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ANTICORPI: STRUTTURA E FUNZIONE
Immunologia e Immunologia Diagnostica
Le due vie dell’immunità adattativa
• Microbi extracellulari: immunità umorale
! Anticorpi
• Microbi fagocitati e intracellulari: immunità cellulare
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Caratteristiche dell’immunità adattativa
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Anticorpi: Specificità, Diversità, Espansione
• Specificità: 1 linfocita B (clone) 1 recettore 1 antigene
• Diversità: ogni recettore è diverso dagli altri (>109)
• Espansione clonale: ogni antigene seleziona un clone e lo moltiplica
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Anticorpi: proprietà generali
• Proteine plasmatiche della frazione gammaglobuline.
• Anticorpi = Immunoglobuline (Ig)
• Molecole specializzate per riconoscere un antigene.
• Uniche cellule produttrici: linfociti B.
• Due varianti biologiche: - Anticorpi di membrana (recettore linfociti B) - Anticorpi solubili (secrezione plasmacellule differenziate)
• Anticorpi solubili : plasma, secrezioni mucosali e fluidi tissutali.
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Struttura degli Anticorpi • Tutti gli anticorpi hanno la stessa struttura molecolare, ma
grande variabilità nella regione che lega l’antigene.
• Struttura simmetrica: - 2 catene polipeptidiche leggere (catene L) - 2 catene polipeptidiche pesanti (catene H)
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Struttura degli Anticorpi • Le catene H e L sono costituite da una serie di domini
proteici ripetuti: il dominio immunoglobulinico (Ig), circa 110 aminoacidi.
• Le catene H e L sono caratterizzate da: - Regioni variabili (legame antigene) - Regioni costanti (funzioni effettrici)
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Struttura degli Anticorpi • Le catene H e L sono legate tra di loro in maniera covalente
da ponti disolfuro.
• Anche le due catene H sono legate da ponti disolfuro: Nelle IgG si trovano vicino la “regione cerniera”, importante per la flessibilità dell’anticorpo.
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Il sito di legame per l’antigene • È formato dalla disposizione tridimensionale delle regione
variabili di una catena H e di una catena L.
• Ogni monomero anticorpale possiede 2 siti di legame: 2 x (VH-VL)
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Denominazione delle regioni funzionali
• Il trattamento degli anticorpi IgG con enzimi proteolitici genera frammenti con caratteristiche distinte, che danno il nome alle diverse regioni dell’immunoglobulina.
• Papaina: - Frammento monovalente con il sito di legame per l’antigene (Fragment antigen binding) = Fab - Frammento cristallizabile = Fc
• Pepsina: - Frammento bivalente con il sito di legame per l’antigene = F(ab’)2
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Denominazione delle regioni funzionali
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Caratteristiche delle regioni variabili
• La variabilità nelle sequenze aminoacidiche delle Ig si concentra nelle regioni ipervariabili e determina la specificità dei diversi anticorpi.
• Regioni ipervariabili (∼10 aa): - 3 segmenti della regione VH - 3 segmenti della regione VL
• Regioni ipervariabili = Regioni che determinano la complementarità (CDR): - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena H) - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena L)
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Caratteristiche delle regioni variabili
• Le 6 regioni ipervariabili si associano in una struttura tridimensionale che forma il sito di legame per l’Ag.
• L’impalcatura dell’Ig resta sempre la stessa.
• La grande diversificazione delle sequenze CDR cambia la specificità di ogni anticorpo.
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Importanza delle regioni ipervariabili
• La capacità di legare l’Ag dipende principalmente dalle regioni CDR.
• Gli aminoacidi che variano più frequentemente sono quelli che entrano in contatto con la molecola bersaglio.
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Importanza delle regioni ipervariabili
Diversità delle regioni ipervariabili = Diversità del sito di legame per l’antigene = Diversità anticorpale
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Caratteristiche delle regioni costanti
• Ogni molecola anticorpale contiene due tipi di regioni costanti (C): - Regioni CH catene pesanti - Regioni CL catene leggere
• Le regioni CH determinano: - la classe anticorpale (isotipo) - la funzione effettrice dell’anticorpo - la “flessibilità” dell’anticorpo (regione cerniera) - la forma di secrezione o di membrana
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Forme secrete e di membrana • La regione aminoacidica dell’ultima regione CH determina se
l’anticorpo è solubile o legato alla membrana citoplasmatica.
• A seconda dell’isotipo, le forme secrete possono essere monomeriche o formare complessi multimerici.
• I complessi multimerici sono legati alla catena J, una proteina che stabilizza e trasporta il complesso (epiteli).
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Le classi anticorpali
• Le immunoglobuline umane sono classificate in 5 isotipi: - IgA, IgD, IgE, IgG e IgM
• Alcune classi sono ulteriormente suddivise in sottoclassi: - IgA IgA1 e IgA2 - IgG IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4
• Per ogni isotipo/sottotipo: tutte le regioni costanti delle catene H hanno la stessa sequenza aminoacidica.
• La sequenza aminoacidica è invece diversa nei vari isotipi/sottotipi.
