HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS -...
Transcript of HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS -...
iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS
Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,
dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk
telah saya nyatakan dengan benar
Nama : Sani Pradasari Afifah
NIM : 1112102000004
Tanda Tangan :
Tanggal : Ciputat, 22 September 2016
HALAMAN PERSETUJUAIY PEMBIMBING
Nama : Sani Pradasari Afifah
NIM :11121*2000004
Program Studi : Farmasi
Judul Skripsi :Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino
Hidroksiprolia Meagguaakan lV1etode Spektrofotometri
IIV-Vis
Disetujui oleh:
Pembimbing IdZilhadia. M.Si." Apt.
NrP. 1 9730 8222A0812A07
Pembimbing II
t,#Supandi.I\C,Si.. Apt.
NIP.
Mengetahui
Ketua Prodi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
^)4,Dr. Nurmeilis. M.Si.. Apt
NIP. 197404302005012003
iv Ulttl Syarif,Hidayatullah Jakarta
IIALAMAN PENGESAHAN
diaiukan oleh :Skripsi ini
Nama
NIM
Program Studi
Judul Skripsi
Pembimbing I
Pembimbing II
Penguji I
Penguji II
Ditetapkan di
Tanggal
: Sani Pradasari Afifah
:1112102000004
: Farmasi
:Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino
Hidroksiprolin Menggunakan Metode Spektrofotometri
tIV-Vis
Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterimasebagai bagian persyaratan yang diperlukan unfuk memperoleh gelarSarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran danIImu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
DEWA}{ PENGUJI
Zilhadia, M.Si., Apt.
Supandi, M.Si., Apt.
Drs.Umar Mansur, M.Sc., Apt
Nurhasni, M.Si.
Ciputat
22 September 2016
(
(
(
)
)
)
{@^ey-
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRAK
Nama : Sani Pradasari Afifah
NIM : 1112102000004
Program Studi : Farmasi
Judul :Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino
Hidroksiprolin Menggunakan Metode Spektrofotometri
UV-Vis
Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil modifikasi prolin yang dikatalisisoleh enzim prolil-4-hidroksilase (P4H) pada saat proses posttranslasi protein.Hidroksiprolin adalah salah satu asam amino yang terdapat dalam gelatin danmenjadi salah satu parameter kualitas gelatin. Selain itu hidroksiprolin juga dapatdigunakan sebagai parameter untuk khasiat pengobatan luka bakar. Dalampenelitian ini telah dilakukan validasi metode penetapan kadar asam aminohidroksiprolin menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Hasil validasimetode selanjutnya dapat digunakan untuk penetapan kadar hidroksiprolin dalamsampel gelatin. Proses analisis hidroksiprolin menggunakan reagen ehrlich (para-dimetilamino-benzaldehid), larutan oksidan (Chloramin-T-hidrat), NaCl,isopropanol, dan buffer asetat/sitrat pH 6. Parameter metode validasi dalampenelitian ini meliputi uji linearitas, uji batas deteksi, uji batas kuantitasi, ujiakurasi dan uji presisi. Berdasarkan hasil penelitian didapat panjang gelombangmaksimum hidroksiprolin yaitu 563,5 nm. Hasil kurva kalibrasi pada rentang 3-18ppm memiliki koefisien korelasi r=0,9991. Dan diperoleh persamaan regresiy=0,0312x-0,0026. Metode yang digunakan mempunyai batas deteksi 0,691 ppmdan batas kuantitasi 2,094 ppm. Metode analisis memiliki nilai presisi kurang dari±2% sedangkan nilai akurasi (% diff) yaitu -0,386%. Hasil analisis sampel gelatinmenunjukan semua sampel mengandung hidroksiprolin. Sampel pertamamengandung hidroksiprolin sebesar 8,277 ppm, sampel kedua mengandunghidroksiprolin sebesar 13,886 ppm, sampel ketiga mengandung hidroksiprolinsebesar 10,126 ppm, sampel keempat mengandung hidroksiprolin sebesar 17,038ppm dan sampel kelima mengandung hidroksiprolin sebesar 10,500 ppm.
Kata kunci : gelatin, hidroksiprolin, spektrofotometri UV-Vis.
vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRACT
Nama : Sani Pradasari Afifah
NIM : 1112102000004
Program Studi : Pharmacy
Judul : Validation of Analytical Method of Acid Amino
Hydroxyproline by Method Spectrofotometry UV-Vis.
Hydroxyproline is a modified amino acid (proline) catalyzed by the enzyme prolil-4-hydroxylase (P4H) during the process of posttranslation protein.Hydroxyproline is one of the amino acids contained in gelatin and became one ofthe quality parameters of gelatin. Besides, hydroxyproline can also be used as aparameter for the efficacy of the treatment of skin burns. This validation methodin this study used spectrophotometry UV-Vis. The validation result then can beused to assay hydroxyproline in gelatin. Hydroxyproline is analysed by ehrlichreagent (para-dimethylamino-benzaldehyde), oxidant solution (Chloramine-T-Hydrat), NaCl, isopropanol, and buffer acetat/citrate pH 6. Parameter validationmethod in the study include test linearity, test detection limit, test quantitationlimit, test accuracy and precision test. Based on the research results obtainedhydroxyproline maximum wavelength is 563.5 nm. The results of the calibrationcurve in the range of 3-18 ppm has a correlation coefficient r=0.9991. And theregression equation y=0,0312x-0,0026. The method used has a detection limit of0.691 ppm and limit of quantitation of 2.094 ppm. The method of analysis hasprecision values less than ±2% while the value accuracy (% diff) of -0,386%. Theresults showed all gelatin samples contained hydroxyproline. The first samplecontains hydroxyproline amounted to 8.277 ppm, a second sample containinghydroxyproline amounted to 13.886 ppm, third sample containing hydroxyprolineamounted to 10.126 ppm, a fourth sample contains hydroxyproline of 17.038 ppmand fifth samples containing hydroxyproline of 10,500 ppm.
Keywords : gelatin, hydroxyproline, spectrophotometry UV-Vis.
viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, rasa syukur serta pujian senantiasa kita panjatkan kehadirat
Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayat-Nya serta segala
anugerah-Nya berupa kesehatan, pemikiran dan ide sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini. Salawat serta salam semoga selalu tercurah kepada
junjungan Nabi Muhammad SAW, keluarga, serta para sahabat dan pengikutnya
yang senantiasa mengikuti sunnahnya hingga akhir zaman.
Skripsi ini penulis susun untuk memenuhi salah satu syarat menempuh
ujian akhir guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta. Adapun judul skripsi ini adalah “Validasi Metode
Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin Menggunakan Metode
Spektrofotometri UV-Vis”.Penulis menyadari bahwa skripsi ini tidak akan selesai dengan baik tanpa
bantuan dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis mengucapkan terima kasih
kepada:
1. Prof. Dr. H. Arief Sumantri, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Kepala Program Studi Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta.
3. Ibu Zilhadia, M.Si., Apt selaku Pembimbing I dan Bapak Supandi, M.Si., Apt
selaku Pembimbing II yang telah meluangkan waktu tenaga dan pikiran serta
dengan sabar membimbing dan mengajari sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi ini.
4. Ayahanda tersayang Samsul Zaman Sari dan Ibunda tersayang Nani Maryani
terima kasih atas doa yang selalu tercurah untukku, kasih sayang, semangat
dan dukungannya yang memberikan kekuatan kepada penulis dalam
menyelesaikan skripsi ini.
ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
5. Adikku tersayang Faruk Katili Basyaroh dan Sanasiu Fafe Sabasam yang
dengan canda tawanya mampu memberikan keceriaan dan semangat di hari-
hari penulis.
6. Ibu/Bapak Dosen dan Staf Akdemika Program Studi Farmasi Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta.
7. Untuk ka yaenab, ka eris dan kakak-kakak laboran di Laboratorium Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah Jakarta yang telah membantu mengoperasikan alat dan
berdiskusi tentang skripsi ini.
8. Rekan-rekan Program Studi Farmasi kelas A dan C angkatan 2012 Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri. Terimakasih atas
tawa ceria dan kebersamaannya selama ini.
9. Dan kepada semua pihak yang telah membantu penulis selama ini yang tidak
dapat disebutkan namanya satu persatu.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari
kesempurnaan. Oleh karena itu, saran, kritik, dan masukan sangat diharapkan
demi penyempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi
perkembangan ilmu pengetahuan dan para pembaca.
Ciputat, 22 September 2016
Penulis
x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGASAKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah
Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Sani Pradasari Afifah
NIM : 1112102000004
Program Studi : Farmasi
Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
Jenis Karya : Skripsi
demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,
dengan judul :
VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR ASAM AMINO
HIDROKSIPROLIN MENGGUNAKAN METODE
SPEKTROFOTOMETRI UV-Vis
untuk dipublikasi atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital
Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.
Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan
sebenarnya.
