How fat stem cells could or not form muscle cells (French)
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Les cellules souches mésenchymateusesLes cellules souches mésenchymateuses
du tissu adipeux humain : du tissu adipeux humain :
Etude de leur potentiel myogéniqueEtude de leur potentiel myogénique
Ari Massoudi
UMR 6543 CNRS« Stem cells and differentiation »
Centre de BiochimieUniversité de Nice-Sophia Antipolis
Faculte des Sciences
Renouvellement tissulaire
- Tissus à renouvellement rapide
Renouvellement de l’épidermeRenouvellement de l’épithélium intestinalRenouvellement des cellules du sang….
Dégénérescence
- Traumatique (brulure, blessure…)
- Pathologique (Alzheimer, défaut génétique, cirrhose…)
Des cellules non-spécialisées assurentle maintien de l’homéostasie tissulaire :
« cellules souches et progéniteurs »
Un homme adulte ≈ 10 trillions (10.1018 ) de cellules spécialisées
• 20- 40 millions de cellules disparaissent / seconde !
Totipotentes
stade 8 blastomères (3 jours)
Nouveau-né
œuffécondé(jour 1)
embryon pré-implantatoire
Pluripotentes
cellules souches embryonnaires (ES)
(≈400 types cellulaires)
trophoblasteBouton embryonnaire
(ICM)
cellules souches germinales
embryonnaires (EG)
Pluripotentes
Embryon/Fœtus
cellules foetales
Multipotentes
Cellules souches du cordon ombilical
Cellules souches adultes• NSC• MSC• SC
• ESC• SPG …
Multipotentes,Oligopotentes,
Unipotentes
1. Totipotentes => organisme entier
2. Pluripotentes => l’ensemble des types cellulaires
3. Multi / oligopotentes => capacités plus restreintes
4. Unipotentes => un seul type cellulaire
cellules souches/progéniteurs
(Adulte ≈ 400 types cellulaires)
progéniteur
précurseur
cellule différenciée
cellule souche
Hiérarchie ontogénique
Potentiel régénératif
Les cellules souches sont des cellules « rares »Fréquence : 1 / 500 à 108
Identitétissulaire
« Définition minimum mais insuffisante » :
« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité »
de se transformer en au moins un type cellulaire
Cellule souche
Cellule souche
« Définition minimum mais insuffisante » :
« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire
Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :
• Auto-renouvellement :
maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires
• Multipotence :
la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
• Clonogénicité :
les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule
progéniteur
précurseur
cellule différenciée
cellule souche
Auto-renouvellement
Maintien du pool de cellules souches au fil des générations
Cellule souche
« Définition minimum mais insuffisante » :
« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire
Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :
• Auto-renouvellement :
maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires
• Multipotence :
la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
• Clonogénicité :
les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule
progéniteur
précurseur
cellule différenciée
cellule souche
Mulipotence
La potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
Multipotence par plasticité
progéniteurs unipotents
cellule souche
indéterminée
Programme type cellulaire A
Programme type cellulaire B
Plasticité : capacité d’acquérir de novo différents « programmes » de différenciations
Le programme peut se matérialiser par l’expression de facteurs de transcription qui
entrainent l’expression de gènes spécifiques d’un type cellulaire
Multipotence par trans-différenciation
Song et al. Faseb J. 2004de la Fuente et al. Exp Cell Res. 2004Real et al. Dev Biol. 2006
Multipotence par fusion