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Immunoglobuline A (IgA) • Catene pesanti α (alfa).
• Forme secrete: monomero, dimero, trimero.
• Ruolo nell’immunità delle mucose:
- secrete nel lume intestinale e respiratorio
- neutralizzazione di microbi e tossine
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Immunoglobuline D (IgD)
• Catene pesanti δ (delta).
• Nessuna forma secreta.
• Immunoglobulina di membrana dei linfociti B naïve = Recettore dei linfociti B (BCR)
• Ruolo nell’attivazione dei linfociti B plasmacellule
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Immunoglobuline E (IgE) • Catene pesanti ε (epsilon).
• Forma secreta: monomero.
• Ruolo fisiologico: difesa contro gli elminti
• Ruolo immunopatologico:
reazioni di ipersensibilità immediata
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Immunoglobuline G (IgG)
• Catene pesanti γ (gamma).
• Forma secreta: monomero.
• Isotipo maggiormente abbondante nel siero
• Molteplici funzioni effettrici
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Immunoglobuline G (IgG)
• Ruolo fisiologico: - Neutralizzazione microbi e tossine - Opsonizzazione antigeni - Attivazione classica del complemento - Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) - Immunità neonatale (via placenta)
• Ruolo immunopatologico: - Autoimmunità - Ipersensibilità tipo II e III
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Immunoglobuline M (IgM) • Catene pesanti µ (mu). • Due forme alternative:
- Ig di membrana dei linfociti B naïve (BCR). - Forma secreta: pentamero.
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Immunoglobuline M (IgM)
• Ruolo fisiologico: - Attivazione dei linfociti B plasmacellule - Attivazione classica del complemento
• Ruolo immunopatologico: - Autoimmunità - Ipersensibilità tipo II e III
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L’espressione dei geni per le Ig varia in dipendenza dello stadio di maturazione e attivazione dei linfociti B.
1. Linfocita pre-B: catene pesanti µ + catene leggere surrogate
2. Linfocita B immaturo: IgM complete di membrana
3. Linfocita B maturo: IgM e IgD di membrana
4. Linfocita B attivato: scambio isotipico e basso livello di secrezione
5. Plasmacellula: elevato livello di secrezione anticorpale
Sintesi ed espressione degli anticorpi
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Sintesi ed espressione degli anticorpi
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Risposta primaria e secondaria dei linfociti B
• La risposta primaria è la prima risposta ad un antigene, che attiva i linfociti naïve in grado di riconoscerlo.
• Gli incontri successivi con lo stesso antigene stimolano le risposte secondarie, mediate dall’attivazione dei linfociti della memoria: - più rapide - più intense - più efficaci
Ottimizzazione della risposta immunitaria: ogni incontro successivo con il patogeno genera nuove cellule memoria e attiva quelle ancora presenti.
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Risposta primaria e secondaria dei linfociti B
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Immunità Attiva e Passiva • Esposizione ad un antigene Risposta immunitaria Immunità Attiva
• Trasferimento di siero (anticorpi) o di cellule (linfociti) da un individuo immune ad uno non immune Immunità Passiva
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Immunità Attiva: Esempi • Fisiologico: tutte le risposte dell’immunità adattativa contro patogeni e tossine. • Clinico: vaccinazioni contro le malattie infettive.
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Immunità Passiva: Esempi • Fisiologico: trasferimento degli anticorpi materni al feto (IgG via placenta) e al neonato (IgA via latte).
• Clinico:
- Anticorpi anti-tossina (tetano, botulino, etc.)
- Anticorpi anti-ofidici (veleno di serpenti)
Caratteristiche del principio attivo Frammenti di immunoglobulina purificati Fab o F(ab’)2
Preparazione plasmatica di origine equina o ovina. Rischio effetti collaterali: reazioni di ipersensibiltà, reazione anafilattica.
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Anticorpi Monoclonali e Policlonali • Ogni cellula B naïve (clone) esprime un recettore per l’antigene (BCR) con specificità diversa.
• Ogni clone attivato differenzia in plasmacellule che secernono un’immunoglobulina con la stessa specificità.
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Anticorpi Monoclonali e Policlonali • Ogni recettore/immunoglobulina riconosce un determinante antigenico diverso (epitopo)
• Ogni antigene possiede numerosi epitopi.
1 clone = 1 epitopo = 1 antigene 1 antigene = n epitopi = n cloni Immunologia e Immunologia Diagnostica
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Generazione di Anticorpi Monoclonali
• Presupposto: i mielomi sono tumori delle plasmacellule e producono anticorpi monoclonali.
• Conseguenza: immortalizzando i linfociti B specifici per un dato antigene, si possono generare anticorpi monoclonali specifici.
• Metodo:
1. Creare una fusione cellulare tra linfociti B e linee di mieloma.
2. Selezionare le cellule fuse Ibridomi.
3. Separare i singoli cloni di ibridoma.
4. Analizzare gli anticorpi prodotti da ciascun clone di ibridoma.
5. Individuare il clone/anticorpo di interesse.
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