Dibuat di : Ciputat
Pada Tanggal : 22 September 2016
Yang menyatakan
Sani Pradasari Afifah
xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ........................................................................................... iiHALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iiiHALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ivHALAMAN PENGESAHAN.............................................................................vABSTRAK ...........................................................................................................viABSTRACT..................................................................................... ...................viiKATA PENGANTAR........................................................................................viiiHALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ....................xDAFTAR ISI........................................................................................................xiDAFTAR GAMBAR..........................................................................................xiiiDAFTAR TABEL ..............................................................................................xivDAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................xv
BAB I PENDAHULUAN....................................................................................11.1 Latar Belakang Masalah ..................................................................11.2 Rumusan Masalah............................................................................41.3 Tujuan Penelitian .............................................................................41.4 Manfaat Penelitian ...........................................................................4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA.........................................................................52.1 Asam Amino Hidroksiprolin ...........................................................5
2.1.1 Sumber Asam Amino Hidroksiprolin.....................................62.1.2 Analisis Asam Amino Hidroksiprolin ....................................6
2.2 Asam Amino ....................................................................................72.2.1 Pembagian Asam Amino........................................................82.2.2 Analisis Asam Amino Secara Umum.....................................8
2.3 Gelatin..............................................................................................92.3.1 Komposisi Asam Amino dalam Gelatin.................................9
2.4 Validasi Metode Analisa..................................................................102.4.1 Parameter Validasi Metode ....................................................11
2.5 Spektrofotometri UV-VIS................................................................142.5.1 Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS ...............................152.5.2 Tipe Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS .......................18
BAB III METODOLOGI PENELITIAN .........................................................203.1 Tempat dan Waktu Penelitian..........................................................203.2 Alat dan Bahan.................................................................................20
3.2.1 Bahan......................................................................................203.2.2 Alat ........................................................................................20
3.3 Prosedur Penelitian ..........................................................................213.3.1 Penyiapan Bahan Baku dan Pereaksi .....................................213.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum 9 ppm ...............233.3.3 Validasi Metode .....................................................................233.3.4 Analisis Sampel Gelatin Secara Kuantitatif ...........................26
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................274.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ....................................27
xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.2 Validasi Metode...............................................................................304.2.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas ......................304.2.2 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi ..................................324.2.3 Uji Kecermatan (Akurasi).......................................................324.2.4 Uji Keseksamaan (Presisi) ......................................................33
4.3 Analisis Sampel Gelatin...................................................................35BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..............................................................38
5.1 Kesimpulan ......................................................................................385.2 Saran ................................................................................................38
DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................39LAMPIRAN.........................................................................................................43
xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Perubahan Asam Amino Prolin Menjadi Hidroksiprolin yangDikatalis Oleh Enzim Prolil 4 Hidroksilase....................................5
Gambar 2.2 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol..................................7Gambar 2.3 Struktur Umum Asam Amino ...........................................................8Gambar 2.4 Komposisi Asam Amino Gelatin dari Beberapa Jenis Bahan Baku .10Gambar 2.5 Skema Kerja Alat Spektrofotometri UV-Vis ....................................15Gambar 2.6 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Single Beam ........................18Gambar 2.7 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Double Beam.......................18Gambar 4.1 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol..................................29Gambar 4.2 Panjang Gelombang Maksimum Hidroksiprolin ..............................29Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin.........................................................31Gambar 4.4 Grafik Hasil Analisis Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin 36Gambar 5.1 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi ...........58
xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 4.1 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin ..............32Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-Rata % diff ....................................................................33Tabel 4.3 Hasil Uji Rata-Rata Presisi ...................................................................34Tabel 4.4 Hasil Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino Hidroksiprolin35Tabel 5.1 Hasil Data Uji Linearitas Larutan Standar Hidroksiprolin ...................51Tabel 5.2 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin ..............52Tabel 5.3 Data Uji Akurasi (% diff) ......................................................................53Tabel 5.4 Data Uji Keseksamaan Pada Tiga Konsentrasi Hidroksiprolin ............54Tabel 5.5 Data Uji Kandungan Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin................55Tabel 5.6 Rumus-Rumus.......................................................................................56
xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1 Skema Pembuatan Reagen.................................................................43Lampiran 2 Skema Kerja Pembuatan Larutan Blanko..........................................46Lampiran 3 Bagan Skema Kerja ...........................................................................47Lampiran 4 Skema Analisis Hidroksiprolin dalam Sampel Gelatin Secara .........50
Kuantitatif...........................................................................................50Lampiran 5 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas .................................51Lampiran 6 Batas Deteksi dan Kuantitasi .............................................................52Lampiran 7 Uji Perolehan Kembali (Akurasi) ......................................................53Lampiran 8 Uji Keseksamaan (Presisi).................................................................54Lampiran 9 Uji Sampel Gelatin ............................................................................55Lampiran 10 Rumus-Rumus .................................................................................56Lampiran 11 Perhitungan Konsentrasi Hidroksiprolin .........................................57Lampiran 12 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi .........58
1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil modifikasi prolin
yang dikatalisis oleh enzim prolil-4-hidroksilase (P4H) pada saat proses
posttranslasi protein. Biasanya modifikasi posttranslasi pada protein
bersifat reversibel (dapat kembali), tetapi pada asam amino prolin dapat
melakukan modifikasi posttranslasi protein secara irreversibel. Asam
amino hidroksiprolin dapat ditemukan pada domain protein kolagen,
elastin, conotoxin, dan argonaute (Kelly et al., 2010). Asam amino
hidroksiprolin juga terdapat pada dinding sel tanaman dan ganggang hijau
(Cassab, 1998). Hidroksiprolin memiliki fungsi sebagai penstabil triple
helix pada kolagen (Kelly et al., 2010).
Penetapan kadar hidroksiprolin penting untuk divalidasi karena
kandungan asam amino hidroksiprolin merupakan salah satu parameter
kualitas gelatin. Gelatin merupakan protein yang diperoleh dari hidrolisis
parsial kolagen kulit, jaringan ikat putih dan tulang hewan (Rizky et al.,
2013). Semakin tinggi asam amino hidroksiprolin maka semakin baik
kualitas gelatin tersebut (Jaswir, 2007). Hidroksiprolin juga merupakan
parameter yang digunakan untuk khasiat pengobatan luka bakar. Seperti
yang dilakukan oleh Eriawan et al (2013) yang mengaplikasikan
penetapan kadar hidroksiprolin untuk mengetahui efektifitas khasiat
pengobatan luka bakar sediaan gel yang mengandung fraksi ekstrak
pegagan. Hal ini dikarenakan kadar hidroksiprolin dalam jaringan dapat
digunakan sebagai indeks parameter jumlah kolagen dalam kulit. Kolagen
menjadi parameter terbentuknya jaringan atau regenerasi kulit yang
tersusun atas dua jenis asam amino yakni hidroksilisin dan hidroksiprolin.
Semakin tinggi kandungan hidroksiprolin dapat diindikasikan bahwa
terjadi peningkatan sintesis kolagen yang berkorelasi dalam kecepatan
proses penyembuhan luka.
Ada tiga metode yang biasanya dilakukan untuk mengetahui kadar
asam amino hidroksiprolin dalam sampel yakni menggunakan HPLC
2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(High Performance Liquid Chromathographic) (Pier et al., 1997; Tobias
et al., 2007; Jun et al., 2014), Spektrofluorometri (Amin et al., 1982; Shila
and Natasa, 2009) dan menggunakan Spektrofotometri UV-VIS (Rajesh et
al., 2014; Daniela, 2014; Jitender et al., 2012). Masing-masing metode
memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode HPLC memiliki kelebihan
yakni cepat, sensitif, selektif, kolom pemisah dapat digunakan kembali
dan dapat menggunakan bermacam-macam detektor (Ardianingsih, 2009).
Metode ini memiliki kelemahan yakni apabila pengujian asam amino
hidroksiprolin dilakukan bersamaan dengan asam amino lain, kadar asam
amino hidroksiprolin secara tunggal sulit terderivatisasi oleh alat. Hasil
yang akan didapatkan berupa kadar total antara hidroksiprolin dan prolin
(Suzanne et al., 1998; Dhillon et al., 2014). Untuk itu analisis asam amino
hidroksiprolin harus dilakukan secara terpisah, hal ini dapat menyebabkan
kendala karena harus melakukan dua kali pengujian dengan kondisi
optimum HPLC yang berbeda. Metode HPLC juga merupakan metode
yang lebih komplek dan mahal dibandingkan metode lainnya.
Metode lainnya menggunakan spektrofluorometri. Metode ini
memiliki kelebihan yakni dapat mengukur konsentrasi sampel yang
rendah, lebih selektif dan peka. Kelemahan dari metode ini yakni dapat
terjadi pemadaman sendiri dan penyerapan sendiri molekul zat yang
disebabkan oleh tabrakan-tabrakan antar molekul zat itu sendiri. Tabrakan
ini dapat menyebabkan energi yang tadinya akan dilepaskan sebagai sinar
fluorosensi ditransfer ke molekul lain akibatnya intensitas berkurang
(Gholib dan Abdul 2007).
Metode lain yang sering digunakan untuk analisa hidroksiprolin
dalam sampel yakni metode Spektrofotometri UV-Vis. Metode ini
memiliki kelebihan yakni dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam
jumlah kecil, cukup sensitif dan selektif, pengerjaannya mudah dan
sederhana, biaya yang relatif murah dan mempunyai kepekaan analisis
yang cukup tinggi (Munson, 1991). Namun metode ini juga mempunyai
kelemahan yakni senyawa yang akan dianalisa harus memiliki gugus
kromofor dan ausokrom agar senyawa dapat terdeteksi pada daerah
3
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ultraviolet dan daerah visible (Harmita, 2006). Selain itu hasil yang
diperoleh juga dipengaruhi oleh kebersihan kuvet dan sinar yang
digunakan harus monokromatis (Gholib dan Abdul, 2007).
Metode yang akan digunakan pada penelitian ini yaitu
menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Metode ini dipilih karena
memiliki kelebihan dibandingkan dengan metode lain yang sering
digunakan dalam analisis asam amino hidroksiprolin yakni metode ini
lebih mudah pengerjaannya dan lebih sederhana dibandingkan metode
spektrofluorometri dan HPLC. Dalam analisis sampel metode ini mampu
mengukur zat dalam jumlah kecil, memiliki kepekaan analisis yang cukup
tinggi, cukup sensitif dan selektif serta biaya pengerjaan yang relatif
murah (Munson, 1991). Selain itu derivatisasi hidroksiprolin dengan
metode spektrofotometri UV-Vis lebih mudah dibandingkan dengan
metode spektrofluorometri dan HPLC.
Suatu metode harus divalidasi untuk mendapatkan data atau hasil
penelitian yang memenuhi persyaratan dan dapat dipertanggung jawabkan
kebenarannya. Validasi metode juga dapat mengevaluasi suatu kerja
metode analisis, menjamin suatu prosedur analisis, menjamin keakuratan
dan keterulangan hasil prosedur analisis serta mengurangi resiko
penyimpangan yang mungkin timbul (Wulandari, 2007).
Berdasarkan uraian diatas maka penelitian ini ditujukan untuk
memvalidasi metode mengenai penetapan kadar asam amino
hidroksiprolin menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis.
Selanjutnya hasil penelitian ini diaplikasikan pada penentuan kadar
hidroksiprolin dalam sampel gelatin.
4
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1.2 Rumusan Masalah
1. Apakah hasil validasi metode penetapan kadar asam amino
hidroksiprolin menggunakan metode spektrofotometri UV-VIS
memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan?
2. Berapakah kadar asam amino hidroksiprolin yang terdapat pada
sampel gelatin?
1.2 Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri UV-VIS yang
digunakan untuk validasi asam amino hidroksiprolin telah memenuhi
persyaratan yang telah ditetapkan.
2. Untuk mengetahui berapakah kadar asam amino pada sampel gelatin.
1.4 Manfaat Hasil Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat membantu para peneliti lain dalam
hal menentukan metode yang tepat untuk menentukan kadar asam amino
hidroksiprolin pada suatu sampel dengan metode yang lebih efektif dan
efisien dan telah divalidasi menggunakan metode spektrofotometri UV-
VIS.
5 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Asam Amino Hidroksiprolin
Hidroksiprolin merupakan asam amino hasil dari modifikasi asam
amino prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil 4 hidroksilase (P4H) pada
saat proses posttranslasi protein. Reaksi enzim prolil 4 hidroksilase
berlangsung di lumen retikulum endoplasma. Biasanya modifikasi
posttranslasi pada protein bersifat reversibel (dapat kembali), tetapi hal ini
berbeda pada asam amino prolin yang dapat melakukan modifikasi
posttranslasi pada protein secara irreversibel. Fungsi hidroksiprolin pada
kolagen yaitu sebagai penstabil triple helix (Kelly et al., 2010). Fungsi
hidroksiprolin pada gelatin yaitu sebagai penstabil jaringan gel (Bustillos
et al., 2006)
Pembentukan prolin menjadi hidroksiprolin sangat bergantung
pada pengaktifan enzim prolil-4-hydroksilase. Enzim ini dapat aktif
dengan adanya vitamin C (kofaktor enzim prolil-4-hydroksilase).
Kekurangan vitamin C dapat memicu terpecah-pecahnya kolagen atau
dengan kata lain kolagen yang kurang sempurna dalam pembentukannya
dan hal ini dapat meyebabkan timbulnya gejala penyakit sariyawan
(scurvy) yang ditandai oleh kerusakan pernbuluh darah serta struktur kulit
(Sidik, 2009).
Gambar 2.1 Perubahan asam amino prolin menjadi hidroksiprolin dikatalis
oleh enzim prolil-4-hidroksilase (Yan et al., 2014).
