Graziele Fonseca de Sousa

Gene ERBB25

Codifica o receptor tipo 2 do fator de

crescimento epidérmico

humano(HER2)

Cerca 20% -30% das mulheres com câncer de mama

apresentam amplificação de

ERBB2

HER2 biomarcador para o câncer de mama

A tirosina quinase desempenha um papel fundamental na regulação dos processos como o crescimento celular, sobrevivência e diferenciação.

http://www.roche.pt/sites-tematicos/her2/index.cfm/her2_e_o_cancro/o-que-e-o-her2/

TrastuzumabA Trastuzumab é potencialmente nocivo para os pacientes sem a produção de HER2, porque ele utiliza o mesmo receptor encontrado em tecido cardíaco não patológico, podendo causar cardiotoxicidade e em alguns casos, morte.

Porque utilizar os ensaios de FISH e IHQ?

• São métodos comumente utilizados para a avaliação de superprodução da proteína ou amplificação do gene em relação as características morfológicas tumorais;

• Ao contrário das técnicas moleculares, não requer homogeneização do tumor;

No entanto os resultados de aproximadamente 20% dos testes de HER2 realizados no departamentos de patologia nos locais de tratamento primário mostraram-se incorretos quando as amostras eram  reavaliadas em um alto volume no laboratório central.

ObjetivosGerar a produção de materiais de

referência para estudar a utilização do IHQ e FISH para quantificação e caracterização das linhas celulares SKBR-3 e MCF-7 de carcinoma de mama HER2 em termos de produção e amplificação de ERBB2, respectivamente, e para examinar a adequação destas linhas celulares como controles para os teste de HER2.

Materiais e Métodos Linhas celulares de carcinoma de mama SK-BR-3 e MCF-

7;

Anticorpo anti-HER2 IgY de frango;

Anticorpo monoclonal anti-HER2 IgG de camundongo;

Anticorpos secundários, anti-IgY biotinilada (Genway Biotech) e anticorpo anti-IgG biotinilada (Ventana);

Sonda de DNA para o gene ERBB2 foi a BAC;

Os anticorpos e a sonda foram detectados por microscopia de fluorescência com estreptavidina-Qdot 655 (Invitrogen) como o reagente de detecção final de afinidade.

Imunohistoquímica ( IHQ)

O anticorpo conjugado a uma enzima, pode catalisar uma reação que produzirá

coloração.

Hibridização Fluorescente In Situ (FISH)

http://www.biomedicinapadrao.com/2012/03/hibridizacao-fluorescente-in-situ-fish.html

Resultados

Para os experimentos FISH em células FFPE, foi utilizado o sonda da HER2 Ventana em vez do sonda BAC CTD-2019C10 usado para células cultivadas fixas e foi utilizado o corante orgânico fluoresceína isotiocianato como o rótulo em vez de Qdot 655.

Discussão

Teste deHER2

Trastuzumab

Tratamento adequadoNegativo

Positivo

Seleção de pacientes para terapia:

Imprecisão observada na prática clínica e em ensaios clínicos:

• Falta de padrões de referência;

• Falta do uso de calibradores do ensaio.

Acreditasse que os materiais de referência ideais para padrões e calibradores em testes de HER2 (bem como outros biomarcadores) possam ser as linhas celulares.

• As linhas de células podem ser cultivadas em vitro;

• Podem ser fixadas e processadas de maneira semelhantes aos das amostras histopatológicas;

• Obtenção de um duradouro banco de material de controle, fornecendo assim a reprodutibilidade e coerência entre os diferentes ensaios.

• A utilização de materiais com base em células de referência será útil para ambos os teste IHQ e FISH.

Sistema de utilização de 2

linhas de células

SK-BR-3

MCF-7

Caracterização da produção da

proteína HER2 e a amplificação do

geneERBB2

contêm aproximadamente

10x mais cópias do gene ERBB2 e cerca

de 15x mais quantidade da proteína HER2

FISH E IHQ

Utilizado como controle devido ao pequeno número

de cópias de ErbB2 em nestas

células.

Conclusões Demonstraram que SK-BR-3 e MCF-7

são candidatos adequados como materiais de referência para o teste HER2. Acoplado com as plataformas de ensaio associados, eles fornecem valiosos controles quantitativos para a medição de amplificação de HER2 no câncer de mama e de produção nas amostras, independentemente do anticorpo/ sonda ou detector usado.