HISTOLOGÍA SOBRE EL AVANCE DE Peronospora sparsa (Berkeley), EN ROSA var. CHARLOTTE Y SU RELACIÓN CON LOS SÍNTOMAS DE LA ENFERMEDAD

DÍAZ GONZÁLEZ JENNIFER IZQUIERDO GARCÍA LUISA FERNANDA

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO Y

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D.C.

Diciembre de 2010

HISTOLOGIA SOBRE EL AVANCE DE Peronospora sparsa (Berkeley), EN ROSA var. CHARLOTTE Y SU RELACIÓN CON LOS SÍNTOMAS DE LA ENFERMEDAD

DÍAZ GONZÁLEZ JENNIFER IZQUIERDO GARCÍA LUISA FERNANDA

APROBADO

____________________________ ____________________________ Ingrid Schuler Janeth Arias

Bióloga Ph.D. Bacterióloga, M. Sc., M. Ed. Decana Académica Director de Programa Académico

HISTOLOGÍA SOBRE EL AVANCE DE Peronospora sparsa (Berkeley), EN ROSA var. CHARLOTTE Y SU RELACIÓN CON LOS SÍNTOMAS DE LA ENFERMEDAD

DÍAZ GONZÁLEZ JENNIFER IZQUIERDO GARCÍA LUISA FERNANDA

APROBADO

____________________________ ____________________________ Ma. Clemencia F. de La-Rotta Humberto Ibarra Ing. Agr. M. Sc. Fitopatología Microbiólogo M. Sc. Directora Jurado ____________________________ Sandra Gómez Ing. Agr. M. Sc. Fitopatología Codirectora

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar

la verdad y la justicia”.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos profundamente a todas las personas que nos ayudaron en la realización de esta investigación: A María Clemencia de La Rotta nuestra directora, docente de la Pontificia Universidad Javeriana; a nuestra codirectora Sandra Gómez docente de la Universidad Nacional de Colombia; A Nancy Niño del CIAA (Centro de Investigación Universidad Jorge Tadeo Lozano); A la Finca Las Acacias; A la profesora Celsa García, Bibiana Romero y Rubén Cruz del Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Agronomía Universidad Nacional de Colombia, a la profesora Liliana Hoyos y a Wadith de León del Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de Colombia y a Marcos Álvarez del área de microscopía de la Facultad de Ciencias de La Pontificia UniversidadJaveriana.

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TABLA DE CONTENIDO

Página

INTRODUCCIÓN…………………………………..………………………………..……………..1 JUSTIFICACIÓN…………….………………………………………………..…………………...2

1. MARCO TEÓRICO………………………………………….……………….…..............2 1.1. Generalidades de las rosas………………..…….………………….…………..2 1.2. Variedad Charlotte………………………………………………………………..3 1.3. Mildeo velloso………………………………………………………….…............3

2. OBJETIVOS…………………………………………………………………..……...........4

2.1. Objetivo General……………………………………………………………...…...4 2.2. Objetivos Específicos………………………………………………………..……4

3. METODOLOGÍA……………………………..…………………………………………....4

3.1. Fase uno: Evaluación de muestras de plantas de rosa var. Charlotte con sintomatología característica de la enfermedad en campo……………...…….4

3.2. Fase dos: Inoculación del microorganismo en plantas de rosa var. Charlotte bajo condiciones de invernadero………………………………………………….5

3.2.1. Propagación………………………………………………………...….....5 3.2.2. Prueba de marcación del inóculo con blanco de calcoflúor………....6 3.2.3. Prueba de microorganismo en ambiente……………………….…......6 3.2.4. Prueba de inoculación en invernadero……………….........................6 3.2.5. Inoculación…………………………………………………………….…..7

4. RESULTADOS Y DISCUSION…………………….…………………………………….8 4.1. Fase uno: Evaluación de muestras de plantas de rosa var. Charlotte con

sintomatología característica de la enfermedad en campo…………......……8 4.1.1. Cortes a mano alzada…………………………………………...............8 4.1.2. Evaluación de muestras para procesamiento mediante Microtomía..8 4.1.3. Microtomía…………………………………………………………….…..9

4.2. Fase dos: inoculación del microorganismo en plantas de rosa var. Charlotte bajo condiciones de invernadero…………….………………………...………….....12

4.2.1. Prueba de marcación del inóculo con blanco de calcoflúor………..12 4.2.2. Prueba de microorganismo en ambiente ……………………..……..13 4.2.3. Prueba de inoculación en invernadero……………………………….14 4.2.4. Inoculación ………………………………..……………...……….…....15 4.2.5. Condiciones ambientales………………………………………………18

4.3. Discusión……………………………………………………………………………18 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ……………………………..………….21 6. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………..……...22

7. ANEXOS………………………………………………………………………..…….......25

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INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Microplaca de propagación…………………………………………………………6

Figura 2. Síntomas esporulación y cortes a mano alzada ………………………………….9 Figura 3. Estructuras observadas en microtomía…………………….……………………....12 Figura 4. Estructuras sexuales de Peronospora sparsa…………………………………….13 Figura 5. Observaciones en prueba de inoculación ………………………..………………14 Figura 6. Resultados inoculacion en invernadero…………………………………..……….16

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INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Resultados de observaciones microscópicas de foliolos procesados por Microtomía …………………………………………………………………………..…………….10

Tabla 2. Resultados de observaciones microscópicas de Tallos procesados por Microtomía…………………………………………………………………………………………11

Tabla 3. Resultados inoculación de foliolos en invernadero…………………………………17

Tabla 4. Resultados inoculación de tallos en invernadero…………………………………..17

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LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Resultados Tiempos de marcación del microorganismo con el fluorocromo

blanco de calcoflúor.…………………………………………………………………..……..…..25

Anexo 2. Esporas encontradas en láminas atrapa esporas…….…………………………...26

Anexo 3. Esporas encontradas en lamina atrapa esporas.........…………………….……..26

Anexo 4. Resultados prueba de inoculación en invernadero.…………………...................27

Anexo 5. Comportamiento de la temperatura (ºC) en los 21 días de seguimiento……….28

Anexo 6. Comportamiento de la humedad relativa (%) en los 21 días de seguimiento....28

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RESUMEN

Peronospora sparsa, microorganismo conocido comúnmente como mildeo velloso, ocasiona 10% de pérdidas de la producción comercial de rosa en la sabana de Bogotá; la poca información sobre la biología del microorganismo nos ha llevado a explorar sobre su desarrollo en los tallos y hojas enfermos y de esta forma evaluar su colonización y avance en los tejidos de las plantas. A partir de inoculaciones del microorganismo en tallos y hojas de plantas de rosa variedad Charlotte, y de igual manera relacionar la expresión de síntomas con la presencia de estructuras del microorganismo, se tomaron muestras con la sintomatología característica de la enfermedad, en dos invernaderos ubicados en la sabana de Bogotá, uno con aplicaciones químicas y el segundo sin alguna aplicación, teniendo en cuenta las diferentes condiciones a las que estaban sometidas las plantas. Los tejidos se procesaron mediante la técnica de microtomía por imbibición en parafina; por otro lado el microorganismo se marco con blanco de calcoflúor y se inoculó bajo condiciones de invernadero sobre foliolos y tallos de rosa, evaluando el desarrollo de la enfermedad durante 24 días; simultáneamente se realizaron cortes para ser observados en el microscopio óptico y de fluorescencia. En la microtomía de los foliolos afectados se encontraron: esporangioforos y esporangios; en los necrosados, oosporas, esporangioforos y esporangios, y en tallos con las ampollas o pústulas se encontraron anteridios, oogonios y oosporas. En la inoculación sobre tallos se observó que el microorganismo avanzó hacia los peciolos inmediatamente superiores cercanos al punto de inoculación, mientras que en las inoculaciones del microorganismo sobre foliolos no avanzó hacia los tallos. Se encontró que en los tallos las células más afectadas corresponden al colénquima y posiblemente en este tejido se lleva a cabo el avance del microorganismo. De acuerdo con las observaciones realizadas en esta investigación se tienen indicios de que el microorganismo es sistémico a partir de esporangios, dado que cuando las inoculaciones se realizaron a partir de este inoculo los síntomas se manifestaron en los tejidos superiores, también se identifico la relación de las pústulas en tallos con la presencia de oosporas en campo y su importancia en la resistencia y sobrevivencia del agente causante de la enfermedad. En esta investigación se registra por primera vez en el país la presencia de oosporas (estructuras sexuales) del microorganismo perteneciente al reino Chromista P. sparsa.

