Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage...

10
Identi®cation and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) ¯owers: an enzyme that is phylogenetically separated from other anthocyanin acyltransferases Hirokazu Suzuki 1 , Shin'ya Sawada 1 , Kazufumi Watanabe 1 , Shiro Nagae 2 , Masa-atsu Yamaguchi 2 , Toru Nakayama 1, and Tokuzo Nishino 1 1 Department of Biomolecular Engineering, Graduate School of Engineering, Tohoku University, Aoba-yama 07, Sendai 980-8579, Japan, and 2 Faculty of Horticulture, Minami-Kyushu University, Miyazaki 884-0003, Japan Received 23 January 2004; revised 26 February 2004; accepted 12 March 2004. For correspondence (fax 81 22 217 7293; e-mail [email protected]). Summary Anthocyanin acyltransferases (AATs) catalyze a regiospeci®c acyl transfer from acyl-CoA to the glycosyl moiety of anthocyanins, thus playing an important role in ¯ower coloration. The known AATs are subfamily members of an acyltransferase family, the BAHD family, which play important roles in secondary meta- bolism in plants. Here, we describe the puri®cation, characterization, and cDNA cloning of a novel antho- cyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) ¯owers. The puri®ed enzyme (hereafter referred to as Ss5MaT2) is a monomeric 46-kDa protein that catalyzes the transfer of the malonyl group from malonyl-CoA to the 4 000 -hydroxyl group of the 5-glucosyl moiety of anthocyanins. Thus, it is a malonyl- CoA:anthocyanin 5-glucoside 4 000 -O-malonyltransferase. On the basis of the partial amino acid sequences of the puri®ed enzyme, we isolated a cDNA that encodes an acyltransferase protein. The steady-state tran- script level of the gene was the highest in recently opened, fully pigmented ¯owers and was also correlated with the trend observed for an AAT gene responsible for the ®rst malonylation step during salvianin biosynthesis. Immunoprecipitation studies using antibodies against the recombinant acyltransferase pro- tein corroborated the identity of this cDNA as that encoding Ss5MaT2. The deduced amino acid sequence of Ss5MaT2 showed a low similarity (22±24% identity) to those of AATs and lacked the AAT-speci®c signature sequence. A phylogenetic analysis suggested that Ss5MaT2 is more related to acetyl-CoA:benzylalcohol acetyltransferase (BEAT) rather than to AAT. This is another example in which enzymes with similar, although not identical, substrate evolved from different branches of the BAHD family. Keywords: anthocyanin, salvianin, malonyl-CoA:anthocyanin 5-glucoside 4 000 -O-malonyltransferase, phylo- genetics, ¯avonoid biosynthesis, BAHD family. Introduction The class of acyl-CoA-dependent acyltransferases play important roles in the secondary metabolism in plants and fungi, including some with biomedical, pharmaceuti- cal, and agricultural importance, such as the biosynthesis of taxol (Walker and Croteau, 2000a,b; Walker et al., 2000), morphine (Grothe et al., 2001), anthocyanins (Fujiwara et al., 1999; Suzuki et al., 2001, 2002, 2004), phytoalexins (Yang et al., 1997), ¯oral scent (D'Auria et al., 2002; Dudareva et al., 1998), and vindoline (St-Pierre et al., 1998). Although the primary structures of these acyltrans- ferases show only low similarities (10±30% identity) with each other, they share two highly conserved sequences, -HXXXD- (motif 1) and -DFGWG- (motif 3), suggesting that they are evolved from a common ancestral gene (St-Pierre and De Luca, 2000). Thus, a single protein family has been proposed for these diversi®ed acyltransferases and is referred to as the BAHD family (Nakayama et al., 2003; St-Pierre and De Luca, 2000; St-Pierre et al., 1998). The BAHD family may be a very large family of proteins because it was recently estimated that the Arabidopsis genome The Plant Journal (2004) 38, 994±1003 994 ß 2004 Blackwell Publishing Ltd doi: 10.1111/j.1365-313X.2004.02101.x

Transcript of Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage...

Page 1: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

����������� �� �������� ��� � ���� ���������������������� ��� ������ ��� ������� ������������� � �� ��� ��� �� �������������� ������� ������� �������� �������������

���� � �� ���� ����!� ���� " ����� #��$�� ���� %��& '�(��� )������& *�� %���� �

�� *�� %������

���������� � � �������� �� ��� �� �������� ���� � �� ��� �� ���� � ���� ��� ��� ���� !"� ����

#$! $%"#� &���� ��'(������ � )�� �������� * �� +����� � ���� ��� * ��,�� $$- !!!.� &���

�������� �� �� � ����� ������ �� ��� � � ����� ������� �� � �� �������� �� ���������� ��� � � �� ��! !�"�� �#$�% �&�$'���&���������&����(�)�

������

+�������� ������������� �++*�� ���� � ����������� ��� ������� ��� ���(,+ � ��� �������

����� � ��������� ���� ������ � ������� ��� �� ���� ������- *�� ���� ++*� �� ��$�����

���$��� � � ������������ ����� ��� .+�/ ����� ����� ��� ������� ���� �� ������� ���(

$���� �� �����- ���� �� ������$� ��� ��������� �������� ��� �� �/%+ ������ � ���� ���(

����� �������������� ��� ������ ��� ������� ������� �����- *�� ������� �� ��� ���������

�������� � � ��0'*&� �� ������� 12(�/ ������ ��� ���� �� ��� ������� � ��� ����� ����

��� �����(,+ � ��� 1� � �(����3�� ���� � ��� 0(������� ����� � ���������- *��� �� �� �����(

,+��������� 0(�������� 1� � �(�(��������������- 4� ��� $��� � ��� ����� ��� ��� ��5������ �

��� ������� �� ��� �� ������ �/%+ ��� ������ � ������������ ������- *�� �����(���� ���(

������ ����� � ��� ���� �� ��� ������� �� �������� ����� ����� ��������� ����� �� �� �� ��������

���� ��� ����� $������ �� � ++* ���� �������$�� �� ��� ���� �������� ���� ������ �������

$����������- ���������������� ������� ����� ���$���� ����� ��� ����$���� ������������ ��(

���� ���$���� ��� �������� � ���� �/%+ � ��� ������� ��0'*&- *�� ������� ��� ��� ��5����� �

��0'*& ����� �� ��������� �&&6&17 ��������� � ���� � ++*� �� ����� ��� ++*(������� ��������

��5�����- + ����������� ������ ��������� ��� ��0'*& �� ��� ������ � �����(,+�$�� ������

�������������� �.8+*� ����� ��� � ++*- *��� �� ����� �3���� �� ����� �� ���� ���� ������

������ �� �������� ��$����� ������ ��� ��������� $������ � ��� .+�/ �����-

"������� �������� ������� �����(,+��������� 0(�������� 1� � �(�(�������������� ����(

�������� ����� $���������� .+�/ �����-

����������

*�� �%�� �� ��%#+�,#��������� ��%� ���� ��� �%�

�$�� ��� �%�� �� ��� ������ � $����%��$ �� �%���

�� ���-�. ���%����- ��$� /��� ���$����%. �� $�����#

�%. �� - ���%�� % �$�� ����. ���� � ��� ������������ ��

���% �0%&� �� + ����. ����.�� 0%&� �� ���. ����).

$� ����� �1 ���� �� ���. ����). ���������� ���(�/

�� ���. �"""� 2�3�&� �� ���. ����. ����. ����). �����%�����

�4�- �� ���. �""!). 5� % ����� �67,� � �� ���. �����

6�� �� �� ���. �"" ). �� �����%��� �2�#8�� � �� ���.

�"" )� ,%����-� ��� � �$ � �� ���� �� �� ����� ��%� ��#

�� ��� ���/ ��%� %�/ ��$�% ����� ���9��: ��������) /���

��� ���� . ���� �� � �/� ��-�%� ����� ��� ��;������.

#<===6# �$���� �) �� #6�101# �$���� �). ��--�����- ���

���� � ���%��� � �$ ��$$�� ����� % -��� �2�#8�� �

�� 6� >��. ����)� *���. ���-%� � ����� �$�%� �� ����

� ������ �� ����� ���� ��?�� ��%� ���� ��� �� ��

��� �� �� � ��� @,<6 �$�%� �A&�$ �� ���. �����

2�#8�� � �� 6� >��. ����� 2�#8�� � �� ���. �"" )� *��

@,<6 �$�%�$� �� �� � % -� �$�%� �� � ������ ������

�� /� �����%� ����$��� ��� ��� ���� ��� � -���$�

��� /��� &���� �����) 9:. ""�9����

""� � ���� @%�&/�%% 8��%�����- >��

���B �������C(����D#���=�������������

Page 2: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

������� ���� !� �%��� -���� �� ���� �$�%�� <�/��� .

