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UNIVERSITE D'AIX-ftARSEILLE II

Faculté des Sciences de Luminy

•••••••• IFREMER B1BLlOTHEQUE LA TREMBLADE

DIPLOftE D'ETUDES APPROFONDIES D'OCEANOLOGIE

ftISE AU POINT D'UN ftODELE EXPERIftENTAL

DE REPRODUCTION ET D'ETUDE DE LA BONAftIOSE,

ftALADIE HEftOCYTAIRE DE L'HUITRE PLATE OSTREA EDULIS

Mémoire présenté

par

Véronique BIGOT-VUILLEftIH

Septembre 1987

Laboratoire de Pathologie et de Génétique des Invertébrés Marins Station IFREMER, LA TREMBLADE (CHARENTES-MARITIMES) (

,

SOli Il AIR E

l - INTRODUCTION ....... .. . . . . .... . . . . . .... . ........ .

II - IIATER I ELS ET IIETHODES.... . .. . ...... ... ...... . .. . 5

1 - ORIGINE DES ANIIIAUX . ... .. . . .. .. .. . . ..... ... . 5

2 - TECHNIQUES D'ELEVAGE AU LABORATOIRE . . . .. .. . . 5

a . lla i ntien des animaux .. . . .. . .. .. . . ........ . 5

b.Paramètres physico-chimiques.. . . .. . . . . .. . . 6

c . Nourr i ture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

3 - PURIFICATION DU PARASITE BONAIIIA OSTRE AE. .. . 7

a.Protocole... ..... .. ... . . .. . ... . . .. . ... . ... 7

b . Test de viabilité .. ... ... . . . .. . .. . . . ... . .. 8

c.T e st de contamination.. . ........ . . ..... .. . 8

d . Comptage des parasites . ... .. . . .. ... . . . .. . . 9

4 - PATHOLOGIE EXPERIIIENTALE.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

a . lnfection per os ... . . . . .. . . ..... ... . ..... . 10

b . Infection par inocula t ion ..... . . . .. . . .. . .. 10

5 - HISTOLOGIE. . . ...... . . .. . . . ... .. .... ..... . . . . 11

a.llicroscop i e photonique......... . ... . . . .... 11

b.llicroscopie électronique . .... .. .. ... . . . .. . 12

6 - IIIII UNODOSAGE . . . . • • • • • . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

III - RESULTATS. . ........ . .. . . ............ . . .. .... .. 14

1 - PURIFICATION DE BONAMIA OSTREAE... .. . . . . . . .. 14

a . Comparaison de méthodes de comptage.. . . . . . 14

b . Contamination bactérienne.... . ... . ... . . . . . 15

c . Intégrité ultrastructurale et viabilité . .. 16

d . Bilan des purifications.. ....... . ... . . .. .. 16

2 - INFECTION PER OS D'OSTREA EDULIS.. . . .. ..... . 17

3 - INFECTION EXPERIMENTALE PAR INOCULATION ... . . 17

a.Etude du développement de la maladie chez Ostrea edulis en fonction de la quantité inoculée de Bonamia ostreae . .. . . . 17

b.Cinétique de développement de la bonamiose . ............... .. .. . .. . . .. 20

4 - INFECTIONS EXPERIMENTALES DE DIFFERENTES ESPECES DE BIVALVES... . ...... . ... . . . . .. . .... 21

a.Crassostrea 9i9as... ......... . . . ... ... . . .. 21

b.Ruditapes Philippinarum.... . . . .. .. .... ... . 22

c.Pecten maximus. . ............... . .. . ... .... 22

IV - DISCUSSIONS - CONCLUSIONS..... . . .... .. . . .... .. . 23

V - BIBLIOGRAPHIE... ... . . . . ........ . .. . . ... ..... . . . 28

l - INTRODUCTION

L'ostréiculture est une a ctivit é traditionnelle dans plusieurs

régions du monde et son importance économique est primordiale en

aquacul ture. Cependa nt, des mortalités à caractère épizootique

affectent les élevages des principales espèces d'huîtres. Dans

à ces un grand nombre de cas , des agents pathogènes associés

mortalités ont été mis en évidence ( 4 ) ainsi, en Amérique du

Crassostrea virginica a subi plusieurs Nord , l'huître creuse ,

épizooties successives , dues d'abord au protozoaire Perkinsus

maximus (Apicomplexa) ( 1 2) , puis à deux haplosporidies Minchinia

costalis et M. nelsoni (Ascetospora) (21 , 11) en France, une

maladie virale a totalement décimé les populations d'huître

po r t u gai s eC ", ... r",a"-s"",s",o,-,s""",t""r",e",a"-__ ",a",n",g",u"""l .. a,,t,,,a ...

L'absence de

C.gigas a

ostréicole .

sens ibil i té

permis s on

à ce

él eva ge

entre 1 966 et

viru s de l'huître

et la relance de

1 9 71 ( 5) •

japonaise

l'économie

Ultérieurement , l'huître plate "O-"s,-,t~r,-"e .. a,---=e",d,-,u"-"-l-"i,",,,,s a s u b i à son t 0 u r

l'impact de maladies p a ra sitaires

protozoaire Marteilia refringens (3,10)

1970 des mortalités massives dans les

rendant pratiquement impossibles en

la première, due au

a provoqué à partir de

élevages d'huîtres,

zone intertidale.

les

Les

élevages en eaux profondes, non affectés par ce parasite ont été

à leur tour touchés par une autre maladie parasitaire, la

bonamiose .

L'agent responsable fut identifié en Bretagne en 1979, et décrit

sous le nom de Bonamia ostreae

d'un nouveau genre (17).

(Ascetospora), seul représentant

Ce protozoaire qui mesure en moyenne 3~m, se multiplie dans les

hémocytes de l'huître au sein d'une vacuole parasitophore. Les

effets cytopathiques sont importants et aboutissent à la mort de

la cellule hôte. Les parasites libérés dans l'hémolymphe vont

alors infecter d'autres hemocytes et contribuer ainsi au

développement de la maladie . Celle-ci se traduit d'un point de vue

anatomopathologique par des ulcérations branchiales et des

réactions inflammatoires dans les tissus conjonctifs. L'évolution

de la maladie est fatale, des mortalités importantes étant

observées dès le sixième mois. La transmission de la maladie

s'effectue tout au long de l'année probablement par contamination

directe avec des parasites provenant des cadavres d'huîtres

parasitées (4,9).

Cette maladie s'est depuis 1979 propagée rapidement à presque

toutes les zones d'élevage de Bretagne faisant chuter la production

de 80 à 90 % ( 9) • Actuellement et suite aux nombreux transferts

nationaux et internationa ux, la bonamiose affecte les principaux

centres ost r éicoles européens et a été récemment signalée chez la

même espèce sur la côte ouest des Etats-Unis (7). Enfin un parasite

similai re, associé à des mortalités massives d' Ostrea lutaria vient

d'être mis en évidence en Nouvelle-zélande (6).

Compte tenu de son extension à l'échelle mondiale et de son impact

sur les élevages d'huîtres, la bonamiose représente actuellement

2

l'aléa majeur allant à l'encontre des activités ostréicoles.

L'importance des enjeux économiques liés à cette maladie (13) a

conduit l'IFREMER à développer des recherches sur la bonamiose

afin d'élaborer des mesures

zootechniques indispensables pour

activité ostréicole.

prophylactiques

assurer la

zoosanitaires et

pérennité de cette

Un premier axe de travail entrepris par l'équipe de pathologie et

gé nétique des Invertébrés marins a consisté à la mise au point de

méthode d'immunodiagnostic permettant de développer une stratégie

de prophylaxie zoosanitaire efficace. Ainsi, des anticorps

monoc lonaux spécifiques ont été produits ( 1 5) et l'un d'eux,

couplé à une phosphatase alcaline a été utilisé pour mettre au

point un immunodiagnostic enzymatique (2).