Ying et al. Nature. 2002Terada et al. Nature. 2002Spees et al. PNAS. 2003Garbade et al. EJCS. 2005 Ishikawa et al.FASEB J.2006
Cellule souche
« Définition minimum mais insuffisante » :
« Cellule indifférenciée » ayant la « potentialité » de se transformer en au moins un type cellulaire
Traits importants s’ajoutant à la définition minimum :
• Auto-renouvellement :
maintien du potentiel « souche » au fil des générations cellulaires
• Multipotence :
la potentialité de se transformer en plus d’un type cellulaire
• Clonogénicité :
les différents traits phénotypiques exprimés sont intrinsèque à une cellule
Cellules souches mésenchymateuses (MSC)
Définition de l’ International Society for Cellular Therapy (ISCT) :
Toute population cellulaire obtenue à partir d’un tissu/organe ayant in vitro les
caractéristiques minimums suivantes :
• Adhérence au plastique (par opposition aux cellules hématopoïétiques)
• Multipotence mésenchymateuse Adipo-Ostéo-Chondrocytaire
• Combinatoire d’expression des marqueurs de surface :
CD45, CD34, CD19, CD14, CD11b, HLA-II… Négatives
CD105, CD90, CD73… Positives
• Clonogénicité
culture in vitroexpansion
cellules adhérentes
adipocytes
cellules stroma-vasculaire
Tissu adipeux humainnouveaux-nés ou enfants
human Multipotent Adipose-Derived Stem cells(hMADS cells)
Culturesecondaire
Zaragosi et al. Stem Cells. 2006
Rodriguez et al. J Exp Med. 2005
• Auto-renouvellement
• Activité télomérase
• Caryotype normal
• Non-tumorigénique in vivo - souris nude -
• Multipotence
cellules hMADS => propriétés fondamentales de cellules souches :
Multipotence
mésenchymateuse des cellules hMADS
cellules hMADS
adipocytes
ostéocytes
chondrocytes
induction adipogénique
induction osteogénique
induction chrodrogénique
cellules hMADS = MSC du tissu adipeux
• CD34 négative• adhérence au plastique
Multipotence mésenchymateusepar « plasticité »
ALPOstéonectine OstéocalcineOstéopontine
ColI1…
CBFA-1
Osterix
SMADs
VD3R
FosB
Adipocytes
CD36GAPDH
LPLaFABPLeptine
AdiponectineAdipsine
…
Pref-1
C/EBP
C/EBP
PPAR
PPAR
C/EBP
Induction adipogénique Induction ostéogénique
progéniteur
précurseur
Ostéocytes
Alizarin redORO
hMADS cells
Contribution myogénique cellules hMADS in vivo
cellules hMADS
injectionintra-musculaire
Résultats antérieurs du laboratoire :
Protéine dystrophine humaine
Noyaux hMADS / myofibre
Rodriguez et al. J Exp Med. 2005.
plusieurs mois après
souris mdx
Souris mdx = modèle de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD)Mutation ponctuelle dans le gène dystrophine => nécrose musculaire
Myogenèse
La myogenèse est sous le contrôle de facteurs de transcription « clés » :Myogenic Regulatory Factors (MRF) : Pax7, MyoD, myf-5, myogénine, MRF4
nls-LacZcellules hMADS
myoblastes lignée C2C12 souris+
noyau humain-gal +
myotube hybride homme - souris
Résultats similaires obtenus avec :
• Myoblastes primaires souris wt ou mdx
• Myoblastes humains de patients sains
• Myoblastes humains de patient DMD
Contribution myogénique cellules hMADS in vitro
Expression de messagers musculaires humainsen co-culture hMADS / C2C12
D 0
D 1
D 2
D 4
hMADS cells / C2C12 co-cultures
h = human specific primers
m = mouse specific primers
h sarcospan
h dystrophin
h muscle creatine kinase
h enolase 3
h desmin
h actin
m hprt
muscle markers
hum
an m
uscl
e ce
llsm
ouse
C2C
12
RT-PCR
noyaux hMADS
sarcoglycane humain
( confocal analysis )
Expression de la protéine -sarcoglycaneen co-culture hMADS / C2C12
sarcoglycane humain
Myotubes issus de myoblastesde patient DMD
Co-culture celllules hMADS / myoblastes DMD
dystrophine
Expression de la dystrophine en co-culture
Myotubes hybrides hMADS/DMD expriment la dystrophine
3) Par quel mécanisme les cellules hMADS contribuent-elles à la myogenèse ?
