocisti sporulate (Dubey, 1996).Un gatto può emettere fino a 100 milioni di

oocisti,raramente però le emette dopo una seconda infezione per lo stabilirsi di una risposta

17

immunitaria; a conferma di ciò è stato osservato che in gatti trattati con trattamenti

immunosoppressori, per esempio alti dosaggi di corticosteroidi o per lungo periodo, si ha una

ripresa dell’emissione di oocisti (Lindsay, 1997). Alcuni studi hanno dimostrato che questo non

succede per malattie infettive come FIV e FeLV (Lappin et al.,1992,Lappin et al.,

1996,Svobodova et all 1998).

Nell’ambiente esterno l’oocisti sporula in 1-5 giorni ed ha all’interno 2 sporocisti con 4

sporozoiti ciascuna ed è infettante.

Nel caso in cui l’ospite definitivo ingerisca le oocisti sporulate si ha la liberazione nell’intestino

di sporozoiti che invadono le cellule della mucosa epiteliale del tenue, dove iniziano la fase

schizogonia asessuata dando origine allo schizonte nel digiuno e nell’ileo (Rinaldi, 2010).Il

ciclo, poi, prosegue come nel caso precedentemente osservato.

Ciclo extraintestinale

Avviene in mammiferi a sangue caldo, gatto compreso, o uccelli, che si infettano per ingestione

di oocisti mature, di tachizoiti o per il consumo di carni di altri animali con cisti terminali

contenenti i bradizoiti. E’ ospite intermedio anche il cane. Una volta entrato nel nuovo ospite,

Toxoplasma, passa la barriera intestinale e per via ematogena, veicolato da macrofagi e altre

cellule della serie bianca, invade le cellule di altri tessuti. Nelle cellule dei tessuti invasi si

formano dei vacuoli parassitofori, nei quali il protozoo si divide per endoduogenia, in due

tachizoiti avvolti dalla pellicola della cellula madre. Dopo circa 3-4 divisioni binarie si sono

formati 8-16 tachizoiti che determinano la rottura della cellula ospite; i tachizoiti riversati in

circolo invadono altre cellule e continuano a riprodursi oppure vengono inglobati da macrofagi e

diffondono a tutto l’organismo. Questa fase acuta dura circa 1-2 settimane, in genere senza una

sintomatologia importante, dopodiche l’ospite acquisisce un’immunità,con la produzione di IgM

che limitano l’invasività e il numero dei tachizoiti localizzati nel tessuto nervoso e muscolare.

In queste sedi i tachizoiti si riproducono per endoduogenia, ma molto più lentamente per sfuggire

all’azione anticorpale, rispetto alla precedente divisione, formando nella cellula madre, qualche

centinaio di bradizoiti (forma simile ai tachizoiti ma di minori dimensioni). I bradizoiti hanno

una bassa capacità di moltiplicazione e restano quiescenti nelle cisti,che hanno sedi preferenziali

di localizzazione , cioè la muscolatura scheletrica, cardiaca, l’ occhio, il sistema nervoso

centrale, raramente il polmone e il fegato (Rinaldi, 2010). I bradizoiti vi rimangono vivi e vitali

per tutta la vita dell’ospite, inattaccabili dalle difese dell’organismo (Dubey et al., 1998). La

formazione della cisti è legata all’equilibrio tra parassita e sistema immunitario dell’ospite ; l

‘infezione decorre senza comparsa dei sintomi clinici. Le cisti tissutali periodicamente si

18

rompono liberando bradizoiti che vengono immediatamente circondati da un involucro cistico.

Un’eventuale caduta delle difese immunitarie riacutizza l’infezione, con attivazione delle forme

quiescenti che si trasformano in tachizoiti e che portano alla formazione di nuove pseudocisti.

Se l’ospite definitivo ingerisce cisti presenti nei tessuti di prede infette i bradizoiti si liberano,

invadono il piccolo intestino, si differenziano in tachizoiti e scatenano la fase acuta in un nuovo

individuo.

2.2 Morfologia

Gli stadi infettanti di T.gondii sono tre:

• Tachizoiti (in gruppo o cloni nei tessuti dell’ospite intermedio)

• Bradizoiti (in cisti tessutali)

• Sporozoiti (in oocisti presenti nell’ambiente)

( Dubey et al., 1998)

Tachizoiti

Il termine tachizoita significa “rapido”, dal greco “tacus”, fu coniato da Frenkel per definire il

veloce moltiplicarsi in ogni cellula dell’ ospite intermedio e nell’epitelio intestinale nell’opite

definitivo. Questa struttura veniva definita precedentemente con il termine “trofozoita”, dal

greco “Trophos” alimentazione; aggregati di più tachizoiti sono definiti cloni, colonie terminali

o gruppi. I tachizoiti presentano una forma a mezzaluna e larga circa 2 micron e lunga 6, con

una parte anteriore conoidale appuntita ed una terminale arrotondata.

Ultrastrutturalmente presenta vari organelli e corpi inclusi rivestiti da una pellicola esterna:

• Anelli apicali

• Anelli polari

• Conoide

• Rostri

• Micronemi

• Micropori

• Mitocondri

• Microtubuli sottopellicolari

• Reticolo endoplasmatico liscio e rugoso

• Apparato del Golgi

• Ribosomi

• Granuli densi+granuli di amilopectina (possono non essere presenti)

19

• Plastide legato alla membrana chiamato “apicoplasto”

(De Melo et al., 1997; De Souza et al., 1978,Kohl et al., 1997; Sheffield et al., 1968,Vivier et al.,

1972)

Figura 5. Schematizzazione di tachizoita (a sx) e bradizoita (a dx) Dubey JP, Lindsay DS, and Speer CA

(1998). Structure of Toxoplasma gondii Tachyzoites, Bradyziotes, and Sporozoites and Biology and

Development of Tissue Cyst. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 1998, p. 267 -299).

Il nucleo è generalmente situato nella parte centrale della cellula, contiene ciuffi di cromatina e

un nucleolo ben definito.

Il rivestimento è costituito da tre membrane, il plasmalemma e due membrane strettamente

adese, che formano la membrana interna, caratterizzata da una maglia di vescicole piatte

(Morrissette et al., 1997; Porchet-Hennere et al., 1985). La membrana interna è discontinua sopra

l’anello polare, ai micropori, a cui è posta lateralmente e alla punta posteriore dello zoita.

L’anello polare è un ispessimento denso del complesso della membrana interna nella parte

anteriore del tachizoita, il quale circonda una struttura a tronco di cono, detta “conoide” che

consiste in 6-8 elementi micro tubulari, ripiegati come una molla compressa. 22 microtubuli

sottopellicolari originati dal secondo anello polare, corrono longitudinalmente quasi per tutta la

lunghezza della cellula, proprio sotto il complesso della membrana interna, mentre 2 microtubuli

interni terminano nel conoide.

20

I microtubuli sono come una gabbia costale e sono organizzati a spirale; singoli microtubuli

hanno strie trasverse prominenti. Nello spazio compreso tra la parte anteriore e il nucleolo ci

sono 8-10 organelli a forma di clava(Sulzer et al., 1974), chiamati “rhoptries”, che sono strutture

escretorie con uno stretto collo anteriormente che si estende all’interno del conoide ed una parte

posteriore sacciforme, spesso intricata. I Micronemi sono delle strutture presenti

prevalentemente nella parte anteriore del parassita.

Figura 6. Complesso apicale del tachizoita.(da Dubey JP, Lindsay DS, and Speer CA 1998, Structure of

Toxoplasma gondii Tachyzoites, Bradyziotes, and Sporozoites and Biology and Development of Tissue

Cyst. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 1998, p. 267 -299).

Il tachizoita si può muovere per scivolamento, flettendosi, ondulando o ruotando su se stesso ma

non hanno visibili mezzi di locomozione come come ciglia, flagelli o pseudopodi. Le funzioni di

alcune strutture, come i conoidi, i roptrii e i micronemi, non sono ancora conosciute ma si pensa

che abbiano un ruolo nella penetrazione della cellula ospite e nella creazione di un ambiente

intracellulare adatto alla crescita e allo sviluppo del parassita. Il conoide può ruotare, inclinarsi,

allungarsi e retrarsi in modo che il parassita possa esplorare prima della penetrazione il

plasmalemma della cellula ospite (Chiappino,et al., 1984). I roptrii hanno una funzione secretoria

associata alla penetrazione poiché riversano il loro secreto ricco di enzimi proteolitici (Saffer et

al., 1992) attraverso il plasma lemma (Nichols et al., 1983). I micropori sono strutture simili ai

citosomi, formati dall’invaginamento della membrana interna( Nichols,et al., 1994).

21

I tachizoiti penetrano nella cellula sia attivamente, attraverso la membrana oppure attraverso

fagocitosi; subito dopo cambia forma e diventa ovoidale ed è circondato di vacuolo parassito

foro, che sembra derivare sia dal parassita che dall’ospite.

Immediatamente dopo la penetrazione una rete membranosa tubulo vescicolare si sviluppa

all’interno del vacuolo parassito foro e sembra originare dalla terminazione posteriore del

tachizoita (Bonhomme et al., 1982; Dubremetz et al., 1993; Joiner, 1993; Morisaki, 1995;

Nichols, 1981; Sibley, 1995; Silva, 1982; Speer, 1997; Werk, 1995). Il tachozoita comincia a

riprodursi asessualmente nella cellula ospite per endoduogenia, forma specializzata di

replicazione in cui due progenie si formano all’interno della cellula madre parassita. L’apparato

di Golgi si duplica per primo e si formano due complessi alla terminazione anteriore del

nucleolo. Successivamente la porzione anteriore del complesso di membrane, i microtubuli

sottopellicolari delle cellule figlie appaiono a forma di cupola; il nucleolo assume la forma di

ferro di cavallo. Il complesso di membrane interne e i microtubuli sottopellicolari continuano a

estendersi posteriormente e circondano parte del nucleolo che si può dividere in due. Le cellule

figlie continuano a crescere fino a raggiungere la superficie delle cellule parentali, le quali

perdono il complesso di membrane interne e la membrana interna diventa il plasma lemma delle

cellule figlie. Quando la cellula ospite non può più sostenere la crescita si rompe e libera

tachizoiti che a loro volta invadono altre cellule; i tassi di invasione e crescita dipendono dal

ceppo del parassita e dalla cellula ospite (Appleford, 1997; Kaufman, 1962). Dopo la

penetrazione del tachizoita nella cellula ospite c’è un periodo di arresto prima che il parassita

inizi la divisione e questa fase è in parte, dipendente dal parassita.

Bradizoiti e cisti tessutali

Il termine bradizoita (“Bradus”dal greco lento)è stato coniato da

descrive un organismo che si riproduce lentamente nella ciste tessutale ed è anche chiamato

“cistozoita”; le cisti tessutali si accrescono e restano intracellulari ,

dividono per endoduogenia (

concerne la taglia; le giovani sono piccole,

contengono solo 2 bradizoiti mentre le adulte possono contenere anche centinaia di individui.

Figura 7. Cisti tissutali di T.gondii

nucleo terminale (frecce). Notare la pa

definite.Notare la ciste del tessuto con

intracellulare. Notare la parete sottile della ciste (freccia) ed il nucleo del la cellula ospite (punta). (D)

Cisti tissutale con numerosi bradizoiti (punte). Sottile parete della cisti (

isolata dal cervello di topo. Notare la parete della cisti (freccia) che accoglie le centinaia di bradizoiti

(Fig 11 pag. 277 Dubey JP, Lindsay DS, and Speer CA (1998) Structure of Toxoplasma gondii

Tachyzoites, Bradyziotes, and Sporozoites and Biology and Development of Tissue Cyst. Clinical

Microbiology Reviews, Apr.1998, p. 267

Le cisti tessutali del tessuto nervoso sono spesso sferoidali e raramente raggiungono i 70

micrometri di diametro,mentre le intramuscolari son

100 micrometri(Dubey, 1977;

Le cisti possono svilupparsi anche in organi viscerali,compresi i polmoni,fegato e reni,sono

molto più frequenti nel tessuto nervoso e muscolare,soprattutto cervello ,occ

Il termine bradizoita (“Bradus”dal greco lento)è stato coniato da Frenkel


le cisti tessutali si accrescono e restano intracellulari , mentre i bradizoiti si

dividono per endoduogenia (Ferguson, 1987).Le cisti tessutali variano molto per quanto

le giovani sono piccole, misurano appena 5 micrometri di diametro


T.gondii nel cervello di topo. (A) Cisti con tre bradizoiti, ciascuna con un

erminale (frecce). Notare la parete sottile della ciste. (B) Tre cisti del tessuto con pareti ben

definite.Notare la ciste del tessuto con due bradizoiti,ciascuno con un nucleo terminale (frecce). (C) Cisti


Cisti tissutale con numerosi bradizoiti (punte). Sottile parete della cisti (freccia). (E) Ciste terminale



nd Sporozoites and Biology and Development of Tissue Cyst. Clinical

Microbiology Reviews, Apr.1998, p. 267-299).


micrometri di diametro,mentre le intramuscolari sono più grandi e possono essere lunghe anche

Dubey, 1993).


molto più frequenti nel tessuto nervoso e muscolare,soprattutto cervello ,occ

22

Frenkel ( Frenkel, 1973) e


mentre i bradizoiti si

1987).Le cisti tessutali variano molto per quanto

5 micrometri di diametro e


nel cervello di topo. (A) Cisti con tre bradizoiti, ciascuna con un

rete sottile della ciste. (B) Tre cisti del tessuto con pareti ben

due bradizoiti,ciascuno con un nucleo terminale (frecce). (C) Cisti


freccia). (E) Ciste terminale



nd Sporozoites and Biology and Development of Tissue Cyst. Clinical


o più grandi e possono essere lunghe anche


molto più frequenti nel tessuto nervoso e muscolare,soprattutto cervello ,occhi e muscoli cardiaci

23

e scheletrici. Le cisti intatte non causano danni e persistono per tutta la vita dell’ospite senza

causare alcuna risposta infiammatoria. La parete della ciste è elastica e sottile,circa 0.5 micron

contiene centinaia di bradizoiti falcifomi, ciascuno misura dai 7 a 1,5 micron(Melhorn e

Frenkel, 1980). La mancanza di colorazione con l’impregnazione argentica indica che la parte

della ciste non contiene glicogeno ne altri polisaccaridi: è composta da elementi dell’ospite e del

parassita (Ferguson e Hutchison, 1987; Ferguson e Hutchison, 1987; Sim et al., 1988).

