Imunogenetika – Fakultet zdravstvenih studija – Laboratorijski smjer – Vježbe

Osnova – ponavljanje

Sve pojave i procesi biološkog nasljeđivanja počivaju na osobenostima strukture i funkcije nukleinskih kiselina – DNK i RNK. To su polimerne makromolekule koje su sastavljene od niza karika (monomera) koje se nazivaju nukleotidi. Nukleotidi se sastoje od tri komponente:1. Azotna baza2. Pentoza (petougljični šećer)3. Fosfatna grupa – ostatak fosforne kiseline koji nukleinskim kiselinama daje kiselinski karakter. DNK je primarni genetički materijal – osnovni nosilac «genetičke informacije» (gena). Naravno da postoje izuzeci kod kojih tu ulogu ima RNK – kao što su RNK virusi. Sa druge strane, najznačajnija uloga RNK je u procesima ostvarivanja funkcije gena (genetičke poruke). Struktura i organizacija genetičkog materijala na molekulskom nivou omogućava tri najbitnije biološke funkcije : autokatalizu, heterokatalizu i mutabilnost.

Na osnovu molekulskih svojstava, a posebno njene uloge u procesu ostvarivanja funkcije genetičkog materijala možemo razlikovati:1. Informacionu RNK (iRNK) /messenger, mRNA/2. Transportnu RNK (tRNK)3. Ribosomalnu RNK (rRNK)

Geni – funkcionalni dijelovi molekule DNK, veličine od nekoliko stotina do nekoliko hiljada nukleotidnih parova.Genski lokusGenski lokus – pozicija gena na hromozomu AleliAleli - različiti oblici jednog gena••Dominantan alelDominantan alel – alel čiji se fenotipski efekat uvijek ispoljava•Recesivan alel•Recesivan alel – njegov fenotipski efekat se ispoljava samo u homozigotnom stanjuHomozigotHomozigot-- dva ista alela jednog gena AA, aa

1

Osobenost DNK RNK

Heterociklične azotne baze

adenin (A), guanin (G), citozin (C), timin (T)

adenin (A), guanin (G), citozin (C), uracil (U)

Petougljični šećer Dezoksiriboza Riboza

Prostorna struktura molekula

Dvojni spiralni lanac nukleotida

Jednostruki lanac nukleotida

Broj nukleotida u molekuli

15.000 - 30.000 i više 20 - 6000

Lokacija u ćelijiUglavnom: hromosomi - jedro

Uglavnom: citoplazma

FunkcijaPohranjivanje i nasljeđivanje genetičke informacije

Uglavnom: realizacija genetičke informacije

HeterozigotHeterozigot- dva različita alela jednog gena AaGenotipGenotip - skup svih gena jednog organizma, genetska konstitucija organizmaGenomGenom - genetička informacija u haploidnom setu hromozomaFenotipFenotip - skup svih vidljivih osobina organizma, rezultat interakcija genotipa i sredine; fizička manifestacija nasljednih činilaca, tj. gena

Hromosomi - su najvažnije komponente jedra jer su nosioci DNK (dezoksiribonukleinske kiseline), odnosno nasljednih jedinica – gena, koji svojom aktivnošću određuju i regulišu metaboličke i osnovne životne procese u ćelijama. Hromosomi se stalno nalaze u jedru, permanentne strukture. Odlikuju se sposobnošću za autoreprodukciju i prilikom diobe jedra dijele se i oni, što odražava njihov kontinuitet kroz ćelijske generacije. Skup svih hromosoma u ćeliji označava se kao hromosomska garnitura. Razlikuju se dva tipa hromosomskih garnitura – haploidna i diploidna. Kod organizama sa seksualnim razmnožavanjem, gamete imaju haploidni broj hromosoma (n), a somatske ćelije imaju diploidan hromosomski broj (2n), jer sadrže dvije haploidne garniture, porijeklom od dva roditelja.Promjenjljivost nasljednog materijala predstavlja genetičku osnovu sveukupne biološke raznolikosti u vremenu i prostoru. Kvalitativne i kvantitativne promjene genetičkog materijala označavaju se kao mutacije, i imaju različite nivoe organizovanja (genske, hromosomske i genomske).Mutacije nastaju slučajnim promjenama u strukturi i količini DNK.Mutageneza (proces nastajanja mutacija) može biti indukovana različitim fizičkim, hemijskim i biološkim faktorima vanjske i unutrašnje sredine.

