INCUBACIÓN EMBRIONARIA EN OSTREA CHILENSIS …
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Profesor Patrocinante: Dr. Oscar Chaparro Torres Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile Profesor Informante Dr. Jorge Navarro A. Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile Profesor Informante Dr. Carlos Bertrán V. Instituto Ciencias Marinas y Limnológicas Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile INCUBACIÓN EMBRIONARIA EN OSTREA CHILENSIS: ENTENDIENDO LA RELACIÓN MADRE-EMBRIÓN Tesis de grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Biología Marina y Título profesional de Biólogo Marino. DANIELA AZMABET MARDONES TOLEDO VALDIVIA – CHILE 2015
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Profesor Patrocinante: Dr. Oscar Chaparro Torres
Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas
Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile
Profesor Informante
Dr. Jorge Navarro A.
Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas
Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile
Profesor Informante
Dr. Carlos Bertrán V. Instituto Ciencias Marinas y Limnológicas
Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile
INCUBACIÓN EMBRIONARIA EN OSTREA CHILENSIS: ENTENDIENDO LA RELACIÓN MADRE-EMBRIÓN
Tesis de grado presentada como parte de los
requisitos para optar al grado de Licenciado
en Biología Marina y Título profesional de
Biólogo Marino.
DANIELA AZMABET MARDONES TOLEDO
VALDIVIA – CHILE
2015
I
AGRADECIMIENTOS
Cuando decides iniciar un camino fuera de casa preparas un equipaje lleno de ilusiones,
objetivos y metas. Dejas de lado los temores y te sientes valiente, ya que por primera vez has sido
tu quien ha tomado la decisión de dar el primer paso para crear tu futuro. Te enfrentas a un lugar
donde las diferencias no dejan espacio para encontrar algún parecido a lo que has dejado atrás y
lo más cercano a ti, es la presencia de cientos de jóvenes con una mochila llena de ilusiones
propias que vienen por lo mismo que tu. En cosa de segundos te das cuenta que estas solo y
cometes el error de mentalizar que el “solo” será la gran compañía de esta carrera hasta su fin. Es
aquí donde me detengo y como en una película recorro en cosa de segundo los años pasados y
con agrado recuerdo que sola no he corrido.
Doy gracias a Dios mi sustento diario, aun que a veces discutimos y decido dar termino a
nuestra relación, el nunca me ha demostrado un fin. Gracias por darme una madre maravillosa a
quien agradezco diariamente sus esfuerzos y sus sonrisas para lograr en mí una persona con
principios y con anhelos de estudiar. Gracias por poner desde el primer día de universidad a una
gran amiga con quien he compartido grandes momentos como, el disfrutar un kilo de frutillas
endulzadas con azúcar luego de un trote, el secar nuestras lagrimas en tiempos de tristezas, el
reírnos sin parar cuando las noticias eran mas que agradables, gracias negrita Loreto por ser junto
a Javierito parte de esta etapa de mi vida.
Gracias por que existe alguien que sabe preparar un gran café, no cualquier café, me
refiero a un café preparado con gran sencillez pero con elegancia, un café que en su aroma sientes
una cálida hospitalidad, un café que te demuestra que el trabajo realmente dignifica y que la
ciencia se hace mas grata al beber un sorbo de este, un café que te enseña a valorar lo que has
aprendido, un café que demuestra que el día en el laboratorio no se inicia con un simple saludo.
Gracias Dr. Oscar Chaparro por la preparación perfecta de este café.
Agradezco a mis profesores informantes Dr. Jorge Navarro y Dr. Carlos Bertrán por
aceptar ser parte de la comisión evaluadora, entregándome criticas constructivas para mejorar la
calidad de esta tesis.
Gracias a todos aquellos que de alguna manera han deseado que esta etapa llegue ha su
fin. Gracias a Jaime por su silencio constate en el laboratorio y sus palabras exactas en el
II
momento preciso, a Maria Elisa y Mauro por su alegría y animo incondicional diario, a Cote y
Sarita por ese la amistad creada y ese ‘ya pues Dani termina tu tesis’. A Cristian, por esos
mensajes infaltable en mi correo electrónico de cada lunes, que decía, “que tenga una linda
semana y cuando termine su tesis celebraremos con un ruso negro”.
Agradezco el financiamiento entregado, para la realización de esta tesis, por el Proyecto
FONDECYT 1141052 a cargo del Dr. Oscar Chaparro, titulado “Hatching process in brooding
molluscs: More complex that thougth before”.
III
INDICE
1. RESUMEN .......................................................................................................................... 1
1.1 Abstract ............................................................................................................................. 3
2. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 5
2.1. Hipotesis........................................................................................................................... 9
2.2. Objetivos .......................................................................................................................... 9
3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................... 11
3.1 Endoscopia de la cavidad incubatoria .............................................................................. 11
3.2 Transporte de las agregaciones de partículas y de los embriones en los canales de
alimentación .......................................................................................................................... 13
3.3 Relación embriones-palpos bucales maternos .................................................................. 15
3.4 Análisis estadístico .......................................................................................................... 15
4. RESULTADOS ................................................................................................................. 17
4.1. Transporte de agregaciones de partículas y embriones-larvas en los canales de
alimentación .......................................................................................................................... 17
4.2. Velocidad de transporte de alimento y embriones-larvas ............................................. 18
4.3. Relación entre palpos bucales maternos y embriones .................................................. 20
5. DISCUSIÓN ...................................................................................................................... 22
6. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 31
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Ostrea chilensis. Diagrama de la cavidad paleal de una hembra incubante.
Veligeras alrededor de los palpos bucales. A: anterior, CD: canal dorsal, CV: canal ventral, M:
boca, P: posterior, Pa: palpos bucales, CC: contracorriente……………………………………. 39
Figura 2: Ostrea chilensis. Transporte de las agregaciones de alimento a través de los canales de
alimentación en ostras adultas (A) periodo no-incubante y (B) durante periodo incubatorio. CD:
canal dorsal; CV: canal ventral. La letras sobre las barras indican diferencias significativas
(p<0.05); media + SD…………………………………………………………………………… 40
Figura 3: Ostrea chilensis. Uso de los canales de alimentación para mover las partículas de
alimento en hembras incubando embriones en estadios inicial o avanzado de desarrollo
(embriones tempranos y velígeras avanzadas). CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes
letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05); media + SD….…………41
Figura 4: Ostrea chilensis. Utilización porcentual de los canales de alimentación maternos, en el
transporte de embriones tempranos y velígeras avanzadas. CD: canal dorsal; CV: canal ventral.
Las diferentes letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05); media +
SD……………………………………………………………………………………………….. 42
V
Figura 5: Ostrea chilensis. Velocidad promedio de transporte de los agregados de alimento a
través de los canales branquiales en dirección a la boca, en hembras fuera del periodo de
incubación. CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras indican
diferencias significativas (p <0,05); media + SD……………………………………………….. 43
Figura 6: Ostrea chilensis. Velocidad de transportes de las partículas de alimento por los canales
de alimentación en hembras no incubando y en hembras incubando embriones tempranos o
velígeras avanzadas durante el periodo de incubación. CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las
diferentes letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05); media +
SD………………………………………………………………………………………………. 44
Figura 7: Ostrea chilensis. Velocidad de transporte de embriones tempranos o veligeras
avanzadas a través de los canales de alimentación dorsal y ventral en hembras incubando. CD:
canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras indican las diferencias
significativas (p <0,05); media + SD……………………………………………………………..45
Figura 8: Ostrea chilensis. Velocidad de transporte de la progenie incubada (embriones
tempranos o veligeras avanzadas) sobre el frontis de la lamela en dirección al canal ventral. CV:
canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05);
media + SD……………………………………………………………………………………… 46
VI
Figura 9: Ostrea chilensis. Esquema del patrón de micro circulación de los embriones tempranos
dentro de la cavidad paleal materna. 1: movimiento de los embriones en la lamela materna hacia
el CV, 2: pérdida de contacto de los embriones con la lamela branquial materna y su posterior
´caída´ hacia el CD, e: embriones, A: región anterior materna, CD: canal dorsal, CV: canal
ventral, P: región posterior materna……………………………………………………………. 47
Figura 10: Ostrea chilensis. Velocidad de transporte de los embriones tempranos en el frontis de
la lamela en dirección al CV y velocidad de ‘caída’ al CD luego que se desprenden desde las
lamelas branquiales. CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras
indican las diferencias significativas (p <0,05); media + SD…………………………………… 48
Figura 11: Ostrea chilensis. Velocidad generada por la contracorriente materna durante el
proceso de redispersión de los embriones tempranos o de las velígeras avanzadas, desde los
palpos bucales hacia la cavidad posterior del manto. Las diferentes letras sobre las barras indican
las diferencias significativas (p <0,05); media + SD……………………………………………. 49
1
1. RESUMEN
La incubación en invertebrados marinos ha sido considerada como un mecanismo
protector de los embriones frente a condiciones externas estresantes y ello puede darse a través de
la retención de los embriones en el interior del cuerpo materno. Este fenómeno reduce el riesgo al
que se ven enfrentadas las etapas pelágicas, cuando ellas se ven expuestas a la depredación o a
otros factores de estrés ambiental. Sin embargo, la incubación, puede conllevar cambios en las
características del fluido paleal, cuando la madre se aísla del exterior debido a malas condiciones
ambientales, incluyendo reducción de la disponibilidad de oxígeno, reducción del pH o
acumulación de excretas nitrogenadas. Los embriones incubados normalmente son inmóviles y, a
menudo se encuentran encerrados en el interior de estructuras envolventes. Sin embargo, en
especies del Género Ostrea, los embriones incubados se mueven libremente dentro de la cavidad
paleal, en estrecha relación con las branquias de la madre, y por un tiempo de hasta 8 semanas.
