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TECNICHE IMMUNOLOGICHE
Immunologia e Immunologia Diagnostica
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Tecniche di laboratorio
• La maggior parte delle tecniche di laboratorio biomedico si basano sull’utilizzo degli anticorpi.
• Gli anticorpi sono utilizzati come reagenti ad elevata specificità.
• Gli anticorpi possono essere prodotti per riconoscere ogni tipo di molecola biologica o chimica:
- Proteine - Acidi nucleici - Lipidi - Polisaccaridi - Sostanze chimiche
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Applicazioni degli anticorpi monoclonali
• Gli anticorpi monoclonali sono attualmente utilizzati: - Nei laboratori di ricerca biologica e biomedica - Nei laboratori di diagnostica - Nelle terapie mediche
• Gli anticorpi monoclonali permettono di:
- Determinare la presenza di un antigene (Test qualitativo)
- Misurare la quantità di un antigene (Test quantitativo)
- Purificare l’antigene desiderato (Molecole o Cellule Intere)
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Concetto di antigene nelle applicazioni pratiche
Dal punto di vista biologico l’antigene è sempre una molecola riconosciuta da un anticorpo, ma diventa utile per individuare/quantificare cellule, batteri, virus e molte sostanze presenti nel sangue:
Marker CD = Linfociti e altre cellule del sangue
Ag batterici e virali = 1. Immunodiagnosi per infezioni 2. Titolo anticorpale
Marker tumorali = Diagnostica per immagini
Proteine del sangue = Diagnostica di laboratorio clinico Immunologia e Immunologia Diagnostica
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Proprietà pratiche nell’utilizzo degli anticorpi
Il riconiscimento dell’antigene da parte di un anticorpo è basato su legami chimici che determineranno:
L’affinità dell’anticorpo
L’avidità dell’anticorpo
La specificità dell’anticorpo
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Reazioni Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab)
• Legami non covalenti:
– Legami Idrogeno – Legami Elettrostatici – Legami Idrofobici
• Processo Reversibile
• Molti legami tra Ag e Ab
• Modello Chiave-Serratura Interazione Lisozima/Anti-Lisozima
H L
Ag
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Affinita’ = Somma delle forze attrattive e repulsive
Ab
Ag
Alta Affinita’
Ab
Ag
Bassa Affinita’
Affinità Anticorpale • La forza della reazione tra un singolo determinante
antigenico ed un singolo sito di legame dell’anticorpo
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Avidità Anticorpale • La forza totale del legame tra un Ag con molti determinanti
e Abs multivalenti
Keq = 104 Affinita’
106 Avidita’
1010 Avidita’
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Specificità Anticorpale
• La capacita’ per un singolo anticorpo di reagire contro un solo determinante antigenico.
• La capacita’ per una popolazione di anticorpi di reagire contro un solo antigene.
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Reazione Incrociata (Cross-Reazione)
• La capacita’ di un singolo anticorpo di reagire contro piu’ determinanti antigenici.
• La capacita’ di una popolazione di anticorpi di reagire contro piu’ antigeni.
Anti-A Ab
Ag A
Anti-A Ab
Ag B
Epitopo condiviso
Anti-A Ab
Ag C
Epitopo simile
Cross-Reazioni
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Test Basati sulle Reazioni Ag/Ab
• Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab permettono di misurare piccole quantita’ degli immuno-complessi.
• Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab possono essere utilizzati per misurare l’antigene o l’anticorpo presenti nel campione.
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Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA):
Saggio di Immunoassorbimento Legato ad Enzima
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Principio dell’ELISA • 1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra
• 1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima
• L’enzima (perossidasi) reagisce con il substrato
• La reazione produce una colorazione misurabile
Piastra ELISA Ag
Ab specifico
Anti-Ig marcato
Substrato incolore
Substrato dopo la reazione
Enzima
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ELISA Diretto per Ag
• Rilevamento dell’Ag – Immobilizare l’Ab – Incubare con il campione
da misurare – Aggiungere l’Ab marcato
con un enzima – La quantita’ di Ab legato
e’ proporzionale alla quantita’ di Ag nel campione del paziente.
