IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A61/4 PADA ...

IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA

SUBJEK UJI NONPEROKOK SUKU PAPUA INDONESIA DENGAN

METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Ferawati

NIM : 178114032

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2021

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii




SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Ferawati

NIM : 178114032

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2021


iii

Persetujuan Pembimbing




Skripsi yang diajukan oleh:

Ferawati

NIM: 178114032

telah disetujui oleh

Pembimbing Utama

Dr. apt. Christine Patramurti

tanggal


iv

HALAMAN PENGESAHAN


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana

layaknya karya ilmiah. Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme

dalam naskah ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan

perundang-undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 10 Juni 2021

Penulis,

Ferawati


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Ferawati

Nomor Mahasiswa : 178114032

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

Identifikasi Genotipe Gen Sitokrom P450 2A6*1/*4 Pada Subjek Uji

Nonperokok Suku Papua Indonesia Dengan Metode Polymerase Chain

Reaction (PCR)

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-

ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,

mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media

lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun

memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis.

Atas kemajuan teknologi informasi, saya tidak berkeberatan jika nama, tanda

tangan, gambar atau image yang ada di dalam karya ilmiah saya terindeks oleh

mesin pencari (search engine), misalnya google.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 22 Juli 2021

Yang menyatakan

Ferawati


vii

HALAMAN PERSEMBAHAN

Karya ini saya persembahkan kepada:

Tuhan Yesus

Kedua orang tua saya Bapak dan Mama

Adik-adik saya Rini, Ryo dan Raffael

Keluarga besar dan sahabat

serta

Almamater tercinta Universitas Sanata Dharma


viii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Yang Maha Esa

atas berkat dan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyusun dan menyelesaikan

skripsi yang berjudul “Identifikasi Genotipe Gen Sitokrom P450 2A6*1/*4 Pada

Subjek Uji Nonperokok Suku Papua Indonesia Dengan Metode Polymerase Chain

Reaction (PCR)” untuk memenuhi persyaratan dalam memperoleh gelar Sarjana

Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Proses penyusunan skripsi ini tidak lepas dari dukungan, peran, dan bantuan dari

berbagai pihak. Maka dari itu, melalui kesempatan ini penulis ingin mengucapkan

banyak terima kasih kepada:

1. Ibu Dr. apt. Yustina Sri Hartini selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Dr. apt. Christine Patramurti selaku Kepala Program Studi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, serta selaku Dosen

Pembimbing Skripsi yang selalu memberikan masukan, arahan, ilmu dan

mendampingi dengan penuh sabar selama proses penyusunan naskah skripsi

dari awal hingga akhir sehingga menjadi lebih baik.

3. Bapak Dr.Jeffry Julianus, M.Si. dan Ibu Damiana Sapta Candrasari, S.Si,

M.Sc. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan kritik, saran dan ilmu

yang bermanfaat serta membangun dalam penelitian ini.

4. Ibu Dr. apt. Erna Tri Wulandari selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

telah mendampingi selama proses perkuliahan di kelas FSMA 2017.

5. Bapak Kayatno selaku Laboran Laboratorium Biokimia dan Bapak Yohanes

Wagiran selaku Laboran Laboratorium Kultur Jaringan yang telah sabar

dalam membantu proses penelitian ini.

6. Seluruh Dosen yang dengan sabar memberikan ilmu pengetahuan dan Staff

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma atas bantuannya selama proses

perkuliahan.


ix

7. Bapak Yohanis dan Ibu Elisabeth selaku orang tua serta adik-adikku Rini,

Ryo dan Raffael yang sangat aku cintai. Terima kasih telah banyak

memberikan dukungan, semangat, doa dan kasih sayang yang begitu besar

selama proses perkuliahan serta penyelesaian skripsi.

8. Keluarga besarku yang selalu memberikan semangat, doa dan kasih sayang

selama proses perkuliahan serta penyelesaian skripsi.

9. Teman-teman seperjuangan penelitian skripsi yaitu Albertha, Vivian, Yosin

dan Epifania yang telah saling mendukung dan melengkapi satu sama lain.

Terima kasih atas kerjasamanya dan suka duka yang telah kita lewati

bersama.

10. Sahabat-sahabatku tersayang dan seperjuangan selama perkuliahan di

Farmasi yaitu Shannia, Veren, Vivian, Desmar, Janise, Bergita dan Carolin

yang telah menemani selama proses perkuliahan. Terima kasih atas kasih

sayang, dukungan dan bimbingan yang telah kalian berikan selama

berkuliah sehingga membuatku menjadi pribadi yang lebih baik.

11. Sahabat-sahabatku dan saudaraku yang telah berjuang merantau bersama di

Yogyakarta yaitu Bergita, Meydistra, Yezika, Ica, Nelly, Welly dan

Dayanara. Terima kasih telah berjuang bersama dan saling memberikan

dukungan selama berada di Yogyakarta.

12. Kakak Marni dan Tina yang berjuang merantau bersama di Yogyakarta.

Terima kasih telah memberikan semangat, kasih sayang dan dukungan serta

sudah menjagaku selama merantau di Yogyakarta.

13. Teman-temanku yang jauh disana yaitu Januar, Malik, Jaka, Yosi, Iyo,

Bambang dan Yoga. Terima kasih atas kasih sayang, semangat dan motivasi

selama proses perkuliahan serta penelitian ini.

14. Teman-teman seperjuangan FSMA 2017 dan golongan A2 yang sudah

berjuang bersama selama proses perkuliahan. Terima kasih atas dinamika

dan kerjasamanya selama proses pembelajaran di kelas serta selama

praktikum.


x

15. Semua pihak yang belum disebutkan dan turut membantu selama proses

penelitian serta penyusunan skripsi.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan

skripsi ini, sehingga penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari

semua pihak. Penulis berharap semoga penulisan skripsi ini dapat bermanfaat bagi

pembaca dan perkembangan ilmu farmasi.

Yogyakarta, 10 Juni 2021

Penulis,

Ferawati


xi

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL ............................................................................................ i HALAMAN JUDUL ............................................................................................... ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN ...................................................... vi LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI ............................................................. vi HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... vii

PRAKATA ........................................................................................................... viii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv ABSTRAK ............................................................................................................ xv

ABSTRACT ........................................................................................................... xvi PENDAHULUAN ................................................................................................ 17

METODOLOGI PENELITIAN ............................................................................ 19 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 23 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 33

LAMPIRAN .......................................................................................................... 36 BIOGRAFI PENULIS .......................................................................................... 45


xii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Frekuensi alel dan genotipe CYP2A6 .................................................... 28

Tabel 2. Efek Genotipe*1/*4 pada beberapa obat ................................................ 30


xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA ................................................... 24

Gambar 2. Urutan basa nukleotida dan primer CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 ..... 27

Gambar 3. Hasil elektroforesis produk PCR CYP2A6*4 ................................... 28


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik .......................................................... 36

Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix ................................. 37

Lampiran 3. Informasi Pemakaian Go Taq Green Master Mix ........................... 38

Lampiran 4. Lembar Infromasi Nucleic Acid Gel Stain ...................................... 39

Lampiran 5. Lembar Infromasi DNA Ladder ..................................................... 40

Lampiran 6. Elektroforesis Hasil PCR ................................................................ 41

Lampiran 7. Hasil Penelitian ............................................................................... 42