INTRODUCCION

Colombia se encuentra entre los principales productores de flores siendo superado solo por Holanda ya que cuenta con 40.000 especies vegetales y ofrece al mercado internacional 270 tipos diferentes. La flor es la primera exportación agrícola no tradicional del país, este sector genera 185.000 empleos en Colombia y otros 200.000 sólo en la cadena de distribución en Estados Unidos, siendo la rosa el principal producto de exportación (Asocolflores, 2008). En la sabana de Bogotá se produce alrededor del 80% de la producción total, esta se ve afectada por el microorganismo Peronospora sparsa. Aunque la literatura científica registra a P. sparsa como un patógeno endémico del área norte del trópico de Cáncer, en la actualidad el mildeo velloso de la rosa causa daños significativos en países tropicales y subtropicales como Brasil, Colombia, Israel, Egipto y Nueva Zelanda. Existen registros de la ocurrencia del mildeo velloso en los cultivos colombianos de rosa desde la década de los 70, para el año de 1999 se estimó en cinco millones de dólares las pérdidas por la afección del mildeo velloso de la rosa (Ayala et al,

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2008) y actualmente se considera que la enfermedad ocasiona una disminución del 10% en la producción total de rosas del país (Gómez, 2004). En la sabana de Bogotá la presencia de la enfermedad es permanente y los ataques severos se presentan en ciertas épocas del año, asociadas con altas precipitaciones (Gómez y Arbeláez, 2005). Conociendo la biología de la enfermedad y el comportamiento del microorganismo, de acuerdo con el tiempo y la longitud con que avanza en el tejido, e identificando la presencia de los síntomas iníciales, permitirá al floricultor evitar pérdidas económicas de su cultivo realizando podas a una distancia adecuada del síntoma antes de la colonización por el microorganismo, permitiéndole disminuir la aplicación de químicos.

Para este trabajo se tomaron muestras de tallos de rosa afectadas por el microorganismo en dos invernaderos comerciales ubicados en la sabana de Bogotá; en uno el manejo de la enfermedad se realizaba mediante control químico, mientras que en el segundo sin ninguna aplicación.

JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El mildeo velloso se ha convertido en el principal problema fitosanitario del cultivo de rosa en la sabana de Bogotá lo cual incide en la productividad, y por lo tanto en los costos de producción de esta especie vegetal. Una de las variedades que se comercializan en los mercados internacionales, es la variedad Charlotte que de acuerdo con los estudios realizados por Gómez y Arbeláez (2005), se ha reportado como una de las más susceptibles a mildeo velloso. Desde el 2001 se han realizado investigaciones en el país sobre esta enfermedad, sin embargo la información publicada sobre el patógeno sigue siendo limitada. El desconocimiento de la biología de enfermedad en las plantas de rosa dificulta el manejo sostenible del problema, lo cual es una amenaza para el éxito del cultivo de rosa en Colombia (Gómez y Arbeláez, 2005; Ayala et al, 2008). Además en Colombia no se ha reportado la presencia de oosporas o estructuras sexuales del agente causal, que de acuerdo con estudios realizados en otros países son la fuente de inoculo primario durante el ciclo de la enfermedad (Danielsen y Ames, 1999; Thakur y Mathur, 2002).

Por lo tanto con este trabajo se busca evaluar el avance del Oomycete Peronospora sparsa (Berkeley) conocido como mildeo velloso, en plantas de rosa variedad Charlotte, para proponer una nueva alternativa en el manejo integrado de la enfermedad en los cultivos bajo invernadero, destinados al comercio internacional.

1. MARCO TEORICO

1.1 Generalidades de las rosas

La rosa es una planta perenne que forma tallos florales continuamente, con variaciones en cantidad y calidad, presentando diversos estadios de desarrollo que van, desde una yema axilar que brota siendo la base estructural de la planta y de la producción de flores, hasta un tallo listo para cosechar. Las yemas ubicadas en las hojas superiores de un tallo con frecuencia parecen ser más generativas de flores, mientras que las yemas inferiores son vegetativas (Hoog, 2001). En promedio, el ciclo de un tallo floral es de 10 a 11 semanas; se considera que la mitad de este periodo es de crecimiento vegetativo y la otra es reproductiva. El periodo

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vegetativo se subdivide en inducción del brote y desarrollo del tallo floral, presentado en la mayoría de los casos un color rojizo característico (Cáceres et al., 2003). 1.2 Variedad Charlotte

La variedad ‘Charlotte’ es una rosa de color rojo terciopelo brillante, adecuada para el cultivo bajo invernadero. Los botones florales se abren lentamente, permitiendo que se conserven entre 10 y 14 días, la longitud de los tallos es de unos 70-80 cm y esta variedad ofrece una buena producción. La oferta actual le permite contar con una alta aceptación, pese a ser de botón mediano, es una variedad con un ciclo de desarrollo de aproximadamente 72 días; presenta tallos gruesos y largos, con 10 hojas verdaderas; los pétalos de la flor son de color rojo a violeta y la dimensión de la flor al momento del corte es de 52 x 29 mm (Rodríguez y Flórez, 2006). De acuerdo con a Gómez (2004), es una de las variedades más susceptibles a la enfermedad.

1.3 Mildeo velloso

El mildeo velloso es un Oomycete que, pertenece al reino Cromista, orden Peronosporales, familia Peronosporaceae, clasificado taxonomicamente en el género Peronospora y especie sparsa; morfológicamente, se caracteriza por poseer esporangios subelípticos (17-22 x 14-18 μm) producidos a partir de esterigmas presentes en esporangióforos erectos y dicotómicamente ramificados en ángulos agudos (Horst, 1983). Se reproduce sexualmente por medio de oosporas caracterizadas por poseer paredes gruesas que cumplen funciones como estructuras de resistencia. En las zonas templadas, la producción de oosporas es profusa en el mesófilo de las hojas así como también en la corteza de los tallos y pedúnculos de las plantas sintomáticas (Ayala et al, 2008), sin embargo de acuerdo con Arbeláez (1999), su presencia en los cultivos de rosa de Colombia no ha sido determinada. Este microorganismo requiere células vivas de tejidos jóvenes para su reproducción (Brich et al, 2006), es por ello que la enfermedad se restringe generalmente a los tejidos jóvenes de la planta que afecta su calidad ya que causa lesiones en foliolos, tallo, peciolos, cálices y pétalos (Gómez y Arbeláez, 2005).