Un deuxième axe de recherche concerne l'étude de la maladie et

des relations hôte-parasite.

Al' échelle de l'individu, il S'agit de préciser l'anatomo-

pathologie et la physiopathologie de la bonamiose, et d'analyser

les réactions immunitaires de l'hôte.

A l'échelle des populations d'huîtres O.edulis, il est important

d'estimer la sensibilité des animaux afin de pouvoir identifier,

éventu ellement, des races géographiques (1) ou des individus

présentant un caractère résistant à la maladie et susceptibles

de ce fait d'être utilisés dans un programme de sélection.

Parallèlement cette

sympat riques afin

bonamiose .

étude doit prendre en compte les espèces

de mieux cerner l'épid émio logie de la

3

Il apparaît que l'ensemble de ces recherches repose en grande

partie sur la reproduction expérimentale et la modélisation de la

maladie au laboratoire. Des essais antérieurs d'infe ction par

proxim ité (20) ou par inoculation de broyat d'huîtres parasitées

(18) on t été réussis mais ils présentaient un caract ère très

aléato ire quant à leur reproductibilité et leur efficience.

La mise au point récente

purif ication de B . ostreae ( 14)

des essa i s de reproduction

d'une méthode d'isolement et de

permet maintenan t d'entreprendre

dans des c o nditi o ns définies

notamment sur le nombre et la viabilité des parasi tes inoculés.

Dans le c adr e de mon stag e de DEA d'océano logie, je me suis

attachée initialement à me t tre au p oint les modalités

expérimentales de repr oduc ti on de la bonamiose.

J'ai pu ensuite aborder l a cinétique et la variabilit é individuelle

de développement de la maladie chez l'huître.

Enfin, j'ai che rché

d'autres espèces

hôtes réserv oi r s .

de

quelle était la sens ibi lité à B.ostreae

bivalves susceptibles de constituer des

4

II - MATERIELS ET METHODES

1 - ORIGINE DES ANIMAUX

Des huîtres plates O.edulis parasitées sont pêchées par

dragage dans la baie de Quiberon. Ce site est atteint par la

bonamiose, les taux d'infection variant entre 0 % et 30 % en

f onction de l ' âge et de la période (9).

De s huît r es plates saines âgées de 2 à 3 ans proviennent d e

l ' étang de Thau

B .o s trea e comme

cette populatio n est indemne du parasit e

l'attestent les examens histologiq u e s

effectués dans le cadre du suivi épidémiologique depuis

p lusieurs années.

Des huîtres creuses C.gigas (2ans) ont été récoltées dans des

él evages surélevés situés dans le bassin de Marennes -O lér o n.

Des palourdes Ru ditape s philippinarum (18 mois) ont ét é

prélevées sur parcs dans le bassin de Marennes-Oléron.

Le lot de coquilles Saint - Jacques Pecten maximus, originaire

de la baie de Saint Brieuc,

différents .

est composé d'individus d'âges

2 - TECHNIQUES D'ELEVAGE AU LABORATOIRE

a. Maintien des animaux

Les coquillages ,

maintenus dans

à raison de 30 par lot expérimental, sont

des ba cs cubiques (0.2 m2 de surface)

co ntenant environ 30 l d'eau de mer filtrée . Ces bacs sont

lavés trois fois par semaine à l'eau de mer (fig.1).

5

FIG.1 ." SALLE DE PATijOLOGIE EXPERIMENTALE

FIG.2 INOCULATION D'UNE SUSPENSION DE BONAMIA OSTREAE

DANS LA GLANDE DIGESTIVE D'UNE HUITRE TRONCONNEE

b. Param è tre s physico-chimiques

L'eau de mer util i sée est f il t r ée sur cartouche de 1 ~m de

poros i té. Dans ces conditions , il n'y a pas d'introduction

possible de protozoaires , en pa r ticulier de B.ostreae. Par

ailleurs, il faut noter que l ' élevage d'O.edulis est absent du

bassin de Marennes - Oléron ce qui limite les risques de présence

du parasite dans l'eau de me r.

L'oxygénation de l'eau de chaque bac est assurée par un

diffuseur, greffé sur un circuit surpressurisé à 0.3 bar.

Les observations d'infections n aturelles semblant indiquer qu e

celles-ci sont plus rapides durant l'été, la température

ambiante des s&lles d'élevage a été maintenue aux environs de 16" C

Compte tenu du changement régulier de l'eau dans les bacs

expérimentaux, leur salinité

l'estuaire de

30 pour mille.

c. No urrit u re

Tetraselmis

la Seudre qui

suesica,

appartenant aux Chlorophycées

est comparable à celle de

a pour valeur moyenne hivernale

algue

et

unicellulaire

la Chromophycée

flagellée

Isochrysis

galbana sont

deux souches,

cultivées au laboratoire . Un litre de mélange des

volume à volume , est distribué une fois par jour

dans chaque bac .

La densité des cultures uti l isées varie selon l'espèce

est en moyenne de 13 millions de cellules par ml.

6

elle

3 - PURIFICATION DU PARASITE BONAHIA OSTREAE

a. Protocole

Des h uîtres fortement parasitées sont identifiées par examen

histologique d 'appositions de coeur. Le système circulatoire

des huîtres étant ouvert, les hémo cytes sont disséminés dans

les différents organes . De ce fait, une purification

quantitative des parasites (schéma fig . 3) nécessite d'utiliser

le corps entier des huîtres parasitées, excepté le muscle

addu cteur dont la nature fibreus e empêche un e homogénéisation

correcte des tissus .

Les huîtres sont broyées à l'aid e d'un homogénéiseur de type

ultra - turrax dans de l'eau de mer filtrée à 0 .45 ~m (EMF).

Ap rès tamisage sur toile nylon de maille décroissante (300, 60

et 25 ~m), les broyats sont clarifiés par centrifugation

(3000g, 30mn, SOC) . Les culots (C1) sont remis en suspension

dans de l'EMF et centrifugés comme précédemment pour éliminer

les matières résiduelles en solution.

L'étape suivante de la concentration des parasites consiste en

une centrifugation sur coussin de sucrose 20 % (3000g, 30mn,

SOC). Celle-ci élimine une grande partie des microorganismes,

les cellules parasites sont alors présentes dans le culot (C2 ) .

Par une centrifugation différentielle sur gradient discontinu

de sucrose 20 %, 40 % (p /p) (3000g , 30mn, SOC), les cellules

parasites sont regroupées à l'interface 20 % - 40 % ( l . 3 ) .

Cel le-ci est prélevée à la seri n gue, lavée dans de l'EMF, puis

centrifugée (3000g, 30mn, SOC) afin d'éliminer le sucrose.

7

EMF ~ ______ ,-_______ CORPS D'HUITRES PARASITEES (eau de f:le r filt r ée , 0 , 45 1") '" : . :. (s ans muscle nddu c teur)

1 - HOMOGENEISATION 1 , " '.' (ultra - turrax ) .' ......... , '1 Broyat d' huitr es

. . (parasi t es libér és des hémocyt es)

2 - TANISAGE (300 ,60 ,251')

3 - CENTRI FUGATION (3 000g , 30mn , S ' C)

4 - CENTRIFUGATI ON (3000g , 30m~ , S'C)

5 - CENTRIFUGATION DIFFERENTIELLE (3000g, 30r:m , S·C)

6 - CENTRIFUGATION (3000g,30mn,S'C)

7 - CENTRI FUGATION ISOPYCNIQUE (3000g,30mn ; S'C)

• CJ:·· ... ., . ' ..

Sus pension de parasit es ( exenpte de ~;ros débr is) ..