La parete della ciste è rivestita da materiale granulare che riempie anche lo spazio tra i

bradizoiti. Alcuni bradizoiti degenerano, specialmente nelle cisti di vecchia data ( Pavesio et al.,

1992).

I bradizoiti strutturalmente sono molto simili ai tachizoiti, il nucleo situato verso l’estremità

posteriore mentre nei secondi è localizzato più centralmente. Il contenuto dei roptrii è labirintico

nei tachizoiti, mentre nei bradizoiti elettrondenso; in quest’ultimo caso varia molto in base

all’età della cisti tessutale: se è giovane i roptrii sono labirintici, se di vecchia data sono

elettrondensi. Inoltre molti bradizoiti hanno da 1 a 3 roptrii che sono collegati tra loro. I

bradizoiti contengono granuli di amilopectina, che possono essere presenti o assenti nei

tachizoiti. I bradizoiti sono più sottili dei tachizoiti e sono perciò più sensibili agli enzimi

proteolitici (Jacobs, Remington e Melton, 1960); da ciò deriva che il periodo prepatente nel gatto

dopo l’ingestione dei bradizoiti è molto più corto di quello dopo ingestione di tachizoiti ( Dubey

e Frenkel., 1976).

24

Oocisti

Oocisti non sporulate sono di forma sferica o subsferica, dai 10 ai 12 micrometri di diametro. In

microscopia chiara la parete dell’oocisti è costituita da 2 strati incolori,i granuli polari sono

assenti e lo sporonte riempie tutta l’oociste. La sporulazione avviene all’esterno in 1-5 giorni a

seconda della temperatura e della tensione di ossigeno.

Figura 8. A.oocisti non sporulata ,la massa centrale è lo sporonte . B.oocisti sporulata con 2 sporocisti, nei

quali sono visibili 4 sporozoiti. Oocisti di toxoplasma gondii. (A) Oocisti non sporulata. (B)Oocisti

sporulata con due sporocisti, e 4 sporozoiti visibili solo in una sporociste. (C) Micro scopia elettronica di

una oocisti sporulata. Notare la parete sottile del oocisti (grande freccia), due sporocisti e gli sporozoiti, di

cui uno in sezione trasversale ed uno in sezione longitudinale(piccole frecce).Dubey JP, Lindsay DS, and

Speer CA (1998) Structure of Toxoplasma gondii Tachyzoites, Bradyziotes, and Sporozoites and Biology

and Development of Tissue Cyst. Clinical Microbiology Reviews, Apr. 1998, p. 267 -299).

Le oocisti sporulate sono sub sferiche o ellissoidali, di11-13 micron di diametro ed ognuna

contiene e due sporocisti ellissoidali di 6-8 micron, senza corpi di Stieda; sono presenti residui

delle sporocisti ma non delle oocisti. Ogni sporociste contiene 4 sporozoiti. Il citoplasma delle

oocisti non sporulate (zigote) ha un grosso nucleo con nucleoplasmi amorfi e un nucleolo

distinto. Lo zigote è delimitato da un'unica membrana con pochi micropori, il nucleo si divide 2

volte ,dando origine a 4 nuclei, localizzati alla periferia dello zigote; si forma in questo stadio la

seconda membrana e dopo la divisione citoplasmatica si formano 2 sporoblasti sferici ognuno

con 2 nuclei (Ferguson, 1979).

A questo punto gli sporoblasti si allungano formando così le sporocisti; le due membrane esterne

degli sporoblasti diventano lo strato esterno della parete della sporocisti e il plasmalemma della

massa citoplasmatica si trasforma nello strato interno(Ferguson, 1979). Infine 4 placche arcuate

25

formano lo strato interno della sporociste; le placche sono unite da 4 suture che formano nel

punto di giunzione, delle depressioni sulla superficie della sporociste. La formazione dello

sporozoita inizia quando due placche dense appaiono a entrambe le estremità della sporociste;

ogni nucleo si divide in due ed è incorporato nella nuova struttura che si sta formando,ogni

sporociste contiene 4 sporozoiti. Dopo che lo sporozoita si è formato restano una serie di corpi

residuali all’interno della membrana (Ferguson, 1979).Ultrastrutturalmente la parete dell’oociste

sporulata consiste in 3 strati:

• Strato elettrondenso esterno;

• Strato elettrolucente medio;

• Strato moderatamente elettrodenso interno;

Lo strato mediano è costituito da resti delle membrane rimasti tra le superfici interne ed esterne

durante la formazione della parete dell’oociti (Speer et al., 1997). Il trattamento con sodio

ipoclorito (Clorox) al 1,3% rimuove lo strato interno.

La parete dell’oociste contiene un micropilo, piccolo, di circa 350 nanometri, presente sulla

parete stessa senza una precisa localizzazione; il micropilo è costituito da 3 strati che si

continuano con quelli dell’oociste; tuttavia lo strato esterno del micropilo è sottile e

moderatamente elettrodenso, mentre quello interno elettrodenso, discoidale e leggermente più

spesso rispetto allo strato interno della parete dell’oociste.

La funzione micropilo non è conosciuta, forse può rappresentare un punto di permeabilità della

parete dell’oociste che diventa suscettibile all’azione della CO2 vari enzimi, che consente

l’entrata dei Sali biliari e della tripsina, che provoca la disincistazione dello sporozoita.

Ricapitolando la parete della sporociste consiste in 2 strati ben distinti,uno esterno sottile ed

elettrondenso ed un altro interno, spesso e moderatamente elettrondenso, costituito da 4 placche

arcuate (Christie, 1978; Ferguson, 1979).

Durante la disincistazione, in presenza di sali biliari e tripsina, la sporocisti si rompe

improvvisamente con la fuoriuscita degli sporozoiti. I residui della sporociste sono granuli di

amilopectina e corpi lipidici. Ultrastutturalmente lo sporozoita e il tachizoita sono molto simili,

differiscono solo per il fatto che nel primo ci sono molti micronemi, roptrii e granuli di

amilopectina.

Gli sporozoiti misurano dai 2 ai 6-8 micron con nucleo terminale, non presentano corpi

cristalloidi o rifrangenti.

26

2.3 Genotipi

In passato, studi molecolari e di biologia delle popolazioni, avevano ipotizzato che T.gondii

avesse tre ceppi clonali diversi per virulenza e patogenicità, (Sibley e Boothroyd, 1992; Howe e

Sibley, 1995). Negli ultimi anni sono stati isolati ceppi diversi sia in uomini malati di AIDS che

in soggetti immunocompetenti nella Guyana francese, affetti da grave sintomatologia

(Ajzenberg et al., 2004; Demar et al.,2008); negli animali questi ceppi sono stati isolati nei suini

in Brasile (Belfort-Neto et al., 2007; Ferreira et al., 2008), nelle otarie in California centrale

(Miller et al., 2004; Conrad et al., 2005). Analizzando campioni prelevati sia da ospiti

apparentemente sani sia da quelli malati, i positivi sono stati classificati secondo tre tipi genetici

(I, II e III) in base al polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) (Howe e

Sibley, 1995). Grazie a nuovi marcatori per la caratterizzazione genetica è stata rivelata una

variabilità genetica molto più elevata rispetto a quello che si pensava (Ajzenberg et al., 2002;

Ajzenberg et al., 2004; Khan et al., 2006; Lehmann et al., 2006).I tipi clonali I, II e III hanno

rilevanti differenze per quanto riguarda la virulenza: il tipo clonale I sembra causare infezioni

letali nei topi “outbred”, mentre i tipi clonali II e III sono significativamente meno virulenti

(Sibley e Boothroyd, 1992).

In Asia e in Sud-America sembrano essere presenti genotipi atipici (Dubey et al., 2007, 2008;

Lehmann et al., 2006), molto virulenti sia nei topi (Pena et al., 2008)che in uomini adulti

immunocompetenti(Carme et al., 2009).

In California sono stati isolati due nuovi ceppi ( A-XX) nelle otarie (Sundar et al., 2009.), ma

anche in altre specie che vivono sulla costa, come i bivalvi e altri invertebrati filtratori. Studi

genetici hanno evidenziato che alcune proteine dei “rhoptries” che vengono rilasciate al

momento della penetrazione nelle cellule ospite (ad esempio ROP18) sono collegate con la

virulenza nei vari ceppi genetici (Yuan et al., 2010); altre analisi genetiche condotte su nuovi loci

variabili sembrano suggerire un’evoluzione distinta di ceppi sudamericani ed eurasiatici fino a

tempi relativamente recenti. Il trasporto di animali, soprattutto gatti, ratti e topi, sulle navi che

trasportavano gli schiavi avrebbe fornito ulteriori possibilità di migrazione di ceppi distinti da un

continente all’altro ( Lehmann et al., 2006).

27

Capitolo 3 Modalità di trasmissione

La trasmissione di T.gondii può essere sia orizzontale che verticale,ma ancora non si conosce

quale via sia la più frequente; è noto il ruolo fondamentale del gatto e dei felidi selvatici nel

mantenimento del parassita nell’ambiente (Dubey et al., 1997). L’infezione segue quattro vie di

trasmissione:

a) ORIZZONTALE: ingestione di oocisti sporulate dall’ambiente;

b) ORIZZONTALE: ingestione di cisti tessutali contenute in carne cruda o poco

cotta o da frattaglie primarie (visceri) di ospiti intermedi;

c) VERTICALE: trasmissione transplacentare dei tachizoiti (Dubey et al., 1998;

Dubey 1991; dubey 1991; jackson e hutchison 1989; Dubey e Beattie 1988)

d) TRAMITE SECRETI (latte) ed escreti (saliva,urine)

3.1 Ingestione oocisti sporulate

Gli ospiti intermedi ,uccelli compresi, possono infettarsi ingerendo direttamente le oocisti

sporulate presenti nell’ambiente esterno come nei pascoli , nel fieno, nel grano e nel grano

contaminato ( Buxton,1990). Il gatto può infettarsi per assunzione di oocisti rilasciate da altri

felini. Gli insetti, mosche e blatte soprattutto, possono essere vettori di trasporto meccanico delle

oocisti sulle zampe o parti dell’apparato boccale (Hartley e Munday 1974,Wallace 1972-1973-

1971).

La trasmissione mediante oocisti è più adatta per l’infezione di ospiti intermedi, mentre nel gatto,

che è un predatore, è più frequente la trasmissione attraverso bradizoiti (Frenkel et al., 1970;

Dubey, 2001). Meno della metà dei gatti alimentati con oocisti emettono a loro volta oocisti; il

preriodo prepatente dopo l’ingestione di oocisti , inoltre, è molto lungo e non completamente

conosciuto (Dubey, 2005).

3.2 Ingestione di bradizoiti

Il cane,così come tutti i carnivori e gli uccelli predatori,può infettarsi per ingestione di prede che

contengono nei loro tessuti cisti (Dubey, 1986;Rothe et al., 1985). Questa via di trasmissione è

molto importante anche nell’uomo, poiché le cisti tessutali sono frequenti in animali da carne

quali i suini, ovini e caprini, meno in avicoli, cunicoli e equini (Tenter et al., 2000). Non sono

escluse però anche carni di piccioni, lepri, cinghiali, cervi e canguri mentre i bovini hanno un

sistema immunitario tale per cui il pericolo di contrarre la malattia è ridotto (Innes,1997) .Il

28

rischio sussiste se le carni sono crude o poco cotte, poiché una cottura a 70°per 10 minuti

distrugge gli organismi, mentre non è sufficiente la cottura “al sangue”(Dubey, 1986).

3.3 Ingestione di tachizoiti

Evenienze più rare sono l’infezione mediante il trasferimento di tachizoiti dalla madre alla prole

con il latte (Powell et al., 2001; Tender, 2000; Jackson e Hutchison, 1989; Dubey e Beattie,

1988).

Un’altra forma di trasmissione è quella attraverso il trapianto di organi quali il cuore, fegato,

reni, midollo osseo e trasfusioni di sangue e liquidi corporei. L’infezione può insorgere per

impianto di organi da un donatore infetto in un soggetto non immune o immunocompromesso

oppure per induzione di malattia in un soggetto immucompromesso con infezione latente;

sembra infatti che le fonti d’infezione siano sia le cisti tissutali presenti nei tessuti, sia l’infezione

latente nei pazienti che son subiscono l’impianto. In entrambi i casi viene somministrata una

forte terapia immunosoppressiva, per ridurre il rigetto molto frequente in questi casi, ma questo

favorisce la riattivazione dell’infezione e l’insorgenza della malattia (D.Hill et al.,2002) .