Los síntomas de la enfermedad en foliolos se presentan como manchas irregulares o moteados que varían de tamaño, que algunos casos son cloróticas, de color café a purpura y con bordes definidos; los esporangióforos y esporangios le dan una apariencia vellosa a algodonosa de color marrón claro, que puede ser muy abundante en el envés del foliolo (Gómez y Arbeláez, 2005; Gunn, 2005 y Ayala et al, 2008). En tallos jóvenes se observan manchas de color purpura, abultamientos o ampollas blancas en la corteza y en tallos maduros se presentan cuarteamientos rodeados de manchas pardas (Gómez y Arbeláez, 2005), síntomas y signos similares a los registrados por Forero de La-Rotta (2001) en mora de castilla (Rubus glaucus Benth). Se ha encontrado que durante los últimos estados de infección, las hojas se pueden volver necróticas, y es en este punto de la infección donde ocasionalmente se puede diseminar hacia el cáliz, pétalos, tallos y flores (Fox, 1996). Para el estudio de estructuras como: apresorios, formación de vesículas y esporulación de P. tabacina se ha utilizado el blanco de calcoflúor como marcador no tóxico en superficies de hojas (Cohen et al, 1987). El micelio se localiza intercelularmente y las oosporas se encuentran en el mesofilo de hojas sintomáticas y en el parénquima de la corteza del tallo tanto en campo como en plantas inoculadas (Aegerter et al, 2002). Las oosporas son esporas sexuales que pueden sobrevivir períodos largos, en tiempos adversos y son la fuente de inóculo primario, la

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fase asexual ocurre en periodos de clima adecuado para su diseminación (Thakur y Mathur, 2002). En quinua (Chenopodium quinoa) las oosporas de P. farinosa son transmitidas por semilla y suelo, sirviendo así como fuentes de inóculo primario para el inicio de epidemias (Danielsen y Ames, 1999). El oogonio y el anteridio son los gametangios femenino y masculino respectivamente, se encuentran generalmente en forma abundante en el tejido de la hoja en proceso de necrobiosis (Thakur y Mathur, 2002).

2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar el avance vertical del Oomycete Peronospora sparsa (Berkeley) en tallos y hojas de plantas de rosa variedad Charlotte cultivadas en la sabana de Bogotá.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.

• Relacionar la expresión de síntomas en los tejidos jóvenes de plantas de rosa var. Charlotte con la presencia de estructuras de P. sparsa en los tejidos de la planta.

• Evaluar si el microorganismo tiene la capacidad de avanzar en forma descendente

hacia el tallo cuando los síntomas iniciales se manifiestan en las hojas jóvenes del tercio superior de plantas enfermas.

• Evaluar si el microorganismo tiene la capacidad de avanzar en forma ascendente hacia las hojas jóvenes, cuando los síntomas se presentan en los tallos.

3. METODOLOGIA

Este proyecto se llevó a cabo en el laboratorio de Biotecnología Vegetal de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá, La metodología se dividió en dos fases, en la primera se evaluaron muestras de plantas de rosa var. Charlotte que mostraron síntomas característicos de la enfermedad en campo, recolectadas de dos invernaderos ubicados en la sabana de Bogotá. En la fase dos se llevó a cabo la inoculación del microorganismo en plantas de rosa var. Charlotte en el invernadero de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de Colombia.

Procedimiento

3.1. Fase uno: Evaluación de muestras de plantas de rosa var. Charlotte con sintomatología característica de la enfermedad en campo.

De acuerdo con la metodología sugerida por Gómez y Arbeláez (2005), se seleccionaron foliolos del tercio superior de la planta y tallos jóvenes que presentaron los síntomas característicos de la enfermedad, de la siguiente manera:

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En foliolos:

1. Presencia de coloraciones pardas en foliolos. 2. Lesiones necrosadas y encorvamiento del foliolo. 3. Foliolos esporulados por el envés.

En tallos:

1. Presencia de coloraciones rojizas. 2. Presencia de pústulas o ampollas blancas. 3. Agrietamientos longitudinales en tejidos jóvenes.

Se tomaron muestras de cada uno de estos síntomas, al igual que muestras sin la sintomatología como control, a cada una de las muestras se le realizaron cortes a mano alzada, luego fueron teñidos con azul de lactofenol para ser observados bajo microscopio óptico; también se procesaron mediante la técnica de microtomía por imbibición en parafina (Sass, 1968), estas últimas se tiñeron según la técnica safranina y “fast green” (Strittmatter, 1979) y se observaron bajo microscopio óptico.

Para la técnica de microtomía por imbibición en parafina las muestras se fijaron durante 24 horas en una solución de formalina, alcohol y ácido acético (F.A.A.); se procedió a realizar una deshidratación a la muestra utilizando alcohol al 50, 70 y 96%, a las muestras se les realizó 3 cambios de alcohol con las dos primeras concentraciones y se dejaron en la solución por 12h, y el último cambio a 96%, se dejo durante 24h; cada uno de los cambios se aceleraron con bomba de vacío, a continuación se realizó el aclarado de las muestras utilizando xileno, se realizaron 3 cambios cada uno de 24h que también fueron acelerados con la bomba de vacío, después se realizó la imbibición de las muestras en parafina dejándolas durante 24h entre 56 a 58OC, se procedió a la confección del bloque de parafina, y a continuación los cortes en el micrótomo (Sass, 1968). Para la coloración, las muestras ya montadas en las laminas se desparafinaron durante ½ hora en horno a 56

OC, se sumergieron en xileno 10min, después dos veces en etanol al 96% durante 3min en cada cambio, luego se dejaron en safranina durante 24h, se lavaron con agua, se sumergieron en etanol al 96% 10seg, y en “fast green” 30seg, en y por última vez se sumergieron dos veces en etanol al 96% y en xileno una vez; las laminillas se fijaron con resina sintetica (Strittmatter, 1979).

3.2. Fase dos: inoculación del microorganismo en plantas de rosa var. Charlotte bajo condiciones de invernadero.

3.2.1. Propagación.

El inóculo se elaboró a partir de muestras de foliolos esporulados recolectados en las plantas de rosa cultivadas en el invernadero sin aplicaciones de fungicidas. Para la propagación se utilizaron microplacas de 6 pozos, los cuales se llenaron con 3ml de agua destilada, para obtener una cámara húmeda; posteriormente se tomaron foliolos de rosa jóvenes y sanos provenientes del invernadero de la Facultad de Agronomía, que se cortaron en discos de 2,5cm de diámetro y se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% por 5min, se enjuagaron en agua destilada, luego se secaron y se ubicaron sobre su haz en cada uno de los pozos (Fig. 1); cada foliolo se inoculó en 4 puntos con 3µl de una suspensión de 106 esporangios/ml, luego se llevaron por espacio de 10 días a un fitotrón,

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calibrado a una humedad relativa de 72%, temperatura entre 18-22 oC, bajo luz y a 10-14oC bajo oscuridad, con un fotoperiodo de 12 horas.

Figura 1. Microplaca de propagación.

3.2.2. Prueba de marcación del inoculo con blanco de calcoflúor.

Para realizar el seguimiento del avance del hongo en la planta a partir de la inoculación y diferenciar entre lesiones causadas por el hongo inoculado y posibles infecciones provenientes de campo, se marcaron los esporangios con una solución de fluorocromo a una concentración de 50% usando como solvente agua destilada, y se sometieron a diferentes tiempos de marcación con el calcoflúor, posteriormente se realizaron pruebas de lavado del inóculo marcado.

La metodología que se realizó fue la siguiente: para cada una de las pruebas que se presentan en la Tabla 1, se tomaron 200µl del inóculo, luego se centrifugó a 5000rpm durante 10min, se eliminó el sobrenadante y se completó con el reactivo (al 50%) hasta 200µl, y cada uno de los tiempos establecidos se dejó incubando bajo oscuridad, posteriormente para eliminar los excesos de reactivo, las muestras se sometieron a lavados se centrifugaron 3 veces a 5000rpm durante 10 minutos cada lavado; todos los lavados se resuspendieron en 200ul de agua destilada; el calcoflúor se adhiere a los polisacáridos de quitina y celulosa presentes en la pared celular del hongo.