DNK ekstrakcija iz bioloških uzoraka

Ekstrakcija DNK predstavlja jedan od primarnih postupaka u genetičkom inženjerstvu i molekularnoj biologiji uopće. To je prvi korak u karakterizaciji genetičkog materijala. Budući da je DNK (tj. nukleinske kiseline) osnovni nosilac nasljednih informacija, za bilo kakvu direktnu genetičku karakterizaciju neophodno je poznavati metode i tehnike izolacije DNK.

Kao izvor DNK može nam poslužiti bilo kakav organski dio ili ostatak koji sadrži ćelije sa jedrom. DNK podliježe izvjesnim organsko-degradacijskim procesima, što u velikoj mjeri oteževa izolaciju iz zastarjelih uzoraka (ali je moguće!).

Postupak izolacije i karakterizacije nasljednog materijala se široko primjenjuje u fundamentalnoj, istraživačkoj biologiji i njenim primijenjenim granama: medicini, farmaciji, hortikulturi, šumarstvu, forenzici, veterinarstvu, itd. za dijagnostičke analize i transformaciju svojstava odabranih resursa npr. dobijanje biljaka otpornih na sušu, dijagnostika sklonosti za tumor, dijagnostika AIDS-a tj. zaraženosti HIV-om i drugih infekcija, provjera rodoslova i čistokrvnih linija npr. pasa ili konja, itd.

Miller-ov protokol za ekstrakciju DNA (isoljavanje) iz brisa bukalne sluznice

2

1. PrincipOva procedura sadrži osnovne upute za izolaciju DNK iz oralnih briseva. Protokol

se bazira na lizi nukleiranih ćelija pomoću ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen proteinazom. Nakon digestije slijedi serija isoljavanja sa 6M NaCl-om. NaCl uklanja zaostale proteine. DNK se konačno izdvaja precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili destilovanoj vodi.

2. UzorakBris bukalne sluznice, osušen na zraku ili uronjen u izopropanol.

3. Kvalitet postupkaa. Prije započinjanja procedure uvjerite se da su svi reagensi, instrumenti i aparati ispravni i da zadovoljavaju bar minimalne standarde za kontrolu kvaliteta procesa.b. Minimalno jedna negativna kontrola mora biti zastupljena i proći cijelu proceduru od početka do kraja i analizirana zajedno sa ostalim uzorcima.

4. Sigurnosta. Svi uzorci moraju biti tretirani kao infektivni. Radi lične sigurnosti preporučuje se korištenje zaštitne opreme u laboratoriji. b. Odbacivanje biohazardnog otpada se vrši na za to predviđenom mjestu.c. Dobro se upoznati sa protokolima o sigurnosti i pouzdanosti procedure, prije samog početka rada.

5. Procedura

a. Sakupljanje uzoraka Uzorci se uzimaju brisom, tj. vatiranim štapićem trljajući po unutrašnjosti usne duplje.

b. Protokol za ekstrakciju:

Štapić sa bukalnom sluznicom potopiti u sljedeći pufer:

REAGENSI KOLIČINAKern Lysis pufer 500 l20% SDS 50 lQiagen Pronase 100 lUKUPNO 650 l

Inkubirati 1 sat na temp. 60 CDodati 200 l 6M NaCl-a, snažno protresti 1 minut,Centrifugirati na 2500 rpm 15 min.,Nakon centrifugiranja supernatant prebaciti u novu tubicu,Protresti 15 sekundi,Centrifugirati na 2500 rpm 15 min.,Supernatant prebaciti u novu tubicu,Dodati 2 x vol. hladnog apsolutnog etanola,

3

Okrenuti tubicu par puta,Centrifugirati 10 min na 10 000 rpm,Dekantirati etanol,Dodati 200 l 70 % etanola, promućkati 10 sekundi,Centrifugirati 5 min. na 13 000 rpm,Dekantirati etanol,Staviti u speedvac i osušiti.Dodati 50 l dest. H2O. Ostaviti preko noći da se resolubizira, ili staviti 30 minuta u termoblok na 37 oC.