6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.1.1 Sumber Asam Amino Hidroksiprolin
Hidroksiprolin berhasil ditemukan dalam hidrolisat gelatin oleh
Emil Fischer (Fischer, 1902). Hidroksiprolin juga dapat ditemukan pada
domain protein kolagen, elastin, conotoxin, dan argonaute (Kelly et al.,
2010). Selain terdapat pada jaringan hewan hidroksiprolin juga merupakan
komponen utama protein pada dinding sel tanaman dan ganggang hijau
(Cassab, 1998). Isomer dari 4-hidroksiprolin juga ditemukan pada produk
bakteri seperti antibiotik gentamisin dan antibiotik actinomysin, tetapi
belum ada laporan yang mengkonfirmasi bahwa 4-hidroksiprolin termasuk
kedalam struktur komponen sel bakteri (Elijah and Leonard, 1980).
2.1.2 Analisis Asam Amino Hidroksiprolin
Salah satu prosedur penentuan hidroksiprolin didasarkan pada
interaksi analit dengan ninhidrit (1,2,3-trioxidena hidrat), interaksi dengan
senyawa yang mengandung gugus amino akan memberikan produk
berwarna. Karena semua asam amino dapat bereaksi dengan ninhidrit,
pertama larutan uji diberi natrium ninhidrit dengan tujuan mengoksidasi
semua jenis asam amino dengan pembentukan alkohol dan alkena. Tetapi
prosedur ini memiliki kerugian utama yaitu penentuan konsentrasi total
hidroksiprolin dan prolin tidak dapat ditentukan secara terpisah satu sama.
Selain itu terdapat hipotesis bahwa tidak terjadi transformasi asam amino
pada saat dekomposisi asam amino, hal ini disebabkan amin sekunder
pada asam amino dapat bereaksi dengan asam nitrat untuk membentuk N-
nitrosamin (N. Yu. Ignat’eva et al., 2007).
Prosedur lain untuk penentuan hidroksiprolin didasarkan pada
reaksi reagen Ehrlich dengan proses oksidasi hidroksiprolin. Mekanisme
kimia dari proses ini dapat digambarkan sebagai berikut. Proses ini
melibatkan oksidasi dari asam imino menjadi pirol-2-karboksilat atau
pirol, kemudian pembentukan kromofor dengan penambahan reagen
Ehrlich (p-dimetilamino-benzaldehida) (Darwin and Sidney, 1960).
Senyawa yang dihasilkan berupa senyawa quinoid yang sangat berwarna
7
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(warna tergantung pada substituen dan bervariasi dari orange-ungu) (N.
Yu. Ignat’eva et al., 2007).
Gambar 2.2 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol (Darwin and
Sidney, 1960).
Chloramin-T-hidrat (N-kloro-4-Toluensulfonamida, garam
natrium) merupakan bahan kimia yang biasanya digunakan sebagai agen
pengoksidasi. Di antara keuntungan yang tidak diragukan sebagai agen
pengoksidasi adalah inexpensivenes, tidak mudah terdekomposisi dan
tidak ada pengurangan produk berwarna. Reaksi oksidasi dilakukan dalam
larutan buffer dengan pH 6 karena reagen ehrlich larut pada air dengan pH
tertentu (N. Yu. Ignat’eva et al., 2007).
2.2 Asam Amino
Asam amino adalah senyawa organik yang terdiri dari asam
karboksilat dan yang mempunyai gugus amino. Asam amino dapat
ditemukan pada keadaan bebas atau sebagai rantai linear pada peptida dan
protein (Bailey, 1990). Asam amino terdiri dari sebuah gugus amino,
gugus karboksil, atom hidrogen dan gugus R yang terikat pada atom C
yang dikenal sebagai karbon alfa (Cα). Gugus R sebagai rantai samping.
Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut pada pelarut
organik non polar seperti eter, aseton, kloroform (Poedjiadi, 2009).
8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 2.3 Struktur Umum Asam Amino (Merinda, 2013).
2.2.1 Pembagian Asam Amino
Berdasarkan sifat kimia rantai sampingnya, asam amino dapat
dibagi menjadi empat kelompok, yaitu asam amino yang bersifat basa
lemah, asam lemah, hidrofilik jika polar dan hidrofobik jika nonpolar
(Almatsier, 2006). Tidak semua asam amino dapat dibuat dalam tubuh kita
apabila ditinjau dari segi pembentukannya asam amino dibagi menjadi dua
golongan yaitu asam amino eksogen dan asam amino endogen. Asam
amino eksogen disebut juga asam amino esensial dan asam amino endogen
disebut juga asam amino non esensial (Winarno, 2008).
2.2.2 Analisis Asam Amino Secara Umum
Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi
asam amino atau kandungan protein dan peptida. Untuk mengidentifikasi
adanya asam amino, terlebih dahulu kita perlu menghidrolisis ikatan amin
dengan sempurna untuk memperoleh asam amino dalam keadaan bebas,
kemudian kita memisahkan, mengidentifikasi dan menghitungnya.
Hidrolisis dapat dilakukan pada kondisi asam dan basa yang kuat atau
menggunakan enzim spesifik untuk memperoleh asam amino. Pada
hidrolisis asam unsur yang diperlukan adalah HCl 6 M pada suhu 110oC.
Reaksinya biasanya dilakukan ditabung kaca yang tertutup. Sementara itu
pada hidrolisis basa, ikatan amida dapat diputus dengan perlakuan peptida
menggunakan NaOH 2M pada suhu 100oC. Hidrolisis basa menghasilkan
destruksi arginin, sistein, serin, dan treonin. Selain itu ada pula hidrolisis
enzim. Peristiwa ini terjadi didalam tubuh. Untuk menghancurkan
makanan perut memiliki enzim dengan kadar tertentu yang dapat
dikatalisasi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal peptidase.
9
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Aminopeptidase bekerja cepat dan efisien dalam hidrolisis ikatan peptida
sekaligus memotong suatu residu asam amino mulai dari ujung N. Tahap
selanjutnya yaitu pemisahan. Pemisahan yang umum dilakukan adalah
dengan cara kromatografi (Bailey, 1990)
2.3 Gelatin
Gelatin merupakan campuran heterogen polipepetida yang
diperoleh melalui hidrolisis parsial kolagen dari jaringan ikat hewan
dengan perlakuan asam atau basa (Fischer, 2012). Gelatin merupakan
protein yang larut yang bisa bersifat sebagai gelling agent (bahan pembuat
gel) atau sebagai non gelling agent. Sumber bahan baku gelatin dapat
berasal dari sapi (tulang dan kulit), babi (kulit) dan ikan (kulit). Gelatin
memiliki fungsi yang masih sulit untuk digantikan dalam industri pangan
maupun obat-obatan. Hal ini dikarenakan gelatin memiliki fungsi yang
banyak yaitu bisa berfungsi sebagai bahan pengisi, pengemulsi
(emulsifier), pengikat, pengendap, pemerkaya gizi, sifatnya juga dapat
membentuk lapisan tipis yang elastis, membentuk film yang transparan
dan kuat, kemudian memiliki sifat penting lainnya yaitu daya cernanya
yang tinggi (Dewi and Iriane, 2007).
2.3.1 Komposisi Asam Amino dalam Gelatin
Gelatin sangat kaya dengan asam amino glisin (Gly) (hampir
sepertiga dari total asam amino), prolin (Pro) dan 4-hidroksiprolin (4Hyp).
Struktur gelatin yang umum adalah -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyp-Gly-
Pro-. Kandungan 4-hidroksiprolin (4-Hyp) juga berpengaruh pada
kekuatan gelatin. Semakin tinggi asam amino ini, kekuatan gel juga lebih
baik. Meskipun gelatin mayoritas diturunkan dari hewan, gelatin
sebenarnya tergolong memiliki nilai biologis yang rendah dan sering juga
dianggap sebagai protein yang tidak lengkap. Pasalnya, gelatin kekurangan
kandungan triptopan (Trp) yang merupakan salah satu asam amino
esensial, serta rendah dalam sistein (Cys) dan tirosin (Tyr) (Jaswir, 2007).
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Berikut beberapa komposisi asam amino yang terdapat dalam gelatin
dengan berbagai sumber bahan baku yang berbeda:
Gambar 2.4 Komposisi Asam Amino Gelatin dari Beberapa Jenis Bahan
Baku (Fischer, 2012).
2.4 Validasi Metode Analisa
Syarat utama dari suatu penelitian yang dapat diterima dan layak
untuk dipublikasi terutama untuk penelitian yang bersifat kuantitatif yaitu
data yang diperoleh harus valid, data atau hasil dari penelitian tersebut
harus memenuhi persyaratan dan dapat dipertanggung jawabkan
kebenarannya untuk mendapatkan suatu data yang valid maka dibutuhkan
metode yang valid pula. Salah satu cara agar suatu metode dikatakan valid
adalah dengan cara melakukan suatu validasi metode.
Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya (Harmita, 2004). Beberapa manfaat validasi metode
analisis adalah untuk mengevaluasi suatu kerja metode analisis, menjamin
suatu prosedur analisis, menjamin keakuratan dan keterulangan hasil
prosedur anlisis dan mengurangi resiko penyimpangan yang mungkin
timbul (Wulandari, 2007).
11
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4.1 Parameter Validasi Metode
Menurut Harmita (2004) ada beberapa parameter analisis yang
harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis, yaitu:
1. Kecermatan (Accuracy)
Kecermatan adalah ukuran yang menunjukan kedekatan hasil yang
diperoleh dari hasil pengamatan dengan hasil yang sebenarnya.
Kecermatan hasil analis sangat tergantung kepada sebaran galat sistematik
di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai
kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi
galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah
dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan
suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat dan sesuai prosedur.
Untuk mendokumentasikan akurasi, ICH (2005)
merekomendasikan pengumpulan data dari 9 kali penetapan kadar dengan
3 konsentrasi yang berbeda (misal 3 konsentrasi dengan 3 kali replikasi).
Uji akurasi dinyatakan dengan persen differensial (% diff). Syarat akurasi
yang baik jika nilai rata-rata % diff tidak lebih dari ±2% (Harmita, 2006).
Perhitungan untuk menentukan % diff adalah sebagai berikut:
% diff =
Keterangan:
B = konsentrasi hasil analisis
A = konsentrasi sesungguhnya
2. Keseksamaan (Precision)
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian
antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari
rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel
yang diambil dari campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai
simpangan baku atau simpangan baku relatif (%RSD). Keseksamaan dapat
12
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan
(reproducibility).
Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpangan
baku relatif (RSD) atau koefisien variasi (KV) sebesar ≤ ±2% dan standar
deviasi (SD) sebesar ≤ ±2 (Harmita, 2004). Akan tetapi kriteria ini sangat
fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah
sampel, dan kondisi laboratorium. Ditemukan bahwa koefisien variasi
meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Keseksamaan
dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:
Jika hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,..............xn, maka simpangan
bakunya adalah:
SD = √ )
)
Simpangan baku relatif (RSD) adalah:
RSD =
(Harmita, 2004)
3. Selektifitas (Spesifitas)
Selektifitas atau Spesifitas suatu metode adalah kemampuannya
yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan
adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel.
Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan
(degree of bias). Cara yang dapat digunakan untuk menentukan selektifitas
adalah dengan cara membandingkan hasil sampel yang mengandung
bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis,
senyawa asing lainnya, dengan hasil analisis sampel yang tidak
mengandung bahan lain yang ditambahkan. Penyimpangan hasil dapat
terlihat apabila ada selisih dari hasil uji kedua sampel.
13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4. Linearitas dan Rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan
respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik
yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang
metode adalah pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah
ditunjukkan dapat ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan
linearitas yang dapat diterima. Linearitas biasanya dinyatakan dalam
istilah variansi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan
persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam
sampel dengan berbagai konsentrasi analit.
Di dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang
digunakan antara 0-200%. Sebagai parameter adanya hubungan linier
digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier y=a+bx.
Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b=0 dan r=+1 atau –1
bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan
analisis instrumen yang digunakan. Nilai koefisien korelasi yang
memenuhi persyaratan adalah sebesar ≥ 0,9970 (ICH, 2005), ≥ 0,9700
(SNI) atau ≥ 0,9980 (AOAC, 2002)
5. Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ)
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang
dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan
dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas
kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai
kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria
cermat dan seksama.
Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung
pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis
yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan
mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada
analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
blangko beberapa kali. Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara
statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi.
Rumus untuk menghitung batas deteksi (LOD):
LOD =
Dan batas kuantitasi (LOQ):
LOQ =
Dimana Simpangan baku (Sb) sama dengan simpangan baku residual
(Sy/x.).
Sy/x = √ )
2.5 Spektrofotometri UV-VIS
Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi
antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia.
Teknik yang sering digunakan dalam analisis farmasi meliputi
spektrofotometri ultraviolet, cahaya tampak, infra merah, dan serapan
atom. Menurut Ditjen POM (1995) daerah spektrum dapat dibagi menjadi
dalam:
1. Daerah ultraviolet : 190-380 nm
2. Daerah cahaya tampak : 380-780 nm
3. Daerah infra merah dekat : 780-3000 nm
4. Daerah infra merah : 2,5-40 µm atau 4000-250 cm-1
Spektrofotometri UV-Vis adalah alat yang digunakan untuk
mengukur serapan yang dihasilkan dari interaksi kimia antara radiasi
elektromagnetik dengan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada
daerah UV-Vis (Ditjen POM, 1995). Spektrofotometri UV-Vis adalah
teknik analisa spektroskopi yang memakai sumber radiasi elektromagnetik
ultraviolet (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai
instrumen spektrofotometer. Spektrofotometri UV-Vis merupakan salah
satu metode yang sering digunakan baik untuk analisa kualitatif maupun
kuantitatif karena metode ini memiliki beberapa keuntungan, yaitu:
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1. Dapat digunakan untuk analisis suatu zat dalam jumlah kecil
2. Cukup sensitif dan selektif
3. Pengerjaannya mudah dan sederhana
4. Biaya yang relatif murah
5. Dan mempunyai kepekaan analisis yang cukup tinggi (Munson, 1991).
2.5.1 Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS
Gambar 2.6 Skema Kerja Alat Spektrofotometri UV-Vis
(Sumber : wocono.wordpress.com)
Komponen spektrofotometri UV-Vis terdiri atas (Gholib dan Abdul, 2007;
Harmita, 2006)
1. Sumber lampu
Sumber lampu deuterium digunakan untuk daerah UV pada panjang
gelombang 190-380 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau lampu
tungsten digunakan untuk daerah visibel (panjang gelombang antara
380-780 nm).
2. Monokromator
Monokromator digunakan untuk mendispersikan sinar kedalam
komponen-komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan
dipilih oleh celah (slit). Monokromator akan memisahkan radiasi
cahaya putih yang polikromatis menjadi cahaya monokromatis
(mendekati monokromatis).
3. Kuvet
Wadah atau cell untuk menempatkan larutan.
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4. Detektor
Mengubah energi radiasi yang mengenainya menjadi suatu besaran
yang dapat diukur.
5. Amplifer
Fungsinya untuk memperkuat sinyal listrik
6. Rekorder
Alat untuk mencatat dapat berupa gambar atau angka-angka
Prinsip kerja instrumen spektrofotometri UV-Vis :
Prinsip kerja dari spektrofotometri UV-Vis berdasarkan pada
penyerapan cahaya atau energi oleh suatu larutan. Jumlah cahaya atau
energi radiasi yang diserap memungkinkan pengukuran jumlah zat
penyerap dalam larutan secara kuantitatif. Cahaya adalah suatu bentuk
energi radiasi yang mempunyai sifat sebagai gelombang dan partikel.
Sifatnya sebagai gelombang dapat dilihat dengan terjadinya pembiasan
dan pemantulan cahaya oleh suatu medium sedangkan sifatnya sebagai
pertikel dapat dilihat dengan terjadinya efek foto listrik. Sedangkan energi
radiasi terdiri dari sejumlah besar panjang gelombang elektromagnetik
dengan panjang gelombang yang berbeda-beda (Pecsok et al., 1976;
Skoog and West, 1971).
Pada instrumen spektrofometer ultraviolet dan visible, suatu
sumber cahaya akan dipancarkan melalui monokromator. Monokromator
menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya tersebut menjadi pita-
pita panjang gelombang yang diinginkan untuk pengukuran suatu zat
tertentu, dan menunjukkan bahwa setiap gugus kromofor mempunyai
panjang gelombang maksimum yang berbeda. Dari monokromator tadi
cahaya atau energi radiasi diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang
akan diperiksa di dalam kuvet. Kemudian jumlah cahaya yang diserap oleh
larutan akan menghasilkan signal elektrik pada detektor, yang mana signal
elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut.
Besarnya signal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai
angka (Pecsok et al., 1976; Skoog and West 1971).
17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Metode Spektrofotometri ultraviolet dan visible berdasarkan pada
hukum LAMBERT-BEER. Hukum tersebut menyatakan bahwa jumlah
radiasi cahaya tampak, ultraviolet dan cahaya-cahaya lain yang diserap
atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen
dari konsentrasi zat dan tebal larutan. Hukum ini secara sederhana dapat
dinyatakan dalam rumus berikut:
A = log (Io/I1) = a b c
Io = Intensitas sinar datang
I1 = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorbsivitas
b = Panjang sel atau kuvet
c = Konsentrasi (g/l)
Persyaratan suatu sampel dapat dianalisa menggunakan spektrofotometri
UV-Vis adalah :
1. Bahan mempunyai gugus kromofor
2. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor tapi berwarna
3. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dan tidak berwarna, maka
ditambahkan pereaksi warna (Vis)
4. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dibuat turunannya yang
mempunyai gugus kromofor (UV). (Harmita, 2006).
Sampel yang sering dianalisis dengan metode spektroftometri UV-
Vis adalah senyawa organik yang memiliki gugus kromofor dan
ausokrom. Gugus kromofor adalah gugus fungsional tidak jenuh yang
memberikan serapan pada daerah ultraviolet atau cahaya tampak. Hampir
semua kromofor mempunyai ikatan rangkap seperti alkena (C=C), C=O, -
NO2, benzen, dan lain-lain. Sedangkan ausokrom adalah gugus fungsional
seperti –OH, -NH2, -X, yaitu gugus yang mempunyai elektron nonbonding
dan tidak mengabsorpsi radiasi pada λ diatas 200 nm (Harmita, 2006).
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.5.2 Tipe Instrumentasi Spektrofotometri UV-VIS
Tipe instrumentasi dari spektrofotometri UV-Vis terbagi menjadi
dua (Harmita, 2006):
1. Spektrofotometri Single Beam
Pada spektrofotometer UV-Vis tipe singel beam absorbsinya
berdasarkan pada sinar tunggal dimana sampel akan ditentukan
jumlahnya pada satu panjang gelombang atau fix wave lenght. Hasil
biasanya dibandingkan dengan blanko (biasanya pelarut).
Gambar 2.6 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Single Beam
(Sumber: www.slideshare.net)
Keterangan gambar skema spektrofotometri tipe single beam:
1. Dari celah mengeluarkan satu sinar monokromatis
2. Wadah atau kuvet yang dapat dilalui sinar hanya satu
3. Setiap perubahan panjang gelombang alat harus dinolkan
2. Spektrofotometri Double Beam
Pada spektrofotometri UV-Vis tipe double beam absorpsinya
siasanya mempunyai variabel panjang gelombang atau multi wave
length. Hasilnya bisa langsung dibandingkan dengan blanko
Gambar 2.7 Skema Spektrofotometri UV-Vis Tipe Double Beam
(Sumber: www.slideshare.net)
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Keterangan gambar skema spektrofotometri tipe double beam:
1. Dari celah mengeluarkan dua sinar monokromatis
2. Sinar melalui dua wadah atau kuvet sekaligus
3. Alat hanya di auto zero satu kali dengan cara mengisi kedua kuvet
dengan larutan blanko.
20 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di laboratorium kimia obat dan laboratorium
penelitian II di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta sejak
bulan maret hingga agustus 2016.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Bahan Kimia
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Standar
Asam Amino Hidroksiprolin (Trans-4-Hidroksi-L-Prolin) (Sigma),
Natrium Asetat Trihidrat (Merck), Asam Sitrat Monohidrat (Merck), Asam
Asetat Glasial (Merck), Asam Klorida 36,7% (J.T.Baker), Natrium
Hidroksida (Merck), Natrium Klorida (Merck), Isopropanol (Merck),
Chloramin T Hidrat (Sigma), 4-dimetilamino-benzaldehid (PDAB)
(Merck), Etanol Absolute (Merck), Asam Sulfat (Merck), Aquades dan
Sampel Gelatin.
3.2.2 Alat
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Instrumen
Spektrofotometri UV-Vis Double Beam, timbangan analitik, shakingbath,
oven, vortex, micropipet dan tip, labu erlenmeyer, labu ukur, gelas kimia,
tabung reaksi, pH meter, batang pengaduk, alumunium foil, spatula, pipet
volume, dan pipet tetes.
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyiapan Bahan Baku dan Pereaksi
1. Pembuatan larutan HCl 6 N
Larutan HCl 36,7% (12 N) dipipet sebanyak 50 ml kemudian
masukkan larutan ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan aquades
sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.
2. Pembuatan larutan NaOH 4 N
Serbuk NaOH ditimbang sebanyak 16 gram kemudian
masukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Tambahkan aquades sampai
tanda batas dan kocok sampai homogen.
3. Pembuatan buffer asetat/sitrat pH 6 (George, 2009)
Masukkan 70 ml aquades ke dalam labu ukur 100 ml,
tambahkan 1,2 ml asam asetat glasial ke dalam labu secara perlahan,
tambahkan 5 gram asam sitrat monohidrat, 12 gram natrium asetat
trihidrat dan 3,4 gram natrium hidroksida, kocok sampai homogen dan
tambahkan aquades sampai 90 ml, cukupkan pH sampai 6 dengan
menambahkan HCl atau NaOH kemudian tambahkan aquades sampai
100 ml dan cek pH kembali.
4. Pembuatan NaCl 0,3 M
Serbuk NaCl ditimbang sebanyak 8,775 gram diatas timbangan
analitik, masukkan serbuk ke dalam labu ukur 500 ml. Tambahkan
aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.
