Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena)

Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad

1) Uno stampo a singola elica

2) un innesco specifico (primer)

3) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

ha bisogno di:

4) una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

La sintesi del filamento compementare, tuttavia non prosegueindefinitivamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro

distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossinucleotiditrifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché

posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Terminazione della catena

DNA stampo a singola elica

3’-GGCTAAC

3’-GGCTAAC5’ 3’

Ibridazione conIl primer

+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi

ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP

-CCG ddA -ddC-C ddC

-CC ddG-CCGATT ddG

-CCGA ddT-CCGAT ddT

Sequenza: 5’-CCGATTG

A C G T

-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC

GT

T

AGCC

Schema di sequenziamento a terminazione di catena

Direzione dilettura

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti

Coniugando a ciascun ddNTPun diverso marcatore fluorescente, è

possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio

e caricare il tutto in solo pozzetto di gel

ddA

ddC

ddT

ddG

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Fluorescent DNA Sequencing

A G T A C T G G G A T C

GelElectrophoresis

Detection of Fluorescently Tagged DNA

DNA FragmentsSeparated by

Electrophoresis

Output to Computer

Scanning Laser Excites

Fluorescent Dyes

Optical Detection System

Fluorescent DNA Sequencing Data

Fluorescent DNA Sequence Trace

Overview of Facts Asserted

• 2.91 billion base pairs (bp)

• 1.1% exons, 24% introns, 75% intergenic DNA

• 2.1 million single nucleotide polymorphisms (SNP’s)

• less than 1% of all SNP’s reflected changes in proteins

Structure of the genome