$��� �� ��� ������$��% �%�� �� ����� @,<6 �$�%� $�$#

�� � � ��� �� �� ���� $�����

,��������� ��%� ���� ��� �,,*�) ��%�3� �-���#

����?� ��% � ���� � �$ ��%#+�, �� ��� -%�����% $����� ��

���������� �� �%� � �$�� ��� �%� �� 5�/� ��%� #

���� �A&�$ �� ���. ����)� *��� � . $�� ,,*� /���

����� ��� ��% ���� �����?����. ��% ������ �����?����.

�� �-�������?���� /��� ������ �� ��% � ���� ��� ����

�%���� �� ��;������� ,%% �� ��� &��/�,,*� �$�$�� �

�� ��� @,<6 �$�%� �� �� �� �� ��� ���-� �3�� ����

���- ��� ��%��) ��� �� ���%�-������%%� ��� ��� � �$

���� @,<6$�$�� � �A&�$ �� ���. ����)� E�����. %% ��

����� ,,*� �� � �����?� ��-��� � ��;�����. #4�1A+#

�$���� �). �� ���� � �$ � �� ���� ��. /���� ���%� �������#

��%%� �� ���� �� ��� �����?� ���%���� �� ����% ,,* -����

�� ��-� ��$�%�-�#���� �� ��-� �2�3�&� �� ���. ����)�

E� �� ���$��� �� ���� ���� ��� �%�������� ���/���

��� �����?���� �� ���%�-������� �� @,<6 $�$�� �. /�

��� �������� �� ��� ,,* ������� �D�*� �������. ���

��-� � �) ����%��� �� ��� ������������ �� �%����� �2�3�&�

�� ���. ����). � ��������� /��� �/� $%���% �� ���

�����% - ���. /���� �� ��������%� �� ��� �� %�� ��%� ����

�� ���� � ������� 5�/� �� 0� � ������%� ��� ��� �� ���

�6A, �%����- �� �� ��� �3���� �� $%���%#+�,B����#

����� D#0#-%�������#�� � �#0#$%���%� ���� �� �� �1 ����

��� �2�D�*�) �� ���/�� ��� ���� ��3�$� ���%�����%�

��%�3�� ��� $%���%���� �� ��� �� � �#��� ���% - ��� ��

�����$%���%�%����� �� � ����� $�����$%���%�%��#

��� �D�*� �������. ��-� � �� 2�3�&� �� ���. ����)� ,�

2�D�*� �� ��� �%� �� ��%�3� ��� �����;���� $%���%#

���� �� ��� �� � �#��� ���% - ��� �� $�����$%���%�%�����

����� ��� ������ $%���%����) �� � ����� �%�����. ���

������ $%���%���� �� ����-�� �� �� ��%�3�� �� �

��3�$� ��� $�� 2�D�*�) ��� �� �������� � �$ 2�D�*�

�2�3�&� �� ���. ����)� *���. /� ���� ���& ��� �6A, �%����-

�� ��%*��' ����- ��$�%�-�#���� �� ��-�� E� ����� ��

$�� ���$���. ��/��� . /� ��%�� �� ����� 2�D�*�

�6A, �� $��� �� ���� �� ��-�� E� ���� �����. /� �� �?��

2�D�*� � �$ �1 ������� 5�/� � �� ��$�-������ ��

�� ��� �3�� ��� �6A, �������� F� ?����-� ���%��

��� 2�D�*� �� ����% ,,* ��� �� ������ �� $���� � ��

��� � �$ � �� ���� �� , ���%�-������ �%���� ���/�� �

�����% ���%�-������ �������� �� 2�D�*� �� � ,,*.

��--�����- ��� 2�D�*� ����%� �� $� � �%��� �� ����%#

+�,B���3�%%����% ����%� ���� �� ��� ��� �� ,,*�

;������

/�� � ��� �� ��������� ,�� � ��%*��'

,� ��� �%����- �� ��%*��' �6A, �� $��� �� ��$�%�-�#

���� �� ��-� /� �����������% ���� 6���������). /�

�� �?�� ��� ��3�$� ��������%� �� D�*� ������� ��

�1 ������� 5�/� �. �� ��� �3�� ��. �� ���� $���� ���

� ��% $��� ��� ��;������� *�� ��3�$� /� ��� �$�%�

�����%� �� �������� �� ��� ������� �� �#$� �������#

��% /� �������% �� ��� ��?����� �� �?�����. � /� ���

��� �� 2�D�*�� *�� ��3�$� ���%� �� �� �?�� �� ��� �����

�*�%� �)� 2����$ ������% ��%���9��%�� �%$��� -�% �%��#

� ���� ���� �26298,1G) �� ��� �� �?�� ��3�$� ���/��

$(� � ����� ��� ��"D: �� ��� (��-��- � �$ ��%�� ����#

��-) /��� � ����$��� $�%���% $�� �� �� &6� *��

�%����� � �?%�� �� D�*� ������� �� ��- �� �$��- �����

�� �� $�� ��� �������� �+<*#E). 2��� ��� ��� �-. ��

���� H ��������� /��� ����� �� ��� ��#&6 � �����. �� ���#

��- ��� ���� ��#&6 � ����� /� ��������%� �� D�*�

�������� *�� ����� $�%���% $�� �� ��� �� �?�� 2��*�

/� ����$��� �� �� �D &6 �� -�% ?%� ���� �� 2��� ���

��� �- ��%�$�. ��������- ��� ��� ��3�$� /� $���#

$� ���

8� �?�� 2�D�*� ���������%� ���� �� $�����$%���%#

�%����� ���� *�%� � �� ����%�) � /�%% � �������

�#0 ��� �#0 �#���$ �%-%�������)#D#0 ��� � �#0 #$%���%-%�#

������) �$%���%��������� 2�3�&� �� ���. ����� �%����

�������. ���: �� $�����$%���%�%����� ���� ���

���� � ��� ����������)� <�/��� . �� ��� ��� ���/

D�*� ������� �� ��� � �������� �� $�����$%���%�#

%����� /��� �����$%���%�%����� /� ���� �

$%���% ������ � +������ �#0 ��� �#0 �#���$ �%-%���#

����)#D#0#-%������� ���������� 2�3�&� �� ���. ����).

<����� �- *�� %�� �/� ����� �� ��� ������������ ���/� �� �%����� �� �1 ��������@����$%���%�%����� ���� -��� ��� ? �� $%���%���� � ��� �� � �#�������� ��%�3�� �� 2�D�*� �2�3�&� �� ���. ����) �� � ����� $�����$%���%�%�����./���� �����;����%� ���� -��� ������$%���%���� � ��� �� � �#�������� ��%�3�� �� 2�D�*� ����� �����). %����- �� ��� � �������� �� �%������ *�� �� ���� ���� ��� ���������� � ���/� �� ���� 5��%��$ �� $��

2��� � ��� �� ��������� ,�� � � ��� ������ ��������������� ��� 2� ��%������ ��3��� ""D

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

Page 3: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

��% -������ �#0#-%�������. ��% -������ �.D#0#��-%���#

����. �� ��% -������ �#0 ��� �#0#$%���%-%�������)#D#0#

-%������� ��%�� �� �� �� � $%���% ������ �� +���� �#

��- ��% ���� �. 2�D�*� ���/�� ��� ��-���� �������

/��� $%���%#+�, �� /�& ������� /��� ����%#+�,

� �%���� �������. �: �� $%���%#+�, ���� ���� �

��� ����������). /�� �� $����%$%���%#+�,. �����#

��%#+�,. �#���$ ��%#+�,. ������%#+�,. �� ���3��%#

+�, ��%�� �� �� �� � ��% ���� �� *���. �� ���%� ��

����%���� ��� 2�D�*� �� $%���%#+�,B���������

D#-%������� �� � �#0#$%���%� ���� ��� *�� 2�D�*�

������� /� ��$�%���%� ��������� �� ��� ��%%�/��- $��%

���� ���� $�)B +���. +���. ����. <-��. �� I���� <�/��� .

��� ������� �� ���� $��% ���� �+��. +���. �-��. ����.A���. �� 2���) /� � ��-%�-��%�� *�� ������� /� �� ��-%�

��������� �� ��� $� +�,#2< � �$����- �������. �:) ��

� ��%%� ��������� �� ��� ��%%�/��- ��$������B ��� $�

����%#+�, ���:). � $� ������ ��� �� :). �� ���D $�

�����$%���%�%����� ���:)� , &������ �%���� ���/��

��� +�,#2< �� �����$%���%�%����� �� ��� � ���#

��� �������� �. /��� +� �%��� �� ��� � ��� �� �� ���� ��. ���������%�� 2�D�*� ������� /� �� ��-%� ���#

������ �� D $� 4#����%$%��$��� � �$����- �������.