5. Pembuatan larutan chloramin T 7% (w/v)
Serbuk Chloramin ditimbang sebanyak 350 mg diatas timbangan
analitik, masukkan serbuk ke dalam labu ukur 5 ml. Tambahkan
aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
6. Pembuatan larutan oksidan (Chloramin T 7% (w/v) dan buffer
asetat/sitrat pH 6 rasio 1:4 (v/v))
Larutan Chloramin 7% dipipet sebanyak 2 ml, masukkan larutan
ke dalam labu ukur 10 ml kemudian tambahkan buffer asetat/sitrat pH
6, sampai tanda batas dan kocok sampai homogen.
7. Pembuatan reagen ehrlich (George, 2009)
Serbuk p-dimetilamino-benzaldehid (PDAB) ditimbang
sebanyak 12 gram kemudian tambahkan 20 ml etanol absolut (larutan
A), selanjutnya larutan asam sulfat dipipet sebanyak 2,74 ml kemudian
tambahkan 20 ml etanol absolut (larutan B). Tambahkan larutan B ke
dalam larutan A kemudian aduk sampai homogen lalu masukkan
larutan ke dalam kulkas dan tunggu larutan sampai terbentuk kristal.
8. Pembuatan larutan induk hidroksiprolin 1000 ppm
Serbuk standar hidroksiprolin ditimbang sebanyak 10 mg diatas
timbangan analitik, kemudian masukkan serbuk ke dalam labu ukur 10
ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai
homogen.
9. Pembuatan larutan standar 100 ppm
Dipipet sebanyak 5 ml dari larutan induk hidroksiprolin 1000
ppm secara kuantitatif, kemudian masukkan larutan ke dalam labu
ukur 50 ml. Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai
homogen.
10. Pembuatan larutan hidroksiprolin konsentrasi 3, 6, 9, 12, 15, dan 18
ppm
Dipipet sebanyak 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, dan 1,8 ml dari larutan
standar hidroksiprolin 100 ppm, kemudian masing-masing larutan
dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan aquades sampai
tanda batas dan kocok sampai homogen. Masukkan masing-masing
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml
buffer asetat/sitrat pH 6 dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai
tanda batas dan kocok sampai homogen.
3.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum 9 ppm
Larutan standar hidroksiprolin 100 ppm dipipet sebanyak 0,9 ml,
kemudian masukkan larutan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan
aquades sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Masukkan semua
larutan (10 ml) ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml
buffer asetat/sitrat pH 6 dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda
batas dan kocok sampai homogen. Pipet sebanyak 1 ml larutan yang telah
dibuat dan masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup lalu
tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian
vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4
ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC diatas
shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan alat spektrofotometri
UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm.
3.3.3 Validasi Metode
1. Pembuatan kurva kalibrasi 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm dan penentuan
linearitas
Larutan hidroksiprolin konsentrasi 3 ppm dipipet sebanyak 1 ml
kemudian masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup lalu
tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian
vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen ehrlich
sebanyak 4 ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit pada
suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan menggunakan
alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 400-800 nm.
Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 6, 9, 12, 15, dan 18
ppm. Kemudian dibuat kurva kalibrasi sampai didapat persamaan
linear y=a+bx. Linearitas dari kurva kalibrasi dilihat dengan
menghitung koefisien korelasi (r) dari persamaan regresi linear.
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Penentuan batas deteksi / limit of detection (LOD) dan batas
kuantitasi/ limit of quantitation (LOQ).
LOD dihitung melalui persamaan garis regresi linear dari kurva
kalibrasi dengan rumus:
LOD =
Sedangkan LOQ dihitung dengan rumus:
LOQ =
Dimana Simpangan baku (Sb) sama dengan simpangan baku residual
(Sy/x.), b adalah slope dari persamaan regresi.
Sy/x = √
3. Uji kecermatan (Akurasi)
Pada uji kecermatan dibuat larutan dengan konsentrasi 5, 10 dan
16 ppm dari larutan standar hidroksiprolin 100 ppm. Untuk konsentrasi
5 ppm, dipipet sebanyak 0,5 ml dari larutan standar hidroksiprolin 100
ppm, masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades
sampai tanda batas kocok sampai homogen. Lalu untuk konsentrasi 10
ppm dipipet sebanyak 1 ml larutan standar hidroksiprolin 100 ppm
masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades sampai
tanda batas kocok sampai homogen. Kemudian untuk konsentasi 16
ppm dengan mengukur 1,6 ml larutan standar hidroksiprolin 100 ppm,
masukkan ke dalam labu ukur kemudian tambahkan aquades sampai
tanda batas kocok sampai homogen. Labu ukur yang digunakan
volume 10 ml. Masukkan masing-masing larutan (10 ml) ke dalam
labu ukur 25 ml kemudian tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat pH 6
dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda batas dan kocok
sampai homogen. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali
pengulangan sehingga diperoleh 9 larutan.
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Dari masing-masing konsentrasi dipipet sebanyak 1 ml larutan
yang telah dibuat dan masukkan larutan ke dalam tabung reaksi
tertutup lalu tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl
kemudian vortex selama 4 menit. Selanjutkan tambahkan reagen
ehrlich sebanyak 4 ml ke dalam tabung dan inkubasi selama 25 menit
pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan dengan
menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang
400-800 nm.
Nilai akurasi dapat diperoleh dengan menghitung nilai % diff,
dengan cara mengurangi nilai konsentrasi dari hasil analisis dengan
nilai konsentrasi yang sebenarnya dibagi nilai konsentrasi sebenarnya
dan dikali seratus persen. Syarat % diff yang dapat diterima yaitu tidak
lebih dari ±2% (Harmita, 2006).
% diff =
4. Uji keseksamaan (presisi)
Dibuat larutan hidroksiprolin dengan konsentrasi 5 ppm, 10
ppm, dan 16 ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali
pengulangan sehingga diperoleh 9 larutan. Setelah dipreparasi sesuai
prosedur. Larutan hidroksiprolin diukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometri UV-Vis. Kemudian dihitung standar deviasi (SD) dan
persentase simpangan baku relatif atau %RSD (Relative Standard
Deviation) dari masing-masing konsentrasi dengan nilai ≤ ±2%
(Harmita, 2004).
SD = √
Simpangan baku relatif (RSD) :
RSD =
26
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.4 Analisis Sampel Gelatin Secara Kuantitatif
Kandungan hidroksiprolin dalam sampel gelatin ditentukan
menggunakan metode ISO (1978) dengan sedikit modifikasi (Rafik et al.,
2011). Sampel gelatin ditimbang sebanyak 10 mg diatas timbangan
analitik. Sampel gelatin dihidrolisis dengan HCl 6 N sebanyak 5 ml dan
diinkubasi selama 12 jam pada suhu 110oC di dalam oven. Setelah
diinkubasi larutan sampel dinetralkan dengan cara menambahkan NaOH 4
N. Larutan yang telah netral kemudian dipipet sebanyak 1 ml dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml kemudian tambahkan larutan buffer
asetat/sitrat pH 6 sebanyak 2 ml dan tambahkan larutan NaCl 0,3 M
sampai tanda batas dan kocok sampai homogen. Larutan sampel dipipet
sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi tertutup lalu tambahkan isopropanol
300 µl dan larutan oksidan 600 µl kemudian vortex larutan selama 4
menit. Selanjutnya tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml dan inkubasi
selama 25 menit pada suhu 60oC diatas shakingbath. Amati serapan
dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang
gelombang 400-800 nm. Kadar asam amino hidroksiprolin dalam sampel
dapat dihitung menggunakan persamaan regresi dari kurva kalibrasi yang
telah dibuat.
27 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Hidroksiprolin merupakan asam amino turunan dari prolin. Asam
amino ini adalah hasil dari reaksi prolin yang dikatalisis oleh enzim prolil-
4-hidroksilase di lumen retikulum endoplasma pada saat posttranslasi
protein. Hidroksiprolin dapat ditemukan pada jaringan hewan, sel tanaman
dan ganggang hijau. Selain itu hidroksiprolin juga dapat ditemukan dalam
gelatin dan merupakan salah satu parameter dalam menentukan kualitas
suatu gelatin.
Pada gelatin hidroksiprolin memiliki fungsi sebagai penstabil triple
helix. Semakin tinggi asam amino hidroksiprolin maka semakin baik
kualitas gelatin tersebut. Gelatin juga memiliki fungsi yang masih sulit
untuk digantikan dalam industri pangan dan obat-obatan. Hal ini
dikarenakan gelatin memiliki fungsi yang banyak yaitu dapat berfungsi
sebagai pengisi, pengemulsi, pengikat tablet, pengendap, pemerkaya giji,
dan dapat membentuk lapisan tipis yang elastis.
Validasi metode penetapan kadar asam amino hidroksiprolin pada
penelitian ini menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis. Metode
spektrofotometri UV-Vis merupakan metode yang pengerjaannya mudah
dan sederhana namun cukup sensitif dan selektif serta dapat mengukur
kadar dalam jumlah yang kecil. Selain itu metode ini juga mempunyai
kepekaan analisis yang cukup tinggi dan pengerjaannya yang relatif
murah. Syarat suatu senyawa dapat diukur serapannya dengan alat
spektrofotometri UV-Vis adalah senyawa tersebut memiliki gugus
kromofor dan ausokrom sehingga dapat diukur serapannya pada daerah
ultraviolet dan daerah visible. Daerah UV-Vis berada pada daerah 190-780
nm.
Asam amino hidroksiprolin merupakan asam amino yang tidak
mempunyai gugus kromofor sehingga tidak mempunyai serapan pada
daerah UV-Vis. Gugus kromofor merupakan gugus kovalen tidak jenuh
yang memberikan serapan pada daerah ultraviolet dan daerah visible.
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Hampir semua gugus kromofor memiliki ikatan rangkap seperti C=C,
C=O, NO2, cincin benzen dan lain-lain.
Oleh karena itu pada penetapan kadar asam amino hidroksiprolin
harus dilakukan derivatisasi. Derivatisasi bertujuan untuk mengubah
hidroksiprolin menjadi berwarna dan dapat dibaca serapannya oleh alat
spektrofotometri UV-Vis. Proses derivatisasi pada penelitian ini dilakukan
dengan cara membuat larutan hidroksiprolin dengan konsentrasi yang
diinginkan. Selanjutnya dilakukan penambahan reagen untuk mengubah
larutan hidroksiprolin tersebut menjadi berwarna. Reagen yang
ditambahkan ke dalam larutan hidroksiprolin yaitu buffer asetat/sitrat pH
6, NaCl, isopropanol, larutan oksidan, dan reagen ehrlich.
Penambahan larutan buffer atau larutan penyangga ke dalam
larutan hidroksiprolin berfungsi untuk mempertahankan nilai pH (derajat
keasaman) agar tidak banyak berubah selama reaksi berlangsung dengan
penambahan sedikit asam kuat atau basa kuat serta pengenceran oleh air.
Pada penelitian ini buffer yang digunakan yaitu larutan buffer asetat/sitrat
dengan pH 6 karena reaksi yang ideal terjadi pada pH 6. Larutan NaCl
ditambahkan agar larutan hidroksiprolin lebih stabil sehingga serapan yang
terbaca oleh alat spektrofotometri UV-Vis lebih stabil. Penambahan
larutan isopropanol berfungsi untuk membantu pelarutan oksidan yang
akan ditambahkan ke dalam larutan hidroksiprolin yang telah dibuat
sehingga larutan yang akan terbentuk lebih homogen. Larutan oksidan
terdiri atas chloramin T hidrat dan larutan buffer asetat/sitrat pH 6.