3.4 Trasmissione transplacentare

L’infezione si trasmette dalla madre, priva di anticorpi anti-toxoplasma, al feto, prevalentemente

nell’uomo, nella pecora e nella capra (Dubey et al., 1981; Masala et al., 2007). Negli ovini

l’infezione è molto importante poiché causa un’elevata percentuale di aborti nei greggi e quindi

determina importanti perdite economiche (Dubey et Beattie, 1988). L’infezione nelle

popolazioni ovine varia con gradi diversi per i singoli greggi, oscilla tra 5% e 95% (Blewett,

1983). In seguito all’infezione , infatti,i tachizoiti sono attratti dagli ormoni, possono

moltiplicarsi nella placenta e nel feto (Cook et al., 2000; Tender et al.,2000) e causare aborto,

morte neonatale, anomalie fetali quali cecità e ritardo mentale (Dubey e Beattle, 1988). Il 20-

50% delle donne infette trasmetterà l’infezione al feto (Jones et al., 2001), ma il rischio aumenta

con il progredire della gestazione (Hohlfeld et al., 1989; Jenum et al., 1998; Dunn et al., 1999;

Foulon et al., 1999; Remington et al., 2005), mentre i sintomi sono più gravi quanto più

l’infezione è ad uno stadio precoce, che corrisponde alla fase di embriogenesi (Hohlfeld et

al.1989; Dunn et al., 1999; Montoya e Liesenfeld, 2004). Studi recenti hanno evidenziato

l’importanza della trasmissione congenita, che in un gregge di pecore avviene nel 61% delle

gravidanze (Duncanson et al., 2001) e hanno rivalutato l’importanza della trasmissione verticale

nel mantenimento del parassita negli ospiti intermedi (Owen e trees, 1998;de Roever –Bonnet,

1969; Remington et al., 1961; Beverly, 1959). La trasmissione congenita può raramente avvenire

29

anche nei felidi, ma la gravità dell’infezione varia a seconda della fase di gravidanza al momento

dell’infezione: più è precoce più saranno evidenti i sintomi. Gattini nati da madri infettate in

gravidanza possono contrarre l’infezione per via transplacentare o trans lattea (Dubey et

al.,1995; Dubey e Carpenter, 1993; Sato e al., 1993). L’infezione transplacentare è molto più

grave rispetto a quella trans lattea, poiché la prima può portare a feti nati morti, mortalità

presvezzamento, la seconda invece causa toxoplasmosi acuta ma ha un’incidenza di mortalità

molto inferiore (Dubey et al.,1995; Dubey e Carpenter, 1993).

3.5 Modalità di trasmissione delle oocisti in ambiente acquatico

Recenti studi sulla Toxoplasmosi hanno evidenziato l’importanza della trasmissione

dell’infezione attraverso l’ambiente acquatico, sia marino che d’acqua dolce; il campanello

d’allarme è stato il ritrovamento di mammiferi marini positivi o morti per toxoplasma e s ‘è

scoperto che toxoplasma è un importante patogeno dei mammiferi marini delle zone costiere

(Lindsay e Dubey, 2009). Le principali fonti d’infezione sono le fognature e gli scarichi dei

liquami che possono contenere anche la sabbia delle letti eredi gatti domestici e che sono portate

dalle correnti fluviali al mare (Feyer et al.,2004). Negli estuari si concentra la maggior parte

delle oocisti, questo è dimostrato dall’elevato numero di lontre della California decedute in

seguito all’ingestione di queste (Miller et al., 2002). Un fattore importante per la contaminazione

delle acque con oocisti di felidi selvatici è il dilavamento dei terreni ad opera delle piogge

torrenziali (Miller et al., 2008). Anche l’ingestione casuale di acqua dolce di laghi o fiumi o

salata del mare e comunque acqua non trattata può causare infezione nell’uomo ma anche nel

cane e tutti gli animali che si abbeverano. Le oocisti nell’acqua marina artificiale sporulano in 3

giorni, a concentrazione di 15 ppm e 32 ppm di NaCl a 24°C, restano infettanti per 6 mesi a 22-

24°C (Lindsay et al.,2003), mentre a 4°anche 24 mesi (Lindsay e Dubey, 2009). La dose di

acqua necessaria a trasmettere l’infezione non è nota, i delfini, per esempio, assumono solo poca

acqua mentre il resto della componente idrica è assunta con il cibo, prevalentemente cefalopodi

e pesci che comunque non sono noti portatori di Toxoplasma (Dubey et al., 2003; Jones et

Dubey, 2009). Recentemente è stato dimostrato che le oocisti di T.gondii possono sporulare in

acqua marina e restare infettanti per i topi fino a 6 mesi (Lindsay and Dubey, 2009); le ostriche

della specie “Crassostrea virginica” rilasciano oocisti in acqua salata fino a 21 giorni post–

infezione , che rimagono infettanti (Lindsay et al., 2001; Arkush et al., 2003; Lindsay et al.,

2004).

Un altro elemento fondamentale da prendere in considerazione è il ruolo di ospiti paratenici dei

molluschi bivalvi. Secondo prove sperimentali le cozze (“Mytilus galloprovincialis”) e le

30

ostriche (“C. virginica”) possono assumente oocisti dall’acqua marina e concentrarle

nell’appartato digerente e restare infettanti per alcuni mesi (Lindsay et al., 2004); questa ipotesi è

stata confermata dal ritrovamento mitili del genere “Mytilus californianus”, nell’estuario della

baia di Monterey, in Calfornia, positiva per il ceppo X di Toxoplasma (Miller et al., 2008),

proprio quello che infetta le lontre della stessa zona (Miller et al., 2003; Conrad et al., 2005). I

molluschi bivalvi , se consumati crudi sono un pericolo per l’uomo ma anche per gli animali. Le

ostriche sono tra i molluschi più apprezzati nel mondo e tradizionalmente mangiati crudi, poco

cotti o cotti al vapore, quindi a rischio trasmissione per l’uomo ( Putignani et al.,2010).

31

Capitolo 4 Immunità anti Toxoplasma gondii e patogenesi

4.1 Immunità anti T.gondii

Numerosi studi hanno rivelato che il controllo di T.gondii richiede la precoce produzione di

Citochine IL-12, le quali stimolano le Natural Killer (NK) e i CD4+ e CD8+ Cell T a rilasciare

INF gamma. Sebbene la cellula infetta liberi linfociti citotossici per il parassita, il ruolo

principale di queste cellule è la produzione di INF gamma, il quale è determinante per una serie

di meccanismi antimicrobici, sia in cellule emopoietiche che non,che limitano la moltiplicazione

del parassita. In particolare INF gamma altera il metabolismo cellulare che trasforma il

triptofano in fibroblasto e che trasporta il ferro alle cellule intestinali. Queste citochine stimolano

i fagociti a produrre ossido di azoto che danneggia T.gondii e ne impedisce la crescita nei

macrofagi. Alcuni studi effettuati sui topi, hanno rivelato l’esistenza di un meccanismo di

resistenza al INF gamma dipendente, ma iNOS (ossido nitrico sintetasi) indipendente. Questo

ha rivelato che il GPTa indotto dall ‘INF gamma ha un’influenza importante nell’eliminazione

del parassita; il meccanismo non è definito, ma sembra che le GTPasi comportino la rottura del

vacuolo contenente il parassita e la sua digestione nel citosol. Tra le GTPasi è compresa la p67

cioè la GBPs, che è stato recentemente scoperto essere molto importante nel controllo nel topo.

L’infezione delle cellule è associata a una ridotta espressione del complesso maggiore di

istocompatibilità(MHC). Nonostante questo meccanismo, l’infezione con il ceppo 2 porta

all’attivazione e espansione del DCs e ad una risposta cellulare importante(CD8+). L’infezione

con il ceppo 1,invece,induce una debole risposta(Christopher A. Hunter,2012).

32

4.2 Patogenesi

Il tipo e la gravità della malattia clinica dipendono da diversi fattori, sia dell’ospite (età, sesso,

specie) ma anche del parassita (numero di organismi, fase del parassita ingerito, il ceppo). Alcuni

tipi di T.gondii, infatti potrebbero avere affinità tessutale; per esempio alcuni ceppi sembrano

avere una maggior probabilità di essere associati a malattie oculari nel gatto (Powell e Lappin,

2001). Gli elementi più importanti che concorrono alla toxoplasmosi clinica sono

l’immunosoppressione e le malattie concomitanti,poichè se la risposta immunitaria dopo

un’infezione primaria è debole,si verifica la riproduzione massiccia dei tachizoiti con necrosi

tessutale (Dubey e Lappin 2006; Dubey et al , 2009). Questo meccanismo è probabile che si

verifichi anche nei gatti affetti da toxoplasmosi cronica che vanno incontro a

immunosoppressione. Il gatto affetto da FeLV, FIV o FIP è molto più suscettibile sia

all’infezione primaria, che alla riattivazione della toxoplasmosi (Davidson et al., 1993), mentre

nel cane sono determinanti soprattutto il Cimurro e l’Ehrlichiosi. L’immunosoppressione

iatrogena è causata da trattamenti prolungati di glicocorticoidi o altri farmaci immunosoppressivi

come la ciclosporina (Beatty e Barrs, 2003; Bernsteen et al.,1999). La toxoplasmosi acquisita è,

generalmente, meno grave della forma congenita. Dopo l’ingestione di cisti tessutali o delle

oocisti i segni clinici sono localizzati all’intestino e con necrosi dell’epitelio e degli organi

linfoidi associati per la proliferazione dei tachizoiti (Dubey e Lappin, 1998); successivamente

per via linfoematica e all’interno dei monociti, il parassita diffonde in altri organi tra i quali

fegato, polmone, cervello e miocardio con aree di necrosi diffuse (Dubey e Lappin, 1998). Nella

terza settimana post-infezione i tachizoiti scompaiono e compaiono le cisti con i bradizoiti ;

queste possono rompersi e i bradizoiti rilasciti possono causare recidive in soggetti

immunodepressi. La forma cronica interessa prevalentemente il cervello,i muscoli scheletrici, il

fegato, i polmoni e gli occhi. Le cisti tessutali persistono per tutta la vita dell’ospite senza dare

particolari reazioni infiammatorie, possono riattivarsi in seguito a immunosoppressione.

33

Capitolo 5 Sintomi clinici

La Toxoplasmosi clinica nel cane raramente si presenta come malattia primaria, ma è quasi

sempre associata ad uno stato di debilitazione indotto da altre malattie o condizioni di

immunodepressione (Dubey ,2003). Come già detto nel cane T.gondii è spesso associato al virus

del Cimurro, all’Ehrlichiosi o all’uso terapeutico dei glicocorticoidi. L’infezione decorre spesso

in modo asintomatico e la gravità della sintomatologia clinica dipende da vari fattori,

fondamentalmente riconducibili a:

• Età

• Organi coinvolti

• Grado d’infezione

5.1 Sintomi clinici nell’ infezione congenita

La trasmissione congenita nel cane è rara ma possibile se l’infezione è contratta nelle prime fasi

di gestazione,quando i tachizoiti si diffondono per via transplacentare; i sintomi riscontrati sono

prevalentemente aborti e morti neonatali o perinatali. Nei soggetti che non muoio alla nascita

sono presenti addome aumentato di volume,spesso associato a epatomegalia e ascite; le forme

nervose sono prevalentemente caratterizzate da encefaliti con ipertermia e forme polmonari con

polmoniti, dispnea e difficoltà respiratoria (Dubey, 2003).

5.2 Sintomi clinici nell’ infezione post-natale

I sintomi clinici nel cane sono dovuti prevalentemente alla disseminazione extraintestinale dei

tachizoiti e alla successiva formazione di cisti contenenti i bradizoiti. Gli organi colpiti più

frequentemente sono i polmoni, il sistema neuromuscolare , l’oculare e il tratto gastroenterico. I

soggetti più sensibili sono cani sotto all’anno di età e gli anziani ovvero categorie con un sistema

immunitario più debole; i soggetti giovani, nelle fasi iniziali dell’infezione, manifestano sintomi

sistemici non patognomonici, come anoressia, letargia , febbre, diarrea, vomito, difficoltà

respiratorie e tonsillite. Sono frequenti anche polmoniti con difficoltà respiratorie e

interessamento epatico con ittero.

Nei soggetti anziani sono più frequenti forme neuromuscolari sistemiche (Dubey, 2000). In studi

effettuati in Brasile nel 2012 è stato dimostrato come T.gondii sia una delle principali cause di

sintomi neurologici nel cane in associazione al Cimurro (Langoni , 2012). I cani affetti

presentano:

34

• Atassia

• Variazioni comportamentali

• Circuitazione

• tremori

• Paralisi e paresi

• Andatura rigida

• Paraplegia

• Zoppia

• Encefaliti

Meno frequenti nel cane rispetto al gatto, ma comunque evidenziati sono sintomi oculari, quali

corio retinite, uveite con glaucoma, distacco del cristallino o della retina,neurite del nervo ottico,

intorbidamento dell’umor acqueo (Da Silva, 2005).

Recenti studi hanno evidenziato lesioni cutanee associate a T.gondii in cani trattati con terapia

immunosoppressiva per altre patologie; questa diagnosi è stata confermata mediante

immunoistochimica e PCR.