Usando la técnica de endoscopia, se caracterizó el patrón de circulación de los embriones
incubados por la hembras de la ostra chilena, Ostrea chilensis. Los embriones en etapa temprana
y las velígeras avanzadas mostraron patrones de circulación en la branquia materna, con
movimientos hacia la región anterior haciendo uso de los canales de alimentación dorsal y ventral
(CD, CV). Embriones tempranos y velígeras avanzadas, se acumularon alrededor de los palpos de
la madre y permanecieron allí hasta que un activo sistema de contracorriente materno los
redispersó hacia la zona inhalante. Ambos canales de alimentación fueron capaces de mover
embriones tempranos, velígeras avanzadas y agregaciones de alimento en sentido anterior. Sin
embargo, el CD fue más importante en el transporte de los embriones. Los embriones tempranos
se movieron más rápido que las velígeras avanzadas, cuando usaron el CD de la branquia para su
desplazamiento. Se evidenció un patrón de circulación específico cuando los embriones fueron
2
transportados por las lamelas branquiales; cuando ellos estaban cercas del CV, la mayoría de los
embriones perdieron contacto con la lamela branquial y ‘cayeron’ hacia el CD. Los embriones
que hicieron contacto directo con el CD, fueron movidos en dirección anterior, pero la mayoría
volvió a entrar en contacto con las lamelas de la branquia y re-iniciaron su movimiento en
dirección al CV. En general, el patrón de circulación de los embriones parece muy relacionado
con el proceso de limpieza, ya que en los palpos bucales se identificó una fuerte actividad
asociada a la eliminación del mucus que los embriones adquirieron durante el desplazamiento por
los canales de alimentación. La contracorriente materna también parece ser eficaz, ya que re-
dispersa los embriones-larvas desde una zona de acumulación en los palpos, probablemente con
bajos niveles de oxígeno, hacia la región posterior, región donde hay más presencia de oxígeno y
alimento que ingresa con las corrientes inhalantes. El proceso de circulación de los embriones en
el interior de la cavidad paleal materna, implica el uso de estructuras de alimentación (branquia y
palpos) y parece ser energéticamente costoso para la madre. Esto podría estar interfiriendo con la
alimentación materna, y quizás explique el balance de energía negativo que ha sido previamente
documentado en hembras incubadoras de O. chilensis.
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1.1 ABSTRACT
Brooding in invertebrates serves to protect embryos from stressful external conditions by
retaining progeny inside the female body, effectively reducing the risk of pelagic stages being
exposed to predation or other environmental stressors, but with accompanying changes in pallial
fluid characteristics, including reduced oxygen availability. Brooded embryos are usually
immobile and often encapsulated, but in some Ostrea species the embryos move freely inside the
female pallial cavity in close association with the mother’s gills for as long as eight weeks. We
used endoscopic techniques to characterize the circulation pattern of embryos brooded by females
of the oyster, Ostrea chilensis. Progeny at embryonic and veliger stages typically circulated in
established patterns that included the use of dorsal and ventral food grooves (DFG, VFG) to
move anteriorly on the gills. Both embryos and veligers accumulated around the mother’s palps,
and remained there until an active maternal countercurrent moved them to the gill inhalant area.
Both food grooves were able to move embryos, veligers, and food-particle aggregates anteriorly,
but the DFG was more important in progeny transport; early embryos were moved more rapidly
than veligers in the DFG. A microcirculation pattern of embryos was apparent when they were
moved by gill lamellae: when they were close to the VFG, most embryos lost gill contact and
´´fell´´ down to the DFG. Those that actually reached the DFG moved anteriorly, but others came
into contact with the base of the lamellae and again moved towards the VFG. The circulation
pattern of the progeny appears well-suited for both cleaning them and directing them posteriorly
to an area where there is more oxygen and food than in the palp region. This process for actively
circulating progeny involves the feeding structures (gill and palps) and appears to be
4
energetically costly for the female. It also interferes with feeding, which could explain the poor
energy balance previously documented for brooding females of this species.
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2. INTRODUCCIÓN
La protección física de los embriones mediante la incubación materna, es un mecanismo
que ha sido documentado para varias especies de invertebrados acuáticos (Thorson, 1950; Vence,
1973; Pechenik, 1986; Toro & Chaparro 1990; Collin, 2003; Segura et al., 2010). Este es
considerado como una estrategia de desarrollo, ya que podría reducir la depredación o proteger
las larvas de las condiciones desfavorables durante el periodo crucial del desarrollo temprano
(Strathmann & Strathmann, 1982, Pechenik, 1999, Gillespie & McClintock 2007, Chaparro et al.,
2008a).
La incubación en invertebrados, conlleva una restricción de los embriones en áreas
particulares del cuerpo de la madre (Ben-Ami & Hodgson 2005). Esto se refiere a que los
embriones pueden ser retenidos o inmovilizados, como por ejemplo, en branquia marsupiales
(Tankersley & Dimock 1992), anclados al cuerpo materno mediante pedúnculos (Ituarte 2009) o
restringidos al interior de estructuras capsulares (Pechenik 1986; Ojeda & Chaparro 2004). Sin
embargo, en algunas especies incubadoras, los embriones, aun siendo mantenidos en la cavidad
paleal materna, presentan alto grado de movilidad dentro de la cavidad paleal (Nelson 1946;
Chaparro et al., 1993). Por ejemplo, embriones de ostras del Género Ostrea, presentan libre
movimiento en la cámara infrabranquial materna (Millar & Hollis, 1963; Chanley & Dinamani,
1980; Buroker 1985; Cranfield & Michael, 1989). Sin embargo, la extensión del tiempo de
incubación embrionaria y la duración de la vida pelágica, difiere considerablemente entre las
especies del Género. Así por ejemplo, la ostra puelchana (Ostrea puelchana) libera larvas
velígeras en una etapa de desarrollo temprano, después de sólo 3-9 días de incubación (Morriconi
& Calvo, 1980; Fernandez Castro & Le Pennec, 1988). Por el contrario, muchas ostras planas
6
comúnmente cultivadas, incluyendo la ostra europea (Ostrea edulis), la ostra olympia (O. lurida),
y la ostra australiana (Ostrea angasi) incuban sus embriones por períodos más cortos (por
ejemplo, entre 1 a 2 semanas, dependiendo de la temperatura del agua) y liberan larvas veligeras
que tiene una fase pelágica relativamente larga de hasta 3 semanas (Hopkins, 1936; Walne, 1964;
Dix, 1976).
La población de ostras planas en Chile (Ostrea chilensis) presenta un comportamiento
inusual, ya que incuba sus embriones durante casi todo el periodo de desarrollo temprano,
aunque, la incubación de O. chilensis, mantenidos bajo condiciones de cultivo en Nueva Zelanda,
ha sido de hasta tres semanas (Joyce et al., 2015). Los embriones de O. chilensis en poblaciones
chilenas, son incubados por aproximadamente ocho semanas (Chaparro et al., 1999, 2001). En
consecuencia, las hembras de esta especie liberan larvas pediveligeras inusualmente grandes y
bien desarrolladas, con una fase pelágica extremadamente corta, de solo algunos minutos y hasta
48 horas (Toro & Chaparro 1990). Adicionalmente, hembras de O. chilensis incuban un alto
número de descendiente (embriones por hembra: 3200-113000 con un valor promedio de 58.000,
Chaparro et al., 1999; Chaparro et al., 2008b) y todos los embriones incubados están en un
mismo estadio de desarrollo dentro de la cavidad paleal de la hembra.
La relación de los embriones con la branquia y con los palpos bucales es de particular
interés en hembras incubantes de Ostrea chilensis, ya que la presencia de ellos podría interferir
con el proceso de alimentación, incluyendo la captura, transporte y selección de las partículas
(Chaparro et al., 1993). De hecho, las hembras muestran una reducción de la tasa de aclaramiento
cuando ellas están en proceso de incubación (Chaparro & Thompson 1998), lo cual limita su
energía disponible. Los estudios de crecimiento de O. chilensis han mostrado que, al terminar el
7
periodo incubatorio, las hembras incubantes tienen significativamente menos tejido que las
hembras no incubantes, un hecho que demuestra los altos costos energéticos de la madre,
asociados con un largo periodo incubatorio (Chaparro & Thompson 1998). Aunque la incubación
ha sido demostrada como energéticamente costosa para le hembra de O. chilensis, el proceso que
se lleva a cabo en la cavidad paleal materna durante la incubación es desconocido,
particularmente los aspectos relacionados con el transporte de partículas y con el manejo materno
de las etapas embrionarias tempranas.