~ SI = bact é r ie s,lipides , glycogène , ...

~ Cl = parasi t es , noyaux ,débris cellulaires r S1 é l iminé

O Cl remi s e n suspens i o~

Coussin de sucrose 20 ~ ( p/ p)

+ ~ ~: par asites , débris r S2 éliminé

8 C2 r emis e n suspensio:1

20

~o Gradie nt de de ns ité dis c ont i nu de suc!'one 20 ~ - 40 ~ (p/ p) ..

820 I 3 = par as i tes

40 C3 = débris cellula i res r C3 éliminé

lm Dilut ion de 13 avec de l 'EMF .. ~ ~~ = parasites r S4 éliminé

~)O C4 r e mis en suspensio:1 40 50 Gradi~nt di s con tinu de Per eoll 60 30-40-50- 60- 70 ~ (V/V ) 70

• ~~: so 60 70

SUSPENSION PURE DE PARASITES

FIG.3 PROTOCOLE DE PURIFICATION DE BONAMIA OSTREAE

Localisation des oarasites

(Si = surnageant; Ii = interface Ci culot)

Les culots ( C 4 ) de parasites concentrés sont remis en

suspension et déposés à la surface d'un gradient de densité

discontinu EHf-Percoll (0 . 7 H NaCl) 30 - 40 - 50 - 60 - 70 X

(vol/voll. La purification des parasites est achevée par

centrifugation isopycnique (3000g, 30mn,

Les fractions correspondant aux interfaces 50 X

8 0 C ) •

60 X et

60 % -70 X contenant les parasites purifiés sont alors

prélevées. Ces suspensions de parasites sont directement

utilisables pour des infections expérimentales ,le Percoll

étant dépourvu de toxicité.

b. Test de viabilité

La viabilité des cellules parasites est vérifiée en fin de

purification selon un test à l'acridine orange (O.lmg / 100 ml

EH stérile) et au bromure d'éthidium (O.lmg / 100 ml EH stérile).

Lors de l'examen au microscope à épifluorescence, les cellules

vivantes émettent en vert (acridine) alors que les cellules

mortes apparaissent orange (bromure d'éthidium) (fig.5), (16).

c. Test de contamination

La contamination microbienne des suspensions de paras i tes

purifiés est estimée

(T.S.A., Difco) d'une

par dépôt

série de

sur milieu nutritif gélosé

dilution au dizième. Les

colonies bactériennes sont comptées après 24H de culture.

8

d . Comptage des parasites

- Cellule de Halassez

C'est u n e ce l l ule à nu mé r ot ati on g l obulaire de 0 . 2 mm de

profondeu r. Chaque quadri ll age de la grille correspond à un

vol u me de 0 . 01 ~ l d ans l equel o n dénombre X parasites. A

partir d'u n e v al eur moyenne X établie sur 20 comptages, il est

poss i ble de quantifie r l e n om b re de parasites présents dans un

volume donné.

La suspension purifiée est préle v ée dans du percoll de même

densité que les parasites . Il est donc nécessaire de diluer

(1/4) cette suspension avec de l'eau de mer pour que les

parasites sédimentent rapidement et puissent être comptés.

Au microscope optique (X 40) , le parasite est reconnaissable

à l'état frais par ses granules réfringents (fig. 4).

- Co mpteur de p arti cul es (C o ul t r onic)

Le principe de comptage repose sur l'accroissement de la

résistance entre deux électrodes lors du passage d 'une

particule en suspension. L'amplitude de l'impulsion de la

tension ainsi générée est d irectement proportionnelle au volume

de la particule .

La gamme de taille des cel l ules parasites étant comprise entre

2 et 5 ~m, le comptage est réalisé avec la sonde dont le micro-

orifice est de 50 ~m de diamèt r e

cette sonde ( 0 . 6 à 24 . 6 ~m),

parmi les 16 canaux de

seuls les nO 6 à 9

correspondent à l a taille du parasite (1 . 9 ~m à 6 ~m).

Une solution témoin d'ea u de mer filtrée à 0.45 ~m permet

d'estimer le bruit de fond.

9

•

FIG . 4 : COMPTAGE DE B.OSTREAE

A LA CELLULE DE MALASSEZ lx40o)

CLASSE D' INf ECTI ON 3

0

•

• ri • e • •

• • • • .. e". 0

• • • • • •

., ••• •

• • • • • 0

0 • • 0

e

• e .. • • • o· • FIG. 5 TEST DE VIABILITE

DE B. OSTREAE (%400)

CLASSE D' INFECTION 4

FIG . 6 et 7 : EXAMENS HISTOLOGI QUES D'APPOSITION

. DE COEUR CHEZ O. EDULIS (xlOoo)

• •

• •

• • • •

• , •

Les comptages des cellules parasites sont effectués sur un

éch an ti llon de 50 ~l.

4 - PATHOLOGIE EXPERIMENTALE

a. Infection per os

La valve supérieure de s hu ît r es O.edulis est tronçonnée sur sa

partie antérieure droi te e n p r éservant l'intégrité de la

cha r nière. Les palpes labiaux qui bordent la bouche sont alors

visibles . La suspension de parasites est introduite dans la

bouche de l'animal à l'aide d'une micropipette type micro

pet tor (SMI).

b. In fec tion par inoculation

- Hu îtres : O.edu lis et C.gigas

La va lve supérieure est tronçonnée sur la longueur en évitant

de léser le manteau et de le décoller de la partie restante de

la coquille . L'inoculum (50 ~l) est inje cté directement dans

les tissus d e la glande digestive (aiguille, seringue) (fig.2).

- Palourde: R. philippinarum

Les valves sont simplement entai ll ées dans la partie

post érieure au n iveau du pied. L'orifice ainsi formé permet

d'inoculer dans la glande digestive.

- Coqu i lle Saint-Jacques : P .maximus

Les valves peuvent étre aisément écartées , ce qui permet

d'accéder directement à l'ensemble des organes . L'injection est

effect uée à la base de la branchie à proximité du muscle

adducteur.

1 0

5 - HI STOLOGIE

a. Hicroscopie photonique

Les appositions de t issus cardiaques sont particulièrement bien

adaptées au diagnostic histologique de B.ostreae,

sont représentatives de l 'infect ion.

car elles

Ap r è s ouverture de la cavi t é p é ricardiqu e, le ventricule est

préle v é et essoré sur papier filtre. Une série d'appositions

est al ors effectuée sur la lame histologique. Après séchage à

l'air, fixation au méthanol et colorat i on par l'hémacolor

(Merck), les parasites libr es et intracellulaires

facilement identifiables au microscope photonique (xl000).

Selon la richesse en parasites, l'in fection sera répartie en

en classes 0, 1, 2 , 3 ou 4 :

sont

- La première (classe 0) concerne les cas pour lesquels aucun

parasite n'a été observé après 10 mn d'examen microscopique.

- Si pour un même laps de temps, moins d'une dizaine de

parasites ont été identifiés,

la classe 1 .

l'infection sera classée dans

- La classe 2 regroupe les cas d'infection permettant

d'observer, 10 à 100 parasites en moins de cinq minutes.

- La classe 3 concerne les infections évidentes, des parasites

étant pr ésents dans pratiquemment tous les champs

d'observation du microscope (Xl000) ( fig . 6).

- Enfin, les cas de bonamiose avancée chez lesquels presque

tous les hémocytes sont parasités,

classe 4 (fig . 7) .

1 1

ont été placés dans la

Il

Cette échelle qui présent e un caractère approximatif, a été

dans ce rt aines expériences comparée aux résultats de

quant if ication d es infect io n s par immunodosage enzymatique.

b. Microscopie électronique

Les parasites pur ifiés en suspension~ont fixés (vol/voll dans

un mélange contenant du glutaraldéhyde (1.75 XI et du

paraformaldéhyde (2 XI tamponné par du cacodylate (0.1 MI.