Questo studio considera due cani, un maschio Akita e di 9 anni ed una femmina Rhodesian

ridgeback di 7. Nel primo caso il cane era affetto da malattia emolitica immunomediata e da

infezioni alle basse vie urinarie;dopo un trattamento con Prednisolone ,ciclosporine ,sucralfato e

amoxicillina con acido clavulanico s’è risolto la forma infettiva e si è stabilizzato l’ematocrito,

ma dopo 20 giorni è descritta la comparsa di melena,diarrea trattata con metronidazolo. Dopo 20

giorni il cane è stato portato ad una visita specialistica per la comparsa di pustole e prurito. La

biopsia cutanea ha evidenziato un’infiammazione piogranulomatosa, estesa dallo strato

superficiale del derma fino a sottocute con neutrofili, macrofagi e frammenti necrotici. Nel

citoplasma di cellule endoteliali ,di cheratinociti , macrofagi e fibroblasti sono stati evidenziati

organismi basofilici, allungati con al centro tachizoiti, singoli o aggregati. Nel secondo caso il

cane era stato sottoposto a terapia immunomediata per trombocitopenia immunomediata ,

endocardite valvolare e infezione del tratto urinario (prednisolone, azathioprine, enrofloxacina e

amoxicillina). Dopo 4 settimane è stato osservato un nodulo cutaneo sulla spalla destra e il

citologico evidenziò la presenza del protozoo. Oltre alle lesioni viste nei due casi clinici in cani

e gatti affetti da toxoplasma sono state descritte dermatiti piogranulomatose o granulomatose e

necrotizzanti, pannicoliti con vasculite, iperplasia dell’epidermide e ipercheratosi. T.gondii può

essere organizzato in gruppo o da solo localizzato fuori della cellula o nel citoplasma del

follicolo epidermico, nei macrofagi, nell’epitelio ghiandolare o nei fibroblasti ( Hoffmann,2012).

35

5.3 Reperti anatomopatologici e lesioni istologiche

La principale lesione evidenziabile nelle infezioni da T.gondii nel cane, ma anche negli altri

animali colpiti è la necrosi e gli organi maggiormente interessati sono:

• il sistema nervoso centrale :

� aree atrofiche e pallide nel cervelletto;

� meningoencefalite multifocale non suppurativa con

necrosi,gliosi e vasculite;

� necrosi neuronale ,malacia,astrocitosi;

� infiltrato multifocale a livello delle meningi consistente in

macrofagi cellule plasmatiche, linfociti e neutrofili;

• il polmone:

� noduli bianco-grigi di 5 mm di diametro localizzati sotto la pleura;

� linfonodi bronchiali necrotici e aumentati di volume;

� essudato fibrinoso, necrosi delle pareti alveolari, dei vasi e dei

bronchioli;

� il lume alveolare con fibrina, linfociti, neutrofili ed eosinofili;

• tratto gastrointestinale :

� ulcere di più di 10 mm di diametro;

• pancreas,reni e milza:

� foci necrotici diffusi;

• Muscoli:

� miosite diffusa(soprattutto agli arti);

� necrosi delle miofibrille e fibrosi dei vasi e del connettivo;

� Atrofia muscolare;

� atrofia muscolare con sostituzione del tessuto muscolare con connettivo;

(Dubey e Lappin, 2006)

36

Capitolo 6 Diagnosi

La sintomatologia clinica e le analisi emato-biochimiche non sono patognomiche per la diagnosi

di T.gondii, perciò è necessaria una ricerca diretta e indiretta del parassita. Il controllo della

malattia nell’uomo e imprescindibilmente negli animali e l’individuazione delle fonti d’infezione

principali sono al centro della politica sanitaria europea, che ha infatti incaricato l’EFSA,

European Food Safety Authority, di fornire linee guida sui metodi diagnostici che permettano

una migliore identificazione del parassita negli animali (The EFSA Journal, 2007).

6.1 Diagnosi Diretta

Permette di identificare il parassita mediante ricerca microscopica, isolamento in vivo ed in vitro

e amplificazione del DNA con metodi molecolari.

� Esame coprologico

Eseguito mediante la tecnica di flottazione con soluzione satura di Nacl e ZnSO4 al 33% o la

tecnica di Telemann, eseguita con la sedimentazione con acido acetico ed etere. Permette di

evidenziare le oocisti eliminate con le feci dall’ospite definitivo ed è, quindi, esclusivo per il

gatto o altri felidi, e al di là della problematica della diagnosi differenziale con le oocisti di

Isospora (I.felis, I.rivolta), Sarcocystis (S.bovifelis, S.ovifelis) e soprattutto Hammondia

hammondi, vengono ritenuti di scarso significato diagnostico dato il breve periodo di patenza

della parassitosi (fino a 15 giorni) (Piergili Fioretti, 2010).

� Isolamento in vivo o in vitro

Il parassita può essere coltivato in vitro in colture di fibroblasti umani, questo metodo è rapido

(7gg) ma poco sensibile per perdite di vitalità del parassita a seguito di trattamenti

farmacologici; in vivo viene inoculato nel peritoneo di topi da laboratorio. Si tratta di un test

lento (4-6 settimane) ma specifico e sensibile (Piergili Fioretti, 2010).

� Istologia

Eseguita su campioni bioptici di organi target (linfonodi, milza , fegato, polmone, pancreas in

caso di infezione acuta, SNC in quella cronica) utilizzando le procedure routinarie di fissazione,

disidratazione, inclusione, colorazione elettiva delle sezioni con ematossilina-eosina. Permette di

evidenziare tachizoiti e cisti tessutali. Infezioni non massive possono però risultare in falsi

negativi per la scarsa quantità di materiale bioptico (the EFSA Journal , 2007).L’identificazione

37

dell’organismo da lesioni cutanee con l’esame istologico può essere una vera e propria sfida: in

soggetti sierologicamente positivi per T.gondii con lesioni cutanee suggestive di questa

infezione, solo nel 50% è possibile isolarlo dai tessuti (Hoffmann,2012).

� Immunofluorescenza e immunoistochimica

Vengono eseguite sui campioni bioptici per evidenziare i tachizoiti e le pseudocisti,

nell’immunoistochimica sono utilizzati anticorpi policlonali che si legano agli antigeni del

parassita (Piergili Fioretti, 2010).

� PCR

La PCR permette di amplificare il DNA del parassita dal siero, sangue, liquor e umor acqueo ed

è una delle tecniche più sensibili;tuttavia la piccola quantità di materiale necessario ne limita la

sensibilità, poiché la distribuzione delle cisti tessutali nel campione è casuale e la densità del

parassita può essere bassa (Hill et al.,2006). Questa tecnica è utilizzata per evidenziare il DNA di

T.gondii nelle feci dei gatti e per la diagnosi differenziale da altri protozoi (Mancianti et al.,2014;

Salant et al., 2010).

� Sierologia

I test sierologici evidenziano la presenza di antigeni circolanti.

6.2 Diagnosi indiretta

Permette di mettere in evidenza la risposta anticorpale che l’organismo mette in atto in seguito

all’infezione; in corso di Toxoplasmosi si ha un primo movimento anticorpale di IgM nei primi

5 giorni dall’infezione, con un picco a 2-3 settimane e scomparsa a 3 -6 mesi; le IgG compaiono

a 2 settimane post infezione, hanno un picco a 2-3 mesi e diminuiscono a 1-2 anni, permangono

però per tutta la vita dell’animale. Le IgA hanno un’insorgenza incostante tra IgM e IgG e

sembrano scomparire in un anno.

38

Figura 9. Grafico che rispecchia i risultati dei diversi studi condotti sulle quantità di oocisti di T. gondii

emesse da gatti infettati sperimentalmente o naturalmente nutriti con tachizoiti o bradizoiti contenuti nei

tessuti suini o murini, o essudati peritoneali di topo.(Dal review di Dabritz e Conrad, 2010)

In bibliografia, sia recente che datata, sono riportati studi solo sui felidi, mentre sul cane non è

presente nessun dato; su gatti affetti da toxoplasmosi clinica sono stati rilevati titoli di IgM

trovati nel 93,3% dei sieri e IgG nel 60%, pertanto si ritiene che le IgM abbiano un valore

predittivo della positività alla forma clinica rispetto alle IgG (Lappin et al., 1989; Lappin, 1996).

Nell’80% dei gatti sani infettati sperimentalmente è possibile rilevare IgM T.gondii-specifiche,

nelle 2-4 settimane post inoculazione (Lappin,2010); questo titolo diventa negativo a 16

settimane circa (Lappi net al.,1989). In gatti con T.gondii oculare e con FIV sono stati descritti

titoli di IgM sopra le 16 settimane (Lappin et al.,1926). Nella maggior parte dei casi il periodo

dell’emissione delle oocisti da parte dell’ospite è terminato quando si rilevano le IgG nel siero,

percui gatti sieropositivi per queste immunoglobuline non dovrebbero rappresentare un rischio

d’infezione. É, però, doveroso usare il congiuntivo, poiché studi recenti hanno riportano casi di

gatti positivi alla ricerca del DNA di T.gondii nelle feci e con IgG nel siero (Mancianti et al.,

2010; Lappin et al., 1989; Lappin, 1996). Titoli anticorpali IgG sono stati rilevati nel siero

anche 6 anni post-infezione, ma si ritiene che persistano tutta la vita del soggetto, visto che il

protozoo può resistere nei tessuti per molti anni (Dubey et al., 1995). Titoli elevati di IgG non

indicano, quindi, necessariamente un’infezione recente o attiva. Il periodo che intercorre tra il

primo rilievo di titoli elevati di IgG e il picco, è di circa 2-3 settimane, per questo motivo al

momento del test sierologico le IgG potrebbero già essere diminuite (Lappin,2010). Infine nel

gatto le IgG aumentano raramente in seguito alla riattivazione cronica (Lappin , 2010).Alla luce

di questi dati è inutile ripetere la titolazione anticorpale dopo la risoluzione della malattia clinica,

né una terapia in soggetti che non presentano sintomi di Toxoplasmosi ( Lappin, 2010).

Le principali tecniche che utilizzano tachizoiti interi sono il Dye Test, MAT, IFAT, mentre

ELISA, IHA usano antigeni endocitoplasmatici . MAT è un test di agglutinazione ,utilizzato per

39

determinare sia le IgG sia le IgM: ELISA e IFAT sono considerati test di riferimento per la

diagnosi perché saggiano tutte le classi anticorpali.

6.2.1 Tecnica IFAT ( Immunofluorescence antibody test)

L’immunofluorescenza è una tecnica di laboratorio usata in quasi tutte le branche della biologia

per ricerche per la diagnostica clinica; questa tecnica si basa sul lavoro pioneristico di Coons e

Kaplan (Coons , et al. , 1941; Coons e Kaplan, 1950) e successivamente di Mary Osborne

(Weber et al., 1975). Con questa tecnica è possibile rendere visibile una reazione antigene -

anticorpo, marcando uno dei due con fluorocromi quali istiocianato di fluoresceina (FITC) o

tetrametil rodamina istiocianato (TRITC). Il FITC è un composto giallo che può essere legato ad

anticorpi senza alterare la loro reattività; quando irradiato da luce ultravioletta o celeste riemette

una luce visibile verde chiaro. Il TRiTC emette una fluorescenza rossa. Questa tecnica è

utilizzata sia per individuare un microrganismo patogeno da tessuti infetti sia complessi

antigene-anticorpo . Viene utilizzata anche per rilevare anticorpi specifici dal siero di sangue,ma

in questo caso l’antigene verso cui si cercano gli anticorpi viene fissato su vetrino e si procede

con la tecnica indiretta. L’immunofluorescenza può essere diretta o indiretta;la prima è utilizzata

per identificare la presenza degli antigeni, mentre l’altra è usata per la titolazione degli anticorpi

o per la ricerca degli antigeni.

Figura 10. Immunofluorescenza diretta e indiretta (da Robinson ,immunohistochemical staining methods

2009, http://www.dako.com/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_10.pdf ).

Immunofluorescenza diretta

Gli anticorpi diretti verso un antigene specifico sono marcati con un

fissato il tessuto da analizzare su un vetrino è incubato con l’antisiero marcato;

il vetrino viene lavato in PBS per eliminare gli anticorpi non legati. Il vetrino sarà osservato ad n

microscopio a luce ultraviolet

antigene anticorpo ci sarà una fluorescenza brillante.