En O. chilensis, el patrón de circulación de las larvas velígeras en la cavidad del manto ha
sido caracterizado parcialmente, al parecer las larvas se mueven dentro de la cavidad incubatoria,
utilizando los mismos canales de alimentación que las hembras usan para transportar el alimento
hacia la boca (Chaparro et al., 1993). Los embriones se mueven hacia el extremo anterior de la
cavidad paleal materna, alcanzando los palpos, lugar donde ocurre la selección de partículas antes
de la ingestión del alimento (Chaparro & Thompson 1998; Kiørboe & Møhlenberg 1981; Ward
1996; Beninger et al., 1997; Garrido et al., 2012). De acuerdo con esto, la presencia física de
numerosas velígeras entre las demibranquias y los palpos bucales, podría alterar el proceso de
alimentación materno. Veliger avanzadas de O. chilensis pueden también consumir partículas de
alimento, lo cual puede reducir aún más la disponibilidad de alimento para las hembras
incubadoras (Chaparro et al., 1993; Chaparro et al., 2001).
Mediante observaciones endoscópicas en O. chilensis, se ha podido observar un
movimiento cíclico de las velígeras avanzadas, concentrándose alrededor de los palpos bucales,
antes de regresar hacia la región inhalante, desde donde ellas reinician su viaje hacia los palpos
(Chaparro et al. 1993). Los mecanismos de la re-dispersión de las velígeras que se acumulan
8
alrededor de los palpos, no están claramente entendidos. Sin embargo, este tipo de transporte está
presumiblemente asociado con la generación de corrientes maternas que redistribuyen las
velígeras hacia la región posterior, oxigenada y con mayor suplemento alimenticio, próximo al
área inhalante (Chaparro et al., 1993). Se desconoce si esta situación es similar en embriones
tempranos, sin capacidad de natación.
El rol materno en el transporte de alimento, embriones tempranos y velígeras avanzadas
dentro de la cavidad del manto de O. chilensis, no ha sido lo suficientemente investigado.
Considerando el extenso periodo de incubación en O. chilensis, es particularmente importante
determinar el rol que juega la madre en los movimientos de la progenie en los diferentes estadios
de desarrollo y, el impacto de cada movimiento en el transporte del alimento y en la selección de
partículas antes de la ingestión. En este estudio, se investigó este proceso, usando observaciones
endoscópicas en ostras incubantes y no incubantes para determinar la relación entre las hembras y
embriones durante el periodo de incubación. La hipótesis establecida en esta investigación
plantea que las hembras incubantes podrían usar diferenciadamente la branquia y los canales de
alimentación para transportar partículas de alimento y embriones, y que su uso podría depender
tanto de la condición reproductiva materna (incubante y no incubante) como del estadio de
desarrollo de la progenie incubada.
9
2.1. HIPOTESIS
Durante el periodo de incubación, los canales de alimentación de Ostrea chilensis son
usados como ruta de transporte de los embriones, afectando el transporte de las partículas en las
branquias maternas. Igualmente, durante la incubación se establece una relación madre-embrión
que involucra una participación activa de los palpos bucales asociados a un proceso de limpieza,
Además la re-localización de la progenie hacia la región posterior, se asocia a un proceso activo
de las contra-corrientes generadas en el interior de la cavidad paleal materna
2.2. OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la relación madre-embrión e implicancias en el proceso de alimentación materna
durante el periodo de incubación en Ostrea chilensis.
Objetivo Específicos
1- Cuantificar la velocidad de las partículas transportadas a través de los canales de
alimentación en hembras incubando y no incubando, durante y fuera de la época de
incubación.
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2- Determinar la velocidad de transporte de los embriones tempranos y de las velígeras
avanzadas, a través de los canales de alimentación dorsal y ventral en hembras incubando.
3- Identificar el uso de los diferentes canales de alimentación en el transporte de embriones
tempranos y avanzados.
4- Identificar la participación de los palpos bucales maternos en el proceso de limpieza de
los embriones tempranos y de velígeras avanzadas durante el proceso incubatorio.
5- Identificar la existencia de un mecanismo de re-dispersión de los embriones tempranos y
de velígeras avanzadas desde los palpos y hacia la región posterior materna.
11
3. MATERIAL Y MÉTODOS
Se recolectaron durante el periodo no incubatorio (Marzo-Abril) e incubatorio
(Noviembre-Diciembre), ostras adultas, mayores a 4 cm, desde el estuario del Rio Quempillén,
Chiloé, Sur de Chile (41º52`S; 73º46'W) y fueron llevadas inmediatamente al laboratorio. Ahí se
mantuvieron por algunos días en acuarios con agua de mar (salinidad: 30-32psu, temperatura: 17-
18ºC) realizando diariamente cambios de agua y adición de la microalga Isochrysis galbana
como alimento.
3.1 Endoscopia de la cavidad incubatoria
En las valvas de ejemplares incubantes y no incubantes de O. chilensis, se hizo un orificio
(3-4 mm de diámetro) en el margen derecho de la concha (Chaparro et al., 1993). La perforación
se realizó en el área anterior o en la posterior de la concha, lo cual permitió acceder con la punta
del endoscopio, de forma directa a los palpos o a las branquias, respectivamente. En el caso de
hembras incubantes, la perforación fue sellada temporalmente con un trozo de parafilm, para
evitar el escape de los embriones incubados. Al momento de las observaciones endoscópicas, los
animales fueron mantenidos en acuarios con agua de mar con alta salinidad (>30psu) y a 17-18°C
de temperatura.
Para realizar las observaciones endoscópicas, las ostras fueron colocadas individualmente
en acuarios con volumen de agua conocido (1L), y con la temperatura y salinidad ya
mencionadas. Se adicionó Isochrysis galbana como alimento con una concentración de 30.000
cel mL-1. Para las observaciones se usó un endoscopio modelo Olympus OTV SX que disponía
12
de una luz fría de Xenon y con una punta de inserción de aprox. 2.5 mm. A través de
movimientos finos de un sistema de micromanipulación, se lograron hacer las observaciones y
filmaciones del interior de la cavidad paleal de 8-12 ostras adultas para cada estado de desarrollo.
Las imágenes obtenidas fueron almacenadas en un grabador digital DVR Stan Alone. Antes de
iniciar las grabaciones, la punta del endoscopio permaneció inserta en la cavidad paleal de cada
ostra hembra durante al menos 15 minutos, hasta identificarse la actividad de bombeo. Las
observaciones endoscópicas fueron facilitadas por la adición de alícuotas de microalga en la
cercanía del orificio hecho en la concha de la ostra. Al comenzar el bombeo, se iniciaron las
grabaciones que fueron prolongadas por alrededor de 0.5 horas para cada ostra.
Las observaciones endoscópicas de la cavidad paleal de la hembra, se centraron en el
transporte de los embriones y de las agregaciones de algas a lo largo de los canales de
alimentación dorsal y ventral (Fig. 1), en el movimiento de los embriones por el frontis de las
lamelas branquiales, principalmente en dirección hacia el canal ventral de alimentación, en la
acción de los palpos bucales durante el proceso de limpieza y manipulación embrionaria, y en las
contracorrientes maternas asociadas a la reorganización de los embriones tempranos y de las
velígeras avanzadas.
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3.2 Transporte de las agregaciones de partículas y de los embriones en los canales de
alimentación
Velocidad de transporte y tamaño de embriones: Además de la suspensión de Isochrysis galbana
(concentración de 30.000 células mL-1), ocasionalmente se adicionaron pequeños pulsos de una
solución de partículas plásticas rojas, no toxicas de 2-10 µm de diámetro, para facilitar en las
imágenes endoscópicas, la identificación del movimiento de las microalgas (Chaparro et al.,
1993).
La velocidad de desplazamiento del alimento y de los embriones, a través de los canales
de alimentación (canal dorsal (CD) y canal ventral (CV)), se estimaron mediante un
procesamiento de imágenes secuenciales. Estas imágenes permitieron identificar la distancia
recorrida, en tanto que el tiempo empleado en el recorrido, se obtuvo a partir de la velocidad de
filmación por unidad de tiempo (número de ‘frames’ por segundo). En la progenie incubada, se
consideraron estadios embrionarios tempranos (aprox. 2 semana de incubación, sin concha o muy
temprana en desarrollo, tamaño ± SD de 275 ± 28 µm, N= 80) o veligeras avanzadas (después de
6-7 semanas de incubación, con presencia de concha de un tamaño medio ± SD de 432 ± 31 µm,
N=81). El periodo de incubación total se considera de 8 semanas (Toro & Chaparro, 1990). La
distancia recorrida por los embriones o por las agregaciones de microalga, fue estimada usando
como referencia el tamaño de los pliques de un trozo de branquia tomado de las ostras usadas en
la endoscopia (Ward et al., 2003, Richoux & Thompson 2001). Las mediciones branquiales
fueron hechas usando un microscopio invertido Zeiss. Se obtuvo el tamaño de los pliques de la
branquia en la cercanía del CD, en la sección media de los filamentos y en el extremo distal muy
cercano al CV. Además, se midió en vista frontal al CV, el tamaño de los pliques branquiales. El
uso de las dimensiones de los pliques dependió de la ubicación y/o dirección de aproximación del
14
endoscopio al objeto (microalga o embrión). Para las hembras incubando, el tamaño medio de los
embriones incubados también se utilizó como referencia para determinar la velocidad de
desplazamiento en el CD y CV. Para esto, después de haber realizado las filmaciones
endoscópicas, se obtuvo una muestra de los embriones correspondiente a la ostra usada y se
realizaron mediciones de los embriones o de las velígeras, usando un microscopio invertido
Zeiss.