Lampiran 8. Lembar Primer PCR alel CYP2A6*4 ............................................. 44


xv

ABSTRAK

Enzim sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) adalah enzim yang bertanggung

jawab dalam metabolisme beberapa substrat obat dan racun seperti nikotin,

fadrozole, asam valproat dan N-nitrosamin. Gen CYP2A6 adalah gen yang

menyandi enzim CYP2A6 yang memiliki bentuk polimorfisme yang tinggi

sehingga dapat berpengaruh terhadap kecepatan metabolisme substrat enzim

CYP2A6. CYP2A6*1 merupakan bentuk wild type dari CYP2A6, sedangkan

CYP2A6*4 merupakan salah satu bentuk polimorfisme yang tidak memiliki

aktivitas CYP2A6. Seorang individu yang memiliki CYP2A6*1 dan CYP2A6*4

dapat membentuk genotipe CYP2A6*1/*4. Genotipe CYP2A6*1/*4 merupakan

salah satu bentuk genotipe yang dikategorikan sebagai slow metabolizers yang

menyebabkan penurunan 50% aktivitas dalam memetabolisme substrat CYP2A6

dari keadaan normal. Penelitian ini dilakukan dengan cara deskriptif observasional.

Sebanyak 30 sampel isolat DNA akan dianalisis yang berasal dari penelitian

sebelumnya. Hasil isolat DNA dianalisis dengan amplifikasi menggunakan metode

Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil penelitian ditemukan dua macam

genotipe, yaitu 20 subjek uji ditemukan genotipe gen CYP2A6*1/*4 (66,67%) yang

merupakan Slow metabolizers dan 10 subjek uji ditemukan genotipe CYP2A6*4/*4

(33,33%) yang merupakan Poor metabolizers.

Kata kunci: CYP2A6*4, Polimorfisme, Suku Papua di Indonesia, Polymerase

Chain Reaction (PCR).


xvi

ABSTRACT

Cytochrome P450 2A6 (CYP2A6) enzymes are enzymes that are

responsible for the metabolism of several drug and toxic substrates such as

nicotine, fadrozole, valproic acid and N-nitrosamines. The CYP2A6 gene is a gene

that codes for the CYP2A6 enzyme which has a high polymorphism form so that it

can affect the metabolic rate of the CYP2A6 enzyme substrate. CYP2A6*1 is a wild

type of CYP2A6, while CYP2A6*4 is a polymorphism that does not have CYP2A6

activity. An individual who has CYP2A6*1 and CYP2A6*4 can form the CYP2A6

*1/*4 genotype. CYP2A6 *1/*4 genotype is one of the genotypes categorized as

slow metabolism which causes a 50% decrease in activity in metabolizing CYP2A6

substrates from the state. normal. This research was conducted in a descriptive

observational manner. A total of 30 DNA isolate samples will be analyzed from

previous studies. The results of the DNA isolates were analyzed by amplification

using the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. The results of the study found

two types of genotypes, namely 20 test subjects found the genotype of the

CYP2A6*1/*4 gene (66.67%) which was Slow metabolizers and 10 test subjects

found the genotype of CYP2A6*4/*4 (33.33%) which was Poor metabolizers.

Keywords: CYP2A6*4, Polymorphism, Papuan Black Race in Indonesia,

Polymerase Chain Reaction (PCR).


17

PENDAHULUAN

Variabilitas respon dan klirens obat antar individu merupakan masalah

yang umum terjadi dalam praktek klinis (Preissner dkk., 2013). Faktor utama yang

menyebabkan masalah tersebut adalah ekspresi dan fungsi enzim pemetabolisme

obat yang bervariasi. Ekpresi dan fungsi enzim yang bervariasi ini dapat

dipengaruhi oleh polimorfisme genetik (Zanger dkk., 2005). Polimorfisme

merupakan perubahan informasi genetik yang menyebabkan terjadinya variasi

bentuk dari gen, baik dua atau lebih dalam satu spesies (Patramurti dkk., 2019).

Sitokrom P450 2A6 (CYP2A6) merupakan salah satu gen yang memiliki bentuk

polimorfisme yang tinggi.

Gen CYP2A6 adalah gen yang menyandi enzim sitokrom P450 2A6

(CYP2A6) yang bertanggung jawab dalam metabolisme beberapa substrat obat dan

senyawa racun, seperti kumarin, nikotin, 3,5-dimetil-2-(3-piridil)thiazolidin-4-one

hidroklorida (SM-12502), tegafur, fadrozole, metoxyflurance, asam valproat,

aflatoksin B1, N-nitrodiethylamine, 1,3-butadine dan N-nitrosamin (Tanner dan

Tyndale, 2017; Fujieda dkk., 2004). Gen CYP2A6 memiliki bentuk polimorfisme

yang tinggi akibat adanya variasi lokus, seperti single nucleotide polymorphisms

(SNPs), gene deletions, duplikasi gen, hibrid gen dengan CYP2A7 dan konversi

gen (McDonagh dkk., 2012). Alel CYP2A6*4 merupakan salah satu bentuk

polimorfisme gen yang tidak aktif, sedangkan CYP2A6*1 (Wild type) merupakan

bentuk aktif yang memiliki aktivitas normal (Zdanowicz dan Adams, 2014).

CYP2A6*4 berperan sebagai gen deletion sehingga termasuk dalam bentuk gen

tidak aktif (Zdanowicz dan Adams, 2014; Patramurti dkk., 2019). Seorang Individu

yang memiliki alel CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dapat membentuk genotipe

CYP2A6*1/*4. Genotipe CYP2A6*1/*4 merupakan salah satu bentuk genotipe

dikategorikan sebagai slow metabolizers (Liu dkk., 2011; Patramurti dkk., 2019).

Frekuensi polimorfisme genotipe CYP2A6*1/*4 pada populasi di

Indonesia belum diketahui secara pasti, karena perbedaan etnis berpengaruh secara

signifikan terhadap frekuensi polimorfisme gen CYP2A6 tertentu (Tsukino dkk.,

2002; Muliaty dkk., 2010). Berdasarkan beberapa penelitian, genotipe gen


18

CYP2A6*1/*4 dapat ditemukan pada beberapa suku di Indonesia seperti suku Jawa

sebesar 63,9% dan Batak sebesar 2,9% (Patramurti dan Fenty., 2017; Soeroso dkk.,

2018). Selain itu, frekuensi bentuk polimorfisme CYP2A6 yang menurunkan dan

tidak memiliki aktivitas enzim CYP2A6 ditemukan lebih tinggi pada populasi di

Afrika dibandingkan populasi berkulit putih. Populasi Afrika merupakan ras

negroid yang memiliki warna kulit yang cenderung lebih hitam. Pada penelitian

yang dilakukan oleh Tanner dan Tyndale (2017), ditemukan bahwa frekuensi

bentuk polimorfisme genotipe loss of function seperti CYP2A6*1/*4 pada

populasi ras kulit hitam sebesar 38%. Ras kulit hitam juga terdapat di Indonesia

khususnya di daerah Papua. Selain itu, frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4

ditemukan cukup tinggi pada seorang nonperokok yaitu sebesar 13,8% sehingga

subjek uji yang digunakan adalah seorang nonperokok (Tan dkk., 2001).

