cchhaapptteerr  ssiixx  

ABSTRACT In this chapter, our initial observations on activation of the complement system by poly(amino  acid)  (PAA)‐liposomes  are  reported. Complement  activation by PAA‐liposomes was evaluated  in vitro using an SC5b‐9 ELISA and a red blood cell  lysis  assay,  and  in  a  porcine  model  of  liposome‐induced  complement‐activation  related  cardiopulmonary  distress.  Like  other  liposome  types,  PAA‐liposomes also appear to activate the complement system.                               

90  

CCoommpplleemmeenntt  aaccttiivvaattiioonn  bbyy  PPAAAA‐‐lliippoossoommeess  

INTRODUCTION Long‐circulating, sterically stabilized liposomes (often also referred to as ʹstealthʹ liposomes)  are  frequently  used  as  pharmaceutical  carriers  (1).  Their  delivery concept makes use of  their passive  targeting properties  to  tumors  and  sites of inflammation, where they can extravasate due to the enhanced permeability and retention (EPR) effect (2). A steric stabilization layer of a hydrophilic polymer on the liposome surface, such as the frequently used poly(ethylene glycol) (PEG), is responsible for the reduced uptake by cells of the mononuclear phagocyte system which  in turn results in prolonged circulation times as compared to non‐coated liposomes.  Liposomes  ‐  coated  but  also  uncoated  ‐  have  been  reported  to  activate  the complement  system  in  preclinical  studies  (3).  In  the  clinical  setting,  adverse respiratory,  hemodynamic  and  hematological  changes  may  occur  in  patients upon  complement  activation  and potentially  lead  to  hypersensitivity  reactions (HSR)  which  occur  immediately  upon  intravenous  administration  and  are reflected in changes in systemic blood pressure and respiration rate, facial edema and  chest  and  back  pain  (4).  In  a  porcine  model  of  liposome‐induced cardiopulmonary  distress,  it  was  demonstrated  that  the  liposome‐induced hemodynamic reactions are very similar to the observed human hypersensitivity responses, and  likely a  consequence of  complement activation  (4). We  recently designed alternative sterically stabilizing polymers based on poly(amino acid)s (PAAs),  in  particular  poly(hydroxyethyl  L‐glutamine)  (PHEG)  and poly(hydroxyethyl L‐asparagine) (PHEA), both coupled to a hydrophobic anchor to  graft  them  onto  the  liposome  bilayer  (5).  To  evaluate whether  PAA‐coated liposomes activate the complement system, initial experiments with PHEA‐ and PHEG‐liposomes  in vitro were carried out, using an SC5b‐9 ELISA assay and a red  blood  cell  lysis  assay.  With  the  SC5b‐9  ELISA  activation  of  all  three complement  pathways  (classical,  alternative  and  lectin  pathway)  in  human serum samples can be assessed  (6). SC5b‐9  is  the soluble, non‐lytic  form of  the terminal complement complex (TCC), which is generated by the assembly of the complement  factors C5‐C9 and  subsequent binding  to  the  regulatory S protein (7).  The  amount  of  SC5b‐9  is  proportional  to  the  total  generated  TCC  and therefore  total  complement  activation.  With  the  red  blood  cell  lysis  assay functional complement can be assessed.  In addition  to  the  in vitro experiments, the potential of PAA‐liposomes to evoke hypersensitivity reactions in the porcine model was studied.  