Contracorriente materna: la velocidad de contracorriente fue estimada para las hembras
incubando tanto embriones tempranos o velígeras avanzadas. Esta velocidad fue medida en los
embriones-larvas concentrados en la región de los palpos bucales y que estaban siendo
redirigidos hacia la región posterior de la cavidad del manto de la madre. La presencia de este
movimiento fue identificado como “contracorriente materna”. La velocidad se midió como ya ha
sido descrita: se analizaron fotogramas (frame) secuenciales de las grabaciones de video y, la
distancia recorrida por los embriones se estimó utilizando el tamaño de los pliques branquiales
como referencia. La velocidad media se basó en 4-6 mediciones de cada una de 10 hembras
incubando embriones tempranos y 10 hembras incubando velígeras avanzadas. Dado que el flujo
de contracorriente no es de forma constante, se medió la velocidad de la contracorriente en
diferentes momentos para cada ostra hembra experimental.
En algunos casos, el movimiento de los embriones hacia el CV de la branquia, utilizó las
lamelas como vía de transporte. Los embriones que no conseguían mantener el contacto con la
lamela, caían hacia el canal dorsal. Este movimiento se denominó como “caída” y su velocidad se
midió usando las técnicas descritas anteriormente.
15
Uso de los canales de alimentación: el transporte de las agregaciones de alimento por los canales
de alimentación, fue cuantificado tanto en ostras obtenidas durante la época de incubación y
también en ejemplares fuera del periodo incubatorio. Lo anterior se hizo, con el objetivo de
examinar un posible uso diferenciado de los canales de alimentación para el transporte de
partículas.
La importancia de los canales (CD y CV) en el transporte de alimento y/o de la progenie,
se estimó mediante el registro del número de embriones-larvas, o agregaciones de microalga,
movidos por unidad de tiempo. Fue posible identificar agregaciones (mucus branquial mas
microalga) como una unidad, considerando la magnificación del endoscopio.
3.3 Relación embriones-palpos bucales maternos
Observaciones endoscópicas fueron realizadas directamente en la región de los palpos
bucales maternos, tanto en hembras incubando estadios tempranos como velígeras avanzadas.
Aquí, se identificó la relación madre-embrión y el comportamiento de los palpos bucales en
relación a la limpieza embrionaria.
3.4 Análisis estadístico
Luego de confirmar la normalidad y la homogeneidad de la varianza de los datos, se
utilizó ANOVA de una vía para determinar las diferencias en la velocidad de transporte de las
partículas entre CD y CV, tanto para hembras fuera del periodo de incubación, como en hembras
incubando y no incubando en el periodo de incubación. Además, se utilizó un ANOVA de una
16
vía para identificar las diferencias en la velocidad de transporte de los embriones tempranos en
comparación con las velígeras avanzadas que se mueven a través de las lamelas maternas hacia el
CV. De la misma manera, se comparó la velocidad de ´´ascenso´´ hacia el CV y la velocidad de
“caída” hacia el CD, al momento de perder el contacto físico con los filamentos branquiales.
Mediante el mismo test, se comparó la velocidad de la contracorriente materna entre embriones
tempranos y velígeras avanzados.
Se usó ANOVA de dos vías para comparar la utilización de CD y CV en el transporte de
alimento y embriones en hembras incubando, ya sean embriones tempranos o veligeras
avanzadas. Durante el periodo de incubación, se utilizó la misma prueba estadística para
determinar las diferencias en la velocidad de transporte de partículas, embriones y veligeras,
comparando nuevamente entre CD y CV. Cuando se identificó la existencia de diferencias
significativas entre los tratamiento, se utilizó la prueba a posteriori de Tukey para determinar
dónde estaban las diferencias. En todos los análisis, se utilizó un nivel de significancia de 0.05
para determinar si las diferencias fueron estadísticamente significativas (Underwood 1997).
17
3. RESULTADOS
4.1. Transporte de agregaciones de partículas y embriones-larvas en los canales de
alimentación
Periodo no incubatorio: El 85 ± 8.1% de las agregaciones de alimento se transportó a través del
canal ventral (CV) en hembras adultas (Fig. 2a), lo que indica que durante el periodo de no
incubación, éste es la principal ruta de transporte de alimento desde las branquias hacia la boca
(ANOVA una vía F (1.30)=340.1; p= 0.00001). Las partículas que fueron transportadas por el CV,
primero fueron colectadas en la superficie frontal de la lamela y luego transportadas hacia el
canal. En tanto que las partículas que alcanzaron el CD ingresaron mayoritariamente a través de
la corriente inhalante, en vez de ser transportadas a través de las lamelas.
Periodo incubatorio: Las hembras no incubantes transportaron aproximadamente el 64 ± 21.2%
de las agregaciones de alimento a través del CV (Fig. 2b). Sin embargo, no se observaron
diferencias significativas entre el uso del CV y CD (ANOVA una vía, F (1,15) = 4.95; p = 0.056).
Las hembras incubantes transportaron, tanto el alimento como los embriones-larvas a
través de ambos canales de alimentación. En estas hembras, la utilización del CD (46 ± 21.8 %
del total de agregaciones de alimento) y CV (53 ± 23.2 % del total de las agregaciones de
alimento) para transportar alimento hacia la boca fue similar, independiente del nivel de
desarrollo de la progenie (Fig. 3; ANOVA dos vías, F(1,30) = 2.67; p = 0.133).
Sin embargo, el uso del CD y CV para transportar la progenie mostró diferencias
significativas, dependiendo del estado de desarrollo de los embriones (Fig. 4; ANOVA dos vías,
F(1,30) = 7.49; p = 0.0021). Los embriones tempranos utilizaron con mayor frecuencia el CD
18
(79.81 ± 14.14 %) que el CV (20.19 ± 16.21 %), mientras que las velígeras avanzadas utilizaron
de forma similar ambos canales (Fig. 4; CD = 60.09 ± 13.86 %., CV = 40.65 ± 33.24 %).
4.2.Velocidad de transporte de alimento y embriones-larvas
Transporte de alimento: Durante el periodo no incubatorio, no se encontraron diferencias
significativas en entre los dos canales respecto de las velocidades promedios con que se movieron
las partículas (ANOVA una vía F (1,115) = 2.701; p = 0.103). Los valores medios (media ± SD)
fueron de 421.10 ± 285.90 y 336.33 ± 199.35 µm seg-1 en el CD y CV, respectivamente (Fig. 5).
Sin embargo, durante el periodo incubatorio, las agregaciones de alimento fueron transportadas
dos veces más rápido (ANOVA dos vías, F(1,133) = 76.443; p = 0.001, Fig.6) en el CD (450 ± 91
µm seg-1) que en el CV (205 ± 72 µm seg-1) (Fig.6).
Dentro de cada canal, la velocidad promedio de las partículas de alimento no fue
significativamente diferente entre hembras incubando embriones tempranos, velígeras avanzadas
o en hembras no incubantes (ANOVA dos vías, F(2,133) = 1.274; p = 0.283, Fig. 6).
Transporte de los embriones: La velocidad de transporte de la progenie (embriones tempranos y
veligeras avanzadas) a través de los canales de alimentación de hembras incubantes de O.
chilensis, dependió del canal en el cual se encontraban (ANOVA dos vías, F (1,161) = 57.548; p =
0.001, Fig. 7) y del estado de desarrollo embrionario (ANOVA dos vías, F(1,161) = 20.088; p =
0.001, Fig. 7); la interacción entre estas dos variables fue significativa (ANOVA dos vías, F(1,161)
= 12.111; p = 0.002). La progenie siempre fue transportada más rápida en el CD que en el CV,
pero en el CD, los embriones tempranos (595.34 ± 247.04 µm seg-1) fueron transportados más
rápidamente que las velígeras avanzadas (341.68 ± 250.24 µm seg-1). Por su parte, en el CV, la
19
velocidad del transporte de embriones (232.04 ± 128.17 µm seg-1) y veligeras (225.96 ± 86.48
µm seg-1) fue similar.
Las veligeras se movieron sobre la cara de la lamela hacia el CV con una velocidad
promedio de 191.91 ± 109.08µm seg-1. Este valor no fue significativamente diferente de la
velocidad observada en embriones tempranos realizando el mismo movimiento (ANOVA una
vía, F(1,30) = 0.005; p = 0.94, Fig. 8). El movimiento de la progenie a través de la lamela, para
alcanzar el CD, ocurre con menos frecuencia que en el CV.