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi genotipe gen

CYP2A6*1/*4 pada subjek nonperokok suku Papua Indonesia mengunakan metode

Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR adalah teknik biologi molekuler yang

digunakan untuk amplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi jutaan salinan sekuen

DNA melalui reaksi enzimatis yang diperantarai oleh primer (Hewajuli dan NLPI.,

2014). Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan yang telah dilakukan oleh

Handani, (2019) dengan judul “Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2A6*4 pada

Subjek Uji Nonperokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia Dengan Metode

Polymerase Chain Reaction (PCR)”. Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan,

karena pada penelitian sebelumnya hanya dilakukan identifikasi keberadaan dan

frekuensi alel CYP2A6*1, sedangkan pada penelitian ini akan dilanjutkan untuk

mengidentifikasi keberadaan dan frekuensi alel CYP2A6*4 sehingga dapat

diperoleh keberadaan dan frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4. Genotipe merupakan

kombinasi antara dua alel pada kromosom yang berbeda dan menghasilkan sifat

fisik yang disebut fenotipe (Styn dkk., 2013; McDonagh dkk., 2012). Tujuan

dilakukan identifikasi genotipe adalah untuk mengetahui fenotipe seperti kecepatan

metabolisme CYP2A6 pada individu tertentu, sedangkan pada penelitian

sebelumnya dilakukan identifikasi alel yang merupakan bentuk variasi gen yang


19

berada pada suatu lokus. Identifikasi alel dilakukan untuk melihat aktivitas enzim

CYP2A6, sedangkan dengan mengetahui genotipe maka dapat ditentukan fenotipe

pada suatu individu tertentu (McDonagh dkk., 2012; Raunio dan Rahnasto-rilla,

2012).

Pada penelitian sebelumnya dilakukan identifikasi keberadaan dan

frekuensi alel CYP2A6*1 menggunakan primer forward (5’- CCT CAT CAC ACA

CAA CTT CCT C - 3’) dan primer reverse (5’ - CGC AGG TAC TGG GTG CTT

GGT AG - 3’), sedangkan pada penelitian ini dilakukan identifikasi keberadaan dan

frekuensi alel CYP2A6*4 mengunakan primer forward (5’ - CCT CAT CAC ACA

CAA CTT CCT C - 3’) dan primer reverse (5’ - TGC AGG TAC TGG GTG CTT

GGT AG - 3’). Data hasil penelitian yang telah didapatkan oleh Handani, (2019)

akan digabungkan dengan hasil data pada penelitian ini. Hasil penelitian ini

diharapkan dapat memberikan informasi mengenai keberadaan genotipe

CYP2A6*1/*4 pada subjek uji nonperokok suku Papua Indonesia.

METODOLOGI PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah isolat DNA dari sampel darah non perokok

suku Papua yang berasal dari penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Handani,

(2019). Isolat DNA yang digunakan dari penelitian terdahulu telah mendapatkan

keterangan layak etik untuk digunakan pada penelitian ini. Primer forward: 5’ CCT

CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3’dan primer reverse: 5’ TGC AGG TAC TGG

GTG CTT GGT AG 3’. Water For Injection (WFI), 1 KB DNA Ladder (Geneaid),

alkohol 70%, aquadest, loading dye, gel agarose (Vivantis), Tris-Brorat-EDTA

(TBE) Buffer 10x (Vivants), nuclease free water dan Promega Go Taq Green

Master Mix (mengandung taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2 dan Buffer).

Alat Penelitian

Alat yang digunakan adalah satu set elektroforesis (Biorad), UV

Transilluminator (Fisher Scientific), microtube 1,5 ml (Biologix), vorteks (Fisher


20

Scientific), mikropipet 1-10 µL (Soccorex Acura 825), mikropipet 2-20 µL

(Soccorex Acura 825), mikropipet 1-10 µL (GilsonTM), PCR Tubes (Axygen),

dispossable gloves, blue tip, yellow tip, white tipe, ice tip, gelas beaker (Pyrex), hot

plate, kamera polaroid, microwave, erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Pyrex),

magnetic stirrer, Thermal cycler (Biorad T100TM) dan alat-alat gelas.

Tata Cara Penelitian

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Analisis kualitatif isolat DNA dilakukan dengan teknik elektroforesis

menggunakan gel agarose 1,0%. Pembuatan gel agarose dengan cara melarutkan

0,25 g agarose dalam larutan 1x TBE buffer sebanyak 25 mL. Campuran tersebut

kemudian dipanaskan menggunakan microwave selama sekitar lima menit hingga

semua agarose larut. Larutan gel agarose yang telah jernih di ambil dari microwave,

lalu ditambahkan 2,5 µL GelRed dan dicampur hingga homogen. Larutan gel

agarose dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah dipasang sisiran ditepi gel dan

gel dibiarkan mengeras. Setelah gel agarose mengeras sisiran ditepi gel dicabut

sehingga terbentuk sumur-sumur. Selanjutnya isolat DNA sebanyak 4,0 µL

diletakkan ke atas plat tetes, kemudian ditambahkan aqubidest sebanyak 1,0 µL dan

loading dye sebanyak 1,0 µL. Campuran isolat DNA diambil sebanyak 6,0 µL dan

dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran gel agarose dan salah satu sumuran gel

agarose diisi dengan DNA leadder sebanyak 3,0 µL. Gel agarose diletakkan ke

dalam gel tray yang berisi larutan buffer TBE 1x. Elektroforesis dilakukan pada

tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Molekul DNA pada gel tray akan

bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif pada pH netral. Gel agarose yang

telah elektroforesis kemudian diambil untuk melihat panjang pita DNA dengan

menggunakan sinar ultraviolet dalam trans ulliminator dan didokumentasikan

menggunakan kamera mirrorless Fujifil XA3.

Amplifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4

Fragmen genotipe gen CYP2A6*1/*4 diamplifikasi menggunakan primer

forward: 5’ CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C 3’dan primer reverse: 5’ TGC


21

AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3’. Amplifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4

dilakukan dengan menggunakan PCR, dengan bahan yang terdiri atas Promega Go

Taq Green Master Mix 12, 5 µl, forward primer 1,25 µL, reverse primer 1,25 µL,

isolat DNA 5,0 µL dan nuclease free water 5,0 µL yang dicampur dengan volume

akhir 25,0 µL. Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler parkin

elmer 2400). Kondisi PCR diatur dengan initial denaturasi pada suhu 95°C selama

5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 98°C selama 20 detik, annealing

pada suhu 62,6°C selama 15 detik, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 30 detik.

Amplifikasi dilakukan dengan siklus sebanyak 35 kali dan diakhiri dengan final

ekstensi pada suhu 72°C selama 5 menit.

