Histološka i histohemijska bojenja

doc. dr Mirela UkropinaKatedra za biologiju ćelija i tkiva

Histologija

� Nauka o tkivima� Struktura – funkcija

� Organi, tkiva, ćelije – korelisati strukturu sa funkcijomfunkcijom

� SM, TEM, SEM� 2D – 3D

Priprema tkiva

� Paradoks – živo vs. mrtvo� Rutinski pripremljeni preparati bojeni H&E

� Fiksacija - metabolizam, struktura (formalin)Ispiranje� Ispiranje

� Dehidratacija – izvlačenje vode (alkoholi, 30-100%)� Ksilol – uklanjanje alkohola� Kalupljenje, parafin (tečan-čvrst)� Sečenje – mikroskopski preseci� (Bojenje)

� Može li histologija bez bojenja?� 1719. Leeuwenhoek – šafran � Neobojeni uzorci, grubo razdvojeno tkivo ili preseci

načinjeni slobodnom rukom, posmatrani u vodi� 1852. Kölliker – opis mikroskopske strukture tkiva� Industrija boja, primena komercijalnih boja u histologiji –

viđeni i proučavani detalji ćelijske struktureviđeni i proučavani detalji ćelijske strukture

� bukalna sluzokoža � neobojene ćelije i obojena metilenskim plavim

Priprema tkiva (cont.)

� Parafinski preseci su bezbojni� Izvlačenje parafina (ksilol)� Re-hidratacija (alkoholi,100-70%), voda� Hematoksilin – rastvoren u vodi� Eozin (rastvoren u alkoholu ili vodi)� Alkoholi, ksilol, montiranje DPX – trajni

preparat� Montiranje u nevodenom medijumu da bi sprečio gubitak

boje

Hematoksilin Eozin H&E

Drugi fiksativi, metode bojenja

� H&E – opšta histološka građa, ali ne hemijski sastav ćelija

� Mnoge komponente izgubljene tokom pripreme preparata (alkoholi i ksiloli uklanjaju pripreme preparata (alkoholi i ksiloli uklanjaju neutralne lipide→)

Lipidi

Oil Red Osmium tetroxide

H&E

Elastična vlakna

� Resorcin-fuksin

Retikularna vlakna

� impregnacija srebrom

� Hemijska osnova za mnoge metode bojenja nije poznata!

Histohemija i citohemija

� Procedure zasnovane na� Specifičnom vezivanju boje� Upotrebi (fluorescentno) obeleženih antitela � Upotrebi (fluorescentno) obeleženih antitela

� Inherentna enzimska aktivnost ćelijske komponente

Hemijski sastav histoloških preparata

� Razlikuje se od živog tkiva� Posle fiksacije preostaju mahom veliki � Posle fiksacije preostaju mahom veliki

molekuli koji se nerado rastvaraju, naročito u koracima koji slede nakon fiksativa

� Oni čine strukturu ćelija i tkiva, organizaciju vidljivu mikroskopom

� Struktura – funkcija� Proteini – vidljivi kontraktilni filamenti mišićne ćelije – učestvuju u kontrakciji

� RNK u citoplazmi motoneurona – Nislova tela –sinteza proteinasinteza proteina

Hemijski sastav histoloških preparata

� Nukleoproteini (nukl. kis. vezane za proteine)� Unutarćelijski citoskeletni proteini,

kompleksovani sa drugim proteinimakompleksovani sa drugim proteinima� Vanćelijski proteini u velikim nerastvorljivim

agregatima, povezani sa susednim sličnim molekulima, kolagena vlakna

� Membranski fosfolipid-protein (ili

ugljenohidratni) kompleksi

Rutinska priprema preparata

� Gubi se� Mali proteini, male nukleinske kiselina (tRNK)� Veliki molekuli – glikogen (unutar), proteoglikani i

GAG (van), neutralni lipidiGAG (van), neutralni lipidi� Rastvorljive komponente, joni, mali molekuli

(intermedijarni metaboliti, glukoza, Na, Cl..) –učestvuju u ćelijskom metabolizmu – ne čine formirane elemente tkiva

Hemijska osnova bojenja

� Kisele i bazne boje� Kisele boje - negativno naelektrisan obojeni

deo [Na+boja-] (eozin) Bazne boje - pozitivno naelektrisan obojeni � Bazne boje - pozitivno naelektrisan obojeni deo [boja+Cl-] (hematoksilin striktno govoreći nije bazna boja, ali ima osobine koje podsećaju na baznu boju)

� Bazne boje� Metil zeleno (zeleno)� Metilensko plavo (plavo)� Pironin G (crveno)� Toluidin plavo (plavo)� Toluidin plavo (plavo)

� Kisele boje� Kiseli fuksin (crveno)� Anilin plavo (plavo)� Eozin (crveno)� Oranž G (narandžasto)

Bazne boje (+)

� Reaguju sa anjonskim komponentama ćelija i tkiva (-)� Fosfatne grupe nukleinskih kiselina� Sulfatne grupe GAG� Sulfatne grupe GAG� Karboksilne grupe proteina

� Bazofilija – strukture koje se boje baznim bojama

� Mali broj tkivnih struktura pokazuje bazofiliju� Heterohromatin i nukleolus, citoplazma bogata

ribozomima, vanćelijski ugljeni hidrati

Bazne boje (+)

� Reakcija anjonskih grupa zavisna je od pH� pH 10: sve tri grupe jonizovane i interaguju sa

baznim bojama� pH 5-7: sulfatne i fosfatne grupe� pH 5-7: sulfatne i fosfatne grupe� pH <4: samo sulfatne grupe

� Bojenje na specifičnom pH vizualizuje određene anjonske grupe, karakteristične za određene makromolekule

Hematoksilin

� Hematoksilin→Hematein� Nije bazna boja, striktno gledajući� Koristi se sa mordantom (štavilom) –

intermedijarni link između tkiva i boje, i on čini intermedijarni link između tkiva i boje, i on čini da hematoksilin podseća na baznu boju (Al, Fe)

� Harisov, Majerov..