�: ��� ��������� � ���+ �� �� $��) �� � ��%%� ��

� $� ������%�� �� ����� � �$����- �������. �":)

���� ��� �$� �����������

��4� �� �� ��������� �5����� � ��

��������� ,��

*�� ��#&6 � ����� ��� /� ��� ���� � �$ 26298,1G

-�%� �� ��-����� /��� %���%������������. � ���� ����

� ������%� �� ��(�/ �� ��� ��""")� *�� ���%���- ��������

/� � ��� ��� �� ��� ���#���� <8>+. �� ��$� �� ���

�� �?�� �������� /� � ���(����� �� ���$��� G�$�

��- ������ */� � ��% $��� ��� ��;������ /� � ���� #

$���� ���-� � �)B A4<E2�>6H<JJK �������� �) �� G16#

1EG,0J<>AG �������� �)� 0� ����-��� �/� ��-��� ���

� �$� � ���� �� ����� ��;������ �� � ��� ��� ��� ��

� ��� ������#��%�$� �� ���� ������ ��*#8+�) ����-

����� � �$� � �� ��%��,)� �A, ���%��� � �$ �1 ����

��� 5�/� � � ��$�%�� �� ����� �#&�� $�%�?�� 6A,

� -$���� L���- ��� � -$��� � � ���. ��� �6A, %�� �

�� ��� ��� �%���� /� �� ����� ���� ��-�#�� ��-����

����������. �� �! �������� �%���� /� � �������� *��

���� ��� �6A,� �� ����� �%���� /� � ����%���� ���� ���

�@K#+�J ��-�$�� ����� . �� ��� ���%������ ��;����� ��

��� %��-��� ���� � /� ���� $����� *�� ��%%#%��-�� �6A,

�1��@�& ,�������� ��$�� ,4� �!��) ������� � �����

��$� ���� �� ��! $��� ���� /��� �%��%��� $�%���%

$�� �� �� ��� 6� , � �$ � �� ���� � �%���� ���%�� ��

�� �� $�$�� �� ��� @,<6 �$�%�. (��-��- � �$ ���

� ������ �� $����� � �� � �� ��� ������� $��� ���

��;����� ���-� � �� ��� ��%�/ �� ����%�)� *���. ���� �6A,

/� ��������%� �� $�� ����-�'� *�� 2�,*��� � ����� /�

��� ����� ���� ��� *D � �$��� �� ������ �� � �� ���"

��%%� � � ��#� $� A#�� $��% ������ /��� ��<��#*-.

���%���- � $- �� ��� ���$����� � ����� � �$ �� % ��

��%�� �� E� /� ��%��%�. ��%����%%� ����� � ����� /���

� ����$��� $�%���% $�� �� �� &6 �� /� �� �?�� ��

�� ��� ��$�-������� *�� �� �?�� 2�,*��� ���/�� ��-#

��?��� D�*� ������� ���-� � �) ��%�3��- ��� $%���%#

+�,#��������� $%���% � ���� �� ��� �� � �#�������� ��

$�����$%���%�%����� �� � ����� �%����� �*�%� �)

*$�� � 8� �?����� ��$$ � �� 2�D�*� � �$ �1 ������� 5�/� �

8� �������� ���� *��% � ����� �$-)2������� ���������$�% ����� $-��) 8� �������� ���%�) 4��%� �:)

+ ��� ��� �� �D�� ��! ��� ���D�: �A<�)�2F� "D� ��! ��� �"6G,G92��� ��� ��� ��! ��� !��8����%92��� ��� �� �� �� ���+<*#E �� � D� ����2��� ��� ��� ���D �"� �" ���"���� H ����" ���� D�� ���

*$�� & K������ � $��� � �� ��� $%���% � ���� � �$$%���%#+�, �� $�����$%���%�%����� ��%�3�� �� ����� �� ���$�����2�D�*� � �< !�� �� ���+

G�3�$� ��� ������)

�%���%#+�, ������$%���%�%�����

+$ ���)���C+$

������ $���) +$ ���)

���C+$

������ $���)

A���� ��DD � ���! ��" � ��� !"�! D��� � ���� ���!����$����� ��2�,*���) ��!� � ��� ��� � ��� ��D D��� � "�� ���D

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

""� ) ���,� ��,�� �� %�

Page 4: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

/��� $��$�$ ������� � �< �D. � /� ���� ��� �� ���

����� 2�D�*�� *�� ���� ��3�$��� � ��� ���� ��

2�,*���. ���� � ��% ���� �����?����. ��% ������

�����?����. �� �������� �����?����. /� � �%���%� �%���

�� ����� �� ��� ����� 2�D�*�. � ���� ���� �����

*� �� ��� ���? $ ��� ��� 2�,*��� �6A, ������

������� ��� � ����� ��������%� �� D�*� ������� ��

�1 ������� 5�/� �. /� � ��� ��� �$$���%�-��% �#

%���� �� D�*� ������� �� � ��� ��� �� �� �1 �������

5�/� � ����- ���� ���#2�,*��� �$$���-%���� 1 �E-1)�

0���� � �%�� �%���� �� ��� � ��� ��� �� �� �1 �������

5�/� � ����- ���#2�,*��� E-1 ���/�� ���-%� �$$���#

�������� ��� �� � ����� /��� $�%���% $�� �� �� &6

���-� � �. %�� �). /���� �� �������� � �����%� �� ���

�%�� ���� $���� /��� 2�D�*� �� �?�� � �$ �1 ����

��� 5�/� �� 0���� � �%�� �%���� ����- E-1 %�� ���/��

��� ������ �� �$$��� ������ � ������ �� � ��� ��� ��

�� %���� �� /�� ��� ��������� ���-� � �. %�� �)� /1 ������

��� �� %���� �%�� ���-��� �� �� �1 ������� ���

�������� D�*� ������� �� ���$�%�� $%���%�������� �

$���$%���%��� ���������) � ��� � ���$���� ����#

����� ��� ���/� �� D�*� ������� �� �� ������ ��

��$%���%��� ���������� 0� %�� � ��� ��� �$$���#

� ���������� ������� �� D�*� ������� �� ��� � ��� ��� ��

�� �1 ������� 5�/� � ����- ���� ���#2�,*��� E-1� *��

���%�� ���/�� ��� D�*� ������� �� ��� � ��� ��� �� /�

�����?�%%� � ��������� /��� ��� ������� �� ����#�����#

���� $��� � D�*� ������� �� ��� ���� ���� /� ����#

�����%� /��� � ������ �� ��� ���#2�,*��� E-1 /�

����. /��%� ��%% D�*� ������� ���%% �$���� �� ��� ���� #

���� ���� ��� �$� ���������� ���-� � ��)� *���� ���%��

� ����� �������� �� ���/ ��� ��� �%���� �6A, �������

2�D�*�. /���� �� ��������%� �� D�*� ������� ��

�1 ������� 5�/� �� *���. �������-�'/� ��%� �#����-#

���� � ��%*��'�

6��� ��� �� ���� � �� /78

*� ��%��� ��� ��������% ��-��?���� �� ��%*��' �� �%#

����� ������������ �� �%�� 5�/� �. � -� �����?���� ��

����%��$���% ���-�� �� ��%*��' ��� ������ �� ��� �%#

�� �%�� /� � �%�3�� �� ;��������� �%#��$� 8+�. ��

��� ���%�� /� � ��$� �� /��� ����� �� ��%*���. /����

�� ��������%� �� ��� ? �� $%���%���� �� ��- �%�����

������������� *�� ��%*��' �� ��%*��� � ��� ���� /� �

���� �$������%� ;����?�� �� �%#��$� 8+� ����- ���%

<����� &- ,%�-�$��� �� ������� $��� ��� ��;������ �� 2�D�*� ����� �����). @G,* �,,+� ���). 2,,* �,,1�����). �� 2�D�*� �,,>D�D��)�E������% ������� ��� �%�& ��&- ����� *�� %������ �� $����� �9� � ���/� /��� � �� 8 ��% $��� ��� ��;������ �� �������� � �� � ���� $���� �� ����$��� G�$� ��- ����� � %�� ���/� ���� ��� 2�D�*� ��;������

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

2��� � ��� �� ��������� ,�� � � ��� ������ ��������������� ��� 2� ��%������ ��3��� ""!

Page 5: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

�A,� ��� ���� � �$ � ���� � -�� � ��$�%��� /���

� �$� � �����?� �� ��� ��������� �6A,� ���-� � �)� *��

��%*��' � ��� ��� /� ��� $��� ������ �� �� 5�/� �.