    91  

cchhaapptteerr  ssiixx  

MATERIALS AND METHODS Materials.  Poly(hydroxyethyl  L‐asparagine)‐N‐succinyldioctadecylamine (PHEA‐DODASuc, average MW = 3000 Da, determined by NMR and MALDI‐ToF mass spectrometry, corresponding to an average degree of polymerization of 15)  and  poly(hydroxyethyl  L‐glutamine)‐N‐succinyldioctadecylamine  (PHEG‐DODASuc, average MW = 4000 Da, determined by NMR and MALDI‐ToF mass spectrometry, corresponding to an average degree of polymerization of 18) were synthesized  as  described  previously  (5).  Dipalmitoyl  phosphatidylcholine (DPPC) was  donated  by  Lipoid GmbH,  Ludwigshafen, Germany.  Cholesterol was purchased  from Sigma‐Aldrich Chemie BV, Zwijndrecht, The Netherlands. The  SC5b‐9 ELISA  kit was  purchased  from Quidel Co.,  San Diego, CA, USA. Sheep  erythrocytes  were  obtained  from  the  Walz  farm,  Hagerston,  MD. Hemolysin was a product of Research Diagnostics, Inc., Concord, MA. All other reagents were of analytical grade.   

Liposome preparation. PHEA‐ and PHEG‐liposomes were prepared by a film‐extrusion  method  (8).  A  lipid  mixture  composed  of  DPPC/cholesterol/PAA (molar  ratio  1.85:1:0.15)  was  dissolved  in  about  10  mL  of  a  mixture  of chloroform/methanol (1:1 v/v) in a 100 mL round‐bottom flask. A lipid film was obtained by evaporation of  the  solvent under  reduced pressure at 50  ˚C. After flushing with nitrogen,  the  lipid  film was hydrated  in  20 mL HEPES buffered saline  (HBS,  10  mM  HEPES,  0.9%  NaCl,  pH  7.4)  yielding  a  total  lipid concentration  of  60  μmol/mL.  Liposomes  were  sized  by  multiple  extrusion through polycarbonate  filters with a high‐pressure extrusion device. The mean particle size and polydispersity index of the liposome dispersions (diluted 1:10 in HBS)  were  determined  by  dynamic  light  scattering  (DLS)  using  a  Malvern ALV/CGS‐3 Goniometer. Phospholipids were quantified spectrophotometrically according to the method of Rouser (9).  

SC5b‐9 ELISA. Serum  from healthy volunteers was  incubated with  the PAA‐liposome  formulations  (4:1 v/v, 8 μmol  total  lipid/mL)  for 30 minutes at 37  °C. After incubation the samples were diluted 20‐fold in the  ‘sample diluent’ of the SC5b‐9 ELISA kit and 100 μL from this mixture were applied into the wells of the ELISA plate in triplicate. For a schematic representation of the assay principle see Figure 1 (for a detailed description of the method see (6)).    

92  

CCoommpplleemmeenntt  aaccttiivvaattiioonn  bbyy  PPAAAA‐‐lliippoossoommeess  

 

 

             Figure 1. Schematic representation of the SC5b‐9 ELISA assay principle. Upon possible liposome‐induced complement activation in the serum samples the SC5b‐9 complex  is  formed. Samples are transferred  to  wells  of  the  ELISA  plate,  which  are  coated  with  anti  SC5b‐9  antibodies.  After binding of the generated SC5b‐9 to these antibodies, a horseradish peroxidase (HRP)  ‐conjugated secondary antibody  is added, which binds  to  epitopes of  the SC5b‐9 complex. HRP  subsequently cleaves a chromogenic substrate which can be assessed spectrophotometrically at 405 nm. SC5b‐9 concentrations in the samples were calculated using a standard curve. 

Red  blood  cell  lysis  assay.  Liposomes  were  incubated  with  pig  serum  or heparinized  plasma  for  30  minutes  (1:4  v/v,  8  μmol  total  lipid  /mL)  and subsequently diluted  five‐fold  in veronal buffered saline  (VBS) containing 0.2% gelatine.  For  sensitization,  sheep  erythrocytes were  incubated with  rabbit  anti sheep  erythrocyte  antiserum  (hemolysin)  (1000:1).  Sensitized  erythrocytes (approximately 2×108 cells in 200 μL VBS) were added to 25 μL of the liposome‐incubated serum samples in quadruplicate in a 96‐well plate and incubated for 1 hour  at  37  °C with  shaking.  After  centrifugation  at  4000  rpm  for  10 min  to remove  intact erythrocytes, hemolysis was assessed  from  the optical density of the  supernatant  at  405  nm  using  a  spectrophotometer.  Erythrocyte  lysis was calculated  relative  to  the  VBS  buffer  control.  Figure  2  shows  a  schematic representation of the assay principle (for a detailed description of the method see (10)).    