Analisis produk PCR menggunakan teknik elektroforesis

Hasil produk PCR dianalisis menggunakan teknik elektroforesis, dengan

gel agarose 1,5% sebagai fase diam dan TBE 1x sebagai fase gerak. Timbang gel

agarose dan dilarutkan dalam larutan TBE 1x sebanyak 25 mL. Panaskan campuran

gel agarose menggunakan microwave hingga semua gel agarose larut, kemudian

tambahkan 2,5 µL Gelred dan dicampur hingga homogen. Larutan gel agarose

dituangkan kedalam cetakan gel yang telah dipasang sisiran ditepi gel dan gel

dibiarkan mengeras. Setelah gel agarose mengeras sisiran ditepi gel dicabut

sehingga terbentuk sumur-sumur. Gel agarose yang telah mengeras diletakkan ke

dalam bejana elektroforesis yang berisi fase gerak TBE 1x hingga permukaan

permukaan gel agarose terendam. Campurkan produk PCR sebanyak 5 µL dengan

loading dye sebanyak 1 µL. Ambil campuran produk PCR sebanyak 6 µL

menggunakan mikropipet dan dimasukkan kedalam sumuran gel agarose. DNA

ladder dimasukkan ke dalam salah satu sumuran gel agarose. Elektroforesis

dilakukan pada tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Gel agarose yang

telah elektroforesis kemudian diambil untuk melihat panjang pita DNA dengan

menggunakan sinar ultraviolet dalam trans ulliminator dan didokumentasikan

menggunakan kamera polaroid (Patramurti dan Fenty, 2015).


22

Analisis Hasil

1. Hasil produk PCR dideteksi menggunakan metode elektroforesis. Terbentuknya

hasil produk berupa pita dengan panjang 350 bp menunjukan bahwa isolat DNA

yang dianalisis memiliki alel CYP2A6*4, sedangkan jika tidak terbentuk pita

maka menunjukkan adanya alel CYP2A6*1.

2. Perhitungan frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4 pada subjek uji suku Papua

non perokok di Indonesia diawali dengan perhitungan frekuensi alel dengan

menggunakan rumus:

Frekuensi CYP2A6*1 =jumlah alel CYP2A6∗1 yang diperoleh

jumlah seluruh (30) x 100%

Frekuensi CYP2A6*4 =jumlah alel CYP2A6∗4 yang diperoleh


Setelah keberadaan dan frekuensi alel telah diketahui maka dilakukan

perhitungan frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4. Perhitungan genotipe

CYP2A6*1/*4 didasarkan pada penelitian yang telah dilakukan oleh Patramurti

dkk., (2015). Untuk mengetahui frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4, maka

dilakukan dengan mengidentifikasi keberadaan alel CYP2A6*1 yang ditemukan

pada penelitian sebelumnya dan alel CYP2A6*4 pada penelitian ini. Individu

yang memiliki CYP2A6*1 dan CYP2A6*4 dikategorikan sebagai individu yang

memiliki genotipe CYP2A6*1/*4. Selain dapat mengetahui genotipe

CYP2A6*1/*4, penelitian ini juga dapat mengetahui bentuk genotipe lain seperti

genotipe CYP2A6*1/*1 dan CYP2A6*4/*4. Setelah dilakukan perthitungan

manual, jumlah frekuensi setiap genotipe akan dilakukan perhitungan persen

frekuensi menggunakan rumus:

Frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗4







23

HASIL DAN PEMBAHASAN

Gen CYP2A6 merupakan gen yang memiliki bentuk polimorfisme yang

tinggi. Polimorfisme gen CYP2A6 dapat mempengaruhi kecepatan CYP2A6 dalam

metabolisme substrat obat. Identifikasi genotipe CYP2A6 dapat dilakukan untuk

mengetahui kecepatan metabolisme pada suatu individu teretntu. Penelitian ini

dilakukan dengan tujuan untuk mengidentifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4 pada

subjek uji nonperokok suku Papua Indonesia sebanyak 30 orang. Perhitungan

subjek uji telah dilakukan oleh Handani (2019) yang mengacu pada B-Rao (2001).

Subjek uji yang digunakan adalah orang dewasa keturunan suku Papua asli minimal

sampai third degree relativies yang bertempat tinggal di Yogyakarta dan seorang

nonperokok. Subjek uji yang dieliminasi pada penelitian ini adalah seseorang

dengan riwayat merokok kurang dari 5 tahun dan sedang terinfeksi bakteri atau

virus. Subjek uji yang terinfeksi bakteri dapat membiaskan hasil penelitian. Hal ini

dapat disebabkan akibat terisolasinya DNA virus atau bakteri tersebut (Handani,

2019).

Identifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4 dilakukan dengan tiga tahapan

utama, yaitu analisis kualitatif kualitatif isolat DNA, amplifikasi genotipe gen

CYP2A6*1/*4 dan analisis produk PCR menggunakan teknik eletroforesis.

Identifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4 dilakukan dengan meggunakan metode

Polymerase Chain Reaction (PCR). Subjek uji yang digunakan adalah suku Papua

yang merupakan ras kulit hitam. Frekuensi bentuk polimorfisme CYP2A6 yang

menurunkan dan tidak memiliki aktivitas enzim CYP2A6 ditemukan lebih tinggi

pada populasi ras kulit hitam di Afrika dibandingkan populasi berkulit putih.

Populasi Afrika dan suku Papua merupakan ras negroid yang memiliki warna kulit

yang cenderung lebih hitam.

Analisis kualitatif isolat DNA

Isolat DNA yang digunakan didapatkan dari penelitian terdahulu oleh

Handani (2019). Isolat DNA dari penelitian terdahulu disimpan pada lemari

pendingin dengan suhu -70°C. Penyimpanan isolat DNA dengan dengan temperatur


24

yang lebih rendah dapat digunakan dalam jangka waktu yang lama (Marwayana,

2015). Isolat DNA berasal dari subjek uji nonperokok ras suku Papua Indonesia

akan dilakukan analisis kemurnian isolat. Tujuan dilakukan analisis kemurnian

isolat DNA adalah untuk memastikan bahwa sampel isolat DNA masih dalam

kedaan murni sehingga dapat digunakan sebagai sampel identifikasi genotipe gen

CYP2A6*1/*4 (Patramurti dan Fenty., 2017). Analisis kualitatif isolat DNA

dilakukan dengan menggunakan teknik elektroforesis yang selanjutnya dideteksi

menggunakan UV transiluminator. Isolat DNA ditambahkan loading dye yang

berfungsi sebagai pemberat DNA sehingga DNA berada di dalam sumuran dan

sebagai penanda posisi pita DNA pada saat migrasi (Yohana dkk., 2018; Novitasari

dkk., 2014). Isolat DNA yang murni dan tidak terkontaminasi, akan menunjukan

hasil analisis dengan terbentuknya pita tunggal tebal di atas marker atau dengan

ukuran lebih dari 3.000 bp. Pita yang tebal menunjukkan secara kualitatif bahwa

konsentrasi isolat DNA yang tinggi (Patramurti dan Fenty., 2017; Hidayanti dkk.,

2016). Isolat yang digunakan pada penelitian ini masih dalam keadaan murni dan

tidak terkontaminasi sehingga dapat digunakan untuk analisis pada penelitian ini

(Gambar 1).

Gambar 1. Hasil analisis kualitatif isolat DNA

Keterangan:

M : DNA ladder sebagai marker

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 : Isolat DNA dengan pita tunggal dan tebal

Kondisi elektroforesis : fase diam gel agarose 1%; dan fase gerak TBE 1x; tegangan

100 Volt; running selama 30 menit

M 7 6 5 4 3 2 1

3000 bp


25

Amplifikasi genotipe gen CYP2A6*1/*4

Penelitian ini dilakukan bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui

frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4. Untuk mengidentifikasi genotipe gen

CYP2A6*1/*4, maka perlu dilakukan amplifikasi alel CYP2A6*1 dan alel

CYP2A6*4. Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi alel CYP2A6*4 sedangkan

hasil amplifikasi alel CYP2A6*1 didapatkan dari hasil penelitian Handani (2019).