En hembras incubantes, la demibranquia normalmente presenta una superficie interna
cóncava y una superficie externa convexa (Fig. 9). Los embriones transportados sobre la lamela,
a través de la superficie convexa, presentaron un promedio de velocidad de 196.55 ± 193.57 µm
seg-1 (± SD) (Fig. 10). También se observaron movimientos de los embriones sobre la superficie
cóncava pero fue registrado con menor frecuencia. La mayoría de los embriones que viajan sobre
la lamela convexa, pierden el contacto con los filamentos branquiales y ´caen´ hacia el CD. Este
descenso ocurre con una velocidad promedio de 425.94 ± 190.47 µm seg-1, el cual fue
significativamente más alto (ANOVA una vía, F(1,30) = 6.752; p = 0.018) que la velocidad de
transporte sobre la lamela hacia el CV (Fig. 10).
Algunos de los embriones que ´caen´, y que consiguen hacer contacto con el CD, son
movidos anteriormente. Sin embargo, antes que la mayoría de los embriones pudiesen completar
su descenso al CD, ellos fueron dirigidos por el flujo de agua hacia la región media de la
superficie frontal de la lamela, donde comienzan nuevamente su movimiento a lo largo de los
filamentos branquiales hacia el CV.
20
Este mini ciclo puede extenderse por tiempos variables, a menos que los embriones sean
1) retenidos en el CD y movidos anteriormente hacia la región de los palpos; 2) logren alcanzar
por si mismos el CV y avanzar en dirección a los palpos; 3) o caer desde el CV hacia la región
dorsal del otro lado de la demibranquia. Esta última situación es bastante común en los embriones
tempranos, y ocurre muy a menudo en la región media distal de la branquia, asociada con la
región inhalante. Sin embargo, cuando los embriones tempranos alcanzan el CV en la zona
anterior media de la branquia, cercana a los palpos, ellos son transportados usando este canal
hasta llegar a los palpos bucales.
Contracorriente materna: Los embriones que se acumularon en el área de los palpos bucales
fueron esporádicamente dispersados hacia la región posterior de la cavidad del manto materno.
Ellos fueron movidos a una velocidad de 1,218.58 ± 570.47 µm seg-1, por acción de la
contracorriente de la hembra (Fig. 11). Para hembras incubando velígeras (las cuales fueron
transportadas por la contracorriente más frecuente), la velocidad fue de 668.52 ± 403.24 µm seg-1
(Fig. 11), y fue significativamente más lenta que la velocidad de los embriones tempranos
(ANOVA una vía, F (1,30) = 6.61; p = 0.018).
4.3. Relación entre palpos bucales maternos y embriones
Embriones: Se identificó un constante suministro de embriones a la región de los palpos bucales
lo que facilitó la agregación en esa área materna. Estos llegaron a través del CV y típicamente
unido al cordón mucoso. Los embriones pasan desde el CV y alcanzan la región media o la
región distal de los palpos bucales maternos. Las agregaciones de embriones que acceden desde
21
el CV, se disgregan entre dos palpos adyacentes, en un proceso de limpieza materna que permite
que los embriones y las agregaciones mucosas sean separados en forma independiente. Los
embriones, ahora individuales, son reintegrados dentro de la cavidad del manto de la hembra, y
alcanzan la región anterior cercana a la boca de la hembra. Por su parte, el alimento incluido en la
agregación mucosa, ingresa a la boca de la hembra. En contraste, no se observaron embriones a lo
largo del CD en la región anterior, ni que desde este canal accedieran a los palpos bucales.
Cuando los embriones en el CD alcanzaron la región anterior de la hembra, los embriones fueron
movidos hacia el CV usando los filamentos branquiales y, desde este canal, los embriones
alcanzaron los palpos bucales de la hembra.
Veligeras: Los estadios más avanzados, también se acercan a la región de los palpos bucales vía
CV. Ellos pueden presentar alguna mucosidad adherida a su concha, pero a diferencia de los
embriones tempranos, generalmente no están agregados. Como las velígeras avanzadas poseen
abundante ciliatura, estas pueden permanecer suspendidas entre los palpos bucales y pueden
moverse y rotar por intervalos de tiempo variables antes de ser dispersados por la contracorriente
materna. Las velígeras avanzadas también pueden estar sometidas al proceso de limpieza
maternal, pero de una manera menos intensa que los embriones tempranos. Pequeñas
agregaciones de velígeras avanzadas, que a veces alcanzan los palpos, pueden ser también
separadas de la agregación mucosa, ocurriendo esto típicamente en la región distal de los palpos.
22
5. DISCUSIÓN
En moluscos bivalvos incubadores, la cavidad del manto frecuentemente retiene los
embriones y/o las larvas dentro del área infrabranquial, que no solo es importante para la captura
de partículas de alimento (Beninger et al., 1992, Ward et al., 1998, Baker et al., 2000, Navarro et
al., 2011), sino que también para el intercambio gaseoso (Byrne & Mcmahon 1994). Las
partículas de alimento son capturadas por la branquia y luego transportadas hacia la región oral
para su ingestión o, alternativamente, para su eliminación como pseudofecas. Los canales de
alimentación dorsal y ventral son los responsables de transportar las partículas capturadas hacia la
región anterior de los bivalvos. Sin embargo, la importancia de cada canal parece ser especie-
específica (Richoux & Thompson, 2001: Ward et al., 2003) y la utilización de los canales
generalmente no varía con el tiempo. El tiempo de utilización de los canales, aparentemente
depende del tipo de branquia (heterorabdica o homorabdica). En Ostrea chilensis es novedoso
que las hembras tengan un uso diferenciado de los canales de alimentación, dependiendo si están
en su periodo reproductivo o no. Durante el periodo no reproductivo, el CV transporta más del
85% de las agregaciones de alimento hacia la boca. Sin embargo, durante el periodo de
incubación, el CD y CV son igualmente importantes para el transporte de alimento, independiente
si las hembras están o no incubando (Fig. 2). Un incremento en la participación del CD en el
transporte del alimento durante el periodo reproductivo, podría estar relacionado con el posible
desarrollo de ciliatura previo a la incubación (un tema que amerita un estudio más a fondo), para
promover el movimiento de los embriones y partículas de alimento. El incremento de la
importancia del CD podría relacionarse con una relativa reducción en la capacidad de transporte
23
del CV, ya que este tiene un activo rol en el transporte de grandes velígeras avanzadas, una
situación que podría reducir la capacidad de transporte del alimento agregado.
En la literatura disponible, se encuentran mediciones de velocidad del transporte de
partículas en diferentes especies de bivalvos, lo cual permite una interesante comparación con las
velocidades obtenidas en este estudio. En algunas especies de ostras, el CD mostró una velocidad
de transporte de partículas mayor que el CV (e.g. Crassostrea virginica; 329 a 406 para CV, 1244
a 1425 µm seg-1 para CD; Crassostrea gigas 594 to 630 en el CV, 1001-1110 µm seg-1 en el CD)
(Ward et al., 2003). En el bivalvo de agua dulce Dreissena polymorpha, las partículas pueden ser
transportadas tanto por el canal marginal de alimentación en la demibranquia interna como
también por el canal dorsal ciliado, con un promedio de velocidades de 156 µm seg-1y 152 µm
seg-1, respectivamente (Baker et al., 2000). En otras especies, todas ellas con branquias
homorabdicas, el transporte de partículas es realizado solamente por el CV (e.g. Mytilus edulis
(Beninger et al., 1993); Mya arenaria y Mytilus edulis (Ward et al., 1991); Mytilus edulis y
Mytilus trossulus (Ward et al., 2003) y con diferencias en las velocidades, pero con mayores
velocidades en las branquias de especies epibentonicas (e.g. Mytilus chilensis, aproximadamente
210-240 µm seg-1, Venus antiqua, aprox.40 µm seg-1, Mulinia edulis y Tagelus dombei, aprox.
150 µm seg-1 (Navarro et al., 2011).En comparación con estas especies, la velocidad de
transporte de las partículas a través del CV en O. chilensis fue más alta durante el estado no
reproductivo (336 µm seg-1), pero la velocidad de transporte fue menor que en el CD (421 µm
seg-1). Sin embargo, es necesario considerar que las velocidades de transporte de partículas
registradas para varias especies, podrían verse influenciadas por la temperatura, concentración de
algas y los tipos de alimento usados durante las mediciones.