L'osmolarité est ajustée à 1000 mosmoles par du sucrose. Une

post-fixation est effectuée par du tétraoxyde d ' osmium à 1 X.

Apr è s fixation,

d'agarose, puis

les cellules sont incluses dans un culot

s uccessivement déshydratées et imprégnées

d'épon par passage dans un automate (ultroprocesseurl.

Des coupes d'épaisseur 700 à 900 A sont contrastées à l ' aide

d'un automate (ultrostainer par l'acétate uranyle

aqueux et le citrate de

LKBI

plomb. Les observations sont

effectuées au microscope électronique de type Jeol 1200 CX.

6 - IMMUNODOSAGE

La présence et la quantité de cellules parasites de

B . ostreae dans un échantillon sont estimées à l 'aide d'un

immunodosage enzymatique de t ype direct (schéma fig.81.

L'hémolymphe (100 est p onctionnée dans la cavité

péricardique à l' aide d'une micropipette à embout conique. Ce

prélèvement est r éparti en v ol um e égal dans deux puits de

plaque de microtitration type Milli pore GV contenant 200 ~l

d'eau distillée.

1 2

ABC

Ll1JLI

-

-

1. Dépôt de l ' é chantill on

2. Addition d ' an ticorps monocl onaux (MAB ) couplés à l ' enzyme

O {?O : ,p o 0 000 00°: 0 0 o r oO o ° 0 0 r o O 0 00 0 00000 0 0 0

A J\.A J\. AJ... J\.J...

3. Lavage pour é l iminer l es ~IAB non f ixés

Addit i on du subs tra t de l' en zyme

·c ·~c· · 00 0 0 ° 0 0 . 0 •• • o 00 0 •• 00 • • •• o 00 0 0 0 0 0 O . JI lI( Jt lM ;t( l XXXXXl J...:J.. XX

,..-

r--

4 . La quantjt ~ de S~!bst~Dt transfor mé e n produi t coloré est fH::,o;)ür'..:ion!le lle à la quanti té de pa~asites présents dans l 'Oc llantillon

FIG.8 PRINCIPE D' IMMUNODOSAGE ENZYMATIQUE

DE B.OSTREAE (TYPE DIRECT) .

Da n s c es condi ti o n s , le s h émocy t e s subi s sent u n choc osmotique

q ui p r ovo q ue des a l térations i r réver~ibles des membranes.

Ai n si l es a nt ico r ps po urr ont accéder aux parasites

intrace l lulaires.

Les hémocytes

concentrés par

et les parasites sont ensuite rapidement

aspir a tion et adsorbés sur la membrane

Durapore (0 . 22 ~m) qui constitue le fond des puits.

Après séchage à l ' étuve et afi n d'éviter les

adsorptions ultérieures non spécifiques des anticorps, la

plaque est saturée pendant 2 heures, à température ambiante

(Tris 10mM, NaCl 90mM , Tween 20 à 1 X, BGG 1 X, BSA 1 X). Pour

chaque hémolymphe, un puit est conse r vé comme témoin et sera

incubé avec la solution de saturation (1 heure , température

ambiante) alors que l'autre puit sera incubé avec une solution

de l'anticorps

membranaire de

monoclonal

B . ostreae.

20

Cet

B2 spécifique d'un épi tope

anticorps , couplé à la

phosphatase alcaline est u tilisé après di lu tion au 1/1000ème

dans un tampon (Tris 10mM, NaCl 90mM, Tween 0.5 X, BGG 1 X).

Plusieurs lavages sont ensuite effectués (NaCl 90mM) pour

éliminer l'anticorps non fixé.

Enfin, chaque puit e st incubé a v ec une solution de substrat

soluble le NPP

diéthanol amine

( nit r ophenyl phosphate) dilué dans le tampon

( 5% , pH= 9. 8 ) . La présence d'anticorps

spéci f iques de B . ost r eae c oup l és à l 'en zyme e t fixés sur les

parasites, est r évélée p ar la coloration du produit de

t r ansformation du NPP . La densi t é optique (DO) mesurée au

lecteur de microplaques T ite r tek

à la quantité de parasites.

(405 nm) est proportionnelle

1 3

"

Les études cliniques, réalisées lors de la mise au point de

l'immunodosage (2) ont conduit à considérer comme infec tées les

hémolymphes corresp ondant à d es val eu rs de densité optique

supérieure s à 0.140 uni té DO. Seuls les r ésultats , dont les

témoi n s ont des valeu rs proches de 0 . 000 unité DO sont

considérés. En effet, dan s les cas d'huîtres e n phase pré-mortem,

des infections microbiennes sont susceptibles d'induire des

rés ul tats faussement positifs.

III - RESULTATS

- PUR IFI CATION DE BONAHIA OSTR EAE

Préa lablement aux purifications de parasites utilisées pour d es

infect ions expérimentales, deux purifications ont eu pour but de

tester la fiabilité de la méthode de comptage , la contamination

bactérienne , la viabili té ainsi que l'intégrité des parasites en

fin de purification.

a. Comparaison de méthodes de comptage

Les parasites prélevés dans les interfaces 50-60 X et 60-70 X du

gradient de Percoll sont comptés d'une part à la cellule de

Halassez et d'autre part à l'aide d'un compteur de particules .

Les résultats obtenus selon ces deux méthodes sont présentés

dans la figure 9 (A,B).

L'examen des profils de comptage par le compteur de particules

montre un pic centré sur 2 . 7 ~m (canal n07 ) . Les dimensions de

1 4

2.0

10

lrIo llhl" e de pr' l"l l cules

40 ' Nombre de particules

JC , 000 le 1 000

JO

2 D

0

,-

-- ,-

iÎ-f l---r-c N du 1

,-

l-

Expérlence

1

2

1

--

-, ~~,1-.1-.1-,~.-L_, L-. L-,l-"~"~U~,-) -,-.--,,--,,· cono l l , l ' ~ , 1 • , 10 Il Il Il l' I ~ l'

Taille du paras! te

Taille du parasite

E.tpèrienec 2

A) COMPTAGE DES PARASITES AU COMPTEUR COULTER

N ombre de particules

(canrlllx ('.7. 8 , 91

N' du canal

J' 000

97 000

78

83

Purification Cellule de ~laIQ(; se 'Z (1) Comp teur coulleur (2 ) Comparaison des 2 mtthoucs

2

Solution mère diluée au 1/ 3 :

dans 0 ,01 f l ---+ 'X ... 12 parosites

dans 1 ml ~ 1 200 000 porositcs

Solution mè re (x3)

dans 1 ml ---Ji- 3 ' 600 000 paras i tes

Solution lIu~rc dilu(:c ou 1/'1

dons 0,01 f'Ù -J> J. " 2,125

dons 1 ml -+ 2 125000 porasites

Salu t ion mè l'e (x'I)

don:; 1 nl 1 --+ 8 ')00 (X)O pat'nr.1tcu

Solut ion mère diluée au 1/6 : (2) - ( 1 ) , 080 000 - 3 600 000

dons 0 , 05 ml -Jil- 3'1 000 particules 480 000

dons 1 ml --.. 680 000 pnrticulcs cc qui correspond à une variation

Solution mère ( x6): de 12 ,;

dons 1 ml ~ 4 080 000 particules

Solutton mère diluée ou 1/5 (2) - ( 1) : 9 700 000 - 8 500 ()()()

don:; 0,05 ml -Jo97 000 particu les

dans 1 ml -Jo 1 9/10 000 pnrticules

So luti on ml' I'C ( liS) :

011111:. 1 !n I -Ji" IJ '(DO ClOO l'nl ' 1. h:1l1c ll

1 200 000

ce qui correspond à une variati on

dc 13 ,;

FIG 9 (A,Bl COMPTAGE DES PARASITES B_ OSTREAE

APRES PURIFICATI ON

B . ostreae étant comp ri ses e ntre 2 e t 5 ~m , seuls les canaux 6,7,

8 et 9 do i vent être co n si d é r és .