Penambahan larutan oksidan berfungsi untuk mengubah hidroksiprolin
menjadi pirol-2-karboksilat atau pirol. Selanjutnya larutan hidroksiprolin
ditambahkan reagen ehrlich yang terdiri dari PDAB (para-dimetilamino-
benzaldehid), etanol absolut dan asam sulfat. Penambahan reagen ehrlich
berfungsi untuk mengubah larutan menjadi berwarna. Larutan
hidroksiprolin yang telah ditambahkan reagen ehrlich akan berwarna
kuning. Setelah larutan di inkubasi pada suhu 60oC selama 25 menit
larutan akan berubah menjadi berwarna merah, fungsi dari pemanasan
sendiri agar reaksi terjadi lebih cepat. Semakin tinggi kadar hidroksiprolin
29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
maka warna merah yang dihasilkan akan semakin pekat. Hidroksiprolin
hasil dari derivatisasi mempunyai serapan pada daerah visible. Daerah
visible berada pada daerah 380-780 nm.
Gambar 4.1 Proses Oksidasi Hidroksiprolin Menjadi Pirol
Penelitian didahului dengan proses penentuan panjang gelombang
maksimum atau serapan maksimum dari larutan hidroksiprolin yang
sebelumnya telah diderivatisasi sehingga menjadi berwarna menggunakan
spektrofotometri UV-Vis pada rentang panjang gelombang 400-800 nm.
Menurut beberapa literatur hidroksiprolin yang telah diderivatisasi
memiliki panjang gelombang maksimum pada 560 nm (George, 2009),
660 nm (Rafik et al., 2011), 558 nm (Jitender et al., 2012).
Gambar 4.2 Panjang Gelombang Maksimum Hidroksiprolin
Setelah dilakukan pengukuran panjang gelombang maksimum
sebanyak 3 kali pengulangan dihasilkan panjang gelombang maksimum
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
pada serapan 563.5 nm. Spektrum hidroksiprolin pada spektrofotometri
UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 4.2. Penentuan panjang gelombang
maksimum hidroksiprolin dilakukan agar dapat mengetahui daerah dimana
hidroksiprolin memberikan serapan warna maksimal yang dapat diabsorbsi
oleh alat spektroftometri UV-Vis, sehingga dapat dihasilkan nilai berupa
absorbansi.
4.2 Validasi Metode
Syarat utama dari suatu penelitian yang dapat diterima dan layak
untuk dipublikasi terutama untuk penelitian yang bersifat kuantitatif yaitu
data yang diperoleh harus valid. Untuk mendapatkan suatu data yang valid
maka dibutuhkan metode yang valid pula. Salah satu cara agar suatu
metode dikatakan valid adalah dengan cara melakukan suatu validasi
metode. Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya (Harmita, 2004). Parameter validasi yang akan ditetapkan
pada penelitian ini yaitu pembuatan kurva kalibrasi dan uji lineariras, LOD
(Limit of Detection), LOQ (Limit of Quantitation), uji akurasi (% diff), uji
presisi (%RSD dan SD).
4.2.1 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas
Pada validasi metode diawali dengan pembuatan kurva kalibrasi.
Kurva kalibrasi merupakan hubungan antara nilai absorbansi terhadap
konsentrasi. Kurva kalibrasi yang dihasilkan dapat digunakan untuk uji
linearitas. Tujuan dari uji linearitas yaitu untuk membuktikan adanya
hubungan linear antara konsentrasi zat yang sebenarnya dengan respon
alat. Linearitas atau kecenderungan korelasi antara dua variabel biasanya
dinyatakan dalam koefisien korelasi (r). Linearitas yang baik atau adanya
korelasi yang erat ditunjukan dengan harga koefisein korelasi mendekati
atau sama dengan 1. Menurut AOAC (2002) syarat uji linearitas yang baik
yaitu dengan nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,9980.
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pada pembuatan kurva kalibrasi dibuat deret larutan standar
hidroksiprolin dari larutan induk hidroksiprolin 100 ppm. Konsentrasi
yang digunakan pada kurva kalibrasi adalah 7 konsentrasi yang bertingkat
yaitu 0 ppm, 3 ppm, 6 ppm, 9 ppm, 12 ppm, 15 ppm dan 18 ppm.
Gambar 4.3 Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin
Berdasarkan hasil kurva yang didapat pada Gambar 4.3
menunjukan bahwa nilai absorbansi yang dihasilkan meningkat sejajar
dengan peningkatan konsentrasi hidroksiprolin. Dari kurva kalibrasi
hidroksiprolin didapatkan persamaan linier antara konsentrasi dan
absorbansi yaitu y=0,0312x-0,0026 dengan nilai koefisien korelasi yaitu
r=0,9991. Berdasarkan hasil yang diperoleh nilai koefisien korelasi yang
didapat telah memenuhi persyaratan AOAC (2002) yaitu ≥ 0,9980.
Persamaan linear yang dihasilkan dapat digunakan untuk mencari
konsentrasi hidroksiprolin dalam sampel dengan memasukkan nilai
absorbansi. Data hasil percobaan dapat dilihat selengkapnya pada lampiran
5 tabel 5.1.
y = 0,0312x - 0,0026 R² = 0,9991
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20
Ab
sorb
an
si
Konsentrasi
Kurva Kalibrasi Hidroksiprolin
Series1
Linear (Series1)
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.2.2 Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi
Setelah didapatkan kurva kalibrasi yang telah memenuhi
persyaratan selanjutnya data yang diperoleh dapat diolah untuk
menentukan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ). Batas
deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi
yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko
(Harmita, 2004). Sedangkan batas kuantitasi adalah kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan
seksama. Batas deteksi (LOD) dari pengujian yaitu 0,691 ppm sedangkan
batas kuantitasi (LOQ) yaitu 2,094 ppm. Data mengenai uji batas deteksi
dan batas kuantitasi dapat dilihat pada tabel 4.1 dan data hasil percobaan
selengkapnya tercantum pada lampiran 6 tabel 5.2.
Tabel 4.1 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin
4.2.3 Uji Kecermatan (Akurasi)
Selanjutnya dilakukan uji kecermatan atau uji akurasi. Kecermatan
adalah ukuran yang menunjukan kedekatan hasil yang diperoleh dari hasil
pengamatan dengan hasil yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan
sebagai % diff. ICH Guideline (2005) merekomendasikan uji akurasi
dilakukan dengan menggunakan minimal 9 kali penentuan terhadap
minimal 3 tingkat konsentrasi yang mencakup rentang konsentrasi yang
telah ditetapkan. Pada penelitian ini uji kecermatan dilakukan dari 3
konsentrasi berbeda hidroksiprolin yaitu 5 ppm, 10 ppm dan 16 ppm.
Masing-masing konsentrasi dibuat 3 kali pengulangan sehingga diperoleh
Parameter Nilai
0,00021361
S (y/x) 0,006536207
LOD (Limit of Detection) 0,691 ppm
LOQ (Limit of Quantitation) 2,094 ppm
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
9 larutan. Selanjutnya masing-masing larutan diukur serapannya
menggunakan spektrofotometri UV-Vis.
Kadar
(ppm)
Rata-rata
% diff Rata-Rata % diff
5 0,384
-0,386 10 -1,089
16 -0,454
Tabel 4.2 Hasil Uji Rata-Rata % diff
Dari percobaan yang dilakukan didapatkan nilai rata-rata % diff
masing-masing konsentrasi yaitu untuk konsentrasi 5 ppm nilai rata-rata %
diff sebesar 0,384%, untuk konsentrasi 10 ppm nilai rata-rata % diff
sebesar -1,089%, untuk konsentrasi 16 ppm nilai rata-rata% diff sebesar
-0,454%. Syarat nilai % diff yang baik yaitu tidak lebih dari +2% dan -2%
(Harmita, 2006). Hasil rata-rata % diff semua konsentrasi yaitu -0,386%.
Dari hasil percobaan yang dilakukan diperoleh data yang telah memenuhi
persyaratan sehingga dapat dikatakan memberikan hasil uji akurasi yang
baik sehingga metode analisis yang dilakukan cukup akurat dan dapat
memberikan hasil yang baik pada pengukuran sampel. Hasil uji akurasi
dapat dilihat pada Tabel 4.2 Data hasil uji presisi selengkapnya dapat
dilihat pada Lampiran 7 tabel 5.3.
4.2.4 Uji Keseksamaan (Presisi)
Uji selanjutnya yang dilakukan yaitu uji keseksamaan (uji presisi).
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara
hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-
rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang
diambil dari campuran yang homogen. Pada uji presisi dilakukan pada 3
konsentrasi yaitu 5 ppm, 10 ppm, dan 16 ppm. Dibuat 3 kali pengulangan
masing-masing konsentrasi sehingga diperoleh 9 larutan. Selanjutnya
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
masing-masing larutan diukur serapannya menggunakan spektrofotometri
UV-Vis.
Tabel 4.3 Hasil Uji Rata-Rata Presisi
Dari percobaan yang dilakukan untuk konsentrasi 5 ppm diperoleh
nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,035% dan nilai SD
(Standard Deviation) sebesar 0,178, untuk konsentrasi 10 ppm diperoleh
nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,021% dan nilai SD
(Standard Deviation) sebesar 0,215, dan untuk konsentrasi 16 ppm
diperoleh nilai %RSD (Relative Standard Deviation) sebesar 0,092% dan
nilai SD (Standard Deviation) sebesar 1,477. Syarat uji presisi yang baik
yaitu nilai %RSD (Relative Standard Deviation) ≤ ±2% dan nilai SD
(Standard Deviation) sebesar ≤ ±2 (Harmita, 2004). Hasil rata-rata %RSD
semua konsentrasi yaitu 0,050% dan rata-rata standar deviasi semua
konsentrasi yaitu 0,623. Dari hasil percobaan yang telah dilakukan
diperoleh data yang telah memenuhi persyaratan sehingga dapat dikatakan
memberikan hasil presisi atau keseksamaan yang baik. Hasil uji presisi
dapat dilihat pada Tabel 4.3. Data hasil uji presisi selengkapnya dapat
dilihat pada Lampiran 8 tabel 5.4.
Kadar (ppm) Rata-rata kadar yang
diperoleh (ppm) SD RSD (%)
5 5,019 0,178 0,035
10 9,891 0,215 0,021
16 15,927 1,477 0,092
Rata-rata 0,623 0,050
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.4 Hasil Validasi Metode Penetapan Kadar Asam Amino
Hidroksiprolin
Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat dilihat bahwa semua hasil
uji yang didapat telah memenuhi syarat sebagai parameter uji validasi
metode penetapan kadar hidroksiprolin. Sehingga metode yang digunakan
untuk penetapan kadar hidroksiprolin dikatakan valid dan dapat
memberikan hasil yang baik dalam pengukuran sampel selanjutnya.