Amplifikasi isolat DNA pada penelitian ini dan Handani (2019) dilakukan dengan

menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Bahan yang diperlukan

dalam berlangsungnya PCR adalah template DNA, Taq polimerase, sepasang

primer, dNTPS (deoksiribonukleosida trifosfat), magnesium klorida, dan larutan

buffer PCR (Hernandez-Rodriguez., 2012). Enzim Taq polimerase berfungsi

sebagai katalis pada saat polimerisasi DNA (Handoyo dan Rudiretna., 2001).

Deoksiribonukleosida trifosfat (dNTPS) berfungsi sebagai penyedia basa

nukleotida pada saat sintesis DNA baru. MgCl2 berfungsi sebagai kofaktor enzim

DNA polimerase dan terdapat ion Mg2+ yang akan berikatan dengan ion α-fosfat

pada dNTP sehingga membantu dalam penambahan molukel dNTP. Larutan buffer

PCR berfungsi dalam mempertahankan pH dalam keadaan optimal. Primer

berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan

menyediakan gugus hidroksi pada ujung 3’ yang diperlukan untuk eksistensi DNA

(Handoyo dan Rudiretna., 2001; Faried dkk., 2019).

Mekanisme kerja metode PCR memiliki prinsip yang sama dengan proses

replikasi rantai DNA. Proses PCR terjadi dengan melalui beberapa tahap yaitu,

danaturasi, annealing dan extension. Tahap denaturasi dikenai suhu setinggi 95°C

berfungsi untuk memutusakan ikatan hidrogen yang menghubungkan kedua rantai

ganda DNA. Pada tahap annealing suhu diturunkan menjadi 62,6°C sehingga

primer dapat berikatan dengan DNA tamplate. Melekatnya primer pada sekuen

awal DNA template akan merangsang DNA polimerase mensintesis rantai DNA

baru dengan menambahkan basa nukleotida yang sesuai pada rantai DNA template

(Faried dkk., 2019; Nurhayati dan Darmawati., 2017). Pada tahap extension suhu

reaksi PCR dinaikan kembali menjadi 72°C. Tahapan aplikasi tersebut dilakukan


26

sebanyak 35 siklus dan diakhiri dengan final ekstensi pada suhu 72°C. Kondisi PCR

yang digunakan pada penelitian ini disesuaikan dengan penelitian Handani (2019).

Pada penelitian Handani (2019) telah dilakukan optimasi suhu dan waktu PCR,

sehingga didapatkan hasil yang optimum. Kondisi PCR dari penelitian Handani

(2019) dapat digunakan pada penelitian ini karena hanya terdapat satu perbedaan

basa nukleotida primer reverse yang digunakan pada penelitian.

Primer yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari satu pasang yaitu

primer forward yang berikatan dengan segmen awal sekuen DNA template dan

primer reverse yang berikatan dengan segmen akhir DNA template. Primer yang

digunakan pada penelitian ini adalah primer yang spesifik untuk mengamplifikasi

CYP2A6*4 yaitu primer forward: 5’ CCT CAT CAC ACA CAA CTT CCT C

3’dan primer reverse: 5’ TGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG 3’. Primer

yang digunakan pada penelitian Handani (2019) adalah primer yang spesifik untuk

mengamplifikasi CYP2A6*1 yaitu primer forward: 5’ CCT CAT CAC ACA CAA

CTT CCT C 3’dan primer reverse: 5’ CGC AGG TAC TGG GTG CTT GGT AG

3’. Primer yang digunakan pada penelitian ini dan Handani (2019) akan spesifik

mengamplifikasi pada urutan basa nukleotida urutan ke-10643 hingga urutan ke-

10993. Perbedaan dari kedua pasang primer tersebut yaitu pada urutan basa

nukleotida primer reverse. Perbedaan urutan basa nukleotida tersebut terdapat pada

urutan ke-10993 yaitu alel CYP2A6*1 mengkode basa nukeleotida G sedangkan

CYP2A6*4 mengkode basa nukleotida A (Gambar 2). Adanya perbedaan urutan

basa nukelotida pada primer reverse, dapat menjadi spesifikasi primer pada saat

penempelan dengan DNA tamplate. Selain perbedaan urutan basa pada primer

reverse, terdapat juga lima perbedaan urutan basa nukleotida anatar alel CYP2A6*1

dan CYP2A6*4 seperti yang terdapat pada gambar 2. Alel CYP2A6*4 mengalami

gen deletion akibat adanya homologous unequal crossover antara CYP2A6 dan

CYP2A7 (Zdanowicz dan Adams, 2014; Lopez-Flores dkk., 2016). Hal ini

menyebabkan tidak terekspresinya mRNA yang mengkode CYP2A6, namun

mengkode mRNA yang menyebabkan terbentuknya protein berbeda sehingga tidak

memiliki aktivitas CYP2A6 (Handani, 2019).


27

Gambar 2. Urutan basa nukleotida dan primer CYP2A6*1 dan CYP2A6*4

Analisis produk PCR

Hasil amplifikasi produk PCR alel CYP2A6*4 dianalisis menggunakan

teknik eletroforesis. Teknik eletroforesis dilakukan dengan menggunakan gel

agarose 1,5% sebagai fase diam dan TBE 1x sebagai fase gerak. Elektroforesis

dilakukan pada tegangan 100 Volt dan running selama 30 menit. Produk PCR yang

telah diamplifikasi dimasukkan kedalam sumuran gel agarose dan salah satu

sumuran digunakan sebagai marker. Marker pada bagian pinggir sumuran berfungsi

sebagai petujuk ukuran segmen DNA atau amplikon (Faried dkk., 2019). Hasil

elektroforesis kemudian diambil untuk melihat ukuran pita DNA dengan

menggunakan sinar ultraviolet dalam UV transulliminator dan didokumentasikan

menggunakan kamera sehingga didapatkan hasil seperti pada gambar 3.

Terbentuknya pita berukuran 350 bp pada hasil elektroforesis produk PCR

menunjukkan bahwa subjek uji memiliki alel CYP2A6*4, sedangkan jika tidak

terbentuk pita menunjukkan bahwa subjek uji memiliki alel CYP2A6*1.


28

Gambar 3. Hasil elektroforesis produk PCR CYP2A6*4

Keterangan:

1-7 : Produk PCR yang terbentuk 350 bp (CYP2A6*4)

M : DNA Ladder

Kondisi elektroforesis : fase diam gel agarose 1,5%; dan fase gerak TBE 1x; tegangan

100 Volt; running selama 30 menit

Tabel 1. Frekuensi alel dan genotipe CYP2A6 Alel Jumlah Frekuensi

CYP2A6*1 (Handani, 2019) 20 66,67%

CYP2A6*4 30 100%

Genotipe Jumlah Frekuensi

Genotipe*1/*4 20 66,67%

Genotipe*4/*4 10 33,33%

Berdasarkan hasil elektroforesis 30 produk PCR yang telah dideteksi

menggunakan UV transulliminator, didapatkan sebanyak 30 produk PCR

menghasilkan pita dengan ukuran 350 bp. Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa,

30 isolat DNA subjek suku Papua memiliki frekuensi alel CYP2A6*4 sebesar 100%

(Tabel 1). Penentukan gentotipe gen CYP2A6 pada suku Papua dilakukan dengan

menggabungkan data penelitian ini dengan penelitian Handani (2019). Pada

penelitian Handani (2019), dilakukan amplifikasi alel CYP2A6*1 yang ditandai

dengan terbentuknya pita berukuran 350 bp, sedangkan jika tidak terbentuk pita

menunjukkan bahwa subjek uji memiliki CYP2A6*4. Berdasarkan hasil penelitian

M 1 2 3 4 5 6 7

350 bp

3000 bp

100 bp

300 bp 200 bp


29

yang dilakukan Handani (2019), didapatkan subjek uji yang memiliki CYP2A6*1

sebanyak 20 isolat DNA dengan frekuensi 66,67%. Berdasarkan kedua hasil

penelitian tersebut, subjek uji yang memiliki genotipe CYP2A6*1/*4 sebanyak 20

isolat DNA dengan frekuensi 66,67%. Sebanyak 10 subjek uji memiliki genotipe

CYP2A6*4/*4 dengan frekuensi 33,33% (Tabel 1).