Para cada una de estas pruebas el inóculo se propagó con el fluorocromo según la metodología descrita en el numeral 3.2.1. Posteriormente a la inoculación se conoció el periodo de latencia, mediante observaciones de cada uno de los tratamientos bajo estereoscopio y el marcaje macroscópicamente con luz UV, y se realizaron montajes para observar la fluorescencia del microorganismo con microscopio de fluorescencia marca Leitz ergolux L03-10; el tipo de fluorocromo es “Evans blue” el cual es observado bajo el filtro de emisión UV de 450nm y el filtro de excitador de 365nm bajo oscuridad, la intensidad de la fluorescencia emitida por el microorganismo propagado con el fluorocromo se comparó cualitativamente con un control positivo (microorganismo marcado directamente con el reactivo). El tratamiento más efectivo en la marcación del

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microorganismo fue seleccionado para las pruebas que se realizaron sobre plantas de rosa cultivadas en invernadero.

3.2.3. Presencia del microorganismo en el invernadero.

Antes de realizar las pruebas de inoculación y con el fin de evaluar la presencia del microorganismo en el ambiente del invernadero, se colocaron durante 24 horas sobre algunas plantas de la rosa (extremos y zona central de la cama) a una altura de 5 cm del foliolo apical, 3 láminas portaobjeto cubiertas con gelatina sin sabor, y una vez retiradas se observaron bajo microscopio óptico, con el fin de conocer la presencia de esporangios como posible fuente de inóculo del agente causal de la enfermedad de acuerdo con la metodología propuesta por Sierra (2005).

3.2.4. Prueba preliminares de inoculación.

Para esta prueba se selecciono el mejor tratamiento de la prueba de marcación del inóculo con blanco de calcoflúor Con el fin de observar el avance del microorganismo inoculado en el foliolo hacia el tallo, se realizaron dos pruebas de inoculación, una por inmersión del foliolo apical (en 2ml de inoculo) y otra mediante gota suspendida en foliolo (5ul) y para observar el avance de tallo a foliolo se realizaron dos pruebas mediante gota suspendida (5µl), una realizando punción y otra sin herida; cada uno de los tratamientos se realizó por triplicado. Además, para proporcionar un ambiente adecuado que permitiera el proceso de germinación y penetración del microorganismo y evitar la diseminación del inoculo hacia otros sitios o plantas, se elaboraron cámaras húmedas con cilindros de acetato cubiertos con bolsas plásticas previamente esterilizados; a estas cámaras se les proporcionó una rejilla en la parte superior que permaneció cubierta durante 5 días para aumentar la humedad ambiental; posteriormente se retiró la cubierta para evitar el exceso de agua y permitir el establecimiento del microorganismo y desarrollo de la enfermedad. A las 3 semanas de la inoculación se tomaron muestras de los tejidos inoculados, a los cuales se les observó la presencia de síntomas hacia los tejidos superiores e inferiores del punto de inoculación, y de acuerdo con la observación macroscópica se realizaron cortes a mano alzada desde el punto de inoculación y en diferentes sitios donde se observaron los posibles síntomas de la enfermedad; posteriormente los cortes se observaron bajo microscopio de fluorescencia

3.2.5. Inoculación.

A partir del mejor tratamiento de inoculación en invernadero, se realizaron las inoculaciones en foliolos y en tallos sobre 18 plantas aparentemente sanas (9 para foliolos y 9 para tallos), paralelamente se inocularon con agua destilada 18 plantas como controles. Los tratamientos se evaluaron de acuerdo con el periodo de incubación o la aparición de los primeros síntomas, para tal fin se tomaran al azar, cada 8 días durante 3 semanas, muestras de 3 tallos y 3 foliolos, para de esta manera evaluar la presencia y avance del microorganismo hacia los tejidos superiores o inferiores de acuerdo con el tejido inoculado.

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Durante el tiempo del ensayo se registró la humedad relativa y la temperatura usando un higrotermografo Cole – Parmer modelo 8368-00.

4. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1. Fase uno: Evaluación de muestras de plantas de rosa var. Charlotte con sintomatología característica de la enfermedad en campo. 4.1.1. Cortes a mano alzada. Sobre el material vegetal afectado con el microorganismo, se detectaron los síntomas característicos de la enfermedad en tallos (Fig. 2a y 2b) y en foliolos (Fig. 2c), al realizar los cortes a mano alzada de cada uno de tejidos afectados y teñirlos con azul de lactofenol, se encontraron en los foliolos esporulados las estructuras asexuales del microorganismo (esporangioforos y esporangios), en los foliolos que presentaban síntomas avanzados de la enfermedad (lesiones necróticas) se encontraron las estructuras sexuales del microorganismo (oosporas), no registradas anteriormente en el país. Las estructuras sexuales conocidas como oosporas se encontraron solamente en los cortes de tallos que presentaban sobre crecimientos o pústulas (Fig. 2d), y que se colorearon con azul de lactofenol, estas estructuras se observaron debajo de la epidermis o en medio del colénquima y la epidermis; en algunos tallos se observó esporulación sobre estas pústulas (Fig. 2e y 2f). En los tallos rajados no se observaron estructuras del microorganismo y se observó que el tejido del colénquima se encuentra levantado y necrosado.

4.1.2. Evaluación de muestras para procesamiento mediante microtomía

Los foliolos seleccionados presentaron características como: encorvamiento, presencia de coloraciones pardas, lesiones necrosadas y esporulación por el envés, que provenían de las plantas de rosa del invernadero sin aplicaciones, y donde la enfermedad y los síntomas descritos fueron más frecuentes. En el invernadero sin aplicaciones además se encontraron tallos con la sintomatología característica de moteados, pústulas o ampollas blancas (todos ellos presentando moteado) y agrietamientos longitudinales.

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Figura 2. Síntomas esporulación y cortes a mano alzada: a. Tallo con ampollas, b. Tallo rajado con ampollas, c. Foliolo esporulado por el envés, d. Oosporas bajo epidermis (100X), e. Formación de esporangioforo dicotómico sobre epidermis en corte transversal de tallo con pústulas (40X), f. Corte transversal de tallo esporulado sobre pústulas (10X).

4.1.3. Microtomía por imbibición en parafina. En los cortes realizados mediante esta técnica se encontró que los foliolos que presentaron los síntomas característicos se vieron afectados en la epidermis abaxial; además fue posible observar que en las muestras con síntomas de encorvamiento (síntoma menos avanzado) no presentaron estructuras del microorganismo, mientras que en los que se encontraban deformes y con coloraciones parduzcas presentaban esporangioforos y esporangios deshidratados; y en los foliolos necrosados se observo la presencia de esporangioforos, esporangios y oosporas (Fig. 3a) (Tabla. 1).

a.

b.

c.

d.

e.

f.

10µm

10µm 100µm

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En los tallos se identificó su composición histológica y su relación con el microorganismo. De esta manera se encontró que en los tallos con moteados se presentaron estructuras similares a “costras” pardas ubicadas sobre la epidermis (Fig. 3b), también en el colénquima se observaron oosporas. De igual manera en los tallos con ampollas se observaron oosporas (Fig. 3c), redondeadas, granuladas de un color rojo intenso generalmente ubicadas en grupos y bastante unidas a manera de racimos (Fig. 3d), algunas veces se localizaron entre la epidermis y el colénquima, otras fuera del tallo (Fig. 3e); también se observaron oogonios y anteridios ubicado bajo la epidermis (Fig. 3f). En los tallos rajados el tejido afectado correspondió a la epidermis, que se encontró levantada, llegando a afectar el colénquima y parénquima, y en algunos casos el esclerénquima. En ninguno de estos tallos se observaron estructuras del microorganismo, como se observa en la Tabla. 2.