    93  

cchhaapptteerr  ssiixx  

 

 

             Figure  2.  Schematic  representation  of  the  red  blood  cell  lysis  assay  principle.  Liposomes  are incubated with pig serum or plasma. When the complement system is activated by the liposomes, complement  (C)  is  consumed.  Samples  are  mixed  with  sensitized  sheep  erythrocytes.  After incubation and centrifugation, activation of residual complement is assessed from hemolysis in the supernatant by spectrophotometric analysis.   

In vivo assay. Experiments were performed in accordance with guidelines of the Committee on Animal Care of the Uniformed Services University of the Health Sciences. Male Yorkshire swine (weight between 10‐25 kg) were sedated with an intramuscular injection of ketamine, intubated, anesthetized with isoflurane and subsequently  instrumented as described previously  (4).  In brief, a catheter was inserted via  the  right  internal  jugular vein  into  the pulmonary  artery;  another catheter was introduced through the right femoral artery into the proximal aortic arch  to measure  the central  systemic arterial pressure. Furthermore, heart  rate, blood  oxygen  and  CO2  levels  were monitored.  PHEA‐  and  PHEG‐liposomes were  diluted  in  PBS  to  the  desired  dose  (see  Table  1)  at  an  injection  rate  of approximately  2.5  mL/s,  injected  into  the  jugular  vein  in  1  mL  boluses  and flushed into the circulation with 10 mL PBS. Based on the changes in the systemic arterial  pressure,  heart  rate  and  blood  gas  levels,  reactions were  classified  as follows: none  (no significant changes  in any of  the measured parameters), mild (transient  50% changes  in at  least one of  the measured parameters) and lethal  (circulatory  collapse  within  2  min  requiring  resuscitation  with  i.v. epinephrine and cardiac massage).  

94  

CCoommpplleemmeenntt  aaccttiivvaattiioonn  bbyy  PPAAAA‐‐lliippoossoommeess  

RESULTS AND DISCUSSION Liposomes had a diameter of approximately 100 nm as determined by DLS, with a  polydispersity  index  below  0.1,  indicating  a  relatively  homogenous  size distribution. The SC5b‐9 ELISA assay was used  to quantify  the soluble  form of the  terminal  complement  complex  in  human  serum  samples  after  incubation with  liposomes. Figure 3 shows the results of a typical experiment. PHEA‐ and PHEG‐liposomes  induce  formation  of  SC5b‐9  in  a  concentration‐dependent manner,  indicating  complement  activation.  In  this  assay,  PHEG‐liposomes appear  to  activate  the  complement  system  to  a  higher  extent  than  PHEA‐liposomes. 

 Figure  3.  In  vitro  complement activation assessed by  the SC5b‐9 ELISA  assay.  SC5b‐9  level  of PHEA‐  (♦)  and  PHEG‐  (■) liposomes  as  a  function  of liposome  concentration  in  a representative  serum  sample. Zymosan,  a  potent  complement activator,  was  used  as  a  positive control  (○). Bars  represent means ± SD for three wells. 