/��� ��� ��-���� %���% �� � ��� ������ ���� ��- � ��-� � ��

5�/� ����%��$���� F� ��� ���� ���. ��%� �$%%

$���� �� � ��� ��� ���%� �� ����� �� ����. ���$�. ��

%���� ���-� � ��)� *�� �����#���� � ��� ��� %���%� ��

��%*��' �� 5�/� � /� � �/� �� ?�� ��$�� ��-�� ���

����� �� ��%*��� �� ��-���� 5�/� ����%��$���� L���#

������%�. ������� �%� %���% �� ��%*��' � ��� ������

/� �������� �� /���� 5�/� �� *��� ���%� /� �� ���

�� ��� ��� �� 0���� � �%�����- �%���� �� ��� � ���

��� �� � �$ /���� 5�/� �. /���� ���%��� � �$$�����#

������ ��� /��� �%�3�� /��� ���#2�,*��� E-1 ����

���/�)� E$�� ���%�. ��/��� . ���� /� %�� ��� ��� ��

2�D�*�. �� /���� � �� ����%� � ��� ��� %���% /�

������?�� �� ��� /���� �%�� 5�/� � *���. ��� ���� � ��

��%*��' ��� ������ /� ���� �%� ���������� /��� ��� ��

��%*����

/� ���� ��������� �� �������� ��

*�� ������� $��� ��� ��;����� �� 2�D�*� ���-� � �)

�������� �/� ��-�%� ����� ��� ��;������ �� ��� @,<6

�$�%�. #<===6# �$���� �) �� #6�101# �$���� �)� L���#

������%�. ��/��� . ��� ��-��� � ��;����� #4�1A+# �$����

�� ��� ��� 2�D�*� ��;�����) ��� �� �����?�%%� ����

������?�� $��- ��� ��;������ �� ��� ,,*� �� ��� �$�%�

/� ��� ������?�� �� ��� 2�D�*� ��;������ �� ���� .

<����� 1- H��������� �%#��$� 8+� �� ��%*��' �� ��%*�����) ,- ��� -�% �%��� ���� ���� ���/��- ��� �����?���� �� � �$� � ���� ����� ������ �� � �$� ��$� � �� ��� ;��������� �%#��$� 8+�� A��%��������;������ �� 8+� � �$� � ���� �� ��� �����?� $�%�?����� �� � ��%�6A,� �� ��%*��' �� ��%*��� � ���� ���� �� ��� ������� ���� G��� �$���% � ����� ��� >�� �. )��EEE ��-��� �� �=�!� 6A,� ��%*��'B8+� $�%�?����� /� � ��� ��� /��� ��%*��'#�����?� � �$� � ����- ����� ��� ��%%�/��- ��$�%�� 6A,�B 8+. ��� �%�$�� �2�D�*� ���� G��� �#$���% � ����� ��)� A+. ��� �%�$�� �2�D�*� �2�3�&� �� ���. ����)� �� �.���% �A, ��� ���� � �$ �1 ������� 5�/� �� ��%*���B 8+� $�%�?�����/� � ��� ��� /��� ��%*���#�����?� � �$� � ����- ��� �� ��� ��%%�/��-��$�%�� 6A,�B 8+. �2�D�*�� A+. �2��*�� �� �. ���% �A, ��� ����� �$ �1 ������� 5�/� ����) *�� �%���� �����#���� � ��� ��� %���%� �� ��%*��� �/���� � �) ����%*��' ���-��% ������ � �) �� ��������% � -�� �� �1 ��������%��. ���� ���. ���$. %��. �� 5�/� � � �� �� ����%��$���% ��-�� ��B��-� �. %��� ��� D $$ �� %��-��. �%�#��-$������ �B ��-� �. �� ���$��%��� $$ �� %��-��. �����%� ������ �� ��%%� ��-$������ �2B ��-� �. ���%� ����%%� ���� �� ��%%� ��-$����� 5�/� � �� �8B ���%� �� ��%%� ���� �� ��%%���-$����� 5�/� )� 0����B /���� 5�/� � ��� ���$��%� �� $$ �� %��-��)�&�� � �$ ��%%� ���� ���� �� ��� ����� ��%���� �� �%�� /� � %���%�3�� �� ��� � ��� ������ �� ��%*��' �� ��%*���� ,�� -� �%����� ��� ����������� ���� $������� �� � ��� ������ %���%� � � �������/��� � � � � ��������- �2G��

<����� 9- E$$���� ���������� �%���� �� D�*� ������� �� �1 ����������%� /��� ���#2�,*��� E-1��) 0���� � �%�� �%���� /��� ���#2�D,*��� E-1 �� �� �- �� � ��������� ���� � �$ �1 ������� 5�/� � �%�� �). �� �- �� � ������ ��� ����� �$ /1 ��������� %���� �%�� �). �� ��� �- �� ���$����� 2�,*������ ����� �� �1 �� �%�� �)� *�� � ��� ��� �� �� /1 ��������� ���/��D�*� ������� ��� ��� ��� ���/ D�*� ����������) E$$���� ���������� �%���� �� D�*� ������� ��) �� D�*� �������� ) �� ��� � ��� ��� �� �� �1 ������� 5�/� � /��� ���#2�,*��� E-1�

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

"" ) ���,� ��,�� �� %�

Page 6: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

2�D�*� ���/�� ��%� %�/ ��;����� ��$�% ��� ���������.

��9��:) �� &��/� ,,* $�$�� � �� ��� �$�%�. ���%����-

2�D�*� ���:). ��� ��������� ��� ��-���� ��;����� ��$�#

% ��� �� ����%#+�,B���3�%%����% ����%� ���� �� �@G,*.

��: ��������). � ��3�$� ��� �� ����%��� �� ��� � ��������

�� ��%��%� ���3�% ����� �� 7���� � ���3�� 5�/� �

�6�� �� �� ���. �"" )� E�����. $�%���% ���%�-������

�%���� ��--����� ��� 2�D�*� �� $� � �%��� �� @G,*

��� ��� �� ,,* ���-� � D)� *���� ���� ������ %�� �� ��

��$��� ��� ����� �� /����� 2�D�*� �� �� @G,*#

�%��� ���������. ���� � ����� �� @G,*. ���3��%#+�,B���#

3�%%����% ���3��%� ���� �� �@G@*� 67,� � �� ���. ����).

<����� 0- ��%���% ���%�-������ � �� �� $��� ��� ��;������ �� ��� @,<6 �$�%��*�� � �� /� ����� ����� �� ��� ���-��� #(�����- $������ *�� %��-��� �� ��� %���� ������� ��� �%���� �������� ���/��� ������ A�$�� � ������� ������ ��%��� - ��� ��� ��� G�3�$�� ���� �� ��� %�-�$��� � � ��%%�/�B 2�D�*�. $%���%#+�,B��������� D#0#-%�������#�� � �#0#$%���%� ���� �� ���1 ������� ����� �����. ,4� �!��)� @G,*. ����%#+�,B���3�%%����% ����%� ���� �� �� 71 ���3�� �,,+� ���)� 2,,*. %����% ��%� ���� �� �� (����� � � ������ �,,1�����)� 6,*. ������%�����%��� �#0#����%� ���� �� �� 7���������� ����� �,,+""���)� �,*. $������������ �"#��� ���#0#����%� ��#�� �� � �$ 71 ����� �,,F��!��)� 2%,*. �%�� �����% !#0#����%� ���� �� �� /������ �� ����� �,,K!����)� 6$��*�. $%���%#+�,B����������� �#0#-%�������#�� �#0#$%���%� ���� �� �� �1 � �� �� �� �,4�" �")� 6$��*�. $%���%#+�,B����������� �#0#-%�������#�� �.�� �#0#��$%���%� ���� �� ���1 � �� �� �� �,4�" ��)� 2���*. $%���%#+�,B����������� �#0#-%�������#�� �#0#$%���%� ���� �� �� ���� ������� �,4�"����)� 6���*. $%���%#+�,B����������� �#0#-%�������#�� �#0#$%���%� ���� �� �� ���� � ��� �� � � �,�� "�� )� 8�D�*. $%���%#+�,B��������� D#0#-%�������#�� � �#0#$%���%#� ���� �� �� /1 ��������� ������%����� ���%��. ,���D���)� 2�D�*�. $%���%#+�,B��������� D#0#-%�������#�� � �#0#$%���%� ���� �� �� �1 ��������1��@�& ,�������� ��$�� . ,,>D�D��)� 2�,*��� ����� �����. ,4� �!�D)� 8��,*. ��� �������$��%#+�,B��������� �#0#-%�������#�� �#0#��%� ���� �� ��/1 ��������� �@,,"��!D)� 2��,*. ��� �������$��%#+�,B��������� D#0#-%�������#�� �#0#��%� ���� �� �� �1 ������� �,4�"D!�")� 1�D,*. ��� �������#$��%#+�,B��������� D#0#-%�������#�� � �#0#��%� ���� �� �� ��� �� �� 9�� �@,,!��� )� @,8*. �����%� �����%� ���� �� �� �1 ���� ���� �,,>"��D")�*@*. �#���3��%#!.��#������%������ EEE#�#0#���3��%� ���� �� �� �1 ���� ���� �,,1� ��")� 6@,*. ��#������%������ EEE#��#0#����%� ���� �� �� �1 ���� ���� �,,��!���)� *,*. �������% ����%� ���� �� �� �1 ���� ���� �,,����D�)� 6@A*@*. ��#4#�����3��%���% 4#���3��%� ���� �� �� �1 ���� �����,,�!D � )� A*2<�. �� ��� � ����� �� 4 �� �� ������� �*���!�)� @G@*. ���3��%#+�,B���3�% %����% ���3��%� ���� �� �� 71 ���3�� �,�D�����)� <+@*.��� �������$��%C���3��%#+�,B��� ��%�� 4#��� �������$��%C���3��%� ���� �� �� � ����� ����������� �+,@�����)� <+*. ��� �������$��% � ���� #�� � �$ 41 ������� �+,6�! ��)� ,+*. -$���� ���$ ��%� ���� �� � �$ )����� ������� �,,F!��!�)� *�,*. � ����������� �#0#����%� ���� �� ��(���� �� ���� ����� �@,,�����)� *�� ��%%�/��- � ������� ��%� ���� ��� /���� ������$��% ��������� � ��� �% �?��B @,@���"�. @,@��D� .@,@�����. @,@��D�". @,@���! . @,@�� ��. @,@�� ��. @,@�� �". @,@����". �� ,,@"D� � �� �1 ���� ��. �G>� �� 7���� � ��� �I!�D��). 6�,*"�" ���1 ��� �� � � �,,F����!). �� 8�,*� �� /��� � ���� �� �@,,"��D�)�

