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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR AREA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MARINA BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FOSFATOS INORGANICOS ASOCIADAS A LA RIZOSFERA DE LOS MANGLES Avicennia germinans L L Y Laguncularia racemosa L Gaertb T E S 1 S QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE BIOLOGO MARI NO P R E S E N T A PATRICIA V AZQUEZ CORREA LA PAZ B C S MAYO DE 1996
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE
BAJA CALIFORNIA SUR
AREA INTERDISCIPLINARIA DE CIENCIAS DEL MAR
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MARINA
BACTERIAS SOLUBILIZADORAS DE FOSFATOS INORGANICOSASOCIADAS A LA RIZOSFERA DE LOS MANGLES Avicennia
germinans L L Y Laguncularia racemosa L Gaertb
T E S 1 S
QUE COMO REQUISITO PARA
OBTENER EL TITULO DE
BIOLOGO MARI NO
P R E S E N T A
PATRICIAVAZQUEZ CORREA
LA PAZ B C S MAYO DE 1996
t tØ711
jS0Jò
Río DE SUEÑOSBilly Jcel
En medio de la nod1e voy caminando en mi sueæo
desde mætaæas de fe
hacia un río tanprofundoDebo de estar buscando algo
algo sagrado que perdípero elrío es ancho y dificil de crnzar
yaunque se que elrío es ancho
camino cada tarde me quedo en la orilla
ytrato de pasar alIado opuestoasí puedo finalmente encontrar
loque he estado buscando
En medio de la nod1e voycaminando en mi sueæo
atravesando elvalle de temor
haciaun río tan profundoHe estado buscando algo sacado de mi alma
algo que nuncaperderíaalgo que alguien robo
No se por que voy caminando en la nod1e
pero ahora estoy cansado no quiero caminar mÆs
pero espero notomar el descanso de mi vidahasta encontrar lo que estado buscando
En medio de la nod1e voy caminando en mi sueæo
atravesando la jungla de dudas
haciaun río tanprofundoSe que estoy buscando algoalgo tan indefinido que sólo
puede ser visto porlos ojos delciegoen medio dela nod1e
No estoy seguro de la vida despuØs de esto
Dios sabe que nuncahe sido un hombre espiritualbautizado por el fuego avanzodentro del río
que correhacialatierra prometida
En medio de la nod1e voy caminando en mi sueæo
atravesando el desierto de la verdad
haciaun río tanprofundoTodosterminamos en elocØano
todos comenzamosen los riachuelos
todos juntos somos llevados
por elrío de sueæos
en medio de la nod1e
traducción
Con mucho cariæo dedico esta tesis a
A mis padres quienes me dieron este gran tesoro que es la vida
A mi abuelita Naty de quien conservo
la mejor de las herencias su inmenso y profundo amor
A mis hermanas y hermanos
Olivia Rocío Yesica
Juan y Enriquequienes tienen en sus manos la posibilidad de crear un mundo mejor
A mis tíos y primos por todo el afecto que de ellos conservo y en especial a toda la familia Burela Picazzo
de quien recibí mucho cariæo y a ti JosØ mi hado padrino por tu apoyo
A mi inolvidable compaæera Angelina HemÆndez 2
y a su familia
en recuerdo a su memoria
A mis amigas estrellas fugaces que aparecen y desaparecen mÆs sin embargo aunque no las vea se que se
encuentran en un lugar especial del corazón y en mis canciones Porque juntas compartimos nuestros
sueæos por llegar a ser alguien en la vida y luchamos por encontrar la luz de nuestra verdad Con ellas
aprendí a pintar muchos de los matices que tiene la vida Por todo su cariæo apoyo confianza consejos y
su gran gran amistad
Ana Rosa Reyes Tania Díaz Mary DurÆn Caridad Ponce Yesmit Rueda Carmen Muæoz AngØlicaAguilar Ney ChÆvez Mary Montiel Lucina Carpio Leticia Romero Martha JimØnez Esther Martínez
Alicia Olascuaga Araceli GaitÆn Lourdes Sauza yolanda Delgado Patty León Catalina HemÆndez y
Lourdes Esquivel
A mi amiga y compaæera de quien aprendí muchas cosas y con quien compartí triunfos tristezas desvelos
y tazas de cafØ Bulmara ZÆrate
A Elizabeth O leary la gran amiga en mis buenos y caóticos momentos
A Gina Holguin y Edith Oropeza quienes han sido mis amigas incondicionales mehan dado su confianza
todo su apoyo y cariæo
A Amada Reyes y Carlos Palacios por su gran amistad apoyo compaæía consejos y comprensión
A Fabiola Julian y Mauro mis primeros amigos aquí en La Paz