Tabla 1. Foliolos procesados por microtomía

(a) Epidermis adaxial, (b) Parénquima en empalizada, (c) Parénquima esponjoso, (d) Epidermis abaxial, (e) Estomas. An-Oo. Anteridio- oogonio, Os. Oospora, Epg. Esporangio, Epf. Esporangioforo

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Tabla 2. Tallos procesados por microtomía.

(a) Cutícula, (b) Epidermis, (c) Colénquima, (d) Parénquima, (e) Esclerénquima (f) Haz vascular (g) Parénquima almacenador. An-Oo. Anteridio- oogonio, Os. Oospora, Epg. Esporangio, Epf. Esporangioforo. CMT. Tallo moteado sin aplicaciones, CPT. Tallo con pústulas sin aplicaciones, CRT. Tallo rajado sin aplicaciones, AT. Tallo con aplicaciones.

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Figura 3. Estructuras observadas bajo la tecnica microtomia por imbibicion en parafina: a. Oosporas sobre epidermis abaxial en corte transversal de foliolo necrosado (10X), b. Costras Sobre cutícula en tallo moteado (10X), c. Oosporas entre cutícula y epidermis en tallo con pústulas (100X), d. Acercamiento de Oosporas en grupos bajo cutícula en tallo con pústulas (40X), e. Oosporas en racimo en corte transversal de tallo con pústulas (40X), f. Anteridio y oogonio ubicado entre epidermis y colénquima en tallo con pústulas (40X).

4.2. Fase dos: inoculación del microorganismo en plantas de rosa var.

Charlotte bajo condiciones de invernadero.

4.2.1. Prueba de marcación del inóculo con blanco de calcoflúor.

En la propagación del inoculo se observaron solo las estructuras asexuales, pero en las microplacas de propagación que se dejaron 5 días más de lo establecido bajo el fitotron, se observaron las estructuras sexuales del microorganismo fig. 4a y 4b. en microscopia realizando cortes directos. Como se observa en el anexo 1 en la columna de tratamientos los números impares corresponden a los tratamientos lavados y los pares corresponden a

c.

d.

e.

f.

a.

b.

100µm 100µm

10µm 25µm

25µm 25µm

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los tratamientos no lavados, estos van de 0 a 2.5 horas aumentando 0.5 horas cada tratamiento, a partir de estos métodos se encontró que en los tratamientos no lavados no se observaron estructuras del microorganismo como anteridios, oogonios y oosporas, mientras que en los lavados se presentaron esporangios; la fluorescencia del microorganismo se midió cualitativamente tanto macroscópicamente al someter la microplacas con los foliolos a luz UV bajo oscuridad, como microscópicamente bajo microscopio de fluorescencia comparando con la marcación directa del microorganismo esporulado sobre el foliolo y se observó que la intensidad fue mucho menor en los tratamientos no lavados como se observa en el anexo 1. Un indicador muy importante el cual fue crucial para definir cual tratamiento era el mejor, fue el porcentaje de esporulación que se midió de acuerdo al número de foliolos esporulados por microplaca, comparando con la esporulación del microorganismo sin marcar con el fluorocromo ya que tanto el tiempo de exposición del microorganismo al reactivo como el lavado o no influyeron en este, obteniéndose siempre un mayor porcentaje de esporulación en los tratamientos lavados, que en los no lavados; con el mismo tiempo de exposición, se observó que los tratamientos que igualaron el porcentaje de esporulación del control fueron el tratamiento 3 y el 5 correspondientes a lavado 0.5 horas y lavado 1 hora respectivamente, sin embargo la fluorescencia, fue más intensa en el tratamiento de 1 hora, por lo tanto este se eligió para marcar el inóculo. En la fig. 5a y 5b se observa el inoculo marcado con calcoflúor bajo microscopio de fluorescencia antes de inocular.

Figura 4. Estructuras sexuales de Peronospora sparsa: a. Oosporas (10X), b. oogonios y anteridos (50X) (imagen tomada del microscopio de fluorescencia Leitz ergolux L03-10, filtro de emisión UV de 450nm y el filtro de excitador de 365nm, bajo luz).

4.2.2. Prueba de microorganismo en ambiente.

Se pudo observar que no hubo presencia de esporangios de P. sparsa en el ambiente del invernadero en la semana anterior a la inoculación, dado que en las láminas colocadas en el follaje de las plantas, no se detectaron esporangios del microorganismo, por lo tanto las inoculaciones puntuales en las plantas expuestas a cámara húmeda tuvieron éxito ya que la enfermedad no se propagó a otras plantas, de esta manera los síntomas obtenidos en cada uno de los tallos inoculados corresponden a las inoculaciones dirigidas y no a la

a. b.

20µm 100µm

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infección por inóculo del microorganismo presente en el ambiente. En los Anexos 2 y 3 se presentan las esporas de otros microorganismos encontradas a lo largo del ensayo.

4.2.3. Prueba de inoculación en invernadero. Cuando los esporangios de P. sparsa previamente marcado, se inocularon sobre los foliolos, mediante el método de inmersión, no se presentaron síntomas de la enfermedad; tampoco fue posible observar su penetración y desarrollo en los cortes realizados para determinar la presencia del microorganismo en los tejidos internos; sin embargo en los inoculados mediante gota suspendida se observaron síntomas de encorvamiento del foliolo y lesiones parduzcas tanto en el punto de inoculación como en la parte superior del sitio inoculado, pero no en los tejidos inferiores correspondientes a peciolo y tallo; en los cortes realizados a partir de las lesiones iniciales, se observaron esporangioforos y esporangios (Fig. 5c).

a.

b.

c.

d.

b.

20µm 20µm

20µm

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Figura 5. Observaciones en prueba de inoculacion (imágenes a, b y c tomadas con camara sony DSC-S650, usando un microscopio de fluorescencia Leitz ergolux L03-10): a. y b. esporangioforos y esporangios en inóculo marcado con calcoflúor bajo microscopio de fluorescencia antes de inocular, 50x. c. Esporulación en envés del foliolo inoculado por gota suspendida marcado con calcoflúor bajo microscopio de fluorescencia, 50x d. Tallo que desarrolló síntomas de moteado una vez inoculados por punción, e. Macroscopía de peciolo: síntomas y esporulación. f. Esporangioforo en peciolo 100X (imagen tomada del microscopio de fluorescencia Leitz ergolux L03-10, filtro de emisión UV de 450nm y el filtro de excitador de 365nm, bajo luz).

En los tallos inoculados, los síntomas presentaron coloraciones rojizas (moteados) (Fig. 5d) y en algunos casos se encontraron esporulados; sobre algunos segmentos, los síntomas desde el punto de inoculación, presentaron un mayor avance ascendente que descendente localizados hacia el peciolo inmediatamente superior (Fig. 5e), llegando hasta los foliolos (Anexo 4). Al realizar los cortes en los tallos moteados de color purpura se observaron sobre la epidermis, estructuras similares a costras. No se presentaron diferencias marcadas en cuanto a punción o no punción al inocular el tallo, por lo tanto los métodos de inoculación elegidos para la inoculación en campo fueron gota suspendida en foliolo e inoculación en tallo mediante gota con punción y sin punción. 4.2.4. Inoculación en invernadero.