1) Contribution des cellules hMADS
à la formation de myotubes hybrides
2) Expression de gènes musculaires
codés par le génome hMADS dans les myotubes hybrides
in vitro
Hypothèse :
Les cellules hMADS possèdent
une « plasticité myogénique » intrinsèque ?
Stratégie :
« Allumer » le programme myogénique
en testant différentes conditions inductives
connues pour promouvoir la myogenèse
Mecanisme de la contribution myogénique ?
• 46 conditions de culture testées en présence ou en l’absence de sérum• milieux conditionnés provenant de myoblastes
• membrane natives provenant de myoblastes• différents type de matrice extracellulaire
Aucune des conditions testées n’a permit d’induire un programme myogénique
Conditions de culture testées pour promouvoir la myogenèse des cellules hMADS
Hypothèse : Seuls les myoblastes induisent le programme myogénique
dans les cellules hMADS ?
Stratégie :
Evaluer l’expression des MRF par les cellules hMADS en co-cultures
Pax7 ? MyoD ?
Myogenin ?
cellules hMADS
Myoblastes
Induction« complexe »
« myo »-hMADS
Mecanisme de la contribution myogénique ?
Pax7 + MyoD +
Myogenin +
myoblastes Myogenin +
Expression de la myogénine en co-culture GFP-hMADS / myoblastes C2C12
GFP-hMADS cells Myogenin -
Aucun MRF exprimé par les cellules hMADS en co-culture
Expression des MRF en co-culture
GFP-hMADS cells : Pax7-Myoblasts : Pax7+
GFP-hMADS cells : MyoD- Myoblasts : MyoD+
Résultats similaires :
co-cultures
hMADS/ myoblastes humains
Expression de la myogenin en co-culture
GFP
noyau hMADS
Hoescht
smooth
noyau souris
merge myoG
hum myogenin
hum actin
mouse hprt
co-culturehMADS/C2C12
myotubes
RT-PCR
hu
man
mu
scle
cel
lsm
ou
se C
2C12
Noyaux issus des cellules hMADS dans les myotubes hybridescontiennent la myogénine codée par le génome de souris
noyau hMADS
noyau souris
Mécanisme de la contribution myogénique ?
cellules hMADS
Myoblastes
induction« complexe »
« myo-like »-hMADS
Engagement « partiel »indépendante des MRF ?
Hypothèse :
Pax7 -
MyoD -
Myogenin -
Desmine +Nestine +
Desmine ?Nestine ?
myoblastes myotubes (j4)
myoblastes humains
GFP-hMADS
+myoblastes
C2C12souris
Nestine « humaine »
différenciation
Expression de Nestine humaine
En co-cultures, seuls les myotubes hybrides expriment la Nestine humaine
Co-culture
Expression de Nestine humaine
*
*
*
*
Co-culture cellules hMADS / myoblastes C2C12 souris
Myotube hybride
Myotubes humain
Conclusion
2nd hypothèseEngagement partiel
1st hypothèsePlasticité myogénique
Expression gènes musculaires :
sarcoglycane +dystrophine +
nestine +sarcospane +
desmin +enolase3 +
muscle creatine kinase +
myocytes
cellules hMADS
Fusion cellulaire
myotube MRFs( myogenin, herculin, MEFs )Conversion myogénique des cellules hMADS
Modèle :Conversion
myogénique post-fusion
Perspectives
Expression gènes musculaires :
sarcoglycan +dystrophin +
nestin +sarcospan +
desmin +enolase3 +
muscle creatin kinase +
Myogenin-expressing myoblasts
hMADS cells
cellular fusion
myotube MRFs( myogenin, herculin, MEFs )
Rôle des MRFsdans la
reprogrammation
Facteurs impliquésdans la fusionhétérologue
reprogrammationapproche globale
This work has been supported byAssociation Française contre les Myopathies