Hasil genotipe CYP2A6*1/*4 yang didapatkan pada subjek uji

nonperokok suku Papua Indonesia sangat tinggi. Menurut Tanner dan Tyndale

(2017), frekuensi bentuk polimorfisme CYP2A6 yang menurunkan dan tidak

memiliki aktivitas enzim CYP2A6 ditemukan lebih tinggi pada populasi di Afrika

dibandingkan populasi berkulit putih. Populasi Afrika merupakan ras negroid yang

memiliki warna kulit yang cenderung lebih hitam. Pada penelitian yang dilakukan

oleh Tanner dan Tyndale (2017), ditemukan bahwa frekuensi bentuk polimorfisme

genotipe loss of function seperti CYP2A6*1/*4 pada populasi ras kulit hitam

sebesar 38%.

Patramurti dkk., (2019) dan Liu dkk., (2011) mengatakan bahwa seorang

individu yang memiliki bentuk heterozigot alel tidak aktif CYP2A6*4

dikategorikan sebagai slow metabolizers, sedangkan bentuk homozigot CYP2A6*4

dikategorikan sebagai poor metabolizers. Genotipe CYP2A6*1/*4 merupakan

salah satu bentuk heterozigot alel gen tidak aktif yang dikategorikan sebagai slow

metabolizers, sedangkan genotipe CYP2A6*4/*4 merupakan salah satu bentuk

homozigot alel gen tidak aktif yang dikategorikan sebagai poor metabolizers.

Individu yang dikategorikan sebagai slow metabolizers dikaitkan dengan

penurunan 50% aktivitas dalam memetabolisme substrat CYP2A6 dari keadaan

normal (Liu dkk., 2011). Penurunan metabolisme dari keadaan normal dapat

mempengaruhi konsentrasi substrat obat di dalam darah dan respon klinis beberapa

terapi obat (Tanner dan Tyndale, 2017). Tanner dkk., (2017) melaporkan bahwa

terjadi penurunan metabolisme senyawa obat letrozole pada seorang individu yang

memiliki genotipe CYP2A6*1/*4. Hal ini ditunjukkan meningkatkan konsentrasi

letrozole pada individu yang memiliki genotipe CYP2A6*1/*4. Selain letrozole,

terdapat beberapa obat yang mengalami penurunan metabolisme pada individu


30

dengan genotipe CYP2A6*1/*4 (Tabel 2). Penurunan metabolisme ini, secara

signifikan berpengaruh terhadap tingkat respon pengobatan menjadi lebih rendah

dan dapat meningkatkan risiko perkembangan penyakit (Tanner dkk., 2017). Oleh

karena itu, polimorfisme CYP2A6 dapat menjadi salah satu pertimbangan dalam

penyesuaian dosis pasien, sehingga dapat mencapai target yang diharapkan.

Tabel 2. Efek Genotipe*1/*4 pada beberapa obat Nama substrak /

obat

Efek

Tegafur Menurunkan metabolisme tegafur menjadi metabolit aktif

5-fluorourasil

Letrozole Menurunkan metabolisme oksidatif letrozole menjadi

bentuk tidak aktif (karbinol)

Asam Valproat Menurunkan metabolisme asam valproat menjadi asam 4-

ene-valproik, asam 3-hidroksi-valproik, asam 4-hidroksi-

valproik dan 5-hidroksi-valproik asam, sehingga

meningkatkan konsentrasi asam valproat

Artesunat (turunan

artemisin)

Menurunkan metabolisme artesunat menjadi metabolit

aktif dihydro-artemisinin

(Tanner dkk., 2017; McDonagh dkk., 2012).

Hasil penelitian ini juga dapat digunakan untuk memprediksikan risiko

terjadinya suatu penyakit, seperti diabetes melitus, kardiovaskular dan kanker. Pada

penelitian ini, subjek uji yang digunakan adalah seorang perokok pasif yang jarang

maupun sering menghirup asap rokok. Asap rokok mengandung beberapa senyawa

berbahaya seperti nikotin dan TSNA (tobacco specific-nitrosamine). Nikotin

dimetabolisme oleh CYP2A6 menjadi metabolit inaktivasi yaitu kotinin yang

selanjutnya dimetabolisme menjadi trans-3’hydroxycotinine (3HC) (Muliaty dkk.,

2010; Tanner and Tyndale, 2017). Keberadaan genotipe CYP2A6*1/*4 pada suku

Papua yang dikategorikan sebalagi slow metabolizers, dapat menurunkan laju

metabolisme nikotin. Hal ini dapat menjadi salah satu faktor risiko terjadinya

penyakit diabetes melitus dan kardiovaskular meningkat. Dampak dari slow

metabolizers dapat meningkatkan kadar nikotin dalam plasma dan dapat

menyebabkan toksisitas nikotin (Muliaty dkk., 2010). Pada penderita diabetes

melitus, penggunaan nikotin dapat menyebabkan resistensi insulin, terjadi

perubahan sekresi insulin dan disfungsi sel β (Sliwinska-Mosson and Milnerowicz,

2017; Ario, 2014). Resistensi insulin terjadi akibat meningkatnya kadar hormon


31

insulin antagonistik yaitu katekolamin sehingga dapat menyebabkan peningkatan

mobilisasi dari gula darah (Benowitz and Burbank., 2017; Ario, 2014).

Penurunan laju metabolisme nikotin akan meningkatkan kadar nikotin di

dalam plasma. Hal ini menjadi salah satu faktor risiko terjadinya penyakit

kardiovaskular melalui peningkatan denyut jantung, tekanan darah dan kerusakan

endotel pembuluh darah koroner (Ljungberg dkk., 2013; Kementerian Kesehatan

Republik Indonesia, 2009). Nikotin dapat meningkatkan lipolisis dan konsentrasi

asam lemak bebas yaitu trigliserida. Penumpukan trigliserida dapat menyebabkan

disfungsi endotel yang memicu terjadinya aterosklerosis. Aterosklerosis dapat

menyebabkan penyempitan saluran pembuluh darah menuju jantung yang

mengakibatkan kurangnya asupan darah untuk otot jantung, sehingga menyebabkan

terjadinya penyakit kardiovaskular (Wowor dkk., 2013; Saesarwati dan Satyabakti.,

2016).