Pour la purif i ca t ion n 01 , 78 % des p ar t icules comptées peuvent

être assimi l ées à du parasite et 83 % po u r la purification nO 2.

Sur la base des observations en microscopie photonique, les

particules plus petites peuvent être assimilées à des

microorganismes et des débris cellulai r es alors que les plus

grosses sont

Malassez qui

(variation de

parasites. Il

en majorité des noyaux. Le comptage à la cellule de

est comparable

12 %) r epose

s'avère ainsi

à celui du compteur de particules

sur une identification directe des

particulièrement intéressant d'une

part pour sa représen t ativité et d'autre part pour sa plus

g rande simplicité de mise en oeuvre .

b. Contamina t i o n bactérienne

Les organes des huîtres étant en contact direct avec le milieu,

la contamination

particulier dans

moribondes.

bactérienne

le cas

est à priori importante, en

d'huîtres fortement parasitées

Les caractéristiques de taille et de densité de B.ostreae et des

microorganismes étant très voisines, la purification du parasite

ne permet pas d'éliminer la totalité des contaminants microbiens.

Ces derniers sont estimés à 10 % environ lors du comptage des

particules totales (fig.9,A canaux 2,3,4,5) .

Ces résultats

milieu gélosé.

de bactéries

sont confirmés par dénombrements bactériens sur

Le rapport du nombre de parasites sur le nombre

établi pour plusieurs purifications est compris

entre 70 et 120.

1 5

c. Intégrité ultrastructurale et viabilit é

Les s u spensions de par as it e s ob te n ue s l o r s des purifications 1

et 2 ont été t r ait é e s p a r de s examens en microscopie

élect r o n ique (f i g . l 0).

Ceux-ci ont mont r é qu e la morpho l ogie des cellules parasites

(fig . l l ) est simi l ai r e à ce l le décrite pour des formes

int r acellulai r es obser v ées su r

organites caractéris t iques tels

granules denses(~) sont présents.

membrane, corresp on da n t à la

des coupes de tissus. Les

q ue les haplosporosomes(qet les

Des fragments résiduels de

vacuole parasitophore, sont

identifiables à ' la surface des pa r asites purifi és . Ces derniers

présentent, dans certains cas , un espace périnucléaire dépourvu

de ribosomes . Cet artéfact de coupe probablement lié aux

modalités de purificatio n ,rend indispensable la réalisation du

test de viabilité.

Selon la technique à l'acridine orange et au bromure d'éthydium,

les tests de viabilité ont toujours indiqué des viabilités

comprises entre 95 et 1 00 % (fig.5).

d . Bilan d es puri f i cation s

Chaque infection expérimentale a été réalisée à partir d'une

p uri fication dont les caractéristiques sont reportées dans le

tableau 1 .

1 6

L l

FIG.10 EXAMEN DES PARASITES B.OSTREAE APRES PURIFICATION (X17 . 000)

~":-:. .; ; "\..>.:

.. .'~ .. . . , ., ... .. .

FIG. 11 ULTRASTRUCTURE DU PARASITE B.OSTREAE APRES PURIFICATION (X 48 000)

Purification

1

2

3

4

5

6

7

6

9

10

Il

12

Nbre hultres Nbre total Nbre total Nbre parasites Utilisation parasitées de parasites , de parasites Rdmt .

(en millions) /m1 Hu1trcs (en millions) (en millions)

Test 15 54 3.6 3.6

Test 20 270 6 . 5 13 .5

Ingestion / / 4 /

Effet 10 64 2.6 6.4

11 75 2.6 6.6

Dose.

5 170 6.6 34 Inoculation

4 42 1.5 10.5 d.

GD 6 93 J.2 15.5

Cinétique (inoc.ds GD) / / 4.4 /

Sensibilité 9 90 3.5 10

d'espêce

C. ghas 5 25 3 5

Sens!. [!!.:..Eh. / / 6 / d ' esp. P.rn.

TABL.l BI LAN DES PURIFICATIONS

Numéro Diagnostic de l' animal Date du sac r ifice(ti) Histologi e ELISA (DO)

1 0 0 . 053 2 0 0 . 054 3 0 0 . 082 4 0 0 . 084 5 0 0 . 096 6 0 0 . 098 7 0 0 .11 5 8 0 0 .12 3 9 t4 4 mois 0 0.125

10 0 0 . 126 Il 0 0 . 127 12 0 0 . 134(T·O .I05) 13 0 0 . 217 14 0 0·366 15 0 0 . 447(T·0.1271 16 0 0.598(T.0.803) 17 0 0 .599 (T.0 . 645) 18 0 ) 2(T>2 )

TABL . 2 : EXP. D' INFECTION PER OS

DIAGNOSTIC ET ESTIMATI ON DU DEGRE D' INFECTI ON

PAR HISTOLOGIE ET IMMU~ODOSAGE (T=puits t émoin)

2 - INFECTION PER OS D'OSTREA ED ULIS

Un lo t d e 3 0 huître s O . edul i s prove n ant de l'étang de Thau a été

infecté expé ri me nt a l e ment par ingestion forcée de 50 ~l d'une

suspension de pa ra si t es purifiés (4 000 000 parasites Iml) soit

200 000 B.ostreae pa r huître .

La d urée de l' e xp é ri ence étant de quatre mois , B animaux sont

mo r ts penda n t ce t t e période,

terme .

les 22 autres ont été sacrifiés à

L'examen histo l ogique des appositions de tissu cardiaque a

conduit à mettre en évidence un seul cas d'infection, très

faible , chez une huître morte au 45ème jour .

Les résultats d'ana l yse par immunodosage enzymatique des huîtres

sacrifiées en fin d'expé r ience sont p r ésentés dans le tableau 2.

Les valeurs, signif i catives par rapport aux témoins (T) sont

comp rises entre 0 . 053 DO et 0 . 366 DO . Ainsi, les deux

hémolymphes (13,14) chez lesquelles aucun parasite n'a été

identifié en histologie optique, ont une absorbance supérieure à

0.140 DO, valeur suggérant la présence de parasites .

3 - I NFE CT I ON EX PERIMENTALE PAR I NOCULATI ON

a - E t ud e du développem en t d e l a ma l a d ie ch e z Os t rea edulis

en fonct i on d e la qu a n ti t é inoculée d e Bo n amia ostreae

Cinq expé r iences d'infections expéri mentales ont été réalisées

pa r inoculation dans l a glande digestive. Le nombre de

parasites inoculés p ar huître est variable: 0 , 1, 100, 10000,

100 000, 000 000 . Pour chaque quantité de parasites, 30

huîtres sont inoculées .

1 7

Les résultats de ces expériences sont illustrés par les figures

12 (a,b,c,d,el.

Des mortalités précoces, moins de deux mois après l'infection,

sont notées sans mise en évidence de B.ostreae et ce, quelles

que soient les quantités de parasites inoculés. Le tableau 3

récapitule les pourcentages respectifs.

Leur analyse statistique est effectuée sur des pourcentages car

les lots d'huîtres sont de même taille en début d'expérience.