24
En O. chilensis, ambos canales (dorsal y ventral) son capaces de transportar el alimento y
los embriones-larvas hacia los palpos bucales. Los embriones son transportados más rápido en el
CD que en el CV (Fig. 4). El CD es un canal más interno en los animales, y que por su ubicación,
está más lejos del flujo de agua inhalante, lo cual hace de este lugar un área más ´protegida´ de
las corrientes de agua, lo que hace que los embriones no puedan ‘escaparse’ con tanta facilidad de
este canal y ello facilita su movilidad hacia la región anterior de la hembra. El transporte de los
embriones tempranos por el CD se efectúa con mayor velocidad, pero es un proceso menos
frecuente que en las velígeras avanzadas. Las altas velocidades con que los embriones son
transportados en el CD, pueden no solo explicarse por la acción ciliar materna, sino que podría
corresponder a una acción combinada de cilios y de fuerzas hidrodinámicas, las cuales podrían
permitir el transporte de embriones tempranos en una condición semi-suspendidas (´´mucus
slurry´´, Ward et al., 1993), a través de dicho canal. El promedio al cual las partículas son
transportados a través del CD en Placopecten magellanicus en una condición de ´mucus slurry´,
es también muy alta (4.3-9 mm seg-1; Beninger et al., 1992). Ambas especies, Placopecten
magellanicus y Ostrea chilensis, presentan branquias de tipo heterorabdicas, lo cual podría estar
asociado con la forma de transporte ciliar-hidrodinámico a través del CD. Sin embargo, la
participación de fuerzas hidrodinámicas en O. chilensis, que permitan efectivamente el transporte
en la condición de ´mucus slurry´, debe ser corroborado con estudios adicionales. En esta especie,
la progenie se mueve a una velocidad constante en el CV, independientemente de su estado de
desarrollo (embriones tempranos o velígeras avanzadas) o de la distancia efectiva que ellos
consigan recorrer a través de este canal. Sin embargo, los embriones tempranos no son capaces de
moverse por grandes distancias en contacto con la superficie del CV y muchos caen hacia el CD,
debido al flujo de agua del exterior que ingresa a la cavidad paleal materna.
25
Los movimientos de los embriones tempranos en el interior de la cavidad paleal materna,
son ligeramente diferentes a los de las velígeras avanzadas. En general, los embriones se mueven
desde la región posterior hacia la región de los palpos bucales, a través de ambos canales de
alimentación. Sin embargo, también se ven involucrados en una micro-circulación en la región
interdemibranquial. Este micro-ciclo incluye movimientos de los embriones sobre la lamela de la
branquia hacia el CV (Fig. 9). Algunos de los embriones cruzan el CV y caen hacia el CD de la
siguiente área interdemibranquial. Sin embargo, cuando la mayoría de estos embriones, no
nadadores, alcanzan el área de la lamela cerca del CV, pierden contacto con los filamentos
branquiales y ´caen´ hacia el CD en la misma área interdemibranquial. Esta última situación
parece estar asociada con una capacidad insuficiente de desarrollo ciliar (e.g ausencia del velo,
Chaparro et al. 1999). No se ha observado un patrón similar de micro-circulación en velígeras
avanzadas. El desprendimiento de los embriones de los filamentos braquiales puede ser explicado
por un fuerte flujo de agua originado en la región inhalante materna y enfrenta directamente al
CV. Los embriones generalmente caen hacia el CD, siguiendo la dirección del flujo de agua que
cruza, a través de las ostias, hacia la cámara suprabranquial. Este flujo facilita el contacto de los
embriones con los filamentos branquiales, lo cual les permite ascender hacia el CV, reiniciando
de esta forma el mini-ciclo descrito. Este patrón de micro-circulación, no implica un avance neto
de los embriones hacia la región de los palpos bucales, excepto para aquellos embriones que
´caen´ hacia el CD y que son inmediatamente movidos hacia la región anterior.
En contraste, las larvas avanzadas que presentaron un buen desarrollo del velo,
incluyendo varios anillos de cilios (e.g cilios apicales, cilios preoral internos, cilios preoral
externos y cilios adorales; Chaparro et al., 1999), fueron movidas a lo largo de los filamentos
branquiales de la lamela hasta alcanzar el CV. La mayoría permaneció en contacto con este canal
26
y ellas fueron movidas anteriormente, hacia los palpos bucales. En este caso, la corriente de agua
no causó un masivo desprendimiento de velígeras desde el CV. En el caso de las velígeras (y
también embriones tempranos) que acceden efectivamente al CV, se observó un contacto
estrecho con el filamento principal en la porción convexa de la lamela, entre dos pliques
branquiales. Durante su transporte hacia el CV, las larvas están probablemente en contacto con
los filamentos ordinarios de dos pliques continuos. Sin embargo, si el filamento principal es
utilizado en este proceso, podría haber asociado un costo energético para la madre. Como las
partículas de alimentos capturados en la lamela en especies heterorabdicas son movidas hacia el
CD usando esta ruta, el transporte de estas partículas podría ser interrumpida por el movimiento
de los embriones.
En general, los embriones tempranos son transportados rápidamente por el CD, pero su
transporte es menos frecuente que en el caso de las veligeras avanzadas. Las veligers son más
pesadas y más grandes que los embriones, y probablemente se mueven más lentamente en el CD,
debido a las dimensiones físicas mayores y a una alta fricción que parece generarse con los
pliques de las lamelas de demibranquias opuestas. También, se cuantifico una mayor velocidad
de movimiento de las velígeras avanzadas cuando se mueven por el CD (341.68 ±250.24 µm seg-
1) que por el CV (225.96 ± 86.48 µm seg-1). Esto es coincidente con investigaciones previas, en
las cuales se identificó la misma tendencia (CD = 471 µm seg-1, CV= 141 µm seg-1) en hembras
incubantes de O. chilensis mantenidas a 17°C (Chaparro et al., 1993).
Cuando las larvas velígeras alcanzan la región anterior materna, ellas nadan entre los
palpos de la madre antes de iniciar su redispersión hacia la región posterior, por acción de las
contracorrientes maternas. Las velígeras avanzadas presentan una activa natación debido a la
27
presencia de una bien desarrollada ciliatura del velo (Chaparro et al,. 1999). La ausencia del velo
con cilios en embriones tempranos, resulta en la inexistencia de una natación activa entre los
palpos bucales. Los embriones, después de ser limpiados del mucus por acción de los palpos de la
hembra, ´caen´ detrás de estos, probablemente alcanzado el área dorsal, cercano a la boca y al
manto de la madre. Por varias razones, este proceso de limpieza de embriones puede ser costoso
energéticamente para la madre. En los embriones sin ciliatura velar, que no pueden nadar, la
madre debe realizar movimientos adicionales de los palpos asociados al proceso de limpieza.
Debido a la limpieza de los embriones, la cantidad de tiempo de la hembra, dedicado a la
clasificación de las partículas de alimento en los palpos y la eficiencia para clasificarlas podría
verse reducida. También, el proceso de limpieza de los embriones en los palpos podría
interrumpir o alterar la producción normal de pseudofecas. Finalmente, la creación de contra-
corrientes, por parte de la hembra, podría ser energéticamente costosa, considerando el largo
periodo en que ellas son producidas (posiblemente a lo largo de todo el periodo de incubación) y
además, ellas generas un flujo neto que se mueve en oposición al flujo normal de las partículas en
la cavidad del manto.
Las agregaciones de embriones-larvas que se acumulan alrededor de los palpos bucales,
son dispersadas hacia la región posterior, por acción de la contracorriente generada por la
hembra. La velocidad de transporte de las velígeras a través de esta contracorriente, excede la
velocidad con que las hembras mueven cualquiera partícula (alimento o embriones) a través de
los canales de alimentación (Fig. 11). Lo anterior hace evidente, que la contracorriente es un
proceso activo, generado por la hembra. Las contracorrientes, en general, se producen con mayor
frecuencia para la dispersión de las velígeras avanzadas que para los embriones tempranos.
28
Las hembras utilizan la branquia y los canales de alimentación, de manera diferenciada
para el transporte de partículas de alimento y embriones y, el uso, depende del estado de
desarrollo de los embriones. La concentración de la progenie en la región de los palpos genera
una gran demanda de oxigeno que es exacerbada debido a la distancia del área posterior de la
branquia, donde se evidencia una mayor disponibilidad de oxígeno, debido a la corriente
inhalante (Chaparro, común. Person.). Los embriones tempranos presentan demandas de oxigeno
más bajas que las velígeras avanzadas, lo cual podría explicar la baja frecuencia con la cual los
embriones tempranos son dispersados por la contracorriente materna hacia la región inhalante, un
área con mayor oxigenación (Chaparro, común. person.).
Cuando las hembras de O. chilensis se aíslan desde el ambiente externo, durante eventos
de baja salinidad (hasta 18 horas), la circulación de los embriones dentro de la cavidad del manto
se detiene después de los primeros minutos de aislamiento. Condiciones de hipoxia severa o de
anoxia en la cavidad incubadora, pueden ser observadas en menos de 10 minutos después del
aislamiento, en hembras que están incubando velígeras avanzadas (Chaparro, comun. person.).
Para evitar estas condiciones de hipoxia severa, cuando los embriones están agregados cerca de
los palpos bucales, la progenie es deliberadamente dispersada hacia las áreas de mayor
disponibilidad de oxigeno (ej. área inhalante). La contracorriente, también dispersa la progenie
hacia el área de la cavidad paleal materna donde alimento particulado está disponible, ya que éste
ingresa a través de la corriente del bombeo. Debido a que las velígeras avanzadas pueden
alimentarse de material particulado exógeno (estadios tempranos no pueden), la llegada al área
inhalante podría representar una ventaja desde el punto de vista nutricional. Normalmente, los
embriones o velígeras son redistribuidas por la contracorriente materna, en forma suspendidas en
el agua presente en el espacio inter-demibranquial, y en muchos casos, se observó que en forma
29
paralela, embriones o velígeras fueron movidas por la misma hembra hacia la región anterior, en
estrecho contacto con el CD.