A mis inolvidables amigos Dario Mora mi Ængel de la guarda Julio Rodríguez Roberto López AdriÆn
VelÆzquez y Rafael García
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo es el resultado no sólo de un esfuerzo sino de muchos Un grano de arena no puedecrear una playa ni una ola forma todo el mar No son todos los que fueron mil disculpas por ello a cada
persona que he conocido le agradezco porque de alguna u otra forma siempre meha enseæado algo
A mis asesores M C Gina Holguin y el Dr Yoav Bashan agradezco infinitamente su confianzasu apoyo y todo el tiempo que invirtieron en mi iniciación en el complejo e interesante mundo microscópico
Agradezco a los miembros de la comisión revisora de esta tesis Me David Siqueiros IBQAurora Rebolledo y Biól Martha Vicencio quienes contribuyeron con sus comentarios para mejorar este
trabajo
Agradezco al Centro de Investigaciones Biológicas del Noroeste por pennitirme el uso de sus
instalaciones y la beca alimenticia que otorga a los tesistas A todos mis compaæeros de todas las divisiones
por su valiosa ayuda En especial a todos los miembros del departamento de Microbiología quienes me
ofrecieron su ayuda material y moral durante el desarrollo de mi trabajo
Al Dr Alejandro López agradezco sus valiosas sugerencias y la toma de fotomicrografías al
microscopio de fase
Agradezco a mi amigos el Dr Francisco López por sus valiosos comentarios y su asesoría
respecto a la cromatografía de gases así como a la Ing Bioq Esther Puente ya la Me Lilia Alcaraz y
quienes me ayudaron a resolver algunos de mis pequeæos grandes problemas en la parte experimental
A los Ing Bioq Iban Murillo y Francisco HemÆndez agradezco su ayuda en lo referente al montajede la tØcnica de ortofosfatos
TambiØn agradezco al TØcnico Ariel Cruz quien elaboró el programa del cromatógrafo para elanÆlisis de Æcidos orgÆnicos así como su tiempo y la disposición para enseæarme y ayudarme a correr las
muestras problema
Agradezco a la Sub Dirección de InformÆtica especialmente al p Ing en Sis Comp Edgar Yuen
por el escaneo de los cromatogramas mapa de Balandra y Ærbol de mangle a Sergio Rosas por su valioso
trabajo de fotografía y a la Ing en Sis Comp Carlota Altamirano por su ayuda en la toma de diapositivasen el palette
A la Bióloga Amada Reyes agradezco su asesoría en los diferentes programas de computación quede mucho mehan servido así como su trabajo de fotografía en el Manglar de Balandra
A la Ing Bioq Flor JimØnez por su mediación entre el Instituto Tecnológico de la Paz y una
servidora para conseguir algunos reactivos que me fueron indispensables
A todos los profesores de quienes aprendí en alguna etapa de mi educación no sólo cosas de la
escuela sino que tambiØn de la vida muy en especial a las maestras Patricia García y Carolina Rojas de
quienes siempre recibí ayuda cariæo y consejos A la maestra Alicia Peæafiel por su apoyo invaluable
A mis compaæeros generación de la UABC S Gina Brabata Gerardo Verdugo Galdino
Alarcón Miriam Rosales Ricardo Rosas Raœl Morales Jorge A Gómez Gallardo Richard Hewitt y
Rolando Bastida por todos los momentos que pasamos juntos durante la carrera
A Edith Oropeza y Miguel Díaz por ofrecerme todas las facilidades para seguir adelante con la
tesis por su gran amistad TambiØn a ti JosØ gracias por tu cariæo
Mi agradecimiento muy en especial a los esposos Tere e Issac por todo el apoyo moral y
gastronómico recibido
A Laura San Vicente y Roberto López por su apoyo incondicional en todo momento y su amistad
A la Sra Laura Maldonado por sus consejos y a Guadalupe Pineda por su apoyo confianza y su
canto
A mis amigas y amigos Rosa 1 Lujano Dalia Gómez Roxana Inohuye Juan Carlos PØrez SergioRosas Rosalba Murillo Marbella López Flor JimØnez Conny Gómez Patty HemÆndez Lourdes
Morquecho Laura Rivera Lucia Ramírez Angel Carrillo Reina Martínez Carlos Ruy y FemÆndo Vegaa todos mil gracias por su amistad y las porras para seguir adelante
A la persona a quien mÆs admiro Mi hermana Olivia agradezco todo lo que has hecho por
nosotros tu familia
INDICE