Besides the SC5b‐9 ELISA, also a red blood cell lysis assay was used to assess the complement consumption by PAA‐liposomes in pig serum or plasma. This assay was adapted from the CH50 assay according to Mayer (11). It is an indirect assay that  measures  the  ability  of  liposome‐incubated  serum  or  plasma  to  lyse erythrocytes  of  a  standardized  suspension  of  sheep  erythrocytes  coated with anti‐erythrocyte antibodies. The stronger the complement activation induced by liposomes,  the more  complement  factors will  be  consumed during  incubation, leading to a reduced  lysis of erythrocytes. In line with the results of the SC5b‐9 assay,  PHEG‐liposomes  are  a  stronger  activator  when  compared  to  PHEA‐liposomes, whereas the latter are not significantly different from the VBS buffer control (Figure 4).     

    95  

cchhaapptteerr  ssiixx  

 Figure 4. Red blood cell  lysis as  a measure  for  complement consumption  in  pig sera/plasma  relative  to  VBS buffer  after  incubation  with the  different  liposome formulations.  Bars  represent means ± SD of three serum or plasma  samples.  Zymosan was used as a positive control (50 mg/mL).   

An  in  vivo  assay  to  assess  complement‐related  HSR  was  performed.  The observed physiological  reactions  in  the pigs were  similar  to  those observed  in earlier  studies:  temporary  decreases  in  systemic  arterial  pressure,  heart  rate, respiration rate and changes in pCO2 (4). In Table 1 the results are shown. Both formulations  induced  acute  HSR  in  the  pigs,  with  again  PHEG‐liposomes exerting a stronger effect than PHEA‐liposomes.   Table 1. Hypersensitivity reactions in the porcine model.

Liposome type  Lipid dose (μmol/kg) 

Frequency of reactions 

Severity of reactions 

PHEA  0.29‐0.85  2/3  none (1), mild (2) PHEG  0.26‐1.38  3/3  mild (2), severe (1) 

 The blood pressure curves in Figure 5 show typical progressions as seen also for other types of liposomes and zymosan: the mean systemic artery pressure (SAP) increased slightly, and then dropped about 40 mmHg. The span between systolic and diastolic SAP was  reduced at  the start of  reaction, which  is approximately one minute after administration. The mean pulmonary artery pressure increased about 15 mmHg during the reaction. The reaction took approximately 3 minutes and was followed by a spontaneous recovery. Reactions were reproducible in the same animal (Figure 6).   

96  

CCoommpplleemmeenntt  aaccttiivvaattiioonn  bbyy  PPAAAA‐‐lliippoossoommeess  

             Figure 5. Pressure  curves  of  systemic  arterial pressure  (SAP,  light grey  curve,  left y‐axis)  and pulmonary arterial pressure  (PAP, dark grey curve, right y‐axis) after  injection of PHEG‐coated liposomes (0.28 μmol total lipid/kg). Injection was given at 0 min. 

 

               Figure 6. Pressure  curve  of  systemic  arterial pressure  (SAP)  after  repeated  injection  of PHEG‐coated liposomes (4.7 μmol total lipid/kg).  

 

 

Thus,  the  in  vitro  and  in  vivo  experiments  reveal  that  PHEA‐  and  PHEG‐liposomes can activate  the complement  system and  induce HSR  in  the porcine model. This is in line with earlier findings on the complement activation by other types  of  liposomes,  e.g.  PEG‐liposomes  (12). As  yet,  it  is  not  clear  how  these reactions depend on  factors  like  lipid dose/composition and animal species. As 

    97  

cchhaapptteerr  ssiixx  

pointed  out  previously,  the  pigs’  uniquely  sensitive  reaction  to  liposomes represents  a model  of  those  2‐7%  hypersensitive  humans  who  respond  with severe HSR to certain liposomal drugs or diagnostic agents (4). In addition, other factors, like the role of endotoxin contamination of our preclinical formulations, need  to  be  addressed. Regarding  the  latter  aspect  though,  it  has  been  shown previously  both,  in  vitro  and  in  vivo  that  endotoxin  contamination  is  not responsible for liposome‐induced complement activation (13,14).    