Figura 11. Immunofluorescenza diretta

UTET, pag. 685)

Immunofluorescenza indiretta

È la tecnica utilizzata in questo lavoro,

incubato con un siero sospetto d’avere anticorpi per quell’antigene;

lasciando solo anticorpi specifici legati agli antigeni.

solo dopo incubazione con antiglobul

non legate. La quantità di anticorpi presenti è valutata mediante una diluizione cres

Questa tecnica, rispetto all’indiretta

può legare più antiglobuline marcate

antiglobuline specifiche per ogni classe di antico

dell’anticorpo (Tizard, 2006).

munofluorescenza diretta

Gli anticorpi diretti verso un antigene specifico sono marcati con un fluorocromo e dopo aver

fissato il tessuto da analizzare su un vetrino è incubato con l’antisiero marcato;


microscopio a luce ultravioletta e dove c’è una reazione positiva,quindi c’è un legame tra

antigene anticorpo ci sarà una fluorescenza brillante.

mmunofluorescenza diretta (da “Microbiologia e immunologia veterinaria

Immunofluorescenza indiretta

la tecnica utilizzata in questo lavoro, in cui un antigene presente in un campione viene

incubato con un siero sospetto d’avere anticorpi per quell’antigene; il siero viene poi lavat

specifici legati agli antigeni. Il legame anticorpo-antigene è visualizzato

solo dopo incubazione con antiglobuline marcate e dopo aver rimosso, mediante lavaggio

La quantità di anticorpi presenti è valutata mediante una diluizione cres

rispetto all’indiretta, ha due vantaggi cioè che ogni complesso antigene anticorpo

egare più antiglobuline marcate e la brillantezza è molto più marcata.

antiglobuline specifiche per ogni classe di anticorpi si può determinare la classe specifica

40

fluorocromo e dopo aver

fissato il tessuto da analizzare su un vetrino è incubato con l’antisiero marcato; successivamente


ta e dove c’è una reazione positiva,quindi c’è un legame tra

Microbiologia e immunologia veterinaria”, Giorgio Poli,

in cui un antigene presente in un campione viene

il siero viene poi lavat o,

antigene è visualizzato

mediante lavaggio, quelle

La quantità di anticorpi presenti è valutata mediante una diluizione crescente di siero.

ha due vantaggi cioè che ogni complesso antigene anticorpo

e la brillantezza è molto più marcata. Inoltre usando

rpi si può determinare la classe specifica

41

Figura 12. Immunofluorescenza indiretta (da “Microbiologia e immunologia veterinaria”,Giorgio

Poli,UTET, pag. 685)

Principi di fluorescenza

Fosforescenza e fluorescenza sono 2 tipi di luminescenza. Quando molecole con proprietà

luminescenti assorbono luce, emettono raggi luminosi a diverse lunghezze d’onda; nella

fluorescenza l’emissione di luce è estremamente rapida mentre nella fosforescenza l’emissione

continua per millisecondi o minuti, dopo che la fonte di energia è stata rimossa. Il materiale

fluorescente emette luce per la struttura atomica; gli elettroni sono organizzati in diversi livelli

intorno al nucleo dell’atomo ed ogni livello ha una predeterminata quantità d’energia. Quando

un elettrone assorbe l’energia da un fotone di luce, diventa “eccitato” e salta al livello di energia

superiore e meno stabile e tale stato non dura più di 10 secondi. L’energia è persa dall’elettrone

sottoforma di calore ,mentre la restante come fotone. La fluorescenza emessa ha minor energia

rispetto alla luce assorbita, così la lunghezza d’onda della luce emessa e maggiore rispetto alla

luce che ha eccitato.

42

Figura 13. Principio della fluorescenza (da Robinson ,immunohistochemical staining methods 2009,

http://www.dako.com/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_10.pdf)

Esiste un range di lunghezza d’onda che può eccitare gli elettroni del fluorocromo; la

fluoresceina ,quando colpita da luce con lunghezza d’onda tra 450 nm e 520 nm emette

fluorescenza; la lunghezza d’onda che da la maggior fluorescenza è 495nm ed è chiamata

“excitation peak”. Anche la luce prodotta dai fluorocromi ha una lunghezza d’onda, che per la

fluoresceina va da 490 nm a 630m e il picco d’emissione è 515 nm (Robinson et al., 2009).

Figura 14. Eccitazione e spettro d'emissione della fluoresceina. Quando la fluoresceina è eccitata a una

lunghezza d'onda diversa dal picco la forma della curva dell'emissione resta la stessa(verde scuro),ma è

ridotta l'intensità (da Robinson ,immunohistochemical staining methods 2009,

http://www.dako.com/08002_03aug09_ihc_guidebook_5th_edition_chapter_10.pdf)

43

Capitolo 7 Terapia e prevenzione

7.1 Trattamento farmacologico

Studi sul trattamento della Toxoplasmosi con farmaci specifici son iniziati negli anni quaranta

con la descrizione degli effetti terapeutici dei sulfonamidici (Sabine et al., 1941) e proseguiti poi

negli anni 50, con lo studio di una terapia combinata di sulfadiazina e pirimetamina (Eyles et al.,

1953) e spiramicina (Beverly, 1958). Questi farmaci agiscono soprattutto nelle infezioni acute,

poiché si rivolgono contro i tachizoiti ed hanno una scarsa efficacia contro le cisti tessutali

(Innes, 2010). Nel cane la soppressione del midollo osseo per uso di atifolati è meno evidente

che nel gatto, dove sono necessari controlli ematologici per escludere trombocitopenia,

leucopenia e anemia se il trattamento dura più di due settimane. Trimethoprim sulfamidico

oltrepassa la barriera ematoencefalica, ma risulta essere inefficace nel cane per il trattamento di

uveiti gravi e neuriti ottiche (Dubey et al., 1990).

Il farmaco d’elezione è la Clindamicina, un antibiotico facente della classe dei Lincosamidi. La

Clindamicina riduce i sintomi della forma clinica della toxoplasmosi,quali l’ipertermia,la

miosite,l’uveite . Questo farmaco trattamento ha un buon assorbimento intestinale,quindi i

dosaggi parenterali e morali sono simili (25 mg /kg bid ) e i segni clinici, non determinati da

danni al SNC, cominciano a ridursi dopo 24-48 ore dall’inizio della terapia. I sintomi

neurologici, quali la polimiosite , il deficit ai motoneuroni inferiori e l’atrofia muscolare,

richiedono, invece, un tempo maggiore per ridursi (alcune settimane), anche se possono non

risolversi mai a causa dei danni al SNC causati dall’infezione. La Clindamicina somministrata

“per os” può causare anoressia, vomito e diarrea in cani trattati a dosaggi elevati, poiché

comporta un’ irritazione della mucosa gastro-intestinale; questi effetti non si verificano nella

somministrazione parenterale. L’uso dei corticosteroidi non è consigliato per l’effetto

immunosoppressivo che ha, se non per uso locale nel il trattamento di infiammazioni del

segmento anteriore oculare, anche perchè sembra che a dosi cliniche non peggiorino il quadro

sistemico (Lappi net al., 1992). Non esiste, al momento, un farmaco che liberi completamento un

organismo da T.gondii e la prognosi per cani e gatti affetti da forma disseminata è quasi sempre

infausta.

44

7.2 Profilassi Vaccinale

Nel 1967 Frenkel ha dimostrato l’importanza della risposta cellulo-mediata mediante

trasferimento di cellule linfoidi ed ha provato la mediazione dell’immunità da parte di cellule

immunitarie; il trasferimento del siero non ha invece protetto i riceventi. Attualmente l’unico

vaccino contro T.gondii in commercio è utilizzabile negli ovini; non può essere utilizzato

nell’uomo o in altre specie poiché, contenendo tachizoiti vivi, rappresenta un rischio d’infezione

(Innes et al.,2006). I vaccini inattivati non sono in grado di stimolare una risposta cellulo medita

abbastanza importante da proteggere dall’infezione (Innes e Vermeulen, 2006). Questo vaccino,

sviluppato in Nuova Zelanda (o’Connel et al.,1988) e contenente tachizoiti del ceppo S48,

previene la trasmissione congenita nelle pecore poichè stimola una risposta cellulo -

mediata,prima della gestazione (Innes et al.,2009).

45

Capitolo 8 Scopo del lavoro La toxoplasmosi è una delle principali zoonosi conosciute, temuta soprattutto dalle donne in

gravidanza e con un importante impatto sulla sanità pubblica . E’ molto importante, perciò,

conoscere questa patologia in tutti i suoi aspetti, sia per garantire la massima protezione e

sicurezza in gravidanza sia per smentire quelle teorie che considerano gli animali domestici

pericolosi portatori di T.gondii .

La toxoplasmosi del gatto è ampiamente conosciuta, sia per quanto riguarda il ciclo e quindi il

ruolo dei felini nella trasmissione e la sintomatologia, sia per quanto concerne la presenza e la

diffusione del parassita tra le colonie feline; sono invece pochi i dati sul cane e gli articoli

presenti in bibliografia riguardano paesi esteri, soprattutto Brasile e Cina. Gli studi sulla

toxoplasmosi canina in Italia sono pochi e non recenti, praticamente assenti quelli sulla

prevalenza del parassita in Toscana. Partendo da questo vuoto bibliografico, lo scopo del mio

lavoro è stato quello di valutare la sieroprevalenza di T.gondii in uno studio retrospettivo

condotto su sieri di animali viventi sia in Toscana che in Liguria, Genova in particolare e, allo

stesso tempo, quando possibile, valutare i fattori di rischio ambientali associati. Analizzando poi

i dati anamnestici fornitimi dalle strutture veterinarie ho potuto evidenziare quali cani siano stati

maggiormente colpiti in base alle categorie d’ appartenenza (età,razza,habitat…).

46

Capitolo 9 Materiali e metodi 9.1 Campionamento

Per questo studio sono stati utilizzati campioni di siero di cane, pervenuti presso il laboratorio di

sierologia parassitaria del Dipartimento di scienze veterinarie dell’Università di Pisa, per il

controllo sierologico annuale della leishmaniosi. Il periodo di tempo in cui sono stati fatti questi

campionamento è di circa due anni, da gennaio 2012 a dicembre 2013.

Il prelievo di sangue è stato effettuato nelle varie strutture, prevalentemente dalla vena Cefalica,

raccolto in apposite provette, lasciato riposare per circa 2 ore, ad una temperatura che oscilla tra

10°C e i 20°C; dopo la formazione del coagulo questo è stato“scollato”dalle pareti della provetta.

Una volta recuperato il siero, è stato centrifugato per allontanare eventuali globuli rossi rimasti.

La provetta chiusa, a circa 4°C, è stata alloggiata in contenitori termici da trasporto, che lo hanno

protetto sia da sbalzi di temperatura che da insulti meccanici e sono stati così inviati; arrivati in

laboratorio sono stati effettuati i test della Leishmania e poi congelati fino all’esecuzione

dell’immunofluorescenza per T.gondii. Una volta evidenziati i sieri positivi li ho esaminati a

diluizioni maggiori al fine di stabilire il titolo anticorpale .

I 1562 sieri da me analizzati, provengono da strutture presenti in una zona compresa tra Toscana

e Liguria e la popolazione di cani analizzata è mista per quanto riguarda la razza, l’età e

l’ambiente di vita. Questa eterogeneità è fondamentale per il lavoro, poiché non solo studia la

presenza di T.gondii nella popolazione canina in esame ma evidenzia anche quali categorie

siano maggiormente colpite. Sui dati riguardanti la siero prevalenza nelle varie zone è stato poi

fatto un test statistico (chi-quadro). Per questo lavoro è stata essenziale la collaborazione e la disponibilità delle strutture veterinarie

che mi hanno prontamente fornito i dati riguardanti i pazienti ; ho preso in esame fattori che

possono influire sia sul contagio di T.gondii che sulla manifestazione clinica della malattia. In

particolare ho analizzato:

• Razza

• Genere (maschile o femminile)

• Età

• Anamnesi ambientale e contatto con altre specie animali

• Dieta

• Anamnesi remota

9.2 Immunofluorescenza indiretta (IFAT)

Per effettuare l’IFAT ho utilizzato vetrini da microscopio “multispot”con 21 pozzetti su ognuno

dei quali è ho messo 1 microlitro circa di antigene costituito da

stati incubato i vetrini in termostato a 37° per qualche minuto,

frattempo ho diluito i sieri per raddoppio in tampone fosfato (PBS) a pH 7,2

titolazione di 1:40. Il vetrino è

così da fissare l’antigene, dopodiché è sciacquato in buffer di lavaggio e tamponato in carta

assorbente. A questo punto ho aggiunto il siero diluito nei primi 19 “spot” ,

ho messo PBS (controllo negativo) e n

infetto.

Ho poi messo il vetrino in termostato a 37° C per 30 minuti e l’ho sciacquato in PBS per

minuti, infine l’ho tamponato con carta assorbente.

l’antisiero con anticorpi secondari diluiti 1:

incubato in termostato per altri 30 minuti;

goccia di glicerina tamponata

assenza di luce. Tutti i vetrini sono stati poi osservati al microscopio a fluorescenza ,

positivi danno una chiara colorazione giallo

mostrano un colore rosso -marrone.