Par une analyse de variance, on remarque que pour un seuil de

5 '-

- les pourcentages ne sont pas significativement

différents d'une dose à l'autre (1, 100, 10 000)

- il existe un effet "purification" si gn if i c a t if

(expériences, lots d'huîtres différents)

L'effet "purification" est testé par la méthode de la PPDS

(plus petite différence significative). Les effectifs

correspondants aux différentes doses ( 1 , 100, 10 000) son t

alors regroupés (réplica) . Le classement des moyennes

(tableau '1) pour un seuil de 5 révèle que

les expériences 4,6 t 7 puis 6,7,8 ne sont pas

significativement différentes , .

.. • " .... ft

l'expérience 5 est différente des expériences 4,6,7.

Il faut noter, en particulier, que les mortalités précoces sont

similaires dans les lots témoins qui ont reçu 50 ~l d'eau de . , .. mer filtrée (0.45 ~m) par inoculation dans la glande digestive .

Pa r ailleurs, des animaux de même provenance, non inoculés, ont

'" .." .. ~ é té maintenus en élevage sans mortalité. •

1 8

"

)

2

)

2

o

Cl. d ' i n rection

o

o

o

o~o

o

•• 00

o

o

o

o 00 0 o o

..., SACRIFICES

i .. •

•

• •

........ 00

......... ~ .... ol.::...lo-..,,64

L-____________ ~--__________ ~------------~--------------~- -- - ---- - -~ 1 ,

FIG. a l

Cl. d ' iI,r, ·,; I ' "'' -

• ••

••

o

••

. ..

.. "ni!,"

I .... i ll l

•

... .

_ .-. . ~-

L-----~--~---:-------_;_-----....._lr- ---- ----""* z 3 fi Temp8

(IllOis)

FIG. bl

Cl. d'in f ection

o •

00 • 000 00 0

L-------,-------,,-------;-------. t-------- -- --, i 1·.· .....

( ... 01 ,, 1

FIG. 12 (a.b , c , d , cl

f 0 : MORTALITE

lb. : SACRIFICE

FIG. cl

EXP . DE CINërIQUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION

REPARTITION ET QUANTIFICATION DES INFECTIONS

EN FONCTION DU TEMPS ( ECHELLE HISTOLOGIQUE

NOMBRE DE PARASITES INOCULES / IillITRE

= 0 NATIIRELLE = 1 - 100 - 10 000

CJ 100 000 - 1 000 000

CI. d'infectIon

•••

•

• 0 0

•

o 000

.. ...... !1t .. .. .. 6.>4 ......... ............ . .

L ____ ___ , ________ -;, _________ ,:;-_______ ----:.+ ------- -1~~

Cl. d'Inhction

c 088

FIG. d)

8 8

FIG. el

o 0 00 0

( .. ,, 1

SACRI I CF.S

•••

••• 00

o 0

3

4

5

6

7

8

% moyen

a 1 100 la 000 100 000

/ 43 56 56 65

/ 16 3 ,5 20 /

50 40 36 70 /

24 33 26 53 /

30 40 33 20 /

34 34 31 44

3. TAUX D'INFECTION ( en %) DES HUITRES MORTES DE FACON PRECOCE

(\~'= dose non effectuée)

p4 = 51.7 J 4. TEST DE LA PPDS ENTRE p6 =

P7

1 000 000

/

17

1

/

/

48 .7 ]

(Pi) 37 .5 :J

LES EXPERIENCES p8 = 31 ] (0( =0. 05) P5 13

TABL. 3 et 4 MORTALITES PRECOCES D'HUITRES 0 .EDULIS ,

OBSERVEES PENDANT LES DEUX PREMIERS MOIS

APRES INOCULATION lE B .OSTREAE

A partir du 3ème mois après l'infection, des mortalités sont

associées à la présence de parasites. Cependant, l'intensité

des infections observées, variable entre et 4 selon l'échelle

histologique précédemment établie, indique que ces mortalités

ne peuvent être imputées directement au parasite.

Lors du sacrifice des animaux à la fin du 4ème mois

d'expérience, les ta u x d'infection observés dans chaque lot

(cla s ses 1,2 , 3 , 4) varient de % à 88 % en fonction de la

quantité de parasites inoculés (tableau 5).

L ' anal y se statistique de la réponse à l'infection est étudiée

sur des effectifs ~Ar les lot s d'huitres sacrifiées n ' ont plus

une taille comparable .

L'analyse de variance étudie l'évolution du pourcentag e de

la classe d'infection a sur les doses 1,

(a = 0 . 05)

100 et 10 000

- les effectifs sacrifiés ne révèlent pas une différence

significative en foncti o n d e s expériences

- les effectifs de la classe d'infection 0 montrent une

différence significative d'une dose à l'autre

L'effet T'dose" observé (1 , 100, la 000) est alors testé sur

la classe d'infection 0 par la méthode de la PPDS en

r e groupant les effectifs des différentes expériences

(réplica). Le classement des moyennes (respectivement 57 , 72,

99) montre pour un seuil de 5 %, une différence

significative entre les trois doses . Il existe donc un effet

dose important sur l'initiation des infections (passage de

la classe 0 aux suivantes) .

1 9

Nombre de pa rasi te 8 inoculés 0

Echelle de

~ 0 1 2

'E:xpér1en~e

4 / / /

5 / / /

6 8 0 0

1 9 0 0

8 12 0 0

L 21 0 0

[en ~ 100

.. .-

1 100 10 000 100 000

J , 0 1 2 J , 0 1 2 J , 0 1 2 J , 0 1 2 J

/ / 10 0 0 0 0 5 1 1 0 0 4 2 0 1 2 2 J 1 0

/ / 21 0 0 0 0 21 J 0 2 0 10 , J 0 0 / / / /

0 0 11 1 0 0 0 8 2 0 2 0 2 0 0 1 0 / / / /

0 0 12 0 0 0 0 1 J 1 0 , , 1 0 2 0 / / / /

0 0 11 0 0 0 0 10 0 J 0 0 1 2 2 1 0 / / / /

0 0 65 1 0 0 0 5 1 9 5 , 0 27 9 5 , 2 2 J 1 0

0 99 1 l' 26 51 'J 28 12

5. TAUX D' IN~ECTION DES HUITRES SACRI~IEES (en effectif)

("1" = dose non effectuée)

Class e

~ 0 l Do::;e

65

6. TEST DU KHI - 2 (~ =0 .05) 100 51 18

10 000 27

[ 143

Classe d ' infection 0 2

Dose

7. TEST DU KHI-2 (0. =0 . 05) 100 5 1 9 5

10 000 27 9 5

r 78 18 10

TABL . 5,6,7 :SACRI~ICES DES HUITRES O.EDULIS EF~ECTUES

QUATRE MOIS APRES INOCULATION DE B.OSTREAE

20

39

3 • 4

4

6

10

- ,

1 000 000

4 0 1 2 J 4

1 / / / / /

/ 1 , 1 1 1

/ / / / / /

/ / / / / /

/ / / / / /

1 1 , 1 1 1

12 88

~

66

69

47

182

49

47

116

L'ana l ys e de l a r é partition des cla s s e s d'i nfec t io n pe u t

s 'effectuer pa r de s te s t s d u Khi 2 p o ur l e s d oses 1 , 100 et

l a 0 0 0 (a = 0 . 05)

- les classes a et l (1 = classes 1+2+3+4) sont

s ignific a tivement di f f é rent es ap r ès correction par le

f a cteur d e Yate s (tabl .6 ) .

- la ré pa rtiti o n e n c la sses 0 , 1, 2 , 3 + 4 ne r évèle par

co n t r e a u c u ne dif fé r e n ce significative après

co rre c ti o n p a r l e fac t e ur de Ya tes (tabl . 7)

b. Ci n é t ique de développeme n t de la b o n a mio s e

Un l ot de 1 26 hu î tre s a é t é infecté expérimentalement par

inoculat i on d ans l a g lande d igestive de 220 000 B.ostreae

par huître . Cette d o s e a été retenue suite aux premières

observations conce r na nt les expériences 4,5,6,7 , 8. Celles - ci

montraie n t q u'e n tre 100 000 et 1 000 000 de B . ostreae injectés,

des infections étaie n t i dentifiées dès le 2ème mois.