98  

CCoommpplleemmeenntt  aaccttiivvaattiioonn  bbyy  PPAAAA‐‐lliippoossoommeess  

REFERENCES 1.   V. P. Torchilin (2005) Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug 

Discov 4, 145‐160. 2.   H. Maeda, J. Wu, T. Sawa, Y. Matsumura, and K. Hori (2000) Tumor vascular permeability and 

the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Release 65, 271‐84 3.   J. Szebeni (1998) The interaction of liposomes with the complement system. Crit Rev Ther Drug 

Carrier Syst 15, 57‐88. 4.   J. Szebeni, J. L. Fontana, N. M. Wassef, P. D. Mongan, D. S. Morse, D. E. Dobbins, G. L. Stahl, R. 

Bunger, and C. R. Alving (1999) Hemodynamic changes induced by liposomes and liposome‐encapsulated  hemoglobin  in  pigs:  a model  for  pseudoallergic  cardiopulmonary  reactions  to liposomes.  Role  of  complement  and  inhibition  by  soluble  CR1  and  anti‐C5a  antibody. Circulation 99, 2302‐2309. 

5.   J. M. Metselaar, P. Bruin, L. W. de Boer, T. de Vringer, C. Snel, C. Oussoren, M. H. Wauben, D. J.  Crommelin, G.  Storm,  and W.  E. Hennink  (2003) A  novel  family  of  L‐amino  acid‐based biodegradable  polymer‐lipid  conjugates  for  the  development  of  long‐circulating  liposomes with effective drug‐targeting capacity. Bioconjugate Chem 14, 1156‐1164. 

6.   J. Szebeni, N. M. Wassef, K. R. Hartman, A. S. Rudolph, and C. R. Alving (1997) Complement activation in vitro by the red cell substitute, liposome‐encapsulated hemoglobin: mechanism of activation and inhibition by soluble complement receptor type 1. Transfusion 37, 150‐159. 

7.   W. P. Kolb, and H. J. Muller‐Eberhard (1975) The membrane attack mechanism of complement. Isolation and subunit composition of the C5b‐9 complex. J Exp Med 141, 724‐35. 

8.   S. Amselem, A. Gabizon, and Y. Barenholz (1993) A large‐scale method for the preparation of sterile and non‐pyrogenic liposomal formulations of defined size distributions for clinical use, in Liposome Technology (G. Gregoriadis, Ed.) pp 501‐525, CRC press, Boca Raton. 

9.   G. Rouser, S. Fleischer, and A. Yamamoto (1970) Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids 5, 494‐496. 

10.      J. Szebeni, L. Baranyi, S. Savay, J. Milosevits, M. Bodo, R. Bunger, and C. R. Alving (2003) The interaction  of  liposomes with  the  complement  system:  in  vitro  and  in  vivo  assays. Methods Enzymol 373, 136‐154. 

11.  M. M. Mayer (1961) Complement and complement fixation,  in Kabat and Mayerʹs Experimental Immunochemistry,  2nd  ed.    (E.  A.  Kabat  and M. M. Mayer,  Eds.),  pp.  133‐240,  Charles  C. Thomas, Springfield, IL. 

12.   S. M. Moghimi,  and  J.  Szebeni  (2003)  Stealth  liposomes  and  long  circulating  nanoparticles: critical issues in pharmacokinetics, opsonization and protein‐binding properties. Prog Lipid Res 42, 463‐478. 

13.   J. Szebeni, L. Baranyi, S. Savay, M. Bodo, D. S. Morse, M. Basta, G. L. Stahl, R. Bunger, and C. R. Alving  (2000)  Liposome‐induced  pulmonary  hypertension:  properties  and mechanism  of  a complement‐mediated pseudoallergic reaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol 279, 1319‐1328 

14.   J. Szebeni, N. M. Wassef, A. S. Rudolph, and C. R. Alving  (1995) Complement activation by liposome‐encapsulated  hemoglobin  in  vitro:  the  role  of  endotoxin  contamination. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 23, 355‐63. 

 

    99