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

2��� � ��� �� ��������� ,�� � � ��� ������ ��������������� ��� 2� ��%������ ��3��� """

Page 7: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

�� %����% ����%� ���� �� �2,,*� ,� ��� �� ���. ����)�

<�/��� . ��� �%���� ���%�� ��� ������ ���3�%%����%

� ����� �� �� @G,* ��@G@*) �� �#�����% � ����� �� ��

2,,*) �� ��� � ����� ��� �� 2�D�*� /��� �� �� ���

��%%�/��- ��%#+�,� /� ���� � � ��% ���� ����� ��B

����%#+�,. ���3��%#+�,. $%���%#+�,. �#���$ ��%#+�,.

�� ������%#+�, ��� ��� ���/�)�

/��������

,����������� -%�������� ��� $�� �������% ����� ��

��3�$��� ��%����� E� ���. $�� ���������� ����� �

���� ��%���%��� �� $�./���� ��� �� �� �� ������$��%

��-��?���� �� 5�/� ��%� ���� �<��� �� 2���. �����

A&�$ �� ���. ����)� ������ ������� ���/ ��� $�%���%�

��%����� �� ��������� -��� %%� �&� �%�� �� � ��%�#

-�� �%� ��;�����% $��� �� ��- ��������� ��������#

���� �� � ��%�3�� �� $�$�� � �� ��� @,<6 �$�%�

�2�3�&� �� ���. ����. ����)� , ���%�-������ �%���� �� � �#

�����%� ���%����� ��;������ �� @,<6 �$�%� $�$�� �

��--���� ��� ��� @,<6 �$�%� �������� �� ���� % ���%�#

-������ ���- ���� �@� ����� �� ���. ����� <���$�� �� ���.

����� A&�$ �� ���. ����� 2�#8�� � �� 6� >��. �����

2�#8�� � �� ���. �"" )� *�� �%���� %�� ��--���� ��� $��#

��%��%%� �%��� @,<6 �$�%� $�$�� � ��� �%��� ���%�#

���� � �%�������� /��� ��� ���� �� ��� ���� -��

� �$ ���-%� ���- ��� �� ��� �$�%�. � ���$�%�?�� ��

&��/� ,,*� � /�%% � @,<6$�$�� � ��� � ����%��� ��

���% ������������ ���-� � D). %����-� ��� @,<6 �$�%�

%�� ������� ���- ��� ���������- �� $�$�� � ���

��%�3� ��� ���� �?����� �� $����%��%%� �� �%��� $�%�#

��%�� �@� ����� �� ���. ����� 67,� � �� ���. ����� <���$��

�� ���. ����)� E� ��$� �%�� �������. ��� $�%���%� $%���%#

���� �� ���������� $� �� ������� �� ��� ����� ��

$%���%� ���� �� ���%� �� ��%�3��- ����������� $%#

���% � ���� �� �� ��$�%�. ��������� ��$%���%����.

/���� �� ����%��� �� ��� ������������ �� ��� 5�/� ��-$���

�� ���������� � �� �� �� ��� ������$�$). �� ��

��%�3�� �� ���-%� ��3�$�. ����������� �#0 �� �.�� �#0#

��$%���%� ���� �� �6$��*�). /���� ��%�3�� ��� ���#

�������� $%���%���� �� ��� �� �� �� ��������� �� ����#

������� �#0#-%������� �� ��� � �� �2�3�&� �� ���. ����)�

*��� ��3�$� �� �%��� ���%�-������ �%�������� /��� ���

�� �#0#$���$%���%� ���� ��� �� ���-��� �%��� �����

6$��*�. 2���*�. �� 6���*� ��� ��-� � D)� E� ���

%�-�� �� ����� ���� ������. �� /� � ���$�� ��� 2�D�*�

����%� %�� �� $�$�� �� ��� ,,* ���- ���. � /� ���

��� �� 2�D�*� �� %% ���� ,,*��

6� ��- ��� ��� �� �� �� ��$�%�-�#���� �� ��� ��

����� �6A, ��� ������� 2�D�*�. /� �����%%� ���%���

�6A,. �� $�� ����'!� �1��@�& ,�������� ��$��

,4� �!�D)� *��� �6A,� ���$�%� ������� �,,*./����

������� $��� ��� ��;����� �������� $����� �9� ��

���/�� D�: �������� �� ��� 2�D�*� ��;������ *��

2�,*��� ��������� � �# �$��� ��%� ���� �� �6A,

��� �� %�� ����%��� �� �%����� ������������ /� ��-�%�

��%�&�%� ������ /� �� � ������%� ������?�� ��� �# �#

$��� ��%� ���� �� �6A, ���.��. 1��@�& ,��������

��$�� ,4�"D!�"� �����%����� ���%��� ��� %�� ��-� � D)�

, A� ��� � �%�� �%���� �� ��� ����% ��� ������ �� ����

�6A, �� �1 ������� ���%�� ��� �� /� �����?�%%�

��� ����� �� ��� ��-$����� � -�� �� ��� �%�� ������#

%����� ���%��). � /� ���� ��� �� ��%*��� �6A,. �$�%�#

��- ��� ����'!� $� ������ 2�D�*�� <�/��� . ���

���$����� 2�,*��� ��� ����� �� �1 �� ��%%� ���/��

�� D�*� �������. �� ��� D�*� ������� �� �1 �������

5�/� � /� ��� ��#� ��������� /��� ��� ��%��%��% ���#

2�,*��� ��������� ������%����� ���%��)� +����;����%�.

/� ����%���� ��� ��� ����'!� ��� ��� ������ 2�D�*��

0� ���� ������ � %�� ����� �� ��-�. �� /���� 2�D�*�

/� �� �?�� � �$ �1 ������� 5�/� �. ��� � ��% $���

��� ��;������ /� � ���� $����. �� ��� �6A, ���

������� � ����� ��������%� �� D�*� ������� /� ���#

%���� ,� ���%�. /� ������?�� �6A, �����- �� ��/

@,<6 $�$�� ����-�'. /���� � �$ � �� ���� � %�&��

$���� � �� �� ��%� �� � %�/ ��$�% ��� �� ����� �� ����

&��/� ,,*�� 0� ����%���� ��� ��� ����-�' �6A,

������� 2�D�*� �� ��� ���� �� ��� ��%%�/��- ���� �#

�����B ��) ��� ��� ����� 2�,*��� ���/�� D�*� �������.

� ������- �%����� � �$ $%���%#+�, �� $�����$%�#

��%�%������ ���) ��� ��3�$��� � ��� ���� �� ��� ���$��#

��� 2�,*���. ���� � $�%���% $��. &������ � $��� �

/��� ������ �� D�*� �������. ��% ������ �����?����.

��% ���� �����?����. �� ������ �� D�*� ������� ��$��%

���� � ���$��%�. /� � �%���%� �%��� �� ����� �� �����

2�D�*� �� �?�� � �$ �1 ������� 5�/� �� ����) ���

�����#���� � ��� ��� %���% �� 2�D�*� /� ��� ��-����

�� ��%%� ��-$����� 5�/� � �� ��-� �� �� ���� . ���

���� ��� ���� �� �� ��� ��$�� % �� ����% ��� �������

�� ��%*��' /� � �� �%��� /��� ��� � ���� ���� ��� ��

��%*���� *���. ��%*��' ��� ������ ����%� �� �%���%�

�%��� �� �%����� ������������ �� ��� �%�� 5�/� .

%����-� ��� ���%�-��% ��-��?���� �� ��� ��� ������ ��

��%*��� �� ��%*��' �� /���� �%�� 5�/� � �$��� ��

�� �% �?��� �� ���) ��� D�*� ������� �� ��� �1 �������

5�/� � /� ��#� ��������� /��� ��%��%��% ���#2�,*���

E-1�

, ���%�-������ �%���� ��--����� ��� 2�D�*�

��2�,*���) /� $� � �%��� �� @G,* �� ���� ��?�� � �$

���- ��� �� ��� @,<6 �$�%� ���������- �� $�$�� � ���

��%�3� ��� ���� �?����� �� $����%��%%� �� �%��� $�%�#

��%�� ��$� �� /��� ,,* ���-� � �)� 6������ ��� ���%�-�#

����� ��������. 2�D�*� ���/�� �� ��������� ��� $� ��

�%��� �� ����� �� ��� @G,*# �%���$�$�� � �� ��� �$�%�.