No se investigó la existencia de movimientos de embriones y/o de agregados de alimento,
cuando las ostras fueron expuestas al aire. En esa condición, lo más probable es que las hembras
también se aíslen del ambiente externo, tal como lo hacen cuando se encuentran enfrentadas a
situaciones de estrés ambiental, mientras están sumergidas (ej. baja salinidad). También, es
conocido que las actividades de la cavidad paleal se detienen después de unos minutos de
aislamiento materno, lo cual implica que los cilios branquiales maternos no podrían mover
partículas o embriones durante ese periodo, de manera que la mayoría de los embriones
incubados deberían terminar concentrados en el área de los palpos bucales. En las velígeras, el
movimiento de la ciliatura de los lóbulos velares también se detienen durante el aislamiento
materno. El cese de todas estas actividades pareciera ser una respuesta a la dramática reducción
del oxígeno durante el aislamiento materno.
Los resultados de esta investigación, hacen evidente que el proceso incubatorio dentro de
la cavidad del manto materno confiere, no solamente una función protectora física, sino que
también se evidencian procesos de limpieza del mucus adherida a la superficie de los embriones,
lo cual es especialmente evidente, cuando las hembras incuban embriones en estadios tempranos.
La incubación pareciera que también tiene como función la dispersión de la progenie, a través de
la contracorriente materna, de manera de evitar la generación de zonas hipóxicas alrededor de los
palpos y, además, hacer disponible partículas de alimento para las velígeras avanzadas (Chaparro
et al., 1993). El uso de los canales de alimentación para el transporte de la progenie en hembras
incubantes de O. chilensis, parece explicar el efecto negativo que la incubación genera sobre el
30
balance de energía. El transporte de embriones y la generación de contracorrientes, pareciera
afectar la disponibilidad de alimento para la hembra, durante el largo periodo de incubación de la
progenie.
La inducción al desove y el cultivo externo de larvas es uno de las prácticas más comunes
de cultivo para la mayoría de las especies de ostras. Es posible alimentar larvas (etapa post-
trocofora) fuera del ambiente materno, pero actualmente no existen técnicas de cultivo que hayan
logrado realizar, exitosamente, la fecundación externa y la mantención de zigotos fuera de la
cavidad del manto materno. El cultivo de larvas fuera de la madre, podría representar
significativos beneficios para el cultivo artificial y podría facilitar, en gran medida, el desarrollo
del cultivo en condiciones de hatchery. Investigaciones como la del presente trabajo podría,
eventualmente, ayudar a mejorar los métodos de mantención de embriones y de larvas de estas
especies, fuera de una cámara incubatoria materna.
31
6. BIBLIOGRAFIA
Baker, S.M., Levinton, J.S., Ward, J.E. (2000). Particle transport in the zebra mussel, Dreissena
polymorpha (Pallas). Biol. Bull., 199, 116–125.
Ben-Ami, F. & Hodgson A.N. (2005). Ovoviviparity and the structure of the brood pouch in
Melanoides tuberculata (Gastropoda: Prosobranchia:Thiaridae). J. Morphol., 263, 322–329.
Beninger, P.G., Dufour, S.C., Bourque, J. (1997). Particle processing mechanisms of the
eulamellibranch bivalves Spisula solidissima and Mya arenaria. Mar. Ecol. Prog. Ser., 150, 157–
169.
Beninger, P.G., St-Jean S., Poussart, Y., Ward, J.E. (1993). Gill function and mucocyte
distribution in Placopecten magellanicus and Mytilu edulis (Mollusca: Bivalvia): the role of
mucus in particle transport. Mar. Ecol. Prog. Ser., 98, 275–282.
Beninger, P.G., Ward, J.E., MacDonald, B.A., Thompson, R.J. (1992). Gill function and particle-
transport in Placopecten magellanicus (Mollusca, Bivalvia) as revealed using video endoscopy.
Mar. Biol., 114, 281–288.
Buroker, N.E. (1985). Evolutionary patterns in the family Ostreidae: larviparity vs. oviparity. J.
Exp. Mar. Biol. Ecol., 90, 233–247
32
Byrne, R.A., Mcmahon, R.F. (1994). Behavioral and physiological responses to emersion in
fresh-water bivalves. Am. Zool. 34, 194–204.
Castaños C., Pascual, M.S., Agulleiro, I., Zampatti, E., Elvira, M. (2005). Brooding pattern and
larval production in wild stocks of the puelche oyster, Ostrea puelchana D´Orbigny. J. Shellf.
Res., 24, 191–196.
Chanley, P., Dinamani, P. (1980). Comparative descriptions of some oyster larvae from New
Zealand and Chile, and a description of a new genus of oyster, Tiostrea. N Z. J. Mar. Freshw.
Res., 14, 103-120.
Chaparro, O.R., Thompson, R.J., Ward, J.E. (1993). In vivo observations of larval brooding in the
Chilean oyster, Ostrea chilensis (Philippi, 1845). Biol. Bull., 185, 365–372.
Chaparro, O.R., Thompson, R.J. (1998). Physiological energetics of brooding in Chilean oyster
Ostrea chilensis. Mar. Ecol.Prog. Ser., 171, 151-163.
Chaparro, O.R., Thompson, R.J., Emerson, C.J. (1999).The Velar ciliature in the brooded larva of
the Chilean oyster Ostrea chilensis (Philippi, 1845). Biol. Bull., 197, 104–111.
Chaparro, O.R., Videla, J.A., Thompson, R.J. (2001). Gill morphogenesis in the oyster Ostrea
chilensis. Mar. Biol., 138, 199–207.
33
Chaparro, O.R., Cubillos, V.M., Montiel, Y.A., Paschke, K.A., Pechenik, J.A. (2008a).
Embryonic encapsulation and maternal incubation: Requirements for survival of the early stages
of the estuarine gastropod Crepipatella dilatata. J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 365, 38–45.
Chaparro, O.R., Matus, P.R., Thompson, R.J., Segura, C.J., Pardo, L.M., Cubillos, V.M. (2008b).
Gametic, morphometric, and physiological variables influencing clutch size in the Chilean oyster,
Ostrea chilensis (Philippi, 1845). J. Exp. Mar. Biol. Ecol., 359, 18–2.
Collin, R. (2003). Worldwide patterns in mode of development in calyptraeid gastropods. Mar.
Ecol. Prog. Ser. 247, 103–122.
Cranfield, H.J., Michael, K.P. (1989). Larvae of the incubatory oyster Tiostrea chilensis
(Bivalvia:Ostreidae) in the plankton of central and southern New Zealand. N. Z. J. Mar. Freshw.
Res. 23, 51-60.
Dix, T.J. (1976). Laboratory rearing of larval Ostrea angasi in Tasmania, Australia. J. Malacol.
Soc. Australia., 3, 209–214
Gillespie, J.M., McClintock, J.B. (2007). Brooding in echinoderms: how can modern
experimental techniques add to our historical perspective. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 342, 191–201
34
Garrido, M.V., Chaparro, O.R., Thompson, R.J., Garrido, O., Navarro, J.M. (2012). Particle
sorting and formation and elimination of pseudofaeces in the bivalves Mulinia edulis (siphonate)
and Mytilus chilensis (asiphonate). Mar. Biol., 159, 987–1000
Hopkins, A.E. (1936). Ecological observations on spawning and early larval development, and
early in the Olympia oyster, Ostrea lurida. Ecology., 17, 551–556.
Ituarte, C. (2009). Unusual modes of oogenesis and brooding in bivalves: the case of Gaimardia
trapesina (Mollusca: Gaimardiidae). Inv. Biol., 128, 243–251.
Joyce, A., Webb, S., Mussely, H., Heasman, K., Elliot, A., King, N. (In press) Towards selective
breeding of a hermaphrodite oyster, Ostrea chilensis: roles of nutrition and temperature in
improving fecundity and synchrony of gamete release. J. Shellf. Res.
Kiørboe, T.,Møhlenberg, F. (1981). Particle selection in suspension-feeding bivalves. Mar. Ecol.
Prog. Ser. 5, 291–296
Morriconi, E., Calvo, J. (1980). Fertilidad y periodicidad del desove en Ostrea puelchana. Rev.
Invest. Desarrollo Pesquero., 2, 57-62
Millar, R.H., Hollis, P.J. (1963). Abbreviated pelagic life of Chilean and New Zealand oysters.
Nature., 197, 512-513.
35
Navarro, J.M, Gonzalez, L.P, Chaparro, O.R. (2011). Filtering capacity and endoscopic analysis
of sympatric infaunal and epifaunal bivalves of Southern Chile. J. Mar. Biol. Ass.UK., 91, 1607–
1612.