RESUMEN
1 INTRODUCCION 1
2 OBJETIVOS 9
3 AREA DE ESTUDIO 10
4 MATERIALES Y METODOS
4 1 Muestreo 12
4 2 Aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosfato inorgÆnico B S FI 13
4 3 Determinación del potencial de solubilización de fosfato inorgÆnico y crecimiento
poblacional 14
4 4 E d ifi d d 15xtracclOn e 1 ent caclOn e aCl osorgamcos
4 5 Diseæo experimental y anÆlisisestadístico
16
5 RESULTADOS
5 1 AnÆlisis químicos del agua y suelo 17
5 2 Aislamiento 18
5 3 Crecimiento poblacional bacteriano 20
54 Determinación del potencial de solubilización deB amyloliquefaciens y B licheniformis 23
5 5 Indentificación y cuantificac˛ón de ÆcidosorgÆnicos
25
6 DISCUSION 27
8 RECOMENDACIONES 3 8
9 LITERATURA CITADA 39
APENDICE
1 Constituyentes del medio de aislamiento para organismos solubilizadores de fosfato de
acuerdo a Sundara Rao y Sinha 1963 modificado 1 SRSM1 i
n Constituyentes del medio para la reactivación y preservación de microorganismos
solubilizadores de fosfato de acuerdo a Sundara Rao y Sinha 1963 modificado 2
SRSM2 ii
III Determinación del potencial de solubilización de fosfatoinorgÆnico
iii
IV E d dxtracClon e aCl os orgamcos v
C ifi d duant caClon e aCl os orgarncos V1
V Programa de operación del Cromatógrafo de gases vii
VI Cromatogramas del experimento 1 Identificación de Æcidos orgÆnicos producidos
por las B S FI con base a sus tiempos deretención
viii
vn Cromatogramas del experimento 2 Identificación de Æcidos orgÆnicos producidos
por las B S F 1 con base a sus tiempos deretención
xii
RESUMEN
La actividad solubilizadora de la comunidad microbiana de la rizósfera de los mangle s
Avicennia germinans y Laguncularia racemosa fue comprobada por la clarificación del medio
líquido de enriquecimiento con fosfato de calcio En todos los matraces con medio de
enriquecimiento que contenían raíces de A germinans se evidenció la actividad solubilizadora de
los microorganismos No obstante solamente en una tercera parte de los matraces que contenían
raíces de L racemosa se evidenció la solubilización del fosfato de calcio
En este trabajo se lograron aislar las siguientes especies de B S FI asociadas a la rizósfera
de los mangles A germinans y L racemosa Bacillus amyloliquefaciens Bacillus licheniformis
Enterobacter aerogenes Enterobacter taylorae Enterobacter asburiae K uyvera cryocrescens
Pseudomonas stutzeri y Chryseomonas luteo a Unicamente una cepa no fue determinada
taxonómicamente y fue nombrada como A10 La actividad solubilizadora de estos aislamientos
fue evidenciada cualitativamente por la formación de halos ahededor de las colonias al crecerse en
medio sólido con fosfato tribÆsico de calcio
Se determinó el potencial de solubilización para ambas especies de Bacillus En el caso
de B amyloliquefaciens se registró una concentración promedio de fosfato de 395 mgl en un
periodo de 16 días No se encontró diferencia significativa entre la concentración de fosfato
solubilizado y el tiempo Para B licheniformis la concentración mÆxima de fosfato se registró al
segundo día y posteriormente disminuyó manteniØndose constante hasta el dØcimo día Al
comparar el potencial de solubilización con crecimiento poblacional de ambas especies de
Bacillus encontramos que en B licheniformis la mÆxima concentración de fosfato solubilizado se
produjo en presencia del mayor porcentaje de cØlulas vegetativas sin embargo para B
amyloliquefaciens esta relación no pudo ser observada Por otra parte se encontró que la
esporulación para B amyloliquefaciens ocurrió mÆs rÆpido que en B licheniformis
El mecanismo de solubilización estudiado en este trabajo fue la producción de Æcidos
orgÆnicos Estos Æcidos fueron detectados por cromatografia de gases y su concentración fue
calculada por el mØtodo geomØtrico Entre los Æcidos orgÆnicos producidos por las B S FI se
encontraron principalmente el lÆctico isovalØrico isobutírico y acØtico Para la mayoria de las
cepas aisladas se detectó la presencia de mÆs de un Æcido orgÆnico Hasta donde tenemos
conocimiento este es el primer reporte de producción de Æcidos orgÆnicos por las especies de