����� � �� /� ��$����� 8%�� ������� ����%� ������

��$� ��� @,<6# �%��� -���� �� ���� -���$��. � ���#

������ �� ��� ���% -���$� ��;����� �� ���� ��� � ����

��� *�� �$�-�� ��� ���� � ���� �� ���%����� � ������

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

���� ) ���,� ��,�� �� %�

Page 8: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

�� ����� @,<6# �%��� -����. ���%���- �� ��� ���� ��?�#

���� �� @,<6 $�$�� � �� ��� ������ � $����%��$�

,%����-� @,<6 $�$�� � /��� ��$�% ������$��% ����#

���� $� ��� ���%� ���%��� � �$ ��� �$� ���- ��� ��

��� �$�%�. ���� $� %�� ��� ���%��� � �$ ����� ���

���- ��� � /�%%. ���%���- �� ��� ��������% �� ���%��� ��

��� @,<6 �$�%�. �� 2�D�*� $�-�� �� ����� ���� �

��$�%�� *��� ���%� %�� �� �%%��� ��� �� ��� ����� ����#

��?����� �� @G@*. /���� �� @,<6 $�$�� �� 71 ���3�� .

� ���% �%�� ����� �� +%��� ��� E� ���� �%�� �������.

����� @,<6$�$�� . @G,*. ��$��%� ��������%� �� ���

� �������� �� 5� % ��%��%� ���3�% ������ @G@* �� %��

���%� �� ��%�3��- ��� � �������� �� ���3�% ���3���.

�%��� ��%��%� ���� � ,%����-� ���� � ���� ����%��� �� ���

� �������� �� $����%��%%� �%��� ��$������. @G@* ��

@G,* � ������%� �%��� �� ��� ���� �� ���� ���%�-���

���-� � D)�

*�� �%����%� %�/ ��%���� ��$������� �� 2�D�*� ��

����/� ���� *�� ��� �� ���C+$ �%��� �� 2�D�*� /� �

��%� %��� ��� ��: �� ��� ��� ��� �%��� �� ���� ,,*�

�A&�$ �� ���. ����)� �� ��$�%�. ��� �%��� �� ����

,,*� �� ���� � ���$�� ������%�-��% ����� ��� � �

��%%�/�B �� 2�D�*�. ���. !� ������ �� ���C+$. ��! �����

$��� �� ��� ��% ���� �� !! ����� $�

�� �� ��� ��%

������ �2�3�&� �� ���. ����)� �� 6���*�. ���. !�� �������� ���C+$. � ����� $�

�� �� ��� ��% ���� ��

�DD ����� $��� �� ��� ��% ������ �2�3�&� �� ���.

����)� *��� ���� ����� %�� � %%�%� ��� ���� ��� &�������

�� @G@*. /���� $� �� �� ��� �$� ����� ��� � @G,*

/��� %�/� ��� �� ���C+$ �%��� �� ����%#+�,� *&��-

����� �� ���� ������ ��-���� /��� ��� ��� ��� 2�D�*�

���%� $� � ���%� ���� -� � ����� ����������� ���� ���

������� ���� ����%��). �� �� %�&�%� ��� 2�D�*� /��%� ��

��� M�$�� ����7 �� � ,,* /��� ������ ���%�-������

�%�������� /��� ���� ,,*�� E� �� �%����%� ���. �� ���

�1 ������� �%��. ��� %�/ ��%���� ������� �� 2�D�*�

$� �� ��$������� �� � ������� ��%*��' ��� ��#

����./���� �� �/� �� ?�� ��$�� ��-�� ��� ��� �� 2�D�*��

83��������� ���������

/��� ����� ���� ������ �� �� ���� ����

�%�/� � ����9��D �$) �� �����%� ������ �� %�� �-� ��1 ���� ���). �� ����� � �$ %��% $ &�� �� 2����. ��. /� ���%%����� �� ��� �� � � ��+ ����% ����� *�� �1 ������� �%������ �� ��� �%���� �� ��� ��$�� % �� ����% ��� ������� ����� ��%*��' �� ��%*��� -���� /� � ������� � �$ %��%$ &�� �� ���3&�. ��� 2%�����. $�����$%���%�%�����.�� ���� ���������� /� � ���%��� �� �� �?�� � �$ �� %���-� 5�/� � ����- � ����%����� � ����� � �2�3�&� �� ���. ����)�� ���� � �������� �$�%�� ��� ���? $���� �� ���� �� ��#�� �� �� ���� �$���% �%����� �#F����% �� ���3�%%����% /� ��� ����� � �$ A�%� *��;��. K����. ��� ,����%#+�,. ���#3��%#+�,. $%���%#+�,. �������%#+�,. �� $����%$%���%#+�,

/� � ��� � ������ �� 2�-$. 2� >����. �F. L2,� �#+��$ ��%#+�, �� ������%#+�, /� � ������� � ���� ���� � ������%� ����(�/ �� ��� ��""")�

�,��� �� ���� ������

E� ��� ���� �� D�*� �������. ��� ���� � ������ $���� ����� �%) ��������� �� �� $� �������$ ��������. �< !��.�� �� $%���%#+�,. ��� �� $�����$%���%�%�����. ����3�$�� ,��� ��������� � ���+ �� �� $��. ��� ������ /��� $����� �� ����- ��� �% �� ���#��%� ��D: ��C�) � �5�� ���������� ,���������� �� ��� ���%���- $���� � /� � �%�3�� �� ��� ���#���� <8>+ ����- ��� 6��$� �����$ ������ E��� �#$���� +��. 0��� �. �,. L2,) /��� � ,����& F68#D� �G��%�$� �2��&�. *�&��. ��)� *�� �%���� � ������ /� � ��������� D�� �$ ���� �%����% ���������� ���� ���� � ������%� ��2�3�&� �� ��� �����)� @G,*. @G@*. �� 2,,* ��������� /� � ������ ���� ���� � ������%� �� ,� ��� �� ��� �����). 67,� � �� ��������). �� 6�� �� �� ��� ��"" )� 8 ����� /� ;����?�� �� ���$����� ���� ���� �� @ ��� � ��"!�) ����- @��#�� 8 �����,��� &�� �@��#��. <� ��%��. +,. L2,) /��� ������ �� �$ %��$��� ��� ���� ��

/�� � ��� � ��%*��' ��� 2� ��%������ ��3���

,%% ��� ����� /� � �� �� $�� � ��+� , �������$ ������������� . �< !��. ��������- �� $��#$� ���������% ��� $�� 8@@)/� ���� � ��� ���� � ����� �� ��-���� ��� ��3�$� �� �?�#����� �1 ������� 5�/� � ���� &-) /� � ��$�-���3�� �� 0 ��-�%���� /��� D��� $% �� ��� $� 8@@ ��������- D $� G6*,.��D $� �����%$����%��%����% 5�� ���. �� D: �/C�) ��%�����%��#%��� �%�����. ��%%�/�� �� ���� ���-���� � "��� � �� �� $��� *������ ���� ����� $%) /� �&�� �� �� D�: ��� ���� /��� $$�#���$ ��%���. �� ��� ���%���- � �������� /� ��%%����� �� ���#� ���-���� � "��� � �� �� $��� *�� � �������� /� �����%��� ����� $% �� ��� �$� ����� � 8�%�����%���$��� /� ���� �� �����3�$� ��%����� �� ?�% ������� ���� �� ���: �/C�). ��%%�/�� ������ ���-���� � "��� � �� �� $�� �� �$��� ���%��� ����� *������ ���� /� ���������%� ��%�3�� -���� �� $� 8@@� *����3�$� ��%����� ���� $%) /� ��%��� �� ������%$������%�6G,G)92��� ��� ��%�$� ���� $%. ,$� ��$@���������. 8����#/�. A. L2,). /���� �� ���� � ������%� �;��%�� ��� /����� $� 8@@. ����- � G���� �����$ �@��#��)� ,��� ���������%�/����- ��� ��%�$� /��� �� $� 8@@. ��� ��3�$� /� �%���� � 5�/ �� �� � $% $���� /��� %��� - ����� ��� D�� $��) �� �9� �

A+% �� �� $� 8@@� ,����� � ������ �D� $%) /� � ��$�����. �&���� �� ��: ��� ���� /��� $$����$ ��%���. �� �$$�����%���%��� �� �����%92��� ��� �%�/#���) ��%�$� ��� $%.,$� ��$ @���������) �;��%�� ��� /��� �� $� 8@@ ��������-$$����$ ��%��� � ��: ��� ���� � 5�/ �� �� � $% $����

����- ��� � ����� %�;��� �� �$��- ��� ��8>+) �����$ �,$� #��$ @���������)� *�� 5�/#�� ��-� � ������ ��� ����������3�$� ������� /� � ��$����� �� ��%��� �� �����%92��� #��� ���-�#���) ��%�$� ��� $%. ,$� ��$ @���������) �;��%�� ���/��� ��� �$� ����� � 5�/ �� �� � $% $���� ����- � �8>+�����$� ,��� /����- ��� ��%�$� /��� ��� �$� ����� . �����3�$� /� �%���� /��� � ���#%��� - ����� ��� ��� $��) ���9D�: ��C�) ����%���-%���% �� ��9�: ��� ���� �� $$����$��%��� �� �� $� 8@@� *�� ��3�$� ��%����� ��! $%) /� ��%�3��-���� �� $� 8@@ ��������- ���: �/C�) +<,82 ��#N��#���%$�#��� ���%)#��$����%$$����O#�#� ������%�����) �� ���� ���#(����� �� �8>+ �� +<*#E ��� �������� ��%�$� �D $%. @��#��)�;��%�� ��� /��� ��� �$� ����� � *�� ��3�$� ��%����� /�

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

2��� � ��� �� ��������� ,�� � � ��� ������ ��������������� ��� 2� ��%������ ��3��� ����

Page 9: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

��%��� �� ��� ��%�$� � 5�/ �� �� ��� $% $����� ,��� �����%�$� /� /���� /��� �� $� 8@@ ��������- ���: �/C�)+<,82. ��� ��3�$� /� �%���� /��� %��� - ����� ������ $��) �� ��9��� $� 8@@ ��������- ���: �/C�) +<,82� *������� � ������ ��� $%) /� � ��$�����. ������� ��� �� �� $% ���%� ?%� ����. �� ���(����� �� �8>+ �� <�>�� ��C�� 2��� ������ �- ��%�$� �,$� ��$ @���������) �;��%�� ��� /����� $� 8@@ ��������- ���: �/C�) +<,82 �� ���D � A+%� *����%�$� /� ����%���� /��� ��� �;��%�� ���� ����� � 5�/ ���� � $% $����� *�� ����� � ������ /� � ��$�����. ��%�3��-���� �� $� 8@@ ��������- ���: �/C�) +<,82. �� ��%����� ����H<� ��C�� ��%�$� �,$� ��$@���������) �;��%�� ���/��� ��� �$� ����� � 5�/ �� �� ��� $% $���� ����- � �8>+�����$� ,��� /����- ��� ��%�$� /��� ��� �$� ����� . �����3�$� /� �%���� /��� %��� - ����� ��� ��� $��) �� �9� �

A+% �� �� $� 8@@ ��������- ���: �/C�) +<,82�

��4� �� �

, �� �� ��-��� �� �%�-����%������ � �$� �. D�#**�*C+)+*E#1,�*C+)+,�,C1)+,�*C+)1*E1*E,,#�� �� D�#*1E,+++,E1+�*C+)*+�,C1C*),*E++#�� �E. �������). /� � ����-��� �� ��� ������ ��� � ��% $��� ��� ��;������ �� ��� �� �?�� ��3�$����� $���� � ���� ���� � ������%� ���� ����%��)� *��% �A,/� ���%��� � �$ �1 ������� 5�/� � ����- ��� �A��� 8%������ K�� �H�-��. <�%���. 1� $��) �� ���� �� ��� ���%���� ����%��,)� �A, ����- F%�-����*�#�*�� 2��� K�� ������ 6�-���#����. ������$. 1� $��)� 0��� ��� � �$� � �� ��� ��%��,)��A, � ��$�%��. � �*#8+� /� �� �� $�� ����- HE,1GAF��2��� �*#8+� K�� �H�-��)� *�� $% ���%��- ���������� /� �� ��%%�/�B *�� �*#8+�$���� � /� �������� � D��+ �� �� $���� ��� �� � ��� ������ �� ���� � "D�+ �� �D $�� �� ����������� �� 6A, ��%�$� �� �� ��� ���������� �� ��� ��� ��� �����. ��%%�/�� �� �D ���%�� �� 8+� ���� ���%� �������� ��"��+ �� �� ���. D��+ �� �� ���. �� !��+ �� � $��). �� ?�%%��������� � !��+ �� �� $��� *�� $�%�?�� � -$��� �� &��) /�6E1 ���-���-����)#%��%�� ����- ��� 8+� 6E1 8 ��� 2�������� K�������� 6�-�������)� 0��� ��� 6E1#%��%�� $�%�?�� � -$��� � � ���. ��� �6A, %�� � �� �1 ������� 5�/� �. �� ���$��%���� ��� �%;���. /� �� ����� � ���� ���� � ������%� ��2�3�&� �� ��� �����)� *�� �6A, �� �������� �%���� /� ����%�������� ��� �@K#+�J ��-�$�� ����� ��%%�/��- ���$������ � 7����� ������� �� ���(����� �� 6A, ��;������- ����- 6��#*� $���� +��%� 2�;������- K�� �@��&$� +��%�� . ��%%� ���.+,. L2,) /��� +GH ���� 6A, �%���� �����$ �@��&$�+��%�� )�

)�������� �5�����

*�� ��%%#%��-�� ����# ����- � $� �� ��� ����-�' �6A, /�$�%�?�� �� 8+� ����- ��� � �$� � D�#11,*++,*1,,*,*+,,+#+,,,*+#�� �� D�#11*,++**,+1,+,,,,,*,,+**1#��. ����� ����� �/� ��� ������ �����. D�#���<E �� ��#+�E. /���� ���$$�����%� ��%%�/�� �� �� � ����� �� � ������ �� ���������. ���������%�� *�� $�%�?�� � -$��� /� �%���� ���� �+��@%���#*F8F ����� �� ��;������ �� ���? $ ��� ������ ��8+� � � �� *�� � -$��� /� ��-����� /��� ���<E �� +�E ������ %�-��� /��� �HG#�� ����� �H�-��) ��� �� � ������%����� ��-����� /��� ���<E �� +�E� *�� ���%��� �%�$�� /����� �� � ���� $ �1 �� ���" ��%%�� *�� ���$����� 2�,*���/� ��� ����� �� ��� � ���� $�� ��%%� �� �� �?�� �� �� �����$�-������. �������%%� � ���� ���� � ������%� �� 2�3�&� �� ��������)�

/������� � �� ����-�' �� �� ��

����� /���� ���$%�) ����� /� � �$$���3�� /��� ��� ���#����� �� �� $ �� 2�,*��� ���� ����%��) �� ��� �� $% ��(�������� ��� �$$���-�� � $�%���%� ����� ��� ���- �� ���� � � ���#��%� �J���&����. �" �)� *�� �����% ��(������ /� �$����� ��� ����$�%��� � ����7� ,�(���� /��� %% �����;���� �$$���3�����������) �� ����$�%��� � ����7� ,�(����� *�� ��%%����� �� �$/� ���(����� �� $$����$ ��%��� � ���������. �� ��� � �#������� � �$ �9D�: ��� ���� � ����� /� �����%��� �� D $% �� �� $� �����$ �������� ����� . �< !��� *�� � ����� ��%����� /���%��� �� 8 ����� ,92��� ��� ��%�$� �� $%. ,$� ��$@���������) ��� �� ���� �;��%�� ��� /��� ��� �$� ����� � ,��� /����- ��� ��%�$� /��� ��� �$� ����� . E-1 /� �%���� /��� ��� � �����$ ��� �� ����� . �< ���� *�� �%��� ��������- E-1 /��$$�����%� ��%�3�� -���� �� $� �����$ �������� ����� .�< !���

���:/��� �� ;����� ���� �

2����$ ������% ��%���9��%�� �%$��� -�% �%��� ���� ���� /�� ��� ��� � ���� ���� �� >�$$%� ��"!�)� *�� � ������ �� ���-�%� /� � ����%�3�� �� ��%�� ������- ��C� ������- /��� +��#$���� @ �%%��� @%��� �� 0���� � �%�����- �%����. � ������ ����� 26298,1G -�% /� � � ���� �� �� � E$$���%��#8 $�$#� �� ���%%��� �. @�%%� ��. �,. L2,). /���� /� ���� �%��&��/��� ��� ���$$����� ��%����� �� �%��&��- �-��� �,$� #��$ @���������) � ��$ ��$�� �� � �� � �� *�� �%��� /� �� ���� /��� � B ���� ��%����� �� ��� � �$ � ���#2�,*��� E-1� ����) �� � B D��� ��%����� �� ��� ������ � ���&�� ��� ����E-19�� �� ���� �� ������ ���(�-��� *�� �$$��� ��$#�%���� /� � ����%�3�� �� $��� �� �� ������#��%�3�� ���#$�%�$��������� ������ ����- � G+> 0���� � �%�����- &���,$� ��$ @���������) ��%%�/��- ��� $������ � 7� ���$#$���������

2������� � ���

J ���- $����� �� ��� �� �?�� ���#2�,*��� E-1 ��9��� �-) �������� �� �$ %��$�� ����9� �-) /� � ���� �� ��� � ��� ��� ���� �1 ������� 5�/� �� ��� ���% $���� �� ��� ���� � ������/� ?��� � ��� �-� *�� $���� �� �?�% ��%�$�. ��� �%) /� ��������� � ��+ �� �� �. ��%%�/�� �� ���� ���-���� �� �� $��� � ��� �. �� ��� ���%���- ���� ����� /� � ����� �� D�*� �� D�*� ���������� *�� ���%�� � � ������� � ����� -� �� ��� ����������� ���� �$���� /��� �2G��

6��� ��� �� ���� � �� /78

*��% �A,/� � �� �� � �$ ��� ��������% � -�� �� � �1 ���� ��� �%�� ����- ��� �A��� 8%�� ���� K�� �H�-��)� *�� ��%*��'�� ��%*��� � ��� ���� �� ��� �- �� ���% �A,/� � ;����?�� ��;��������� �%#��$� 8+� /��� ��� ��%*��'#�����?� � �$� ��D�#*11,+1,,11*1**1,*1#�� �� D�#+,+1*+1,,,,+++*,#*1#��) �� ��� ��%*���#�����?� � �$� � �D�#1,,111,1,1,#1,,*+,+#�� �� D�#+,*+11***+*++,,*+,+#��). ���������%����%#��$� 8+� /� � ��� ��� ����- ��� >�-��+��%� H���& 2����$$���% ��� ������ 6�-�������) �� ��� H����*��� 24@� 1 ����*#8+� K�� �H�-��)� *�� $% ���%��- ���������� /� � D��+ �� �� $�� �� ���� "D�+ �� �D $��. ��%%�/�� �� �� ���%�� �� "D�+ �� �D ���. DD�+ �� �� ���. �� !��+ �� �� ���� *�� ���%�� � � �#������ � ��� �� -� �� ��� ����������� ���� $������� /����2G��

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

���� ) ���,� ��,�� �� %�

Page 10: Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage (Salvia splendens) flowers: an enzyme that is phylogenetically separated from other

;���������

+���� +- "�� �� =-,- .��������� �->- � ��� �����) E�����?�#���� �� ��� 2,,* -��� ����%��� �� �� /�� � 5�� ���-�������� ��� �� 6A, $�� � ��� /��� 7���. �&. ��!9����

.����� '-'- ��"!�) , ��� �� ��������� $����� �� ��� ;��#������� �� $�� �- $ ;�������� �� � ����� ���%�3��- ��� � �����%��� � �����#��� ������-� ���1 � ����1 ?&. �� 9�D��

.������� "- "��������� .-"- �� ;������� �- �����) , ��/�%�� �� 4#��� �������$��%� ���� ���� 8� �?�����. �%����-.�� ��� ������ �� � %�� -$���� ���$ ��%� ���� �� �G+��������)� &1 � �1 7���1 &?:. ��"�"9��"�!�

/!+��� >-,- ,��� <- �� @�������� 8- �����) +� ��� �3���� ��� ��%� ���� �� ���%� �� ��������3��- ���3�%���3��� ������ ��%��%� ���� � �� 5�/� � �� �$-�� %���� �� 7���� ����3�� � /��� /��� �1 �9A. ���9�!��

/����� %- /!+��� >-,- %� "-�- ;��� ;-+- �� @�������� 8- ��"" ) ,����%#+�,B���3�%%����% ����%� ���� ��B ���3�$� ����%��� �� 5� % ����� � �������� �� 7���� � ���3�� �/��� &1 �1. �"!9����

<�B��� �- *�� )- )�����(����$� "- <������('� �(��� '- %� '- <���� )- )������ '-(+- +������ *- ��"����� *- ��""") �6A, �%����-. -��� ��� ������. �� �����%#%�% %��%�3���� �� ��������� D# �$��� ��%� ���� �� � �$��� �� �� 9��� /��� &1 �2. ���9����

C���� *- =�� ;- �� "����� *-'- �����) ��%���% �� ��� #�3���� �� ��� �%�� �����% !#0#����%� ���� �� ����%��� ��$� ����� ������������ �� ����$ ����� /������ �� ������&1 � �1 7���1 &?2. ��!�!9��!���

������ =- '��� �- '�� <- C����� @- �� =����� '-�����) 8� �?�����. �%����-. �� � ��� ���� �� � ��%� ���� ������ �%%��- ���&�$�� �� ;����� ���� ���� $������ �� ���#��%� ������ $����%��$� &1 � �1 7���1 &?:. "D9����

��� *- �� ��� %- �����) ������ � �- ��� �� ��� ���$��� � ����%���%��� ���������� � 5�/� ��%� ��-$����� )���� ������. 02. ���9�"��

=����� D-"- ��"!�) +%��-� �� �� ���� % � ������ �� ��- ������$�%� �� ��� ��� �� ���� ����-� *��4�����. &&?. � �9� D�

%��� *- �� ��� �- �� %����� *- �����) ,�����������%� ���� ���B �����?������. $������$. ���%�-�������. ����%�������� &1 *�1 7��1 � �,���� �. &9. ��!9����

��(@����� .- �� /� =�� E- �����) G��%����� �� ��%� ���� ��-����B � �-�� �� ���� ��?����� �� ��� @,<6 ���� �$�%� ��

��%� ���� ��� ����%��� �� ������ � $����%��$� E� ���� � � *����� � /���3��� ���$��. �*�. ���)� ,$��� �$BG%����� . ��� � D9��D�

��(@����� .- =���� @- +��� +-('- �� /� =�� E- ��"" )*�� �� $��%0#����%� ���� �� ����%��� �� �����%��� ��������#���� ��?��� ��/ �%�� �� � ������ ��������%� �� ����3�$� ,#��������� ��% � ���� � /��� &1 �1. !��9!���

�� ��� �- %��� *- )�����(����$� "- <���� )- %���� %- %� '- *�� )- )������ '-(+- "����� *- �� %����� *- �����) �%���%#+�,B���������D#0#-%�������#�� � �#0#$%���%� ���� �� � �$ �� %�� �-������ � �������) 5�/� �� &1 � �1 7���1 &?2. �"���9�"��"�

�� ��� �- %��� *- )�����(����$� "- <���� )- %���� %- )������ '-(+- *�� )- "����� *- ��%����� *- �����) �6A, �%����-. ���� �%�-��� ��� �������. ����������% �� ��� �3���� �� $%���%#����3�$� ,B��������#��� �#0#-%�������#��#0#$%���%� ���� �� � �$ ��%� 5�/� ��/��� /��� �1 �9A. ����9��D��

�� ��� �- %��� *- )������ '-(+- �� %����� *- �����)�6A, �%����- �� �� ��� �3���� �� �/� ���������� ��� �� �� ��������� $%���%� ���� ��� /��� ����� �����������% ���������� /��� �� 1 �22. "9"��

E�������� >-=- ��" �) 8 �������� �� ����� /��� �$%% ����� ���$$���-��B $�%���%� ��� �� $% ��(�������� *���1 �,���1?9. ��9D��

#���� "- �� ,���� ;- �����) ��%���% �%����- �� ��#������%������ EEE#��#0#����%� ���� �� �6A, � �$ ��5���� ��������% ��� ������ �� ������ �� � �� � /��1 4���1 ����1�� 1 ���. F?. D �9D !�

#���� "- �� ,���� ;- ������) *��% ������������B $�%���% �%����- �� ���3��%#+�,B���� �#0#���3��%� ���� �� �6A,� �$ ��5�� �� ��������% ��� ������ �� ������ �� � �� � /��14���1 ����1 �� 1 ���. F?. ��D"�9��D"��

#���� "- �������� +- �� ,���� ;- �����) ��%���% �%��#��- �� ��#� ���).�� ���) #����#D#�%#0#����% � ���� �� �6A,� �$ *��� �� ��������% ��� ������ �� ������ �� � �� � ����1� ����1 � ����1 9?1. �!�9� ��

)�� G- ;������ "- ������ 8- �� '���� D- ��""!) +� ��� #�3���� �� ���� �%�-��� ��� ������ �� ��� �������$��%C���#3��%#+�,B��� ��%�� 4#��� �������$��%C���3��%� ���� ��� �$ �%������ ��%% ��%�� �� �� � �����. � ����� ������������/��� *�1 � �1 90. !!!9! "�

*�� ���%������ ��;������ ��� ��� �� ���� ��� ��� ���� ���$����� �� 1��@�&*� /��� ,�������� ��$�� � ,4� �!�� ���

��%*��'). ,4� �!�D ��� ����'!�). �� ,4�"D!�" ��� ��.��)� E� $��� �� ������� ��� ��� ���%������ ��;����� ���������

���� 1��@�& ,�������� ��$�� @6��D��! �� ���� ����-���� � ��*��'� *�� ��*��' �� @,<6 ��$�%�- �� ��&��/�

�������� �� �1 ������� �� �� ����� ��� � �$ ��%*��'�

� @%�&/�%% 8��%�����- >��. ��� /��� &����. �����). 9:. ""�9����

2��� � ��� �� ��������� ,�� � � ��� ������ ��������������� ��� 2� ��%������ ��3��� ����