CYP2A6 bertanggung jawab dalam memetabolisme TSNA menjadi

metabolit aktif. Terdapat beberapa jenis TSNA yang memicu terjadinya kanker dari

asap rokok yaitu 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) dan N-

nitrosonornicotine (NNN). NNK dan NNN akan diaktivasi secara metabolik

melalui reaksi α-hidroksilasi menjadi zat perantara yang reaktif seperti methyl

diazonium ion, pyridyloxobutyl diazonium ion dan pyridylhydroxylbutyl diazonium

ion. Perantara reaktif ini dapat terikat dengan DNA sehingga membentuk DNA

adduct yang memicu terjadinya pembentukan kanker pada jaringan yang terpapar

asap rokok, terutama laring dan paru-paru (Chiang dkk., 2011; Raunio and

Rahnasto-Rilla, 2012). Pada individu dengan slow metabolizers dapat menurunkan

laju metabolisme NNK dan NNN, sehingga risiko terjadinya kanker paru-paru

menjadi lebih rendah. Pada penelitian yang dilakukan oleh Tan dkk., (2001),

didapatkan bahwa frekuensi risiko terjadinya kaner paru-paru lebih tinggi pada

individu dengan genotipe CYP2A6*1/*1 dibandingkan dengan individu dengan

genotipe CYP2A6*1/*4. Berdasarkan hasil penelitian ini, maka suku Papua dengan

genotipe CYP2A6*1/*4 memiliki risiko terjadinya kanker paru-paru lebih rendah.


32

Namun perokok pasif tetap disarankan untuk menghindari asap rokok, karena

polimorfisme CYP2A6 ini hanya menjadi salah satu faktor prediksi risiko kanker.

KESIMPULAN

1. Subjek uji nonperokok suku Papua Indonesia ditemukan dua macam genotipe

yaitu genotipe gen CYP2A6*1/*4 dan CYP2A6*4/*4.

2. Frekuensi genotipe gen CYP2A6*1/*4 ditemukan pada subjek uji nonperokok

Indonesia sebanyak 66,67% dan CYP2A6*4/*4 sebanyak 33,33%.

SARAN

Pada penelitian selanjutnya, perlu dilakukan identifikasi genotipe gen

CYP2A6*1/*4 pada suku yang berbeda dengan dikaitkan secara langsung pengaruh

konsentrasi subtrat obat pada individu tersebut.


33

DAFTAR PUSTAKA

Ario, M. D., 2014. Effect Of Nicotine In Cigarette For Type 2 Diabetes Melitus. J

MAJORITY, 3(7), 75-80.

Benowitz, N, L., dan Burbank, A, D., 2017. Cardiovascular Toxicity of Nicotine:

Implications for Electronic Cigarette Use. Trends Cardiovasc Med, 26(6),

515-523.

B-Rao, C., 2001. Sample size considerations in genetic polymorphism studies.

Chiang, H. C., Wang, C. Y., Lee, H. L., dan Tsou, T. C., 2011. Metabolic effects of

CYP2A6 and CYP2A13 on 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-

butanone (NNK)-induced gene mutation-A mammalian cell-based

mutagenesis approach. Toxicology and Applied Pharmacology, 253, 145-

152.

Faried, Ahmad., Halim, Danny., dan Achmad, T. H., 2019. Biologi Molekuler

Dasar. Penerbit Erlangga, Jakarta. Hal. 146-150.

Fujieda, M., Yamazaki, H., Saito, T., Kiyotani, K., Gyamfi, M. A., Sakurai, M.,

Akita, H. D., Sawamura, Y., Yokota, J., Kunitoh, H., dan Kamataki, T.,

2004. Evaluation of CYP2A6 genetic polymorphisms as determinants of

smoking behavior and tobacco-related lung cancer risk in male Japanese

smokers. Carcinogenesis, 25(12), 2451-2458.

Handani, Dewa, Ayu, Sri., 2019. Identifikasi Alel Gen Sitokrom P450 2a6*4 Pada

Subjek Uji Nonperokok Ras Kulit Hitam Papua Indonesia Dengan Metode

Polymerase Chain Reaction (PCR).

Handoyo, Darmo., dan Rudiretna, Ari., 2001. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan

Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas, 9(1), 17-29.

Hewajuli, Dyah, Ayu., dan NLPI, Dharmayanti., 2014. Perkembangan Teknologi

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction dalam

Mengidentifikasi Genom Avian Influenza dan Newcastle Diseases.

Wartazoa, 24(1), 16-29.

Hidayati., Saleh, E., dan Aulawi, T., 2016. Identifikasi Keragaman Gen BMPR-1B

(Bone Morphogenetic Protein Receptor Ib) Pada Ayam Arab,Ayam

Kampung Dan Ayam Ras Petelur Menggunakan PCR-RFLP. Jurnal

Peternakan, 13(1), 1-12.

Kemenkes RI, 2009. Pedoman Pengendalian Penyakit Jantung dan Pembuluh

Darah.

Liu, T., David, S. P., Tyndale, R. F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., He, Y. H., Yu,

X. Q., Chen, W., Crump, C., Wen, X. Z., dan Chen, W. Q., 2011.

Associations of CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern

China. National Institutes of Health, 5(106), 984-994.

Ljungberg, L. U., Persson, L., Eriksson, A. C., Green, H., dan Whiss, P. A., 2017.

Effects of nicotine, its metabolites and tobacco extracts on human platelet

function in vitro. Toxicology in Vitro, 27, 932-938.


34

López-Flores, L. A., Pérez-Rubio, G., dan Falfán-Valencia, R., 2016. Distribution

Of Polymorphic Variants Of CYP2A6 And Their Involvement In Nicotine

Addiction. EXCLI Journal, 16, 174-196.

Marwayana, O. N., 2015. Ekstraksi Asam Deoksiribonukleat (DNA) Dari Sampel

Jaringan Otot. Oseana, 40(2), 1-9.

McDonagh, E. M., dkk., 2012. PharmGKB summary: Very important

pharmacogene information for cytochrome P-450, family 2, subfamily A,

polypeptide 6. Pharmacogenetics and Genomics, 22(9), 695–708.

Muliaty, D., Yusuf, I., Satiabudy, R., dan Wanandi, S. I., 2010. CYP2A6 Gene

Polymorphisms Impact To Nicotine Metabolism. Med J Indones. 19(1),

46-51.

Novitasari, D. A., Elvyra, R., Roslim, D.I., 2014. Teknik Isolasi dan Elektroforesis

DNA Total pada Kryptopterus Apogon (Bleeker 1851) dari Sungai

Kampar Kiri dan Tapung Hilir Kabupaten Kampar Provinsi Riau. JOM

FMIPA, 1(2), 259- 260.

Patramurti, C., Candaya, E. J., Kiatarto, S. F., dan Karut, A. K., 2019. Polimorfisme

Gen Sitokrom P450 2A6 Alel *1, *4, *7, dan *9 pada Subjek Uji Perokok

Suku Tionghoa Indonesia. Jurnal Farmasi Indonesia, 11(1), 437-445.

Patramurti, C., dan Fenty., 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel

CYP2A6*4 dan CYP2A6*9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa

Indonesia. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 15(1), 50-56.

Patramurti, C., Sugiyanto., Nurrochmad, A., dan Martomo, S., 2015. Polymorphism

Of Cytochrome P450 (CYP2A6*1 And CYP2A6*4) Among Javanese

Indonesian Smoker And Non Smoker. Indonesian Journals Pharm, 26(1),

11-19.