Test Quantitativo
Fase Solida
Ag Immobilizato
Ag nel campione del paziente
Ab marcato
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ELISA Diretto per Ab
• Rilevamento dell’Ab – Immobilizare l’Ag – Incubare con il
campione da misurare – Aggiungere l’anti-Ig
marcato con un enzima – La quantita’ di anti-Ig
legato e’ proporzionale alla quantita’ di Ab nel campione del paziente.
Test Quantitativo
Fase Solida
Ag Immobilizato
Ab nel campione del paziente
Anti-Ig marcato
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Immunofluorescenzae
Citofluorimetria
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Immunofluorescenza • Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag
Antigeni sulla membrana citoplasmatica:
- direttamente accessibili
Antigeni intracellulari:
- inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione
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Immunofluorescenza
• Preparazione dei campioni → Marcatura Ab
Traccianti Fluorescenti:
-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag
- Fino a 4 traccianti diversi per un campione
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Fluorescenza e Fluorocromi • I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti fluorescenti:
-Assorbono l’energia della luce → Eccitazione -Emettono fluorescenza nel visibile → Emissione
Fluorocromo Eccitazione (nm) Emissione (nm)
Fluoresceina (FITC) 495 519
Rodammina 550 573
Ficoeritrina (PE)
565 578
Texas Red 589 615
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Immunofluorescenza
• Diretta: - L’anticorpo che riconosce l’antigene e’ marcato con un fluorocromo (molecola fluorescente)
Ag
Ab marcato con fluorocromo
Sezione di un tessuto
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Immunofluorescenza
• Indiretta: - L’Ab che riconosce l’Ag non e’ marcato - Viene utilizzato un anti-Ig marcato con un fluorocromo per rilevare il legame del primo Ab.
Test Qualitativo/Semi-Quantitativo
Ag
Anti-Ig marcato con fluorocromo
Sezione di un tessuto
Ab non marcato
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Immunofluorescenza
Area T (Paracorticale)
Area B (Follicoli)
Linfociti T e B all’interno di un linfonodo
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Immunofluorescenza
• Analisi di Tessuti • Analisi di Singole Cellule
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Citofluorimetria • Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag
Antigeni sulla membrana citoplasmatica:
- direttamente accessibili
Antigeni intracellulari:
- inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione
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Citofluorimetria
• Preparazione dei campioni → Marcatura Ab
Traccianti Fluorescenti:
-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag
- Fino a 8 traccianti diversi per un campione
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Citofluorimetria • La sospensione di cellule da analizzare viene marcata
con una molecola fluorescente. • La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o
Indiretta. • Il campione di cellule viene analizzato con un
citofluorimetro (FACS)
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Citofluorimetria
• Analisi del campione al FACS
Intensita’ Fluorescenza Verde
Num
ero
di C
ellu
le
Cellule non marcate
Cellule fluorescenti
Istogramma con 1 Parametro
Intensita’ Fluorescenza Rossa In
tens
ita’ F
luor
esce
nza
Verd
e
Istogramma con 2 Parametri
1 2
3 4
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Citofluorimetria • Esempio: Analisi cellule da sangue periferico
- Miscela di linfociti, monociti e granulociti
- Colorazione con Ab monoclonali:
1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con ficoeritrina (PE)
2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti: linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina (FITC)
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Citofluorimetria • Esempio: Analisi cellule da sangue periferico
con 1 parametro
CD14=monociti
Intensita’ Fluorescenza
CD14 PE
CD45=linfociti>monociti>granulociti (1) (2) (3)
CD45 FITC
1 2
3
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Citofluorimetria • Esempio: Analisi cellule da sangue periferico
con 2 parametri
CD45 FITC
CD
14 P
E
CD14=monociti CD45=linfociti>monociti>granulociti
R1=monociti (CD14+) R2=linfociti (CD45>monociti) R3=granulociti (CD45<monociti)
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