B S Fl aisladas bajo estas condiciones glucosa como fuente de carbono y fosfato tribÆsico de
calcio
Se encontró que la concentración de ortofosfatos en el agua del manglar de Balandra fue
de 14 33 lg1 Y los valores de pH de los extractos de suelo de A germinans y 1 racemosa
fueron ligeramente bÆsicos
1
1 INTRODUCCION
El fósforo existe como un componente estructural y funcional de todos los organismos
siendo esencial en todo ser viviente Ehrlich 1990 DespuØs del nitrógeno es el segundo de los
nutrientes requeridos por plantas y microorganismos su principal función radica en participar en
algunos pasos dentro de los procesos de acumulación y liberación de energía durante el
metabolismo celular Alexander 1980
El mar es una parte principal de numerosos ciclos importantes como lo es del ciclo del
fósforo Re Velle y Re Velle 1984 Este puede ser descrito como abierto o sedimentario
debido a que no hay intercambio con la atmósfera Begon el al 1990 La precipitación del
fósforo especialmente en hÆbitats marinos limita grandemente la productividad primaria Atlas y
Bartha 1987 El mayor reservorio de fósforo son las rocas y otros depósitos formados durante
eras geológicas Los fosfatos se incorporan a los ecosistemas por la erosión de estos depósitos o
por fuentes puntuales de descarga como producto de la actividad humana Una parte del fósforo
se deposita en los sedimentos someros y otra se pierde en los sedimentos profundos Odum
1986 Este proceso es unidireccional porque œnicamente cerca de 0 01 millones de toneladas
mØtricas de fósforo son devueltas a la tierra principalmente como guano producto de excreción
de las aves marinas Martin 1970
Cuando estÆ libre en el ambiente el fósforo se encuentra principalmente como Østeres de
fosfato orgÆnico y como fosfato inorgÆnico Los enlaces de fósforo orgÆnico no pueden ser
asimilados por la cØlula en esta forma y debido a que no estÆn disponibles para la mayor parte de
los organismos vivos tienen que ser liberados del compuesto orgÆnico a travØs de la
2
mineralización Esta es acompaæada del rompimiento hidrolítico catalizado por fosfatasas
Ehrlich 1990 En el ambiente marino algunos ortofosfatos pueden ser liberados por la acción
de estas enzimas sobre el detritus Ayyakkanu y Chandramohan 1970 1971 Venkateswaran y
Natarajan 1983
La mineralización del fósforo da como resultado la formación de compuestos inorgÆnico s
y se relaciona con la degradación microbiana de la materia orgÆnica Esta descomposición
mediada por bacterias actinomicetos y hongos es controlada por los siguientes factores i fÆcil
oxidación del sustrato de carbono ii adecuado abastecimiento de nitrógeno iii temperatura y pH
adecuados Mitchell 1974
El fosfato inorgÆnico disuelto existe en el mar principalmente en forma de iones de Æcido
orto fosfórico HlO4 Alrededor del 1 0 estÆ presente como iones PO 43 Y el resto del fosfato
como iones HPot KoroleB1983 Asimismo el 99 6 del PO y el 44 del HPot estÆn
en forma de pares iónicos principalmente formando compuestos con calcio y magnesio Riley y
Chester 1989
La molØcula de Æcido fosfórico no puede considerarse significativa para la nutrición de las
plantas pues sólo se presenta a valores bajos de pH así como el ion trifosfato PO que ocurre a
niveles de pH muy elevados Thompson y Troeh 1980
La mayor parte del fósforo absorbido por las plantas pertenece a la forma de monofosfato
HzP04 que es la mÆs rÆpidamente absorbida Algunas plantas pueden utilizar o incluso requerir
cierta cantidad de difosfato HPot Thompson y Troeh 1980 La importancia del ion HPot es
aœn mayor ya que es el ion dominante en la solución cuando el pH es superior a 7 2 Day el al
1989
3
Las formas solubles de fosfatos inorgÆnico s pueden ser tomadas rÆpidamente por plantas y
organismos y ser asimiladas como fosfatos orgÆnicos El fósforo orgÆnico soluble es liberado de
los organismos por excreción o descomposición La muerte de plantas y organismos superiores
tambiØn produce excreción de fósforo en partículas Por fenómenos de turbulencia y surgencias el