Kisele boje (-)

� Reaguju sa katjonskim komponentama ćelija i tkiva (+)� Jonizovane amino grupe proteina

� Acidofilija – sposobnost katjonskih grupa iz � Acidofilija – sposobnost katjonskih grupa iz tkiva da reaguju sa kiselim bojama

� Bojenje kiselim bojama je manje specifično i precizno nego bojenje baznim bojama

� Citoplazmatski filamenti, citoplazma, većina vanćelijskih vlakna (amino grupe) – više tkivnih komponenti pokazuje acidofiliju

Trihromno bojenje

� Tri kisele boje – metod za vezivno tkivo� Kiseli fuksin (Mallory)/azokarmin (Heidenhain's AZAN)

(citoplazma) � Anilin plavo (kolagen, ali i hrskavica, mukus)� Orange G (eritrociti)

� Veličina molekula boje, permeabilnost/kompaktnost tkiva

Metahromazija

� Neke bazne boje reaguju sa komponentama tkiva koje menjaju njihovu normalnu plavu obojenost u crveno/ljubičasto

� Toluidin plavo� Toluidin plavo

Metahromazija

� Zbog prisustva polianjona u tkivima, molekuli boje formiraju polimerne agregate – različita apsorpciona svojstva od monomera boje

� Jonizovane sulfatne i fosfatne grupe u tkivima � Jonizovane sulfatne i fosfatne grupe u tkivima (granule mastocita-heparin, osnovna supstanca hrskavičavog tkiva)

Aldehidne grupe i Šifov reagens

� Izbeljeni bazni fuksin (Šifov reagens) reaguje sa aldehidnim grupama dajući specifično crveno/magenta obojenje

� PAS (Periodic Acid Schiff) metod – ugljeni � PAS (Periodic Acid Schiff) metod – ugljeni hidrati i makromolekuli bogati njima

� Glikogen, mukus, podepitelske lamine

H&E vs. PAS

� Intestinalne žlezde - podepitelska lamina i mukus PAS +

Enzimska digestija

� Pozitivna identifikacija obojenog materijala� Dva uzastopna tkivna preseka� Pretretman diastazom ili amilazom, zatim PAS –

ne boji se glikogenne boji se glikogen

AB-PAS Neutralni vs. kiseli mukus

BPB Proteini

� Pedomorfan Lissotriton vulgaris, 40x

Enzimska histohemija

� Za lokalizaciju enzima u tkivnim presecima� Vizualizuje se produkt enzimske aktivnosti, a

ne sâm enzimBoja ili teški metal vezuje produkt reakcije � Boja ili teški metal vezuje produkt reakcije enzima – precipitacija� Lizozomi – olovo fosfat nastaje dejstvom kisele

fosfataze – SM i EM� ATPaza, Na/K ATPaza..

Imunohistohemija - IHC

� Antigen – antitelo specifična reakcija

� U zavisnosti od toga šta je vezano za antiteloImunofluorescenca� Imunofluorescenca

� Imunoenzimološko bojenje / enzimska IHC� Imunokoloidno zlato – imunocitohemija, EM

� U zavisnosti od tipa procedure� Direktno bojenje� Indirektno bojenje

Enzimska IHC

� Enzimi - peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza (AP)

� Supstrat – DAB (braon), ...

Insulin Ki67

Propidijum jodid - apoptoza

� Tkiva bojena ne-jonskim bojama montiraju se vodenim medijumom

� Bojenje – vizuelno obeležavanje nekog entiteta vezivanjem, ili taloženjem u njegovoj blizini, markera karakteristične boje ili oblika

� Boja – marker, ili reagens korišćen da bi se � Boja – marker, ili reagens korišćen da bi se stvorio marker

Zašto se tkiva boje?

� Boja-tkivo afinitet � Afinitet – tendencija boje da pređe iz rastvora

na tkivni presek� Boja-tkivo interakcije� Boja-tkivo interakcije

� Elektrostatičke veze, Van der Valsove sile, vodonične veze, kovalentne veze; rastvorljivost

� Boja-boja interakcije� Molekuli boje se privlače – agregati; metahromazija

� Druge mogućnosti� Negativno bojenje – kanalikuli koštanog matriksa

� Tionin i pikrinska kiselina

� Vitalno bojenje � India Ink & H&E � Trypan Blue & Safranin & Orange G

� Autoradiografija

� Mali molekuli, prekursori većih – aminokiseline, nukleotidi – mogu se obeležiti radioaktivnim atomima (inkorporiraju se)

� Injektiraju se u životinju ili unesu u kulturu ćelija, uključuju se u sintezu proteina, nukleinskih uključuju se u sintezu proteina, nukleinskih kiselina...sekrecija, deoba

� Preseci tkiva se uranjaju u fotografsku emulziju, razvijaju standardnim fotografskim tehnikama, mogu se i obojiti, montiranje

� Partikule srebra u emulziji iznad radioaktivno obeleženih molekula – crne granule

� [3H] timidin – sinteza DNK

� Limfni čvor