Kvantitativna i kvalitativna analiza izolovane DNK

Postoji nekoliko metoda za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolovane DNK: Elektroforeza na agaroznom gelu, UV spektrofotometrija, Real-time PCR, Picogreen reagens Quantiblot itd.

Od ovih nabrojanih metoda najčešće se koriste elektroforeza na agaroznom gelu te UV spektrofotometrija.

Elektroforeza DNK na agaroznom geluPrincip

Elektroforeza označava gibanje čestica u električnom polju, dok elektroforeza DNK predstavlja tehniku koje se primjenjuje za separaciju bioloških molekula, baziranu na fizičkim osobinama molekule, kao što su veličina, oblik, izoelektrična tačka molekule. Najčešće se primjenjuje u analitičke svrhe, za separaciju i analizu DNK fragmenata različite veličine. Snaga električnog polja podstiče migraciju fragmenata DNK kroz gel.

Molekule koje se separiraju elektroforetski najčešće u svojoj strukturi sadrže anionske ili kationske grupe, pa su prema tome dipolarni joni. Fragmenti DNK putuju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog negativnog naboja koji nosi DNK molekula. Fragmenti veće molekulske mase migriraju sporije kroz gel, u odnosu na fragmente manje molekulske mase čija je migracija brža. Veličina fragmenata separiranih na gelu se determinira komparacijom uzorka sa DNK ladder-om, koji sadrži fragmente DNK poznate veličine i služi kao referentni sistem.

Izbor sistema pufera je bitan, jer o njemu ovisi količina električne energije koja se može primjeniti na sistemu. Ako je dovod struje previsok, dolazi do pretjeranog zagrijavanja, što može uzrokovati denaturaciju uzorka, a ako je dovod struje prenizak, ne dolazi do pretjeranog zagrijavanja, ali elektroforeza traje dugo pa razdvojene zone nisu oštre zbog difuzije.Protokol

Pripremiti kadicu za izlivanje agaroznog gela. Gornji i donji rub kadice oblijepiti trakom. U prostor predviđen za formiranje džepova za uzorke staviti adekvatan češalj. Veličina džepova ovisi o količini uzorka koju analiziramo.

Napraviti 1% rastvor agaroze u 30-50ml TBE pufera (ili prema veličini kadice) i prokuhati ga kako bi se napravio homogeni polimer. Smjesu ohladiti na oko 50°C i dodati

4

1l etidium-bromida (!). Rastvor agaroze izliti ravnomjerno u posudicu za gel, pazeći da je to na skoro idealno ravnoj površini.

Kad se gel ohladi, uspemo TBE pufer, izvadimo češalj pažljivo i skinemo trake koje smo koristili za oblikovanje gela. Postavimo gel u aparat za elektroforezu i pripremimo ga za punjenje uzoraka. Gel mora biti potopljen u TBE pufer. Uzorci (5l) se miješaju na parafilmu sa (1l) Load Dye pufera, koji olakšava punjenje uzorka u džepić (uzorak je teži i vidi se). Pored uzoraka, na gel nanosimo i 2l markera koji će nam služiti za kvalitativnu i kvantitativnu analizu uzorka koji ispitujemo nakon vizualizacije i dokumentacije.

Marker sadrži fragmente poznate veličine (u parovima baza-bp) i poznate gustine (ng), tako da mi na osnovu vizuelne inspekcije indirektno zaključujemo o veličini, gustoći i kvalitetu našeg uzorka (loša, odlična ili osrednja ekstrakcija, degradirana DNK i sl.).

Slika 2. – Slika agaroznog gela nakon elektroforeze uzoraka.

Na sl.2 se vidi agarozni gel sa sedam traka. U prvoj se vidi marker koji sadrži osam fragmenata poznate veličine (200-2000 bp). U traci 3, vidi se ukupno šest bandova. Najkraći fragment je veličine 200-300bp, drugi oko 500, treći oko 900, a posljednja tri od 1500-1800 bp. Najintenzivniji band je drugi u prosjeku tri puta intenzivniji od ostalih znači veće koncentracije, a kvalitet ekstrakcije je odličan.