Nelson, T.C. (1946). Circulation of embryos in the branchial chamber of Ostrea cristata. Anat.
Rec., 94, 355.
Ojeda, J. A., Chaparro, O.R. (2004). Morphological, gravimetric, and biochemical changes in
Crepidula fecunda (Gastropoda: Calyptraeidae) egg capsule walls during embryonic
development. Mar. Biol., 144, 263–269
Pechenik, J.A., Chang, S.C., Lord, A. (1984). Encapsulated development of the marine
prosobranch gastropod Nucella lapillus. Mar. Biol., 78, 223 – 229.
Pechenik, J.A. (1986). The encapsulation of eggs and embryos by molluscs: An overview. Am.
Malacol. Bull. 4, 165–172
Pechenik, J.A. (1999). On the advantages and disadvantages of larval stages in benthic marine
invertebrate life cycles. Mar. Ecol. Prog. Ser., 177, 269–297.
Richoux, N.B., Thompson, R.J. (2001). Regulation of particle transport within the ventral groove
of the mussel (Mytilus edulis) gill in response to environmental conditions. J. Exp. Mar. Biol.
Ecol., 260, 199 – 215.
36
Strathmann, R.R., Strathmann, M.F. (1982). The relationship between adult size and brooding in
marine invertebrates. Am. Nat., 119, 91–101.
Strathmann, R.R., Strathmann, M.F. (1995). Oxygen supply and limits on aggregation of
embryos. J. Mar. Biol. Assoc. U.K., 75, 413–428.
Segura, C.J., Chaparro, O.R, Paschke, K.A., Pechenik, J.A. (2010). Capsule walls as barriers to
oxygen availability: Implications for the development of brooded embryos by the estuarine
Crepipatella dilatata (Calyptraeidae). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 390, 49–57.
Tankersley, R.A., Dimock, R.V.Jr. (1992). Quantitative analysis of the structure and function of
the marsupial gills of the freshwater mussel Anodonta cataracta. Biol. Bull., 182, 145–154.
Thorson, G. (1950). Reproductive and larval ecology of marine bottom invertebrates. Biol. Rev,.
25, 1–45
Toro, J.E., Chaparro O.R. (1990). Conocimiento biológico de Ostrea chilensis (Philippi 1845).
Impacto y perspectivas en el desarrollo de la ostricultura en Chile. In: Hernandez, A. (ed) Cultivo
de moluscos en América Latina. Memorias segunda reunión grupo trabajo técnico, Ancud, Chile.
Underwood, A.J. (1997). Experiments in ecology. Their logical design and interpretation using
analysis of variance, 1stedn. Cambridge University press, Sydney.
37
Vance, R.R. (1973). On reproductive strategies in marine benthic invertebrates. Am. Nat. 107,
339–352.
Walne, R. (1964). Observations on the fertility of the oyster Ostrea edulis. J. Mar. Biol. Ass. U.K.
44, 293–310.
Ward, J.E, Levinton, J.S., Shumway, S.E. (2003). Influence of diet on pre-ingestive particle
processing in bivalves I: Transport velocities on the ctenidium. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 293, 129–
149.
Ward, J.E, MacDonald, L.B.A, Thompson, R.J. (1993). Mechanisms of suspension feeding in
bivalves: Resolution of current controversies by means of endoscopy. Limnol. Oceanogr. 38,
263–372.
Ward, J.E. (1996). Biodynamics of suspension-feeding in adult bivalve molluscs: particle
capture, processing, and fate. Invert. Biol. 115, 218–231.
Ward, J.E, Levinton, J. S, Shumway, S.E., Cucci, T. (1998). Particle sorting in bivalves: in vivo
determination of the pallial organs of selection. Mar. Biol. 131, 283–292.
38
Ward, J.E., Beninger, P.G., MacDonald, B.A., Thompson, R.J. (1991). Direct observations of
feeding structures and mechanisms in bivalve molluscs using endoscopic examination and video
image analysis. Mar. Biol., 111, 287–291.
39
FIGURAS
Figura 1: Ostrea chilensis. Diagrama de la cavidad paleal de una hembra incubante. Veligeras
alrededor de los palpos bucales. A: anterior, CD: canal dorsal, CV: canal ventral, M: boca, P:
posterior, Pa: palpos bucales, CC: contracorriente.
40
CD CV
Us
o d
e c
an
ale
s d
e a
lim
en
tac
ión
(%
)
0
20
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a
a
B
Canales de alimentación
CD CV
Uso
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an
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lim
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tació
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%)
0
20
40
60
80
100
120
a
bA
Figura 2: Ostrea chilensis. Transporte de las agregaciones de alimento a través de los canales de
alimentación en ostras adultas (A) periodo no-incubante y (B) durante periodo incubatorio. CD:
canal dorsal; CV: canal ventral. La letras sobre las barras indican diferencias significativas
(p<0.05); media + SD.
41
Canales de alimentación
CD CV
Tra
nsp
ort
e d
e a
gre
gació
n d
e a
lim
en
to (
%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100Embrión
Veliger
a
aa
a
Figura 3: Ostrea chilensis. Uso de los canales de alimentación para mover las partículas de
alimento en hembras incubando embriones en estadios inicial o avanzado de desarrollo
(embriones tempranos y velígeras avanzadas). CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes
letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05); media + SD.
42
CD CV
Tra
nsp
ort
e d
e e
mb
rio
nes (
%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 Embrión
Veliger
a
ab bc
c
Canales de alimentación
Figura 4: Ostrea chilensis. Utilización porcentual de los canales de alimentación maternos, en el
transporte de embriones tempranos y velígeras avanzadas. CD: canal dorsal; CV: canal ventral.
Las diferentes letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05); media + SD.
43
CD CVVelo
cid
ad
de a
gre
gació
n d
e a
lim
en
to (
µm
sec-1
)
0
100
200
300
400
500
600
700
800
a
a
Canales de alimentación
Figura 5: Ostrea chilensis. Velocidad promedio de transporte de los agregados de alimento a
través de los canales branquiales en dirección a la boca, en hembras fuera del periodo de
incubación. CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras indican
diferencias significativas (p <0,05); media + SD.
44
CD CV
Ve
loc
ida
d d
e a
gre
ga
ció
n d
e a
lim
en
to (
µm
se
c-1
)
0
100
200
300
400
500
600
700No-incubando
Incubando embriones
Incubando veligeras
a a a
b
b
b
Canales de alimentación
Figura 6: Ostrea chilensis. Velocidad de transportes de las partículas de alimento por los canales
de alimentación en hembras no incubando y en hembras incubando embriones tempranos o
velígeras avanzadas durante el periodo de incubación. CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las
diferentes letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05); media + SD.
45
CD CV
Velo
cid
ad
de e
mb
rio
ne
s (
µm
seg
-1)
0
100
200
300
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500
600
700
800
900
1000
Embrión
Veliger
a
b
cc
Canales de alimentación
Figura 7: Ostrea chilensis. Velocidad de transporte de embriones tempranos o veligeras
avanzadas a través de los canales de alimentación dorsal y ventral en hembras incubando. CD:
canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras indican las diferencias
significativas (p <0,05); media + SD.
46
Embrión Veliger
Ve
loc
ida
d d
e e
mb
rio
ne
s e
n C
V (
µm
se
c-1
)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
a
a
Estado de desarrollo
Figura 8: Ostrea chilensis. Velocidad de transporte de la progenie incubada (embriones
tempranos o veligeras avanzadas) sobre el frontis de la lamela en dirección al canal ventral. CV:
canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras indican las diferencias significativas (p <0,05);
media + SD.
47
Figura 9: Ostrea chilensis. Esquema del patrón de micro circulación de los embriones tempranos
dentro de la cavidad paleal materna. 1: movimiento de los embriones en la lamela materna hacia
el CV, 2: pérdida de contacto de los embriones con la lamela branquial materna y su posterior
´caída´ hacia el CD, e: embriones, A: región anterior materna, CD: canal dorsal, CV: canal
ventral, P: región posterior materna.
48
a
Hacia CV Caída hacia CD
Velo
cid
ad
de t
ran
sp
ort
e d
e e
mb
rio
ne
s (
µm
se
c-1
)
0
100
200
300
400
500
600
700
Dirección de desplazamiento en la lamela
b
a
Figura 10: Ostrea chilensis. Velocidad de transporte de los embriones tempranos en el frontis de
la lamela en dirección al CV y velocidad de ‘caída’ al CD luego que se desprenden desde las
lamelas branquiales. CD: canal dorsal; CV: canal ventral. Las diferentes letras sobre las barras
indican las diferencias significativas (p <0,05); media + SD.
49
Embrion Veliger
Ve
loc
ida
d d
e c
on
trac
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ien
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µm
sec
-1)
0
300
600
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1200
1500
1800
2100
a
b
Estado de desarrollo
Figura 11: Ostrea chilensis. Velocidad generada por la contracorriente materna durante el
proceso de redispersión de los embriones tempranos o de las velígeras avanzadas, desde los
palpos bucales hacia la cavidad posterior del manto. Las diferentes letras sobre las barras indican
las diferencias significativas (p <0,05); media + SD.