Les première s détec t ions de l a bonamiose par examen

histologique, s e font p eu av a nt le ?ème mois d'infection pour

des mo r tali t és spontanées (fig . 13 ) .

Le 1 er sacrifice me n suel (t l ) , condu i t à i dentifi e r le parasite

chez 5% des a ni maux , l e 2 è me (t2) chez 5 0 %, le 3ème (t3) et l e

dernie r (t4) ch ez 100 % des c as ( t abl . 8 , f i g.14) .

L'analyse stati s t i que de l a r épa r t i t i on de l'infection en

c l asse a et l ( 1 = cl asses 1+2+3+4) s ' effect u e par un test du

Khi 2 ( ta bleau 9) : a près correction par le facteur de Yates,

20

"

3

2

o

Cl . d'infec tion

Mortalité naturelle

Sacrifice

o

o 00

o ~~ 0 a

ooo~~ 00 00

a 00: %> 00

2

ooog 00 a

o

o

o

Tempo e n Illois 3 •

nc. 1}: REPfl.IlT I TlOH l':-r QUfl.NTTFTCfl.1TOH OF.S T N FF.c:T 'ON ~ EN FOHCT JOI ou Tf':MIOS

\00

50

:::::ect if en ~

h o 123 4

tl

r

I-

l-

h o 1 2 3 4

t2 :: 2

ECHELLE Ill STOLOGIQUE

-

r-

I-

o 1 234

t3 • 3

~

l-

l-

o 1 234

tl; :: 4

CI .d'inrect ion

Socrifices en moi~

FIG . 14 HISTOGRAMME DE REPARTITION DES INFECTIONS D'O.EOULIS

A CHAQUE SACRIFICE MENSUEL (ti)

FIG . 13 et 14 EXP . DE CINETIQUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION

CHEZ O.EDULIS

Clas~e

t 1 r.loi~

, 2 2 mois

'3 3 mois

, 4 4 mois

0 2 3

'.!ffe c tif • cffp.~tir ~ effec tif ~ effectif r .. 22 95 5 0 0 0 0

11 50 6 27 4 18 • 0 0 7 70 10 2 20

0 0 3 50 2 33 17

TABL. 8 REPARTITION DES INFECTIONS A CHAQUE SACRIFICE MENSUEL

~e 0 l ~ ét: ... $

22 23

TABL. 9 TEST DU KHI-2 ( .0.05) 2 11 11 22

TABL. 8 et 9

3 0 10 10

4 0 6 6

1: 33 28 61

EXP. DE CINETIQUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION

CHEZ O.EDULIS

• e r f"ect j f < .'

0 0

0 0

0 0

0 0

e l le mont r e u ne différence significative entre les temps ti de

l ' infection .

Il faut remarquer que le diagnostic histologique a été effectué

en deux temps

suggéraient la

en effet les résultats des immunodosages

présence de parasites chez des animaux

initialement considérés comme négatifs (tabl.l0 : *)

L'hémolymphedes animaux morts de façon précoce avant la fin du

1er mois de l'expérience, et celle des animaux morts entre les

temps tl et t2 n'ont pas été analys ées en ELISA.

Les résultats

(qOlbl.l0) sont

établis

corrélés

par chacune de ces deux méthodes

dans 77 des diagnostics.

L'immunodosage est dans 7 X des cas supérieur à l'histologie

(A) , et inversement . ). Cette situation correspond aux

limites de sensibilité pour de très faibles infections. Enfin,

dans 9 X des analyses (.), l'état moribond des animaux rend

les diagnostics incertains en particulier en immunodosage.

4 - INFE CTIONS EXPERIMENTALES DE DIFFERENTES ESPECES DE BIVALVES

a - Crassostrea gigas

Des essais d'infection expérimentale de C.gigas ont été

réalisés par inoculation dans la glande digestive. 30 huîtres

réparties en quatre lots ont r eçu respectivement 175, 1750,

17 500 et 175 000 B.ostreae par huître (fig.15) .

Les mortalités précoces se sont avérées très importantes dans

les deux expériences , quelles que soient les quantités de

parasites inoculés .

21

NUIllt!ro Dale de DK)rtalilé Diagnos ti c Numé ro Date de .ortal!té (ti il t n (tiA. tJ)

e l'onimol ou de u crUJce ( l J ) de l 'animal

ou de sacrir i ce ( li) llisto ELISA

1 a 0 .000 ' 6 2 a 0.021 '7

3 a 0 . 028 48

" a 0 .029 '9

5 a 0.036 50

6 a 0.0)7 51

7 a 0 .038 52

8 a 0 .043 53

9 a 0 .052 5' t 2 è t 3 la a 0.053 55

tl • 1 .,ia 0.056 56 11 a

12 a 0·057 57

13 a 0.061 58

l' a 0.067 59

15 a 0.068 60

16 a 0 .076 61

17 a 0.081 62

18 a 0.125 63

19 a 0. 129 6' 20 .0 0.~14(T.O.q56)+ 65 21 a 0 .49 1(T _0.444 )+ 66 22 a )2 (T > 21+ 67 23 0-4 1 0.103 0

68

2" a 0.025 69 t3 • )lIIOis

25 a 0 .027 70 26 a 0.040 71

27 a 0.040 72 28 a 0.054 73

29 a 0.054 7' 30 a 0 .068

75 31 a 0.082 76 32 a 0.155 ..

77 J3 a 0 . 162 .. 78 t 3 il t " 3" t2 • 2 DOis a 0. 163 ..

79 15 1 0.076 •

80 36 1 0.086 • 81 37 0-4 1 0.109 •

j8 1 0.20 0; 82

)9 1 0.472( T-0 . 514 >+ 83

"0 1 O. 601( T-0 . 455 )+ 8' t4 • 1; fIIOis

' 1 2 0 . 111 . 85

'2 2 0.150 86

"3 2 0. 159 87

44 2 0.705(T.0.3981 +

'5 3 0.247

TABL. 10 EXP . DE CINETI QUE DE DEVELOPPEMENT DE L'INFECTION

DIAGNOSTIC ET ESTIMATION DU DEGRE D'INFECTI ON

PAR HISTOLOGIE ET IMMUNODOSAGE (T=puit t emoin)

Diagnost i c

H1sto ELISA ( DO)

O~ 1 0.11 ) •

0-1 1 0.125 •

a 0 . 1)6

a 0.159(To O.!!'I + a o. 259(T.o . 476 1.

. '1 0. 173

1 0. 192

1 0.236

1 0.252

2 0 .291

2 0.539

3 0.563

3 0 .998

3 1 .002 , 1.156

• 1.855 , 1 . 882

• >2 , >2

0--7 1 0.117 0

0--7 1 0 . 145 . ...

0-4 1 0. 238 ....

0--7 1 0.246 . ...

1 0·321

1 0.)21

1 0 · 321

2 0.370

3 0.715

3 0.908

1 0 . 190

1 0 .292

2 0 . 429

3 0.765 , 1.079

4 1.769

• 2

1 0 .086 •

0-11 '0. 10) •

1 0 . 1)0 •

2 0. 134 •

2 0.)47

3 0 . 974

A C:l. l ' , .. rec t , ....

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2

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2 )

EXPERIENCE A)

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2

• • •

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2 J

EXPERI ENCE B)

FIG. 15 (A,B) RESULTATS D'ESSAIS D'INFECTION PAR B. OSTREAE,CHEZ C.GlGAS .., .,c_ t'1 ,., Il . . ~ . ..

l'CID,,:. (rnois)

o

0

l'clllpll (illois)

Au tr o isi è me mois, l e s ta ux de survi e ne dépassent pas 15 %.