El periodo tanto de incubación como de latencia se observo en las hojas inoculadas con gota suspendida, se presentó hacia la tercera semana de la inoculación; la esporulación ocurrió en el envés, acompañado de coloraciones pardas; en las observaciones de los tejidos inoculados realizadas bajo microscopio de fluorescencia se encontraron esporangios en las dos primeras semanas de la inoculación, se presume que corresponden a los esporangios inoculados, y solo hacia la tercera semana se observaron nuevos esporangios y esporangioforos (Fig. 6a), etapa que coincide con la esporulación observada macroscópicamente; el tejido lesionado corresponde a la epidermis abaxial, que al ser comparada con tejidos sanos presentó diferencias en su estructura (Tabla 3).

En los tallos inoculados con punción se observaron coloraciones rojizas a partir de la semana dos, inicialmente fue localizada y abarcó un total de 3cm (1cm hacia arriba, 2cm hacia abajo), y más extendida en la semana 3 que alcanzó un total de 6.7cm (5cm hacia arriba y 1,7cm hacia abajo) (Fig. 6b) En los tallos inoculados sin punción se observaron macroscópicamente las mismas coloraciones a partir de la semana 2 abarcando un total

e. f.

10µm

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de 2,8cm (1,3cm hacia arriba y 1,5cm hacia abajo); la coloración rojiza encontrada hacia la tercera semana de observación alcanzó un total de 6.5cm (4,7cm hacia arriba y 1,8cm hacia abajo). Microscópicamente se encontró en todos los tallos fluorescencia en el punto de inoculación, en la gran mayoría se encontraron los esporangios inoculados (Fig. 6c) y solo en uno sin punción se encontraron esporangioforos, también se observaron estructuras sin definir en los tallos con y sin punción. Los tejidos vegetales afectados fueron tanto en los tallos con y sin punción, la cutícula, la epidermis, el colénquima y el parénquima, tanto la epidermis como el colénquima y el parénquima se observaron afectados a partir de la segunda semana de la inoculación (Fig. 6d), (Tabla 4).

Figura 6. Resultados de la inoculacion en invernadero (imágenes tomadas con camara samsung (EC-L110ZRBB/E1), a ,c y d usando microscopio de fluorescencia Leitz ergolux L03-10): a. esporangios sobre epidermis abaxial en foliolo (50X). b. coloraciones pardas extendidas en tallo inoculado con punción en semana 3, c. Esporangios inoculados en tallo (50X). d. Tejidos afectados en tallo: Cutícula, Epidermis, colénquima, parénquima (50X).

a.

c.

d.

b.

20µm

20µm 20µm

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Tabla 3. Resultados inoculación en invernadero de foliolos.

(A) coloraciones pardas, (B). necrosis- encorvamiento, (C). esporulación en envés; An- oo. Anteridio - oogonio, os. Oospora, epg. Esporangio, epf. Esporangioforo; (a). epidermis adaxial, (b). parénquima empalizada, (c). parénquima esponjoso, (d). epidermis abaxial, (e). estomas.

Tabla 4. Resultados inoculación en invernadero de tallos.

(A). coloraciones rojizas, (B). Pústulas, (C). Rajado; an- oo. Anteridio – oogonio , o . Oospora, epg. Esporangios, epf. Esporangioforos. Todas las inoculaciones tuvieron fluorescencia en el punto de inoculación al ser observadas microscópicamente; (a). Cutícula, (b). Epidermis, (c). Colénquima, (d). Parénquima, (e).

Esclerénquima, (f) haz vascular, (g). Parénquima almacenador.

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4.2.5. Condiciones ambientales En el registro de las condiciones ambientales en campo se observa la relación entre el desarrollo del microorganismo y los datos de temperatura (°C) (Anexo 5) y humedad relativa (%) (Anexo 6) obtenidos durante los 21 días de evaluación, los cuales permitieron establecer que tanto la temperatura como la humedad relativa promedio están correlacionadas con el desarrollo de la enfermedad; pues la temperatura promedio fue alta, pero se equilibro con la alta humedad que se presento. La máxima temperatura (33°C) se obtuvo sobre el día 6 de la prueba y la temperatura mínima (19°C) se obtuvo en los días 11 y 15 de la evaluación, para obtenerse una temperatura promedio de24°C. La humedad relativa fue alta en toda la prueba alcanzando hasta 100% de humedad, sin embargo se presentaron días soleados y calurosos (día 2 y 16) donde la humedad relativa bajo a 45%, la humedad relativa promedio se encontró en 85%, condiciones climáticas que de acuerdo con los estudios realizados permiten el desarrollo de la enfermedad. 4.3. Discusión Correspondiente a la evaluación de muestras de plantas de rosa var. Charlotte con sintomatología característica de la enfermedad en campo, se encontraron tallos y foliolos con la sintomatología característica descrita por Gómez (2004), sin embargo en las muestras tomadas en las plantas sin aplicaciones químicas la sintomatología se observó más avanzada y la incidencia de la enfermedad fue mayor; como información relevante se encontraron las estructuras del agente causal de la enfermedad y se logro recrear el ciclo del microorganismo al observar las estructuras sexuales, los gametangios femenino (oogonio) y masculino (anteridio), adosado uno al otro, además de oosporas en foliolos necrosados y en tallos con coloraciones pardas (moteado) y pústulas blancas; se observaron oosporas recién formadas y maduras caracterizadas por presentar un color marrón y una pared oscura, que al compararlas con las jóvenes, presentan una pared externa gruesa, ondulada y hialina tal como las describe Danielsen (1999) para P. farinosa en quinua. También se observó que los esporangioforos dicotómicos se producen a partir de las oosporas presentes en las pústulas blancas encontradas sobre la cutícula de los tallos; la producción de esporangios ocurre cuando se presentan las condiciones adecuadas para su esporulación. En los tallos rajados no se encontró el microorganismo, ya que este tejido se encuentra lignificado y necrosado y el hábitat del microorganismo son las células vivas de tejidos jóvenes, sin embargo en algunas oportunidades se encontró que sobre los tallos ubicados en el tercio medio se presentaron simultáneamente pústulas y cuarteamiento de la corteza con abundantes oosporas maduras; de acuerdo con Montes (2009), para mildeos como Peronospora se ha encontrado un decrecimiento en la eficiencia del inoculo esporangial a medida que la planta madura, por lo tanto este comportamiento puede explicar la presencia de oosporas en estos tejidos ya que no cuenta con las condiciones necesarias para el desarrollo de la enfermedad, y le permite sobrevivir para posteriormente iniciar nuevos ciclos de infección. En la prueba de marcación con calcoflúor, se han realizado trabajos donde se usa como un marcador directo en varios mildeos (Hughes. et al. 1975; Rohringer. et al, 1977; Cohen. et. al, 1987) aunque existen estudios previos de marcaje de inóculo en Botrytis cinerea en mora de castilla (Molina y Forero, 2004) a bajas concentraciones y con un mayor tiempo de exposición, en esta investigación se quiso evaluar una prueba de marcación más rápida, con mayor concentración para determinar el menor tiempo