UV spektrofotometrija

Princip

Spektrofotometrija je jedan od načina kvantifikacije biomolekula. To je, u principu, fotoelektrično mjerenje zračenja koje neka supstanca apsorbira na određenoj valnoj dužini. Prema područjima valnih dužina izvora svjetla, razlikuju se ultraljubičasta (200 - 400 nm), vidljiva (400 - 760 nm) i infracrvena (iznad 760 nm) spektrofotometrija.

Ova metoda služi za kvantitativno određivanje malih količina otopljenih supstanci. Količina apsorbiranog svjetla određene valne dužine odgovara koncentraciji ispitivane supstance. Što se nukleinskih kiselina tiče, spektrofotometrom se mjeri apsorbancija na 260 i 280 nm. Potpuno čista DNK ima OD (optical density ili optička gustoća) A260/A280 =1,8-2,0. Kontaminacija CH2O, fenolom i proteinima se računa preko odnosa OD230/OD260. Ako je ovaj odnos veći od 0,5 prisutna je kontaminacija.

Za određivanje koncentracije DNK dobivene izolacijom, uzorak DNK jedinične apsorancije na 260 nm ima koncentraciju 50 mg/ml DNK. Da bi smo kvantifikovali DNK

5

spektrofotometrijskom analizom potrebno je uzorak DNK razrijediti destilovanom vodom (1:100), izmjeriti apsorbanciju na 260 i 280 nm, i koncentraciju računati po formuli:

cDNK = A260 x R x 50 (ng/ml)

ProtokolPripremiti tubicu od 50 ml destilovane vode, pipete od 1000 i 20 l, te

odgovarajuće tipove. Kivete za spektrofotometar proprati destilovanom vodom. Uzorak DNK razblažiti 1:100 ( 1980 l ddH2O i 20 l uzorka), te mjeriti apsorbancu na 260, 280 i 230 nm. Nakon mjerenja izračunati koncentraciju i čistoću DNK.

Polimerase chain reaction (PCR)

Lančana reakcija sa polimerazom, polimerazna lančana reakcija, lančana sinteza polimerazom samo su neki od načina da se prevede naziv tehnike koja je doslovno izazvala revoluciju na polju molekularne genetike i biologije uopšte. Polazna količina DNK, koja je decenijama predstavljala ograničavajuci faktor u istraživanjima, svela se na doslovno jednu, dobro očuvanu molekulu a mukotrpne procedure izolacije i prečišćavanja dijelova genoma postale su jednostavnije. Pred istraživacima su se naglo otvorile nove mogućnosti. Pored toga, gotovo da ne postoji društvena djelatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i zauvijek izmijenila. Glavni “krivci” za ovakvu pometnju su Kary Mullis i njegovi suradnici iz Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U časopisu Science 1985. godine objavljen je naučni rad autora R. Saiki, K. Mullis, H. Erlich u kojem prvi put opisuju tehniku specifičnog umnožavanja fragmenta DNK in vitro koju katalizira enzim DNK polimeraza I izolovan iz Escherichia coli. 1988. godine, opet u Science, isti tim naučnika publicira rad1 u kome umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNK polimerazu I izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq). Unatoč brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa lančane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. i 1988. nisu se značajnije izmijenile.

Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su :u nativnom stanju DNK je dvostruki heliks, sastoji se od dva antiparalelna polinukleotidna lanca međusobno povezana vodikovim vezama, nukleotidi jednog polinukleotidnog lanca su međusobno povezani kovalentnom vezom između dezoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne grupe susjednog nukleotida,vodikove veze koje održavaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvijek se formiraju između komplementarnih baza tj. A-adenin se uvijek veže za T-timin a C-citozin za G-guanin, vodikove veze su energetski slabe i lako se remete zagrijavanjem (denaturacija), dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se održavaju,

1 Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase - Prajmerima-upravljano enzimatsko umnožavanje DNK posredstvom termostabilne DNK polimeraze

6

hlađenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodikovih veza između komplementarnih baza (renaturacija), DNK replikaciju in vivo inicira RNK Pol I sintetizirajući kratke RNK sekvence, time kreirajući supstrat za DNK Pol I (slobodnu -OH- grupu dezoksiriboze na 3’ kraju),na optimalnoj temperaturi, DNK Pol I katalizira ugradnju slobodnih dezoksiribonukleotid-3-fosfata na postojeći oligonukleotidni lanac sa slobodnom -OH- grupom na 3’ kraju kada je isti vodikovim vezama povezan za matricu.