Preissner, S. C., Hoffmann, H. F., Preissner, R., Dunkel, M., Gewiess, A., dan

Preissner, S., 2013. Polymorphic Cytochrome P450 Enzymes (CYPs) and

Their Role in Personalized Therapy. PLOS ONE, 8(12).

Raunio, Hannu., dan Rahnasto-Rilla, Minna., 2012. CYP2A6: genetics, structure,

regulation, and function. Drug Metab Drug Interact, 27(2), 73-88.

Saesarwati, Desta., dan Satyabakti, Prijono., 2016. Analisis Faktor Risiko Yang

Dapat Dikendalikan Pada Kejadian PJK Usia Produktif. Jurnal Promkes,

4(1), 22-33.

Styn, M. A., Nukui, T., Romkes, M., Perkins, K. A., Land, S. R., dan Weissfeld, J.

L., 2013. CYP2A6 Genotype and Smoking Behavior in Current Smokers

Screened for Lung Cancer. Subst Use Misuse, 48(7), 490-494.

Tan, W., Chen, G. F., Xing, D. Y., Song, C. Y., Kadlubar, F. F., dan Lin, D. X.,

2001. Frequency Of Cyp2a6 Gene Deletion And Its Relation To Risk Of

Lung And Esophageal Cancer In The Chinese Population. International

Union Against Cancer, 95, 96-101.

Tanner, J. A., dan Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 Activity and

Personalized Medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(18), 1-29.

Tanner, J. A., Henderson, J. A., Buchwald, D., Howard, B. V., Henderson, P. N.,

dan Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 and nicotine metabolism


35

among two American Indian tribal groups differing in smoking patterns

and risk for tobacco-related cancer. Pharmacogenet Genomics, 27(5), 169-

178.

Tsukino, H., Kuroda, Y., Qiu, D., Nakao, H., Imai, H., dan Katoh, T., 2002. Effects

Of Cytochrome P450 (Cyp) 2a6 Gene Deletion And Cyp2e1 Genotypes

On Gastric Adenocarcinoma. International Union Againts Cancer, 100,

425-428.

Yohana, Kesia., Adisyahputra., dan Trijatmiko, K. R., 2018. Validasi Qtl Dan

Aplikasinya Untuk Perbaikan Sifat Toleran Keracunan Al Pada Padi

(Oryza Sativa L.). BIOMA, 14(1), 37-48.

Zanger, Ulrich, M., Klein, Kathrin., Richter, Tanja., Toscano, Claudia., dan

Zukunft, Jorg., 2005. Impact of Genetic Polymorphism in Relation to

Other Factors on Expression and Function of Human Drug-Metabolizing

P450s. Taylor & Francis Inc, 15, 121-124.

Zdanowicz, Marti, M., dan Adams, Patti, W., 2014. The Pharmacogenetics of

Nicotine Dependence and Smoking Cessation Therapies. Journal

Pharmacogenomics Pharmacoproteimics, 5(4), 1-20.


36

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Layak Etik


37

Lampiran 2. Sertifikat analisis Go Taq Green Master Mix


38

Lampiran 3. Informasi Pemakaian Go Taq Green Master Mix


39

Lampiran 4. Lembar Infromasi Nucleic Acid Gel Stain


40

Lampiran 5. Lembar Infromasi DNA Ladder


41

Lampiran 6. Elektroforesis Hasil PCR

M 1 2 3 4 5 6 7 M

: 8 9 10 11 12 13 14

M 15 16 17 18 19 20 21 M 22 23 24 25 26 27 28

M 29 30


42

Lampiran 7. Hasil Penelitian

No

Subjek

CYP2A6 Genotipe CYP2A6

*1

(Handani, 2019)

*4 *1/*4 *4/*4

1 - ✓ - ✓

2 - ✓ - ✓

3 - ✓ - ✓

4 - ✓ - ✓

5 ✓ ✓ ✓ -

6 ✓ ✓ ✓ -

7 - ✓ - ✓

8 ✓ ✓ ✓ -

9 ✓ ✓ ✓ -

10 ✓ ✓ ✓ -

11 ✓ ✓ ✓ -

12 ✓ ✓ ✓ -

13 - ✓ - ✓

14 - ✓ - ✓

15 ✓ ✓ ✓ -

16 ✓ ✓ ✓ -

17 ✓ ✓ ✓ -

18 ✓ ✓ ✓ -

19 ✓ ✓ ✓ -

20 ✓ ✓ ✓ -

21 ✓ ✓ ✓ -

22 ✓ ✓ ✓ -

23 - ✓ - ✓

24 ✓ ✓ ✓ -

25 ✓ ✓ ✓ -

26 ✓ ✓ ✓ -

27 ✓ ✓ ✓ -

28 - ✓ - ✓

29 ✓ ✓ ✓ -

30 - ✓ - ✓

Total 20 30 20 10


43

Analisis Hasil Alel:

1. Frekuensi alel CYP2A6*1 yang didapatkan dari penelitian Handani (2019)

dengan menggunakan sepasang primer yang spesifik alel CYP2A6*1

Frekuensi CYP2A6*1 = jumlah alel CYP2A6∗1 yang diperoleh


= 20

30 x 100% = 66,67%

2. Frekuensi alel CYP2A6*4 yang didapatkan dari penelitian ini dengan

menggunakan sepasang primer yang spesifik alel CYP2A6*4

Frekuensi CYP2A6*4 = jumlah alel CYP2A6∗4 yang diperoleh


= 30

30 x 100% = 100%

Analisis Hasil Genotipe:

1. Frekuensi genotipe CYP2A6*1/*1 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗1


= 20

30 x 100% = 66,67%

2. Frekuensi genotipe CYP2A6*1/*4 =jumlah genotipe CYP2A6∗1/∗4


= 10

30 x 100% = 33,33%


44

Lampiran 8. Lembar Primer PCR alel CYP2A6*4


45

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Identifikasi Genotipe Gen

Sitokrom P450 2A6*1/*4 Pada Subjek Uji Nonperokok

Suku Papua Indonesia Dengan Metode Polymerase

Chain Reaction (PCR)” memiliki nama lengkap Ferawati.

Penulis lahir di Bontang pada tanggal 11 November 1998.

Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara

pasangan Yohanis dan Elisabeth. Penulis telah

menempuh pendidikan formal di TK YPPSB Sangatta

(2003-2005), SD YPPSB sangatta (2005-2011), SMP

YPPSB Sangatta (2011-2014), dan SMA Santo Fransiskus Assisi Samarinda (2014-

2017). Penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta. Semasa menempuh kuliah, penulis aktif berpartisipasi

dalam kegiatan kepanitian seperti anggota sie Konsumsi KPU Fakultas Farmasi

(2018) dan Bendahara Pelepasan Wisuda II (2019). Penulis juga aktif mengikuti

organisasi yaitu DPMF Farmasi periode 2018/2019 sebagai anggota divisi

Advokasi. Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten dosen praktikum yaitu

Kimia Dasar (2018).


IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A61/4 PADA ...

Documents

Transcript of IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A61/4 PADA ...

IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA ...

Documents

Transcript of IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A6*1/*4 PADA ...

IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A61/4 PADA ...

Transcript of IDENTIFIKASI GENOTIPE GEN SITOKROM P450 2A61/4 PADA ...