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requerido de exposición al fluorocromo para su marcaje; los lavados en la prueba de marcación de inoculo con blanco de calcoflúor, se realizaron con el fin de evitar que el fluorocromo marcara el tejido vegetal, que al igual que P. sparsa contiene celulosa; la pared de los oomycetes contienen glucanos y quitina (Kortekamp A. 2005), el fluorocromo se adhiere no solo a los B-glucanos (celulosa) de la pared celular (Bessire M. et. al. 2007) sino también a la quitina( Kortekamp A. 2005), lo que permite la observación bajo el microscopio de fluorescencia; sin embargo también se encontró una autofluorescencia producida por las células vegetales, siendo esta débil en las células sanas y más intensa en las células afectadas (necrosadas) por el microorganismo (Rohringer et al, 1977). Sobre la inoculación de las plantas en invernadero es necesario mencionar que en estudios realizados en la sabana de Bogotá, Romero (2005) encuentra que un ambiente húmedo es clave para el progreso de la enfermedad, y observa un mayor desarrollo con menor temperatura y mayor humedad, sin embargo de acuerdo con Montes (2009) los periodos de humedad relativa alta puede compensar una temperatura no optima para el desarrollo del microorganismo. En condiciones favorables, con una humedad mínima entre 69 -76% y una temperatura máxima de 21-23ºC se ha presentado esporulación a los 3 días de la inoculación y necrosis de los foliolos a los 7 días (Romero, 2005). En este estudio se observó que tanto el periodo de incubación como de latencia se presento en la tercera semana post inoculación; en los 12 ddi la temperatura promedio mínima fue de 28ºC llegando hasta 33ºC y la humedad relativa promedio se mantuvo entre 70 y 85%, estas condiciones iníciales no son las adecuadas para la germinación y penetración del microorganismo ya que esta temperatura es muy alta. La mayor humedad y menor temperatura en el estudio se presentó alrededor del día 13 donde la temperatura máxima fue de 24ºC y al humedad relativa de 100%, los días posteriores hasta el fin del ensayo la temperatura promedio no supero los 26ºC y la humedad se encontró por encima del 70 %. Si se tiene en cuenta que las observaciones se realizaron cada 7 días, las consideraciones anteriores permiten explicar la expresión de signos y síntomas solamente en la tercera observación ya que en las lecturas anteriores solo se encontró el inóculo previamente colocado, comportamiento diferente a lo que sucede con las esporas asexuales de los mildeos vellosos de gramíneas, que son efímeras y mueren dentro de las primeras horas después de su madurez, incluso bajo condiciones frescas y de humedad y por lo tanto es necesario una rápida dispersión (Jegera, 1998); los esporangios de P. sparsa mostraron una amplia sobrevivencia en cámara húmeda hasta encontrar las condiciones adecuadas para su germinación. En trabajos recientes se ha encontrado que el período de latencia (aparición de signos) en foliolos, puede ser más corto que el período de incubación (aparición de síntomas) (Romero, 2005), lo cual coincidió cuando el inoculo se produjo en el laboratorio, comportamiento que en el caso de las muestras tomadas en el cultivo de rosas no comercial fue diferente, se encontró que a pesar de presentarse los síntomas iníciales (encorvamiento y moteado), el microorganismo no tuvo la capacidad de reproducirse y expresarse en la superficie foliar abaxial donde se ubica. Sin embargo en la inoculación en campo solamente en la tercera observación se presentaron simultáneamente los signos y síntomas de la enfermedad, según Gómez (2004) la posible presencia de ciclos consecutivos del patógeno en las epidemias que ocurren en invernaderos comerciales impide ver con claridad la duración de los periodos de latencia, situación que permite explicar la expresión clara de los síntomas y signos solamente a partir de la tercera lectura.

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Por otro lado en los tallos el primer síntoma observado fue la aparición de moteado que se manifestó a partir de la segunda semana de la inoculación y el periodo de latencia, aunque no se observó en la inoculación final, en las pruebas de calibración se observó a la tercera semana. En la inoculación final los foliolos afectados por el microorganismo P. sparsa, empiezan a presentar coloraciones pardas, las cuales son debidas a las fitoalexinas, isoflavonoides (Ibraheem et. al., 2010), tanto estos cambios como los moteados en las células de plantas invadidas por microorganismos son producidos por cambios en la composición de su membrana y un redireccionamiento de su metabolismo en respuesta al parasitismo (Nicole . et. al., 2001). Las antocianinas se caracterizan por tener una coloración rojiza, azul y purpura, que pueden ser observadas en varios tejidos de plantas (flores y frutos) incluso en tallos y foliolos, además son pigmentos hidrosolubles derivados de los flavonoides por la ruta metabólica del acido shikimico, pueden generarse durante el desarrollo de una planta, aparecer solo en la fase juvenil, ser permanentes, o desarrollarse en tejido senescente; también por el estrés causado por fotoinducción, bajas temperaturas, estrés osmótico (Linda,1999), coloraciones que fueron frecuentes durante el desarrollo de la investigación. La aparición de pústulas o ampollas de color blanco, encontradas, durante la recolección de tejidos vegetales fueron similares a las encontradas por Gómez (2004) los cuales no se habían relacionado anteriormente con la enfermedad; se observó que en estas lesiones se encuentran las estructuras sexuales del microorganismo, a pesar de lo afirmado por Arbeláez, (1999), sobre la ausencia de oosporas en los cultivos de rosa de la sabana de Bogotá, pero sí habían sido observadas en mora de Castilla por Forero de La-Rotta (2001). La formación o no de oosporas depende en gran medida de las condiciones ambientales favorables para su desarrollo, su producción ocurre cuando se presentan temporadas de marcada sequía (Jegera, 1998) razón por la cual se encontraron en las muestras recolectadas en los dos invernaderos monitoreados; de acuerdo con la información suministrada por el IDEAM, durante el mes de Junio de 2009, época en que se recolectó el material vegetal, se presentó el fenómeno del niño. Además se pudo observar que durante la inoculación en invernadero no se observaron estas estructuras, sin embargo al inocular en invernadero plantas a las que no se les proporciono una humedad relativa alta, sobre los tallos aparecieron síntomas de moteado y posteriormente presentaron pústulas, lo cual confirma lo anterior. Por otro lado algunas de las muestras recolectadas con pústulas, se sometieron a cámara húmeda en laboratorio observándose al cabo de cinco días, esporulación sobre los abultamientos, estas condiciones pudieron facilitar su germinación y de esta manera se logro observar la formación de estructuras asexuales, esporangioforos y esporangios a partir de las lesiones que contenían las estructuras sexuales. De acuerdo con Romero (2005) la penetración del microorganismo en foliolos ocurre en forma directa a través de la cutícula y epidermis, sin embargo sobre la inoculación en los tallos no se encuentra algún trabajo de investigación que mencione la penetración de P. sparsa a través de heridas, razón por la cual al evaluar la inoculación con y sin punción, se encuentra que las dos fueron igualmente efectivas ya que se observó en ambos casos el desarrollo de la enfermedad, lo cual demuestra que el microorganismo es capaz de penetrar directamente en el tallo. La inoculación puntual con gota suspendida, tanto en los tallos como en los foliolos permite evaluar el avance de P. sparsa a partir del sitio de inoculación. Según Gómez (2004) en cortes transversales de tallos jóvenes con esporulación, sólo se evidencia micelio del patógeno a nivel del parénquima cortical y del parénquima de

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empalizada , sin embargo en este estudio sobre los tallos esporulados se observaron igualmente afectados el colénquima y parénquima, mientras que en tallos con pústulas, en todas las muestras analizadas, solo se observó la epidermis y el colénquima afectado, y en foliolos los tejidos afectados corresponden a la epidermis abaxial. En relación con la marcación de los microorganismos con calcoflúor, Rohringer (1977) menciona en su trabajo con Puccinia graminis, que algunos tejidos sanos de las plantas pueden presentar una ligera autofluorescencia que es posible diferenciarla de las células afectadas, ya que las colonizadas por los microorganismos producen una fluorescencia mayor, lo cual pudo ser comprobado en este trabajo. El avance vertical del microorganismo en tallos se observó en ambas direcciones, hacia los tejidos superiores e inferiores; a las dos semanas de la inoculación avanzo 3 cm en total y en la tercera semana 6.5 cm, en la mayoría de los casos colonizó en mayor proporción los tejidos localizados hacia el peciolo superior, que hacia abajo del punto de inoculación) este avance se evidencio macroscópicamente por la longitud del síntoma de moteado y microscópicamente por la presencia de estructuras del microorganismo en los tejidos y la autofluorescencia del tejido afectado. En otros trabajos realizados en Colombia se ha encontrado que en los tejidos jóvenes de las plantas los síntomas de la enfermedad se manifiestan más rápido que en los leñosos; de esta manera en el tallo inoculado el mayor avance presentado después de tres semanas fue de 2cm hacia abajo, lo cual comprueba que el microorganismo coloniza más rápido los tejidos blandos o más jóvenes; cuando el avance llegó al peciolo, alcanzo a afectar los foliolos, mientras que en los foliolos inoculados, no hubo un avance hacia otros tejidos después de las tres semanas de la evaluación. El microorganismo se localiza en tejidos del colénquima a medida que avanza en los tallos, cambios que se manifiestan como moteados ocasionados por la acumulación de antocianinas, como consecuencia de la alteración en los procesos fisiológicos, síntomas que se observaron durante las semanas de evaluación sobre la efectividad de la inoculación.