Figura 15. Campione positivo di

Immunofluorescenza indiretta (IFAT)


dei quali è ho messo 1 microlitro circa di antigene costituito da tachizoiti del parassita; ho poi

stati incubato i vetrini in termostato a 37° per qualche minuto, fino a completa asciugatura. Nel

frattempo ho diluito i sieri per raddoppio in tampone fosfato (PBS) a pH 7,2

Il vetrino è tolto dal termostato ed è immerso in acetone per circa 5minuti

dopodiché è sciacquato in buffer di lavaggio e tamponato in carta

assorbente. A questo punto ho aggiunto il siero diluito nei primi 19 “spot” ,

(controllo negativo) e nell’ultimo un controllo positivo, cioè un siero sicuramente

Ho poi messo il vetrino in termostato a 37° C per 30 minuti e l’ho sciacquato in PBS per

infine l’ho tamponato con carta assorbente. A questo punto ho messo sui pozzetti

l’antisiero con anticorpi secondari diluiti 1:30 e marcati con fluoresceina isotiocianato e ho

incubato in termostato per altri 30 minuti; successivamente ho sciacquato in PBS

per ogni pozzetto, ho coperto con vetrino coprio

Tutti i vetrini sono stati poi osservati al microscopio a fluorescenza ,

colorazione giallo-verde fluorescente mentre i campioni non reatt

marrone.

ampione positivo di T.gondii

47


tachizoiti del parassita; ho poi

fino a completa asciugatura. Nel

frattempo ho diluito i sieri per raddoppio in tampone fosfato (PBS) a pH 7,2 ,fino ad una

tolto dal termostato ed è immerso in acetone per circa 5minuti

dopodiché è sciacquato in buffer di lavaggio e tamponato in carta

assorbente. A questo punto ho aggiunto il siero diluito nei primi 19 “spot” , mentre nel penultimo

cioè un siero sicuramente

Ho poi messo il vetrino in termostato a 37° C per 30 minuti e l’ho sciacquato in PBS per 5

questo punto ho messo sui pozzetti

e marcati con fluoresceina isotiocianato e ho

cquato in PBS e aggiunto 1

to, ho coperto con vetrino coprioggetti e messo in

Tutti i vetrini sono stati poi osservati al microscopio a fluorescenza , dove i

verde fluorescente mentre i campioni non reattivi

48

9.3 Leishmania e Neospora

Sui sieri è stata eseguita anche l’immunofluorescenza indiretta per Leishmania infantum

(Mancianti e Meciani, 1988) ed i sieri positivi sono stati valutati anche per la presenza di

anticorpi nei confronti di Neospora caninum, protozoo che colpisce i cani causando sintomi che

possono essere confusi con quelli provocati da T.gondii.

L.infantum è un protozoo flagellato, appartenente al phylum “Mastigophora”(Ross ,1903),

parassita obbligato e permanente che ha come ospite preferenziale il cane,ma può colpire anche

la volpe, il gatto e l’uomo. Nell’ospite vertebrato è presente la forma amastigote del parassita, a

livello dei macrofagi cutanei. L’infezione è trasmessa da un insetto vettore appartenente al

genere Phlebotomus che compie il pasto di sangue sull’ospite infetto,ingerisce gli amastigoti

presenti nei macrofagi,che si trasformeranno in o promastigoti e migreranno alle ghiandole

salivari dell’insetto da cui saranno inoculati al prossimo pasto. L.infantum è cosmopolita, si

ritrova nel bacino del Mediterraneo, in Cina, nell’ex URSS, dal nord degli Usa fino

all’Argentina, Brasile compreso (Kuhls et al., 2011).

I sintomi nel cane sono variabili, possono compendere linfoademopatia periferica, lesioni

cutanee, insufficienza renale , uveite e disturbi di deambulazione (Paulan et al., 2012).

N. caninum è un protozoo appartenente al phylum “apicomplexa”, che causa aborto e infertilità

in bovine di tutto il mondo; fu identificato per la prima volta nel cervello di cane (Dubey et al.,

1990), che rappresenta l’ospite definitivo e un fattore importante nella trasmissione agli altri

animali selvatici e domestici (Dubey et al., 2003). Negli ospiti intermedi, bovini , ovini ma anche

canidi, il parassita si trasmette per passaggio transplacentare dei tachizoiti che colonizzano feto

ed invogli, causando nelle prime gravidanze aborti, mentre successivamente nascita di soggetti

infettati; l’ospite definitivo (il cane) si contagia per ingestione di cisti tessutali (Mc Innes et al.,

2006). La differenza sostanziale tra N.caninum e T.gondii è che nella prima il parassita è

particolarmente adattato al passaggio transplacentare, che è parte attiva del contagio, mentre

nella toxoplasmosi il passaggio transplacentare pare essere di minor rilevanza ai fini del ciclo.

Nel cane i sintomi principali sono nervosi, con paresi progressiva ascendente agli arti posteriori

che diventa paralisi, con ipertensione spastica e polimiosite; è presente anche flaccidità e paralisi

della mandibola, insufficienza cardiaca, renale ed epatite (Plugge et al., 2011). Sono presenti

anche lesioni cutanee che possono essere confuse con quelle indotte T.gondii.

49

Capitolo 9 Risultati

La prevalenza totale è risultata 8,9% (140/1562) con variabilità per le diverse zone; la prevalenza

maggiore è stata evidenziata in provincia di Pisa (18,35%), le province di Firenze e Pistoia

hanno mostrato una prevalenza del 7,6%, mentre Genova e Livorno si aggirano intorno all’8,5%;

nelle province di Siena, Lucca e Prato non sono stati rilevati sieri positivi, probabilmente per

l’esiguità del campione.In dettaglio 107 (76.4%) campioni hanno presentato un titolo 1/40, 21

(15%)1/80, 11 (7.9%) 1/20 ed 1 (0.7%) 1/320.

Luogo N°campioni N° campioni

positivi Indice di

prevalenza

Prov.di Pisa

Pisa 69 13 13,2

Pontedera 18 4 4.08

San Miniato 3 1 1,02

Calci 8 0 0

Tot. 98 18 18,3

Prov.di Livorno

Livorno 376 33 8,39

Portoferraio 6 1 0,25

Rosignano Mmo. 5 0 0

Cecina 4 0 0

Tirrenia 1 0 0

Venturina 1 0 0

tot. 393 34 8,65

Prov.di Genova

Tot. 393 38 9,6

Prov.di Firenze

Firenze 293 21 3,59

Sesto F.no 145 13 2,22

Fiesole 86 5 0,85

Scandicci 20 2 0,34

Vinci 19 0 0

Empoli 11 1 0,17

Greve 6 1 0,17

Certaldo 2 0 0

San Giovanni 1 0 0

50

Campi Bisenzio 1 1 0,17

Tot. 584 44 7,51

Prov.di Pistoia

Pistoia 65 3 3,48

Serravalle 17 1 1,16

Lamporecchio 2 1 1,16

Pescia 2 1 1,16

Tot. 86 6 6,96

Prov.di Prato

Tot. 3 0 0

Prov.di Lucca

tot 3 0 0

Prov.di Siena

Tot. 2 0 0

Dall’analisi statistica, eseguita con il test del Chi-quadro, si hanno i seguenti risultati:

� Differenza tra Pisa e Pistoia • Significativa • P=0.0221 • Chi-quadro=5.24 • Odd ratio (95% CI)=3 (1.13-7.95)

� Differenza tra Pisa e Firenze • Altamente significativa • P=0,0006 • Chi-quadro=11.92 • OR (95%CI)=2.76 (1.52-5.01)

� Differenza tra Pisa e Livorno • Altamente significativa • P=0,0052 • Chi-quadro=7.82 • OR (95%CI)=2.38 (1.28-4.42)

� Tra Pisa e Genova • Significativa • P=0,0154 • Chi-quadro=5.87 • OR (95% CI)=2.10 (1.14-3.87)

51

I campioni positivi sono stati suddivisi in 3 categorie d’età, cioè in “giovani”, fino all’anno di

vita, in “adulti” dai 2 ai 7 anni e in “anziani”sopra gli 8 anni. I risultati sono stati i seguenti:

� Giovani: 5% (7 campioni)

� Adulti:44 % (61 campioni)

� Anziani 51% (72 campioni)

Nella prima categoria tutti i campioni hanno titolo anticorpale 1 /40; tra gli adulti 6 hanno un

titolo di 1/80, 42 di 1/40 e 7 di 1/20. Un solo campione di un cane di 15 anni ha titolo 1/320.

Per quanto riguarda il genere,i maschi positivi sono 81,mentre le femmine 59,con una titolazione

così distribuita:

- 1/320=1 maschio;

-1/80= 13 maschi e 7 femmine;

-1/40= 54 maschi e 40 femmine;

-1/20=12 maschi e 8 femmine.

Esiste un sostanziale equilibrio tra i meticci e i cani di razza positivi; tra i 77 meticci la maggior

parte sono di taglia medio grande, così come tra le razze dove prevalgono quelle “da caccia” o

cani con indole molto attiva.

Il titolo 1/320 è evidenziato in un meticcio, 1/80 in 7 di razza e 14 meticci, 1/40 in 48 meticci e

44 di razza, mentre 1 /20 in 9 di razza e 8 meticci.L’anamnesi ambientale dei cani esaminati

riporta che 45 vivono in campagna, 69 in città e 26 in semicampagna. I cani che vivono in

ambiente urbano,soprattutto Genova e Firenze, hanno scarso contatto con quello rurale e con

animali selvatici che ci vivono; da un approfondimento fatto sui cani definiti ”di città” ho potuto

evincere che la maggior parte hanno comunque periodici contatti con zone rurali.

È stata definita la categoria “semicampagna” per quei soggetti che nonostante non vivano in

aperta campagna, sono spesso a contatto con prati, aree verdi non presenza di altre specie, in

particolare il gatto o che vivono in paesi che confinano con aree rurali. I cani di campagna,

infine, vivono a contatto con gatti, topi e altri animali selvatici,potenzialmente infetti.

49 campioni appartengono a cani alimentati esclusivamente con prodotti secchi o umidi

commerciali, mentre 40 con cibo preparato dai proprietari, avanzi o “pastoni”con soprattutto

carboidrati (pasta o riso) e carne. 51 cani sono alimentati con cibo “misto”,con questo si

definisce un ‘alimentazione varia, sia casalinga che commerciale in base alla disponibilità di

risorse e in base alla comodità dei proprietari.

Ho cercato di risalire all’anamnesi sanitaria dei cani per poter valutare se T.gondii fosse presente

in associazione ad altre patologie più evidenti, che hanno causato un indebolimento del sistema

52

immunitario. 41 dei 140 cani sieropositivi sono affetti da patologie più o meno debilitanti del

sistema immunitario o vari sintomi che possono essere così riassunti:

• Patologie neoplastiche;

• Insufficienze d’organo:rene,fegato,cuore

• Disfunzioni metaboliche:ipotiroidismo,Cushing,diabete

• Patologie cutanee quali dermatiti atopiche

• Sindromi autoimmunitarie

Sono stati riferiti 6 casi di cani con sintomi nervosi e cerebrali, con difficoltà alla deambulazione

e con crisi epilettiche, per i quali non era ancora stata fatta una diagnosi precisa; 1 cane presenta

difficoltà visive e cataratta, mentre 2 cani hanno dermatite cronica che non si risolve con nessun

trattamento farmacologico.19 cani sono sieropositivi,oltre che per T.gondii,anche per N.caninum

e per L.infantum:

� 10 sieri positivi per T.gondii e N.caninum;

� 6 sieri positivi per T.gondii e Leishmania;

� 3 sieri per T.gondii,N.caninum e L.infantum;

N°

TIT. ANTICORP

ALE TOXOPLA

SMA

SESSO

ETÀ

RAZZA ALIMENTA

ZIONE HABITA

T ANAMNESI SANITARIA

TITOLO ANTICORPALE

LEISHMANIA

TITOLO ANTICORPA

LE NEOSPORA

1 1/40 ms 5 Meticcio mista semicampag

na n.p. neg. neg.

2 1/40 m 9 Pastore Tedesco

commerciale città mastocitoma neg. neg.

3 1/40 m 12 Meticcio

tg. grande mista

semicampagna

n.p. neg. neg.

4 1/40 f 10 Meticcio tg.media

mista semicampag

na sindrome cerebrale

neg. 1/40

5 1/20 m s 10 Maltese commerciale città dermatite neg. neg.

6 1/40 f 10 Setter Inglese

commerciale città insufficienza

renale neg. neg.

7 1/40 fs 11 Meticcio

taglia media

commerciale città n.p. Neg. neg.

8 1/40 f 12 Setter Inglese

commerciale città ipotiroidismo neg. neg.

9 1/80 m 1 Meticcio tg.piccola

mista campagna n.a. neg. neg.

53

10 1/40 m 13 Bassotto commerciale città

Dermatite +sintomi

nervosi+insuff.renale

1/80 neg.

11 1/40 f 3 Labrador Retriever

commerciale città mastocitoma neg. neg.

12 1/40 m 9 Meticcio commerciale città dermatite neg. neg.

13 1/40 ms 3 Pastore Tedesco

mista semicampag

na n.a. neg. neg.

14 1/40 ms 1 Meticcio commerciale città n.a. neg. neg.

15 1/40 f 14 Meticcio mista città n.p. neg. neg.

16 1/40 m 11 Labrador Retriever

mista campagna n.p. neg. neg.

17 1/40 m 12 Meticcio commerciale città np neg. neg.

18 1/40 m 7 Jack

Russel Terrier

commerciale città sindrome autoimm.

neg. neg.

19 1/40 m 11 Meticcio commerciale città emangiosarcoma

milza neg. neg.


commerciale città n.p. neg. neg.

21 1/40 f 9 Meticcio mista campagna carcinoma

mamm. 1/320 neg.

22 1/40 f 14 Meticcio casalinga campagna n.p. neg. neg.

23 1/80 fs 14 Springer Spaniel Inglese

commerciale semicampag

na insuff.renale

cronica neg. 1/160

24 1/40 f 3 Deutscher

Boxer casalinga campagna n.p. neg. neg.

25 1/40 m 6 Meticcio casalinga città n.p. neg. neg.

26 1/80 fs 10 Meticcio casalinga campagna n.p. neg. neg.

27 1/80 f 9 Golden

Retriever commerciale città n.p. neg. neg.

28 1/40 f 13 Bassotto commerciale città carcinoma

mamm. neg. neg.