4.3 Analisis Sampel Gelatin
Pada proses preparasi sampel gelatin, dilakukan reaksi hidrolisis
asam terlebih dahulu menggunakan HCl 6 N pada suhu 110oC
selama 12
jam dalam tabung kaca tertutup agar sampel tidak menguap pada saat di
inkubasi dalam oven. Hidrolisis ini dilakukan untuk memecah ikatan amin
pada asam amino sehingga diperoleh asam amino dalam keadaan bebas.
Setelah sampel dihidrolisis dengan HCl 6 N sampel dinetralkan dengan
penambahan NaOH 4 N. Larutan yang telah netral dipreparasi sesuai
prosedur. Larutan sampel yang mengandung hidroksiprolin akan berubah
warna menjadi merah. Selanjutnya masing-masing larutan sampel diukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometri UV-Vis pada panjang
gelombang maksimal 563,5 nm.
No Parameter Hasil Persyaratan
1. Koefisien korelasi (r) 0,9991 0,9980 (AOAC,
2002)
2. LOD (Limit of Detection) 0,691 ppm -
3. LOQ (Limit of Quantitation) 2,094 ppm -
4. Akurasi % diff -0,384 ≤ ±2% (Harmita,
2006)
5. Presisi
% RSD 0,050 ≤ ±2% (Harmita,
2004)
SD 0,623 ≤ ±2 (Harmita,
2004)
36
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 4.4 Grafik Hasil Analisis Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel
Gelatin
Hasil dari penetapan kadar dari seluruh sampel yang telah diperiksa
akan menghasilkan data absorbansi. Kadar hidroksiprolin dalam sampel
dapat dihitung menggunakan persamaan linier yang didapat dari kurva
kalibrasi yaitu y=0,0312x-0,0026 dengan cara memasukkan nilai
absorbansi sampel. Sampel pertama yaitu sampel sapi dan diperoleh rata-
rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,255 dan kadar
hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 8,277 ppm. Sampel
kedua yaitu sampel babi dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali
pengukuran sebesar 0,430 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang
diperoleh sebesar 13,886 ppm. Sampel ketiga yaitu sampel sapi dan
diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,313 dan
kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh sebesar 10,126 ppm.
Sampel keempat yaitu sampel sapi dan diperoleh rata-rata absorbansi
setelah 3 kali pengukuran sebesar 0,529 dan kadar hidroksiprolin dalam
sampel yang diperoleh sebesar 17,038 ppm. Sampel kelima yaitu sampel
kambing dan diperoleh rata-rata absorbansi setelah 3 kali pengukuran
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1
Grafik Kadar Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin
Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 Sampel 5
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sebesar 0,325 dan kadar hidroksiprolin dalam sampel yang diperoleh
sebesar 10,500 ppm. Semua sampel mengandung hidroksiprolin dengan
kadar yang berbeda-beda karena menggunakan sumber bahan baku yang
berbeda yaitu sapi, babi dan kambing. Pada sampel nomor 1, 3, dan 4
menggunakan bahan baku yang sama yaitu sapi tetapi proses ekstraksi
bahan baku menjadi gelatin dilakukan dengan cara yang berbeda sehingga
diperoleh kandungan kolagen pada gelatin yang berbeda pula. Hal ini
mengakibatkan kadar hidroksiprolin dalam gelatin juga tidak sama. Hasil
uji analisis sampel dapat dilihat pada Gambar 4.4. Data hasil analisis
hidroksiprolin pada sampel dapat dilihat selengkapnya pada lampiran 9
tabel 5.5.
38 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Parameter validasi untuk penetapan kadar asam amino hidroksiprolin
meliputi uji linearitas, LOD (batas deteksi), LOQ (batas kuantitasi), uji
akurasi (% diff), dan uji presisi (relatif standar deviasi dan standar
deviasi). Berdasarkan hasil validasi metode tersebut dapat disimpulkan
bahwa metode analisis hidroksiprolin yang digunakan dalam penelitian
ini valid karena telah memenuhi persyaratan.
2. Sampel pertama mengandung hidroksiprolin sebesar 8,277 ppm,
sampel kedua sebesar 13,886 ppm, sampel ketiga sebesar 10,126 ppm,
sampel keempat sebesar 17,038 ppm dan sampel kelima sebesar
10,500 ppm.
5.2 Saran
Sebaiknya pada penelitian selanjutnya dilakukan analisis penetapan
kadar hidroksiprolin dalam produk yang beredar dipasaran seperti kapsul
lunak dan kapsul keras.
39 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Almatsier, S. 2006. Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama.
Amin, B., Viviane, P., Alain, R., Jacques, P.B. 1982. A New Sensitive Method for
the Quantitative Evaluation of the Hydroxyproline Isomers. Analytical
Biochemistry, 122:52-57.
Anonim. 2005. ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of Analytical
Procedures : Text and Methodology.
Ardianingsih, Retno. 2009. Penggunaan HPLC Dalam Deteksi ION. Berita
Dirgantara, 4 (10):101-104.
Association of Analytical Communities. 2002. AOAC Guidelines for Single
Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplement and
Botanicals.
Bailey, P.D. 1990. An Introduction to Peptide Chemistry. Wiley Interscience.
New York.
Bustillos, R.J.A., C.W. Olsen., D.A. Olson, B. Chiou, E. Yee, P.J. Bechtel and
T.H. McHugh. 2006. Water vapor permeability of mammalian and fish
gelatin films. Journal of Food Science, 4(71):202-207.
Cassab, Gladys I. 1998. Plant Cell Wall Protein. Plant Mol Biol, 49:281-309.
Daniela, O.A. 2014. Study and determination of meat products quality. Journal of
Agroalimentary Processes and Technologies, 20(4):363-368.
Darwin, J.Prockop and Sidney, Udenfriend. 1960. Specific Method for the
Analysis of Hydroxyproline in Tissues and Urine. Analytical Biochemistry,
1:228-239.
Dewi, H., and Iriane, S. 2007. Pengenalan dan Proses Pembuatan Gelatin. Jurnal
ilmu-ilmu pertanian, 1(3):39-48.
Dhillon, M.K. Sandeep,K., G.T,Gujar. 2014. A Common HPLC-PDA Method For
Amino Acid Analysis In Insects and Plants. Indian Journal of Experimental
Biologi, 52:73-79.
Ditjen POM. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Jakarta: Departemen
Kesehatan RI. Jakarta.
Elijah, Adams and Leonard, Frank. 1980. Metabolism of Proline And The
Hydroxyproline. Ann. Rev. Biochem, 49:1005-1061.
40
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Eriawan, R., Idah, R., Prasetyawan, Y., Olivia, B., Erna, Y. 2013. Efektifitas
Khasiat Pengobatan Luka Bakar Sediaan Gel Mengandung Fraksi Ekstrak
Pegagan Berdasarkan Analisis Hidroksiprolin dan Histopatologi Pada Kulit
Kelinci. Bul Penelit Kesehatan, 1(41):45- 60.
Fischer, E. 1902. Gelatin Manufacturers Institute of America.USA. 35:2660-2665.
George, Carlson. 2009. Determination of Hydroxyproline Content as a Measure of
Fibrosis in Nondystrophic and Dystrophic Skeletal Muscle.
Gholib, Ibnu dan Abdul, Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta :
Pustaka Pelajar.
Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksananaan Validasi Metoda dan Cara
Perhitungannya. Majalah Ilmu Kefarmasian, 3(1):117-135.
Harmita. 2006. Analisa Fisikokimia. Jakarta : UI Press.
Jaswir, Irwandi. 2007. Memahami Gelatin, http//www.BeritaIptek.Com.
Jitender, K.J., A. Devi, Varaprasad, Reddy, Sunita,M, Hanjabam, M.D., G. Vidya
Sagar Reddy and G. Venkateshwarlu. 2012. Characterization of fish gelatin
from Blackspotted Croaker (Protonibea diacanthus). Archives of Applied
Science Research, 4(3):1353-1358.
Jun, G., Yi, Z., Guiyou,Z., Chengyin,W., Qishu,Q., Xiaoya,H,. Guoxiu,W. 2014.
Determination of Proline, Hydroxyproline, and N–Ethylglycine In Urine By
Using A New HPLC Labeling Reagent and its Application In Detection of
Tumor Markers. Journal of Liquid Chromatography & Related
Technologies.
Kelly, L., Gorres, Ronald, T., Raines. 2010. Review Artikel Prolyl 4-hydroxylase.
USA. University of Wisconsin Madison.
Merinda, H. 2013. Analisis Kadar Protein dan Identifikasi Asam Amino Pada
Ikan Patin. Jurusan Kimia Universitas Jember. (Skripsi).
Munson, J.W. 1991, Analisis Farmasi Metode Modern. Surabaya : Airlangga
University Press.
N. Yu. Ignat’eva., N. A. Danilov., S. V. Averkiev., M. V. Obrezkova., V. V.
Lunin., E. N. Sobol,. 2007. Determination of Hydroxyproline in Tissues and
the Evaluation of the Collagen Content of the Tissues. Journal of Analytical
Chemistry, 1(62):51-57.
41
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pecsok, R.L., L.D.Shileds, T. Cairns, and I.G. Mcwilliam. 1976. Modern methods
of chemical analysis. 2nd ed. John Wiley and Sons, Inc.. New York.
Pier, A.B., Luca, M.C., Maria, R.S. 1997. A New Procedure for the Specific
High-Performance Liquid Chromatographic Determination of
Hydroxyproline. Journal of Chromatographic Science, Vol. 35.
Poedjiadi, A. 2009. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.
Rafik, B., Mourad, J., Assaad, S., Nabil, S., Naima, N.A., Didier, G., Moncef, N.
2011. Extraction and functional properties of gelatin from the skin of
cuttlefish (Sepia officinalis) using smooth hound crude acid protease-aided
process. Journal Food Hydrocolloid.
Rajesh, Kamble, Shrangdher, S.T., Koli, J.M. 2014. Physico-Chemical Properties
Of Gelatin Extracted From Calta Skin (Calta Catla) (Hamilton, 1822).
Indian Journal of Fundamental and Applied Life Sciences, 4:328-337.
Rizky, A.R., Fatimah,N., Elok,M. 2013. Ekstraksi Gelatin dari Tulang Tenggiri
Melalui Proses Hidrolisis Menggunakan Larutan Basa. Jurusan Farmasi
UHAMKA Jakarta.
Sidik, Abubakar. 2009. Struktur dan Fungsi Protein Kolagen. Jurnal Pelangi Ilmu
5(2).
Shila, G. and Natasa, S.B. 2009. Wound healing properties of Carica papaya
latex: In vivo evaluation in mice burn model. Journal of
Ethnopharmacology, 121:338–341.
Skoog, D.A. and D.M. West. 1971. Principles of instrumental analysis. Holt,
Rinehart and Winston, Inc., New York.
Suzanne, M., et al. 1998. High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of
Amino Acid- and Peptide-Derived Chloramines. Journal of
Chromatographic Science, Vol. 36.
Tobias, L., Natividad, G.V., Ralf, H. 2007. Analysis of hydroxyproline isomers
and hydroxylysine by reversed-phase HPLC and mass spectrometry.
Journal of Chromatography B, 847:282-288.
Winarno, FG. 2008. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Wulandari, N. 2007, Validasi Metode Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet untuk
Penentuan Reserpin dalam Tablet Obat, Departemen Kimia FMIPA IPB,
Bogor. (Skripsi).