Ch e z qua tre huître s d e la d e u x i ème expérience, des parasites,

en no mbr e tr ès limité , on t été mis en év i dence (fig 15 Bl.

b - Rudi ta pe s philipp i n ar um

Un lot de 40 p alou r des R.philippinarum agées de 18 mois a été

infecté par i n oculation de 300 000 B.ostreae par huître dans

la g l ande digestive. Les animaux ont particulièrement bien

tolé r és l'inject i on p u isque se u lement 8 sont morts pendant les

quatre mois de l ' expérience. Aucun parasite n'a été identifié

chez ces palourdes , ni dans celles sacrifiées en fin

d'expérie n ce .

c - Pecten maximu s

L'essai d ' infection a porté sur 41 individus d'âges différents.

Deux mois après i noculation de 300 000 B . ostreae par huître,

aucune cellule parasite n'a été identifiée dans les cas de

mortalité spontanée , il en est de même chez les animaux

sacrifiés au bout de 4 mois . La présence de rickettsies a par

contre été constante.

22

IV - DISCUS SIONS - CONCLUSIO NS

L'étude des relat i o n s d'un pa r asite avec son hôte repose sur

une maîtrise opt i ma l e des modalités de reproduction

expérimentale de la maladie.

Dans la pratique, l'élaboration d'un tel modèle nécessite

initialement de pouvoir isoler et purifier l'agent, bien que

la maladie puisse être souvent reproduite de façon empirique.

Ainsi, la bonamiose a pu être initiée au laboratoire chez des

huîtres saines par " proximité" avec des huîtres infectées (9,

19) et par "feeding" (18) ou par inoculation (9,18) avec de s

broyats d'huîtres parasitées . L'extrême variabilité des

résultats alors obtenus est évidemment liée à l'hétérogénéité

des inoculum .

La disponibilité d'un protocole de purification de B.ostrea e

représente une amélioration notable de préparation de tels

inoculum. Dans mes exp é riences, les parasites régulièrement

isolés et purifiés ont pu être quantifiés précisément et leur

viabilité vérifiée.

Cependant, la contamination bactérienne et éventuellement

fongique (levures), estimée en moyenne à %, constitue encore

un aléa difficile à solutionner par une amélioration du

protocole de purification. L'addition d'antibiotiques pourrait

être essayée en vérifiant leur inocuité pour B.ostreae.

Par ailleurs, l' i mpact de cette contamination sur les

mortalités précoces ,

certain. En effet,

observées dans nos expériences, n'est pas

les résultats similaires observés chez le s

animaux témoins suggèrent que l'inoculation elle-m ê me dans la

23

gl ande digestive puisse être directem ent impliquée dans les

mo r ta lit és. Ce lle s - ci résulteraient de lésions tissulaires et

de se pti cémies secondaires .

*****

Dans le cadre de l 'essai d'infection per os, cette faible

contami nat ion bactérienne n'intervient évidemment pas, mais

l'ingestion forcée de 200 000 parasites chez 30 huîtres, s'est

traduite par l'identification histologique d 'un seul cas de

bonamiose.

Ces résultats sont à comparer à ceux obte nus par immunodosage

enzymatique des hémolymphes

à

( 2 ) .

des

En effet,

résultats d'infections associées

supérieurs à 0 .1 40 DO, le s animaux 1 3 , 1 4,

sur la base

d'immunodosage

peuvent être

considérés comme

supposer que la

positif .

durée de

Dans ces conditions, on peut

l'expérience (4 mois) a été trop

courte pour diagnostiquer les débuts d'infection. A l'encontre

de cette hypothèse, il faut ra ppeler que des infections sont

identifiées dès le troisième mois lors d'introduction

d'huîtres saines dans une zone in fectée .

Cette expérience est actue ll ement r épé tée s ur une centaine

d ' huîtres , une première série de sacrifice devant être

effectuée au six i ème mois .

*****

24

Les résultats obtenus pour les infections expérimentales par

inoculation de différentes quantités de parasites sont

particul ièr emen t intéressants à analyser.

Compte tenu des mortalités précoces observées chez tous les

animaux et estimées à 30 % environ ,

d'améliorer les modalités d'infection.

il s'avère nécessaire

Des essais d'injection, dans des organes moins susceptibles de

s'infecter, suite à une inoculation, doivent être maintenant

développés il s'agit en particulier du muscle et du

péricarde. Parallèlement ,

pénicillines, agissant

des antibiotiques,

spécifiquement sur

tels que des

les parois

bactériennes , pourront être utilisés, la posologie devant être

définie.

Dans nos essais ,

directement liée

respectivement de

10 000 , 100 000 et

la quantité de parasites inocul és est

aux taux d'infections initiés, qui sont

'Y. , 28 %, 43 %, 71 % et 88 % pour 1, 100,

000 000 de parasites. Ces dernier s taux sont

nettement plus importants que ceux obtenus précédemment par

d'autres méthodes (1,9,18,20).

Cependant, au sein de chaque lot, les degrés d'infections sont

différents. Ces

individuelle de

résultats suggèrent

la sensibilité à

une variabilité

B.ostreae qu'il sera

nécessaire d'étudier ultérieurement sur des effectifs plus

élevés, afin d'obtenir des résultats exploitables d'un point

de vue statistique.

25

Par contre , et c'est probablement le point primordial de ce

travail , il apparaît que des huîtres pourraient présenter

entre elles une sensibilité différente au parasite. D'un point

de vue immunopathologie des mollusques, il devient ainsi

possible d'appréhender expérimentalement les mécanismes

immunitaires, cellulaires et humoraux, en réponse à une

infection parasitaire.

l'analyse individuelle

De telles investigations reposent sur

de l'hémolymphe d'huîtres pendant

plusieurs semaines. Les techniques de base, telles que prise

d e sang, détermination des populations de cellules sanguines,

analyse biochimique de facteurs seriques, immunodosage du

parasite sont maîtrisées au laboratoire.

Un début d'interprétation des phénomènes que nous avons mis en

é vidence est donc envisageable. Parallèlement, des analyses à

l'échelle cellulaire des relations hôte-parasite sont

développées suite à la mise au point de modèle d'étude in

vitro. (Mourton, CH., comm. pers.)

*****

Cette variabilité individuelle se retrouve dans notre

expérience qui avait pour but de préciser la cinétique de

développement de l'infection. En effet, dans le même lot

expérimental, l'infection s'avère fatale pour certaines

huîtres alors que d'autres semblent exemptes de parasites.

26

Comme précédemment , l'analyse individuelle du développement de

l'infection est nécessaire à la compr éhension des processus

infectieux .

*****

D' u n point d e vu e épidémiologique et de l'éventuelle

sensibilité d'autres espèces de b ivalves vis à vis de

B.ostreae, seu l e l'huître creuse C.gigas semble mériter d ' être

prise en compte. Des infections expérimentales seront donc

renouve l ées.

*****

En conclusion , ce travail expérimental est or i ginal en

pathologie des mollusques de par sa méthodologie expérimentale

(parasites purifiés

(immunodosage) . Il

et

présente

quan tif i és)

de ce

et analytique

fait de nombreuses

imperfections qui indiquent plusieurs voies d'améliorations

pour acquérir le statut de modèle d'étude. Cependant, il rend

possible , prochainement, des r echerches en immunopathologie

infectieuse . En fin , sur ces premières bases méthodologiques,

un travail en collaboration avec une équipe américaine est en

cours pour vérifier la résistance à B. ost r eae d'une souche

d'huître plate lo cale (8).

*-* - *-* -*-*-*-*-*-*

27

v - BIBLIOGRAPHIE

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