Pošavši od ovih premisa, Mullis2 je pretpostavio da može postići umnožavanje specifičnog dijela DNK molekule koji leži između dva regiona čija je sekvenca poznata. Selekcija specifičnog dijela DNK molekule postiže se primjenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNK sekvenci (20-30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane sekvence. U tipičnoj PCR reakciji učestvuju dva prajmera sintetizirana u 5’3’ pravcu tako da se na njihovom 3’ kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom -OH-

grupom. Obično se obilježavaju sa F (forward) i R (reverse). Na temperaturi od 95oC pucaju vodikove veze koje održavaju dvolančanu strukturu molekule čiji se dio umnožava (template DNA = matrica) te se ona denaturiše. Spuštanjem temperature stvaraju se uslovi za renaturaciju ali i za formiranje hibridnih molekula matrica-prajmer. DNK Pol I pronalazi takve hibride i, pod odgovarajućim uslovima, katalizira vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid-3-fosfata za 3’ -OH- grupu dezoksiriboze prajmera prema zakonu komplementarnosti. Rezultat je sintetiziran naspramni lanac komplementaran matrici koji može poslužiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlađenjem i sinteze naspramnog lanca može se ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Također, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifično umnožavanog dijela DNK. Teoretski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela DNK molekule između prajmerskih sekvenci, iznosi 2n-2n (n - broj ciklusa) za svaku molekulu DNK matrice. Također teoretski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, može dobiti 230-2*30 = 1073741764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa može biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid-3-fosfata ili enzima). Ovisno od svrhe reakcije, veličine umnožavanog dijela DNK i željene koncentracije, tipična PCR reakcija se odvija u 30-40 ciklusa.

TIPIČNA PCR REAKCIJA

Tipična reakcija enzimatske amplifikacije DNK fragmenta odvija se u plastičnim tubicama sa poklopcem, volumena 200 l. Plastika je termostabilna a zid tubice dovoljno tanak da omogući brzo i ravnomjerno zagrijavanje smjese. Volumen reakcije se kreće od

2 1993. godine K. Mullis je za otkriće PCR dodijeljena Nobelova nagrada iz hemije

7

25 - 100 l, ovisno o primjeni. Ovdje je naveden jedan primjer smjese i programa PCR reakcije.

Zadatci Imunogenetika

1. U populaciji 123 individue imaju A krvnu grupu, 45 B, 22 AB i 77 O. Izvrsite procjenu alelnih frekvencija p, q i r!!

8

2. U ukupnoj populaciji od 256 individua, 122 ima B krvnu grupu, 50 AM i 40 O krvnu. Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

3. U populaciji ljudi, 111 individua imaju M krvnu grupu, 102 N i 88 MN Krvnu grupu Izvrsite procjenu alelnih frekvencija Pm i Qn!!

4. U populaciji ljudi, 543 individue imaju M krvnu grupu, 123 N i 234 MN krvnu grupu. Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

5. U populaciji ljudi 54 individue su Rh (+), a 23 Rh(-). Izvrsite procjenu alelnih frekvencija p i q!!

6. U populaciji ljudi od 154 individue 61 su Rh (-). Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

7. U populaciji 156 individua imaju A krvnu grupu, 57 B, 38 AB i 72 O. Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

8. U ukupnoj populaciji od 720 individua, 432 ima B krvnu grupu, 74 AB i 50 O krvnu grupu. Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

9. U popilaciji ljudi, 125 individua imaju M krvnu grupu, 104 N i 92 MN krvnu grupu. Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

10. U populaciji ljudi od 163 individue, 34% ima M, 22% N krvnu grupu. Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

11. U populaciji od 456 individua, 75% su Rh(+). Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

12. U populaciji ljudi od 172 individue 65 su Rh(-). Izvrsite procjenu alelnih frekvencija!!

9