fósforo particulado orgÆnico combinado con detritus orgÆnico e inorgÆnico fosfatos de calcio y
hierro puede liberarse apartir del sedimento Dawes 1986
Debido a la carga elevada del anión pot Øste es rÆpidamente adsorbido sobre las
patiículas de arcilla cargadas y detritus orgÆnico A elevadas concentraciones de fósforo
inorgÆnico disuelto el pot es adsorbido mientras que a bajas concentraciones de fósforo
inorgÆnico disuelto en la columna de agua este anión es liberado de los sedimentos hacia la
columna manteniendo así una concentración ambiental moderada Day et al 1989
Los microorganismo s pueden causar la fijación o inmovilización de fosfato ya sea
promoviendo la formación de precipitados inorgÆnicos depósitos de fosforita o asimilÆndolo en
constituyentes orgÆnicos celulares o en grÆnulos de polifosfato intracelulares Ehrlich 1990
Las formas insolubles de fósforo inorgÆnico fosfatos de aluminio calcio y hierro pueden
ser solubilizadas a travØs de la acción microbiana Ehrlich 1990 Un gran nœmero de bacterias
Pseudomonas Bacillus Micrococcus Flavobacterium hongos Mycobacterium Penicillum
Sclerotium Fusarium Aspergillus y protozoario s entre otros microorganismos son capaces de
crecer en medios con fosfato de calcio CalP04 2 apatita CalP04MF C OH o materiales
insolubles similares como œnica fuente de fosfato Los microorganismos no sólo asimilan el
elemento sino que tambiØn lo hacen soluble en una gran porción liberÆndolo en cantidades
superiores a sus propias demandas nutricionales Alexander 1980 Las cepas responsables son
4
rÆpidamente detectadas por la zona clara producida alrededor de la colonia al crecer sobre medio
sólido con fosfato insoluble Gerretsen 1948 lana y Patel 1984 Raghu y MacRae 1966
Sperber 1957
Existen diversos meCanIsmos por los cuales los microorganismos llevan a cabo la
solubilización de compuestos inorgÆnicos de fósforo Estos mecanismos involucran la producción
de Æcidos inorgÆnico s como sulfhídrico Rudolfs 1922 y Sperber 1958 nítrico y carbónico
Hopkins y Whiting 1916 Sin embargo estos procesos han sido cuestionados en cuanto a su
efectividad y en relación a sus efectos sobre las plantas Rudolfs 1922 demostró que la acidez
producida por el Æcido sulfhídrico en suelos no fue suficiente para solubilizar el fósforo en
cantidades significativas sin embargo esta acidez ocasionó retraso en la maduración de plantas de
soya y en cultivos con suelos de arena donde se produjo suficiente acidez las plantas murieron
El principal mecanismo de solubilización de fosfato inorgÆnico es la producción de Æcidos
orgÆnicos como el resultado del metabolismo de fermentación de bacterias heterótrofas Craven y
Hayasaka 1982 Duff Y Webley 1959 Harrison el al 1972 Raghu y MacRae 1966 Rose
1957 Sperber 1957 Sundara Rao y Sinha 1963
Los Æcidos acØtico butírico lÆctico y muchos otros Æcidos similares resultan de la
fermentación producida por bacterias y hongos sobre carbohidratos proteínas y grasas presentes
en el suelo Estos Æcidos pueden actuar sobre los fosfatos y hacerlos solubles Es posible que
estos Æcidos orgÆnicos puedan acumularse en zonas localizadas como resultado de la degradación
de la materia orgÆnica en cantidades suficientes para incrementar la disponibilidad de fosfato
Hopkins y Whiting 1916
5
Por otra parte Duffy Webley 1959 han demostrado que la liberación de fosfato a partir
de varios tipos de fosfatos insolubles estÆ acompaæada por una marcada quelación del calcio por
el Æcido 2 cetoglucónico producido por bacterias
Aunque la solubilización del fosfato requiere comœnmente de producción de Æcido existen
mecanismos abióticos para la movilización del fosfato En suelos inundados se puede reducir el
hierro de fosfatos fØrricos FePO 2HzO a hierro ferroso Fe P04 2 dando como resultado la
formación de hierro soluble con liberación de fosfato Alexander 1980
Así las bacterias solubilizadoras de fosfato inorgÆnico B S FI en suelos juegan un
importante papel en convertir el fosfato no disponible en una forma œtil Tales bacterias se han
encontrado en la rizósfera de plantas terrestres Sperber 1957 Sundara Rao y Sinha 1963 y en