29 1/20 m 2 Meticcio casalinga campagna n.p. neg. neg.

30 1/20 m 10 Epagneul

Breton casalinga campagna n.a. neg. neg.

31 1/40 f 5 Springer Spaniel Inglese

mista città n.p. neg. neg.

32 1/80 fs 5 Meticcio commerciale città n.a. neg. neg.

33 1/40 ms 14 Setter Inglese

commerciale città insuff. epatica e

renale 1/160 neg.

54

34 1/40 fs 11 Segugio Italiano

casalinga campagna n.p. neg. neg.

35 1/40 ms 9 Setter Inglese

casalinga campagna n.a. neg. neg.

36 1/40 ms 15 Meticcio mista campagna n.p. neg. neg.

37 1/40 m 10 American Pit Bull Terrier


na mastocitoma neg. neg.

38 1/40 m 9 Deutscher

Boxer commerciale

semicampagna

n.p. neg. neg.


40 1/40 ms 3 Meticcio commerciale città n.p. neg. neg.

41 1/80 f 5 Epagneul

Breton commerciale città n.a. neg. neg.

42 1/40 m 10 Meticcio mista campagna n.a. neg. neg.

43 1/40 ms 3 Golden


44 1/40 m s 12 Beagle commerciale città n.p. neg. neg.

45 1/40 m s 8 Weimaran

er commerciale città cataratta neg. 1/40

46 1/20 m 6 American Pit Bull Terrier


47 1/20 m 4 Weimaran

er mista campagna n.p. neg. neg.

48 1/80 f 8 Meticcio mista campagna n.p. neg. neg.



50 1/40 fs 4 Golden


51 1/40 m 10 Meticcio commerciale città n.p. neg. neg.

52 1/20 m 4 Meticcio commerciale città n.p. neg. neg.

53 1/40 fs 14 Pastore Tedesco

commerciale città mielopatia

degenerativa neg. neg.

54 1/40 fs 8 Meticcio commerciale città n.a. neg. neg.

55 1/40 m 4 Meticcio mista campagna n.p. neg. 1/40

56 1/40 m 7 Meticcio mista semicampag

na n.p. neg. neg.

57 1/40 fs 8 Pastore

Maremmano


na mastocitoma neg. neg.

58 1/40 fs 15 Bracco Italiano

mista semicampag

na n.p. neg. neg.

55

59 1/40 m 9 Springer Spaniel Inglese

commerciale campagna n.p. neg. neg.

60 1/40 m 13 Meticcio mista campagna linfoma neg. neg.

61 1/40 f 3 Meticcio mista città n.p. neg. neg.

62 1/40 fs 5 Meticcio mista campagna n.a. neg. neg.

63 1/40 fs 6 Meticcio mista città n.p. neg. neg.

64 1/40 m 11 Bracco italiano

casalinga città n.p. neg. neg.

65 1/40 ms 4 Pastore tedesco

commerciale città n.a. neg. neg.

66 1/40 m 15 Meticcio commerciale campagna sintomi

nervosi+cutanei 1/40 1/80

67 1/80 m 13 Meticcio commerciale città osteosarcoma neg. neg.

68 1/40 m 1 Meticcio mista campagna n.p. neg. neg.

69 1/80 m 10 Meticcio

tg. grande mista campagna n.p. neg. neg.

70 1/40 ms 11 Meticcio

tg. grande mista città Addison neg. neg.

71 1/320 fs 8 Meticcio mista città n.p. neg. neg.

72 1/40 f 13 Meticcio mista campagna n.a. neg. neg.

73 1/40 m 7 Segugio Italiano


na n.a. neg. neg.

74 1/40 m 7 Bracco Italiano


na n.p. neg. neg.

75 1/80 m 13 Meticcio casalinga città linfoma neg. neg.

76 1/40 f 3 Meticcio commerciale città n.p. neg. neg.

77 1/40 fs 14 Meticcio commerciale città n.p. neg. neg.

78 1/40 fs 3 Pastore Tedesco


79 1/40 fs 11 Meticcio casalinga semicampag

na n.a. neg. neg.

80 1/40 f 11me

si Meticcio casalinga

semicampagna

n.p. neg. neg.

81 1/40 m 13 Golden

Retriever mista

semicampagna

tumore cell. Del Leydig

neg. neg.

82 1/80 ms 4 Bracco Italiano


83 1/40 ms 7 Meticcio mista città n.p. neg. neg.

56

84 1/40 f 15 Meticcio mista campagna

sint.nervosi + crisi

epilettiche+sintomi cutanei

neg. 1/80



87 1/80 fs 9 Meticcio casalinga città n.a. neg. neg.

88 1/40 ms 5 Meticcio mista campagna n.p. neg. neg.

89 1/40 m 2 Meticcio commerciale semicampag

na sintomi nervosi

+dermatite 1/160 1/80

90 1/40 f 5 Bovaro del

Bernese casalinga città n.p. neg. neg.

91 1/40 m 14 Meticcio mista città trombocitopenia

immunom. neg. neg.

92 1/40 m 8 Meticcio mista semicampag

na n.p. neg. 1/40

93 1/40 m 13 Meticcio mista città n.p. neg. neg.

94 1/40 fs 11me

si Meticcio mista città n.p. neg. neg.

94 1/40 f 8 Pastore Tedesco

mista campagna insufficienza

renale neg. neg.



mista semicampag

na n.p. neg. neg.

98 1/80 ms 15 Epagneul

Breton casalinga

semicampagna

n.p. neg. neg.

99 1/40 fs 8 Meticcio mista semicampag

na n.a. neg. neg.

100

1/40 fs 11 Meticcio mista semicampag

na anemia emolitica neg. neg.

101

1/40 m 2 Segugio Italiano

casalinga semicampag

na n.p. neg. neg.

102

1/40 f 6 Bracco Italiano

casalinga città n.a. neg. neg.

103

1/80 f 11 Meticcio mista campagna leucemia neg. neg.

104

1/20 f 14 Meticcio casalinga campagna n.p. neg. neg.

105

1/40 ms 4 Springer Spaniel Inglese


106

1/20 fs 3 Meticcio

tg. grande casalinga campagna

disfunzione poliorgano

1/640 neg.

107

1/20 fs 2 Meticcio

tg. grande mista campagna n.p. neg. 1/640

57

108

1/40 ms 15 Setter Inglese

mista città osteosarcoma neg. neg.

109

1/40 m 12 Springer spaniel inglese

casalinga campagna n.p. neg. neg.

110

1/80 m 5 Setter inglese

casalinga città n.a. neg. neg.

111

1/40 m 8 Meticcio casalinga città n.p. neg. neg.

112

1/80 m 9 Meticcio casalinga campagna n.p. 1/160 neg.

113

1/40 m 8 Meticcio casalinga campagna sintomi nervosi neg. 1/40

114

1/20 m 4 Meticcio casalinga città n.p. neg. neg.

115

1/40 f 3 Labrador Retriever


116

1/80 m 7 Epagneul

Breton casalinga campagna tumore epatico neg. neg.

117

1/40 f 8 Golden

Retriever mista città n.p. neg. neg.

118

1/40 m 8 Pastore Tedesco


119

1/40 f 11 Meticcio mista città n.a. neg. neg.

120

1/80 f 6 Meticcio mista campagna sindrome autoim. 1/320 neg.

121

1/40 f 1 Bracco Italiano


na n.p. neg. 1/640

122

1/40 m 9 Setter Inglese

mista semicampag

na n.p. neg. neg.

123

1/40 fs 10me

si Meticcio mista campagna neoplasia neg. neg.

124

1/40 f 4 Meticcio

tg. grande casalinga città n.p. neg. neg.

125

1/40 m 6 Meticcio commerciale semicampag

na n.p. neg. neg.

126

1/80 ms 11 Meticcio

tg. grande commerciale

semicampagna

n.p. neg. neg.

127

1/40 ms 5 Meticcio

tg. grande casalinga campagna n.p. neg. neg.

128

1/40 ms 9 Meticcio

tg. grande casalinga campagna anemia emolitica neg. neg.

129

1/40 ms 5 Meticcio casalinga città n.p. neg. neg.

130

1/80 m 7 Meticcio casalinga campagna n.p. neg. neg.

131

1/40 m 9 Labrador Retriever


132

1/40 ms 11 Setter Inglese

mista città insuf.mitralica neg. neg.

58

133

1/20 f 15 Meticcio

tg. grande mista campagna neoplasia neg. 1/80

134

1/40 f 13 Meticcio commerciale città n.p. neg. neg.

135

1/40 fs 5 Labrador Retriever


136

1/40 m 12 Meticcio casalinga campagna n.p. neg. neg.

137

1/40 ms 15 Bracco Italiano

casalinga campagna Sindrome di

Cushing neg. neg.

138

1/40 m 4 Setter Inglese


139

1/40 f 7 Meticcio

tg. grande casalinga campagna n.p. neg. neg.

140

1/40 f 14 Segugio Italiano


na crisi epilettiche 1/80 1/80

Legenda

-n.p.=assenza di patologia

-a.d.=assenza di dati anamnestici

-f=femmina intera.

-fs=femmina sterilizzata.

-m=maschio intero.

-ms=maschio sterilizzato.

-evidenziati in rosso: soggetti che manifestano sintomi riconducibili a T.gondii.

59

Capitolo 11 Discussione e conclusioni

La prevalenza da noi osservata si attesta intorno all’8%. I nostri dati, sono coerenti con parte

della letteratura consultata. Studi sulla sieroprevalenza di T.gondii nel cane riguardano

soprattutto la Cina e il Brasile, paesi dove questa patologia ha un importante impatto sulla salute

pubblica. In Cina è usuale un’alimentazione con carne di cane,questo rappresenta un rischio

elevato per la sanità pubblica e giustifica il numero elevato di indagini fatte in questo paese.

Sono presenti, tuttavia, anche alcuni studi che riguardano la siero prevalenza in Canada, negli

USA (in particolare in America Centrale), in Turchia, in Malesia e Arabia Saudita. Per quanto

concerne l’Europa, i dati provengono soprattutto dalle Baleari (Spagna), dall’Austria, dalle

Repubbliche Ceca e Slovacca e dalla Svezia. Dati italiani sono assenti. La prevalenza evidenziata

in questi lavori è molto variabile soprattutto per quanto riguarda la Cina, dove per ogni area

geografica, sono stati raccolti dati con i seguenti risultati: • nord-est 10%

• est 21,5%

• nord-ovest 11,6%

• ovest 10,42%

• sud-ovest 21,6%

Le titolazioni anticorpali sono medie, con il 50% dei sieri che ha un titolo di 1:20, il 32% 1:40, il

14% 1:80 e a 1:160 il 4% (Wu et al., 2011; Gang Duan et al., 2012; Wang et al., 2012 Yongmei

et al., 2012 ;Yang et al., 2013). Anche in Corea, così come nell’isola di Taiwan la siero

prevalenza è intorno ai 20% ( Nguyen et al., 2012; Tsai, 2008); in quest’ultima i sieri hanno una

titolazione molto alta:

� 122 con 1:32;

� 75 con 1:74;

� 28 con 1:128;

� 36 con 1:256;

� 15 con 1:512;

� 5 con 1 :1024;

� 3 con 1:2048.

In Brasile la sieroprevalenza di T.gondii nei cani si attesta intorno al 52% nell’area

amazzonica,di 21,8% nello stato di San Paolo, a sud del paese e del 22% nella zona sud

60

occidentale (Langoni et al., 2013;Plugge et al., 2011;Minervino et al., 2012); la titolazione

anticorpale in questo paese è alta, 1:200.

Oltre al Brasile, la siero prevalenza in America Centrale, in particolare nello Stato di Grenada, si

attesta intorno a 35,7% anche in un’altra zona, Stato di Trinitad e Tobago,33% (Ali et al.,2003).

La titolazione anticorpale riscontrata è molto alta: 8% ha titolo 1:3200, 10% 1:1600, 13 % 1:100,

10% 1:50 e 8% 1:25.

Per quanto riguarda gli Stati Uniti i dati prevalenti provengono dal Maryland dove la prevalenza

è del 32,2% (Child et Seegar, 1996) e dalla Virginia dove i cani positivi sono il 21% con

titolazione 1:50 (Rosypal et al., 2010); in Canada la prevalenza sfiora il 30% (Salb et al., 2008).

In Messico i cani risultati positivi sono stati 51,5% (Dubey et al., 2007), che con il Brasile sono i

paesi con più alta siero prevalenza di T.gondii nei cani; i titoli anticorpali riportati nello studio

messicano sono medio alti:

• 1:25 in 27 campioni;

• 1:50 in 11;

• 1:100 in 5;

• 1:200 in 4;

• 1:400 in 2;

• 1:800 in 2 ;

• 1:3200 in 1 .

(Dubey et al., 2007)

Studi del 2005 riportano una siero prevalenza nella città di Ankara, in Turchia, del 2,58% (

Aslantas et al., 2005), mentre più recentemente è stata valutata una percentuale del 15% nella

provincia di Kirikkale, nel centro dell’Anatolia con una titolazione di 1:16 (Yildiz et al., 2009). I

dati che provengono dalla Malesia e dall’Arabia Saudita sono molto bassi 9,6%

(Chandrawathani, 2008) e 3% ( Hossain, 1986), anche se la titolazione è alta (1:200).