Yan, X., Xin, W., Xiao, J., Nai, Y., Kuo, C. 2014. Predicting Hydroxyproline and
Hydroxylysine in Proteins by Incorporating Dipeptide Position Specific
42
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Propensity into Pseudo Amino Acid Composition. International Journal of
Molecular Sciences, 15:7594-7610.
43
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
LAMPIRAN
Lampiran 1. Skema Pembuatan Reagen
a. Skema pembuatan HCl 6 N
b. Skema pembuatan NaOH 4 N
c. Skema pembuatan NaCl 0,3 M
Dipipet sebanyak 50 ml larutan HCl
36,7%
Masukkan ke dalam labu ukur
100 ml
Tambahkan aquades sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
Ditimbang sebanyak 16 gram
NaOH
Masukkan ke dalam labu ukur
100 ml
Tambahkan aquades sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
Ditimbang sebanyak 877,5
gram NaCl
Masukkan ke dalam labu ukur
500 ml
Tambahkan aquades sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
d. Skema pembutan larutan chloramin T 7%
e. Skema pembuatan larutan oksidan
f. Skema pembuatan buffer asetat/sitrat pH 6
Ditimbang sebanyak 350 mg chloramin-
T-hidrat
Masukkan ke dalam labu ukur
5 ml
Tambahkan aquades sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
Dipipet sebanyak 2 ml larutan chloramin T
Masukkan larutan ke dalam labu ukur 10 ml
Tambahkan buffer asetat/sitrat pH 6
sampai tanda batas
Kocok sampai homogen
Masukkan 70 ml aquades ke
dalam labu ukur 100 ml
Ditambah 1,2 ml asam asetat glasial
ke dalam labu secara perlahan
5 gram asam sitrat
monohidrat
12 gram natrium asetat
trihidrat
3,4 gram natrium hidroksida
Tambahkan aquades sampai
90 ml
Cukupkan pH sampai 6
Tambahkan aquades sampai 100 ml dan cek
pH kembali
45
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
g. Skema pembuatan reagen ehrlich
PDAB ditimbang sebanyak 12 gram
Tambahkan 20 ml etanol absolut
Larutan A
Larutan asam sulfat dipipet sebanyak 2,74 ml
Tambahkan 20 ml etanol absolut
Larutan B
Tambahkan larutan B ke dalam larutan A
Aduk sampai homogen lalu masukkan larutan ke dalam
kulkas
Tunggu larutan sampai terbentuk kristal
46
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 2 Skema Kerja Pembuatan Larutan Blanko
Pipet aquades sebanyak 10 ml
larutan
Masukkan larutan ke dalam labu ukur
25 ml
Tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat
pH 6
Tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
Pipet larutan sebanyak 1 ml
larutan
Masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup
Tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan
600 µl
Vortex selama 4 menit
Tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4
ml
Inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC
diatas shakingbath
Amati serapan dengan spektrofotometri UV-Vis pada panjang
gelombang 400-800 nm
47
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 3 Bagan Skema Kerja
a. Skema pembuatan larutan baku hidroksiprolin
Larutan Baku
Larutan baku induk hidroksiprolin 1000
ppm
Ditimbang sebanyak 10 mg standar hidroksiprolin
Masukkan serbuk ke dalam labu ukur 10 ml
Tambahkan aquades sampai tanda batas dan
kocok sampai homogen
Larutan baku kerja 100 ppm
Dipipet sebanyak 5 ml dari larutan induk hidroksiprolin 1
mg/ml
Masukkan larutan ke dalam labu ukur 50 ml
Tambahkan aquades sampai tanda batas dan
kocok sampai homogen
48
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
b. Skema penentuan panjang gelombang maksimum 9 ppm
Dipipet sebanyak 0,9 ml larutan
standar hidroksiprolin 100
ppm
Masukkan larutan ke dalam labu ukur
10 ml
Tambahkan aquades sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
Masukkan semua larutan (10 ml) ke
dalam labu ukur 25 ml
Tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat
pH 6
Tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
Pipet sebanyak 1 ml larutan
Masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup
Tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan
600 µl
Vortex selama 4 menit
Tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4
ml
Inkubasi selama 25 menit pada suhu
60oC diatas shakingbath
Amati serapan dengan
spektrofotometri UV-Vis pada panjang
gelombang 400-800 nm
49
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
c. Skema kerja pembuatan kurva kalibrasi 3, 6, 9, 12, 15, 18 ppm dan penentuan
linearitas
Pipet sebanyak 0,3, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, dan
1,8 ml dari larutan standar
hidroksiprolin 100 ppm
Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam labu ukur
10 ml
Tambahkan aquades sampai tanda batas dan kocok sampai
homogen
Masukkan masing-masing larutan (10 ml) ke dalam labu
ukur 25 ml
Tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat
pH 6
Tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai
tanda batas
Kocok sampai homogen
Pipet masing-masing larutan sebanyak 1 ml
larutan
Masukkan masing-masing larutan ke
dalam tabung reaksi tertutup
Tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan
600 µl
Vortex selama 4 menit
Tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4
ml
Inkubasi selama 25 menit pada suhu 60oC
diatas shakingbath
Amati serapan dengan spektrofotometri UV-Vis pada
panjang gelombang 400-800 nm
50
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 4 Skema Analisis Hidroksiprolin dalam Sampel Gelatin Secara
Kuantitatif
Timbang sebanyak 10 mg
sampel
Hidrolisis sampel dengan
menambahkan HCl 6 N sebanyak 5 ml
Inkubasi sampel selama 12 jam
pada suhu 110oC di dalam oven
Sampel dinetralkan dengan cara
menambahkan NaOH 4 N
Pipet larutan sampel sebanyak
1 ml larutan
Masukkan larutan ke dalam labu
ukur 25 ml
Tambahkan 2 ml buffer asetat/sitrat
pH 6
Tambahkan larutan NaCl 0,3 M sampai tanda
batas
Kocok sampai homogen
Pipet larutan sebanyak 1 ml
larutan
Masukkan larutan ke dalam tabung reaksi tertutup
Tambahkan isopropanol 300 µl dan larutan oksidan 600 µl
Vortex selama 4 menit
Tambahkan reagen ehrlich sebanyak 4 ml
Inkubasi selama 25 menit pada suhu
60oC diatas shakingbath
Amati serapan dengan spektrofotometri UV-Vis pada
panjang gelombang 400-800 nm
51
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 5 Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas
Tabel 5.1 Hasil Data Uji Linearitas Larutan Standar Hidroksiprolin
Keterangan :
Persamaan regresi : y=0,0312x-0,0026
Koefisien korelasi (r) : 0,9991
Panjang gelombang maksimum : 563,5 nm
Konsentrasi (ppm) Absorbansi
0 0
3 0,089
6 0,185
9 0,280
12 0,368
15 0,455
18 0,568
52
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 6 Batas Deteksi dan Kuantitasi
Tabel 5.2 Hasil Uji Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Hidroksiprolin
Konsentrasi (ppm) Absorbansi (y) y' y - y' (y - y')2
0 0 -0,0026 0,0026 0,00000676
3 0,0895 0,091 -0,0015 2,25E-06
6 0,1850 0,1846 0,0004 1,6E-07
9 0,2805 0,2782 0,0023 5,29E-06
12 0,3685 0,3718 -0,0033 1,089E-05
15 0,4555 0,4654 -0,0099 9,801E-05
18 0,5685 0,559 0,0095 9,025E-05
Jumlah 0,00021361
S(y/x) = √
= √
= √
= √ = 0,006536207
LOD =
=
= 0,691 ppm
LOQ =
=
= 2,094 ppm
53
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 7 Uji Kecermatan (Akurasi)
Tabel 5.3 Data Uji Akurasi (%diff)
Kadar
(ppm) Absorbansi
Kadar yang
diperoleh (ppm) % diff
Rata-rata
% diff
5
0,148 4,826 -3,461
0,384 0,159 5,179 3,589
0,155 5,051 1,025
10
0,300 9,698 -3,012
-1,089 0,320 10,339 3,397
0,298 9,634 -3,653
16
0,521 16,782 4,887
-0,454 0,503 16,205 1,282
0,459 14,794 -7,532
Rata-rata -0,386
54
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 8 Uji Keseksamaan (Presisi)
Tabel 5.4 Data Uji Keseksamaan Pada Tiga Konsentrasi Hidroksiprolin
Kadar
(ppm) Absorbansi
Kadar yang
diperoleh
(ppm) (x)
x-x' (x-x')2
SD RSD (%)
5
0,148 4,826 -0,192 0,036
0,178 0,035 0,159 5,179 0,160 0,025
0,155 5,051 0,032 0,001
x’ = 5,019 ∑ = 0,063
10
0,300 9,698 -0,192 0,036
0,215 0,021 0,320 10,339 0,448 0,201
0,298 9,634 -0,256 0,065
x’ = 9,891 ∑ = 0,304
16
0,521 16,782 0,854 0,730
1,477 0,092 0,503 16,205 0,277 0,077
0,459 14,794 -1,132 1,282
x’ = 15,927 ∑ = 2,090
Rata-rata 0,623 0,050
55
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 9 Uji Sampel Gelatin
Tabel 5.5 Data Uji Kandungan Hidroksiprolin Dalam Sampel Gelatin
Sampel Absorbansi Rata-rata
absorbansi Kadar (ppm)
Rata-rata
kadar (ppm)
Sampel 1
0,280
0,255
9,057
8,277 0,247 8,000
0,240 7,775
Sampel 2
0,450
0,430
14,506
13,886 0,401 12,935
0,441 14,217
Sampel 3
0,275
0,313
8,897
10,126 0,345 11,141
0,320 10,339
Sampel 4
0,500
0,529
16,109
17,038 0,587 18,897
0,500 16,109
Sampel 5
0,322
0,325
10,403
10,500 0,334 10,788
0,319 10,307
56
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 10 Rumus-Rumus
Tabel 5.6 Rumus-Rumus
Nama Rumus Formula
Sb Sy/x = √
LOD LOD =
LOQ LOQ =
%diff % diff =
SD SD = √
%RSD RSD =
57
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 11 Perhitungan Konsentrasi Hidroksiprolin
Konsentrasi awal = 10 mg dalam 10 ml aquades = 1000 ppm
Konsentrasi untuk larutan kerja 100 ppm
5 ml Hidroksiprolin 1000 ppm dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml,
kemudian dicukupkan dengan aquades hingga tanda batas.
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 1000 ppm = 50 ml x 100 ppm
V1 = 5000 / 1000
= 5 ml
Dari larutan kerja 100 ppm, kemudian diambil beberapa ml dan dicukupkan
dengan aquades hingga garis batas pada labu 10 ml sehingga diperoleh larutan
yang mengandung 3 ppm, 6 ppm, 9 ppm, 12 ppm, 15 ppm dan 18 ppm.
Contoh untuk larutan hidroksiprolin yang mengandung 9 ppm
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 100 ppm = 10 ml x 9 ppm
V1 = 900 / 100
= 9 ml
58
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 12 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi
Gambar 5.1 Perubahan Warna Larutan Hidroksiprolin Hasil Derivatisasi
Penambahan
Buffer asetat/sitrat pH 6
Nacl
Isopropanol
Chloramin T
Penambahan
Reagen ehrlich
Setelah inkubasi selama 25
menit suhu 60oC