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Aunque en mildeos como el del opio (Peronospora arborescens), se ha encontrado que los esporangios formados sobre plantas infectadas por oosporas, son efectivos en la producción de infecciones locales secundarias, que más tarde se vuelven sistémicas, manifestando o no síntomas, (Montes, 2009), en esta investigación con el mildeo velloso (P. sparsa) en rosa, al usar como inóculo los esporangios o estructuras asexuales, se encontraron indicios de que el microorganismo puede ser sistémico, dado que no se limitó a desarrollarse en el lugar de penetración, sino que colonizó los tejidos superiores e inferiores cuando la inoculación se realizó en tallos. Sobre plantas de rosa cultivadas en el invernadero con aplicaciones químicas, se encontraron con menor frecuencia y severidad tanto en tallos como en hojas síntomas de la enfermedad, sin embargo presentaron el estado sexual o las oosporas típicas del microorganismo, que además le dan resistencia a condiciones adversas del medio, situación que es posible por el estricto control químico que se implementa en este tipo de invernaderos. Por otro parte es posible que las oosporas se conviertan tanto en inóculo primario como secundario del ciclo de la enfermedad, de esta manera si se presentan las condiciones medio ambientales adecuadas para su inicio, como alta precipitación y días

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soleados (frecuentes en la sabana de Bogotá) existen altas posibilidades de iniciarse una epidemia, lo cual presiona a los productores al manejo inadecuado de la enfermedad, ya que no permite la su erradicación de las diferentes estructuras reproductivas, pero que si conduce a su sobrevivencia para iniciar ciclos permanentes de la enfermedad. De acuerdo con los resultados de la investigación, se registra por primera vez en el país la presencia del mildeo velloso (P. sparsa) formando sobre plantas de rosa, estructuras sexuales, oogonios, anteridios y oosporas, anteriormente solo se habían observado esporangioforos y esporangios. Es importante dar a conocer esta información al sector floricultor que se especializa en cultivos de rosa bajo invernadero, ya que es frecuente que en la Sabana de Bogotá se presenten las condiciones adecuadas para el desarrollo de la enfermedad, además al conocer totalmente el ciclo del microorganismo y su relación con los síntomas en las planta es posible conocer la reacción del patógeno frente al manejo que se le está dando a la enfermedad en los cultivos, y si se cuentan con los recursos necesarios, se justifica plenamente implementar métodos que permitan manejar la enfermedad en estados tempranos de desarrollo, mediante podas oportuna de los tejidos que presenten los primeros síntomas de la enfermedad como la aparición de los síntomas patrones de acumulación de antocianinas, manifestados por la aparición de moteados en los tallos.

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25

7. ANEXOS

ANEXO 1. Resultados Tiempos de marcación del microorganismo con el fluorocromo blanco de calcoflúor.

Tratamiento Esporulación* (%)

Fluorescencia macro

Fluorescencia micro

Estructuras microscópicas

Oospora Oogonio Anteridio Esporangio

+ -------- +++++ +++++ + + + +

- 83.3 -------- --------- + + + +

1 66.6 +++ + + + + +

2 66.6 ++++ ++ - - - +

3 83.3 +++ +++ + + + +

4 66.6 ++++ ++ - - - +

5 83.3 +++ ++++ + + + +

6 33.3 ++++ ++ - - - +

7 50 +++ ++++ + + + +

8 16.6 ++++ ++ - - - +

9 33.3 +++ ++++ + + + +

10 16.6 ++++ ++ - - - +

11 33.3 +++ ++++ + + + +

12 16.6 ++++ ++ - - - +

(-) Control negativo: sin calcoflúor, (+) control positivo: marcado directamente, *numero de foliolos esporulados por microplaca.

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ANEXO 2. Esporas encontradas en láminas atrapa esporas

Ubicación de las laminas en la cama: (3) extremo inicial, (2) centro, (1) extremo final.

ANEXO 3. Esporas encontradas en lamina atrapaesporas.

a. Sphaerotheca pannosa, b. Nigrospora, c. Phragmidium disciflorum, d. Cladosporum (100X)

Lamina Semana 0 Semana 1 Semana 2 Semana 3 1 Sphaerotheca Nigrospora

Sphaerotheca

Nigrospora Sphaerotheca

Nigrospora Phragmidium Sphaerotheca

2 Cladosporium Phragmidium Sphaerotheca

Chaetomium Nigrospora

Chaetomium Epicoccum Nigrospora Phragmidium Sphaerotheca

Nigrospora Phragmidium Sphaerotheca

3 Phragmidium Sphaerotheca.

Chaetomium Nigrospora Phragmidium Sphaerotheca

Chaetomium Nigrospora Phragmidium Sphaerotheca

Chaetomium Nigrospora Phragmidium Sphaerotheca

a. b.

c. d.

10µm 10µm

10µm 10µm

27

ANEXO 4. Resultados prueba de inoculación en invernadero.

*Síntomas en foliolos (A): Presencia de coloraciones pardas en foliolos, (B): Lesiones necrosadas y encorvamiento del foliolo, (C): Foliolos esporulados por el envés. Síntomas en tallos (A): Presencia de coloraciones rojizas, (B): Presencia de pústulas o ampollas blancas, (C): Agrietamientos longitudinales en tejidos jóvenes. a. 2.5cm tallo y 4cm hacia el peciolo, foliolo esporulado. b. No síntomas evidentes peciolo moteado y esporulado ubicado a 2 cm hacia arriba de punto de inoculación, en el tallo no se observaron estructuras, estas solo se observan en el peciolo. c. Peciolo esporulado 2 cm y moteado ubicado a 1 cm hacia arriba de punto de inoculación, esporangioforos y esporangios en peciolo d. Los esporangios se observaron deshidratados en el punto de inoculación y se observó una “costra” sobre la epidermis. e. no tiene peciolo, presencia de costra sobre epidermis. f. se observa costra sobre epidermis

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ANEXO 5. Comportamiento de la temperatura (ºC) en los 21 días de seguimiento.

TIEMPO (DIAS)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

TEM

PE

RA

TUR

A (`

C)

18

20

22

24

26

28

30

32

34

TEMPERATURA MAXI. (`C)TEMPERARUA PROMEDIOTEMPERATURA MIN.

ANEXO 6. Comportamiento de la humedad relativa (%) en los 21 días de seguimiento.

TIEMPO (DIAS)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

HUM

EDAD

REL

ATIV

A (%

)

40

50

60

70

80

90

100

110

HUMEDAD RELATIVA MAX. (%)HUMEDAD RELATIVA PROMEDIOHUMEDAD RELATIVA MIN.