In Europa la sieroprevalenza si attesta intorno al 59% sull’isola di Maiorca,in Spagna, (Cabezon

et al.,2010), 26% in Austria (Wanha et al., 2005), 20% in Repubblica Ceca e Slovacca (Hejlícek

et al., 1995)e 38 % in Portogallo.

I titoli anticorpali evidenziati in Spagna sono sostanzialmente bassi (1:25) ( Cabezon et al.,

2010), in Austria molto alti, infatti circa il 10% dei sieri hanno titolo 1:6400 (Wanha et

al.,2005). In Portogallo il 45,6 % dei campioni positivi ha titolo alto, infatti in 115 su 252 è di

1:160 (Lopes et al. , 2011).

61

Alla luce dei dati riportati, la sieroprevalenza riscontrata nella provincia di Pisa è pienamente in

accordo con la media delle altre aree analizzate ed anche le percentuali più basse, come quelle

della provincia di Livorno e Genova,non si discostano più di tanto dai dati più bassi riscontrati.

I dati riguardanti i singoli fattori di rischio sono pienamente concordanti; i campioni positivi

sono sia maschi che femmine, senza differenza significativa e per tutti gli autori il genere non è

associato all’insorgere dell’infezione da T.gondii nel cane (Yongmei et al., 2012; Na Yang et

al.,2013; Dubey et al., 2007; Wahna et al., 2005;Aslatas et al., 2005; Lopes et al., 2011).

Questo lavoro è stato possibile grazie alla collaborazione attenta e precisa delle strutture

veterinarie contattate, che mi hanno fornito i dati anamnestici sui cani in esame. La mia

attenzione si è concentrata su alcune informazioni fornitemi, che possono essere considerate o

essere solo apparentemente, i fattori di rischio della toxoplasmosi; avendo esclusivamente l’

anamnesi dei cani positivi, i dati rappresentano solo un’apparente tendenza della sieropositività.

A questo proposito appare interessante notare che l’unico campione con titolo anticorpale

elevato (il N.71 con 1/320) non presentava alcuna sintomatologia. Il fatto che a titoli anticorpali

bassi corrispondano segni clinici compatibili con toxoplasmosi potrebbero indicare una fase

acuta dell’infezione, come peraltro i titoli bassi degli animali asintomatici potrebbero indicare

fase acuta o essere il risultato di un’infezione pregressa.

La maggior parte dei campioni positivi appartengono a cani maschi, tuttavia la percentuale delle

femmine non vi si discosta troppo(42%femmine, 58%maschi); questo non è un dato molto

rilevante,sia perché i sieri inizialmente analizzati erano soprattutto di maschi, sia perché non

valuto il genere un elemento discriminante per l’infezione.

L’età,invece,è un carattere determinante in quest’analisi; il 51% dei positivi sono cani anziani,

che hanno un’età superiore agli 8 anni, mentre solo il 5% sono giovani, fino all’anno di età. L’età

più elevata giustifica la maggior prevalenza, poiché, probabilmente, questi cani hanno avuto

maggiori occasioni per poter venire a contatto con il parassita, rispetto a quelli dai 2 agli 8

anni,che comunque hanno una percentuale elevata (44%); in queste due classi l’infezione è

sicuramente post natale acquisita. Tra i cuccioli solo 7 sono positivi e è alta la probabilità che

siano stati infettati o per via congenita o transcolostrale, ma non è esclusa una nuova infezione.

I meticci e i cani “di razza” positivi sono in sostanziale equilibrio, ma il dato rilevante è che in

entrambe le categorie siano presenti cani di taglia medio grande e comunque di indole attiva;

poiché l’elemento essenziale per il contagio postnatale è il contatto con animali o aree infette è

evidente l’importanza dell’attitudine e del movimento di questi cani. 33 soggetti appartengono a

razze prettamente utilizzati per la caccia, come il “Epagneul Breton ” o il ”Segugio Italiano”che

vengono a contatto con prede selvatiche e con feci di felini, durante la loro attività venatoria. Tra

i positivi si evidenziano,soprattutto, il Pastore Tedesco, Pitt Bull, Rottweiler, Pastore

62

Maremmano,razze dinamiche e vivaci, mentre solo 1-2 soggetti possono essere definiti ”da

appartamento”, quali per esempio la razza maltese.

Le caratteristiche che maggiormente rappresentano un fattori di rischio sono l’habitat di vita e il

tipo di alimentazione , che sono spesso collegati; i cani che vivono in campagna sono quelli

maggiormente presenti( 72), mentre quelli che vivono in aree urbane sono solo 69.27 cani

provengono da zone non definite città, perché in paesi piccoli o comunque a contatto frequente

con aree aperte e animali selvatici. Dalle mie indagini ho potuto evincere che molti soggetti che

vivono in città vengono portati con frequenza in aree rurali e che solo una piccola percentuale ha

effettivamente una vita strettamente urbana. La prevalenza maggiore si evidenzia nella provincia

di Pisa,dove la percentuale nella sola città è del 13,2%,giustificata però dalla geografia di questa

zona, che presenta molti piccoli paesi semirurali al confine con la città, appartenenti però allo

stesso comune. Sono molto più basse le percentuali di Livorno(8,39%), di Genova (8,42%) e

Firenze (3,59%), dove i comuni sono costituiti prevalentemente da sole zone urbane.Un dato

rilevante è quello riguardante l’alimentazione: solo 49 cani vengono abitualmente alimentati con

cibo prettamente commerciale , mentre a 51 soggetti è fornito un cibo misto, cioè sia acquistato,

in preparati umidi o secchi,sia casalingo; in quest’ultima categoria rientrano sia gli avanzi della

tavola sia alimenti preparati per il cane. 40 soggetti sono alimentati solo con preparati

casalinghi. Questi dati sono molto importanti poiché una delle vie di trasmissione più frequente è

proprio alimentazione con carni crude o poco cotte.

L’anamnesi sanitaria dei cani è fondamentale per poter capire quali siano maggiormente colpiti;

purtroppo non ho potuto risalire allo stato di salute di tutti i campionati. Dai risultati ottenuti è

possibile evidenziare come tra i cani esaminati, 44 siano affetti da patologie gravi,croniche e

debilitanti; è stato interessante notare che 9 soggetti presentano sintomi associabili a

toxoplasmosi, quali crisi epilettiche, sindromi cerebrali, alterazione della vista e patologie

dermiche. Per molti di essi non era ancora stata definita una diagnosi certa,vista la variabilità dei

sintomi. Tra i soggetti “sintomatici”i titoli anticorpali non sono alti (8 a 1/40,mentre 1 a 1/20) e

8 sono risultati positivi anche a Neospora e Leishmania.

19 cani presentano possibili coinfezioni con sintomatologia più o meno evidente:

• 3 sono sieropositivi per Toxoplasma, Neospora e Leishmania e hanno sintomi nervosi,

crisi epilettiche e dermatite( 2%); In tutti questi casi il titolo anti toxoplasma è inferiore a

quello anti neospora, pertanto è legittimo sospettare che si tratti di cross reazioni. Per

quanto riguarda leishmania i cani N. 89 e 140 hanno titoli positivi, per quanto riguarda il

N. 66 sarebbero richieste ulteriori indagini per confermare.

63

• 6 cani(4%) mostrano solo anticorpi per Leishmania e Toxoplasma di cui 1 è affetto da

dermatiti,insufficienza renale e sintomi nervosi;

• 10 cani sono positivi per Toxoplasma e Neospora(10%), di cui 4 presentano sintomi

nervosi,cerebrali e cataratta e i restanti 6 sono affetti da patologie degenerative. Anche in

questo caso la metà dei campioni presentano titoli più elevati per Neospora facendo

sospettare una cross reazione nei confronti di Toxoplasma. La prevalenza totale dei

positivi a Toxoplasma è dell’ 8% per Neospora, mentre per Leishmania del 6%.

È importante sottolineare, però, che visti i bassi titoli anticorpali di Neospora nei

campioni analizzati, non è possibile escludere una cross-reazione anticorpale.

La maggior parte degli studi concordano sul fatto che la siero prevalenza si evidenzi soprattutto

in cani sopra ai 6-8 anni per la maggior possibilità di contatto con ambiente infetto; viene,

quindi, considerato un fattore di rischio l’habitat del cane, evidenziando l’importante differenza

tra le positività riscontrate in zone prettamente urbane e quelle rurali o semi rurali (Yongmel et

al., 2012; Na Yang et al., 2013; Dubey et al., 2007; Dubey et al., 2008; Ali et al., 2003; Nguyen

et al., 2012; Lopes et al., 2011; Gang Duan et al., 2012; Wang et al., 2012; Langoni et al., 2013).

I dati raccolti in questo lavoro concordano anche per quanto riguarda l’alimentazione del cane;

sussiste una differenza significativa tra soggetti che ricevono un’alimentazione solo commerciale

e quelli che si cibano di avanzi (soprattutto visceri crudi e poco cotti) o con alimentazione

casalinga ( Lopes et al., 2011;Duan et al., 2012;Ali et al., 2003).

Le coinfezioni tra T.gondii con N.caninum e L.infantum sono molto frequenti e sono numerosi i

lavori sul tema,soprattutto effettuati in Brasile, Corea, Cina e Turchia. T.gondii e N.caninum

sono molto simili, sia nel ciclo, sia per i sintomi sia per la distribuzione geografica e lo sono

anche i fattori di rischio che le favoriscono; questo potrebbe essere il motivo della loro frequente

presenza in associazione (Minervino et al., 2012). Per quanto riguarda L.infantum l’elevata

presenza potrebbe essere collegata all’immunodepressione da essa determinata, che può favorire

l’infezione malattie concomitanti. Tutti gli studi concordano sul fatto che, anche nelle

confezioni, i fattori di rischio sono prevalentemente l’habitat di vita, l’età e il tipo di

alimentazione (Nguyen et al., 2012;Plugge et al., 2011; Minervino et al., 2012); in pochi studi,

tuttavia, è stato evidenziato come N.caninum sia meno influenzata dall’ambiente rispetto a

T.gondii (Yildiz et al., 2009).

Nelle coinfezioni sono frequenti forme nervose e cutanee, come risulta anche da questo studio,

spesso difficili da curare e anche da diagnosticare in modo certo, visto la similarità e la

variabilità dei sintomi (Hoffman et al., 2012).

La maggior parte della bibliografia riporta l’infezione crociata di T.gondii e N.Caninum,con

sintomi nervosi e cutanei similari(Dubey et al., 2007)e con le seguenti percentuali di confezione :

64

• 4,97%Stato di San Paolo (Brasile) (Langoni et al., 2013);

• 2,72% Stato di Paranà (Plugge et al., 2011 );

• 0,72 Corea (Nguyen et al., 2012);

• 1,7% Austria (Wanha et al., 2005)

Le percentuali evidenziate in questo lavoro sono più alte,ma , come detto in precedenza, visti i

bassi livelli anticorpali, non può essere esclusa una cross-reazione.

T.gondii è considerata una delle principali cause di sintomi neurologici del cane e N.caninum

può essere valutata come diagnosi differenziale o come infezione concomitante e la

differenziazione deve essere eseguita con metodi sierologici ( Langoni et al., 2012). Studi

crociati T.gondii e L.infantum sono soprattutto brasiliani e mettono in evidenza la stretta

connessione tra l’immunodepressione sostenuta da Leishmania e l’insorgere d’ infezione

sostenuta Toxoplasma( Paulan et al., 2013). La prevalenza globale di Leishmania, cioè su tutti i

sieri esaminati, è di circa 20%, ciò potrebbe significare che la coinfezione può rappresentare un

campione casuale di sieri di animali viventi in zona endemica.

65

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96

Grazie……

…alla Professoressa Mancianti, per l’attenzione, la dedizione, la pazienza e il

tempo dedicatomi; per avermi aiutato e seguito anche ad agosto, nonostante fosse

in ferie.

Una delle migliori professioniste e persone che ho incontrato in questi anni

universitari.

…alla Dottoressa Nardoni, sempre presente, disponibile ed attenta ad ogni mia

necessità; grazie per la pazienza e la qualità del tempo che m’ha dedicato.

…al Dottor Papini, per l’aiuto, l’attenzione e la professionalità che ha messo a mia

disposizione.

…a Linda e Guido, perché non solo mi hanno seguito con serietà e professionalità,

ma anche guidato, consolato e dato coraggio, come dei veri amici.

…a mamma e babbo, perché hanno sempre creduto in me, più di quanto abbia fatto

io.

…a Alessio, per il suo immenso amore.

…a Barbara e Federica, perchè mi hanno insegnato che nella vita, se vogliamo,

tutto è possibile.

…a nonna, per avermi coccolato, come solo lei sa fare.

…a Enrico, per la sua dolcezza, il suo amore e l’infinita pazienza…

…a Haidi, insostituibile compagna di vita e di tante giornate sui libri…

…a Camilla e a tutti i miei animaletti, per avermi fatto capire quale fosse la mia

strada.

…a Francesca ,una grande amica ed una grande collega….la migliore che potessi

avere….

97

…a Serena, per la sua insostituibile amicizia, pazienza e per tutto il tempo che mi

ha dedicato.

…a Federica ed Erica, le migliori amiche che si possano avere.

…a Alessandro, Federico, Patrizio e a tutti gli altri amici sinceri….per avermi

sopportato e ascoltato, anche nei miei momenti peggiori.

…a me…perché ce l ho fatta!

Infezione toxoplasmica nel cane: indagine sierologica ... · la reale importanza di questa...

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