plantas en suelos sumergidos Raghu y MacRae 1966 Gerretsen 1948 demostró que estos
microorgamsmos ejercen una influencia benØfica en el consumo de fosfatos insolubles o
difícilmente solubles para plantas diversas Se ha encontrado que ademÆs de los beneficios que las
plantas reciben como resultado de la actividad microbiana las plantas contribuyen a su vez a
mantener a las bacterias de la rizósfera metabólicamente activas
La presencia de B S FI en el ambiente marino ha sido reportada en la columna de agua
Ayyakkannu y Chandramohan 1971 Promod y Dhevendaran 1987 y recientemente estas
bacterias se han aislado de la rizósfera del pasto marino Zostera marina en donde se demostró
que los exudado s radiculares aminoÆcidos y glucosa sirven como fuentes de carbono y energía
para estas bacterias Craven y Hayasaka 1982
Se ha demostrado que los manglares estÆn entre las regiones de mÆs alta producción
primaria y que el detritos originado a partir de las hojas de mangle es la principal fuente de
6
compuestos orgÆnicos para la comunidad heterótrofa Odwn y Heald 1975a 1975b Los
manglares no sólo sirven como zonas para la alimentación sino que tambiØn constituyen Æreas de
desove apareamiento protección de estadíos juveniles de nwnerosas especies marinas económica
o ecológicamente importantes y son exportadores de nutrientes a las costas y ocØanos Rico
Gray 1993 Los ciclos abiertos de transporte de materia en los bosques de manglar son
dirigidos por factores fisicos y biológicos que controlan la tasa de importación y exportación de
compuestos orgÆnicos e inorgÆnicos El sinergismo entre los factores fisicos y faunísticos
gobiernan la función del ecosistema Lugo y Snedaker 1974
En sedimentos de manglar se ha demostrado que las bacterias son el grupo de
microorganismos con mayor biomasa La mayor parte del carbono en sedimentos de manglar fluye
a travØs de la actividad bacteriana logrÆndose un reciclamiento de nutrientes muy efectivo el cual
sirve para conservar los escasos nutrientes necesarios para la existencia de algunos manglares
tropicales Along 1988 Se ha sugerido que la explicación a Østo es una relación muy estrecha
entre planta bacteria y nutriente Alongi el al 1993 Los exudados radiculares de plantas de
mangle se difunden hacia los sedimentos proveyendo así a la comunidad bacteriana en sedimentos
de manglar de fuentes de carbono y energía Nedwell el al 1994 La presencia de bacterias
fijadoras de nitrógeno en la rizósfera de mangle Holguin el al 1992 así como la presencia de
cianobacterias fijadoras de nitrógeno asociadas a las raíces aØreas de mangle Toledo Gama
1995 sugieren que estas bacterias contribuyen al bienestar de las plantas de mangle De esta
manera se establece una asociación entre plantas y bacterias donde ambos participantes se
benefician
7
Otros grupos bacterianos que han sido estudiados en sedimentos de manglar son las
bacterias sulfato reductoras y las bacterias pœrpuras fotosintØticas Las bacterias sulfato
reductoras son abundantes en sedimento de manglar las cuales ademÆs de fijar nitrógeno
participan en la liberación de fosfato a travØs de la producción de Æcido sulfhídrico Saxena el al
1988 Por otra parte bacterias pœrpuras fotosintØtica s han sido aisladas exitosamente de los
sedimentos de manglar estas bacterias tienen la capacidad de fijar nitrógeno y producir gas
hidrógeno en ambientes reducidos ricos en sulfuro Vethanayagam 1991
La presencia de bacterias solubilizadoras de fosfatos inorgÆnico s BS FI ha sido
reportada en sedimentos marinos Devendaran y colaboradores 1974 encontraron que en
sedimentos de manglar las B S F I variaron entre 127 x 106 y 10 26 X 106 gsedimento sin
embargo en este estudio no explican el mecanismo por medio del cual estas bacterias solubilizan
el fosfato
Todo lo anteriormente expuesto refleja la complejidad de la comunidad bacteriana
presente en sedimentos de manglar Los factores que regulan la productividad de los manglares
son generalmente similares a los de las marismas y la mayoria de Østos se deben a cambios
ambientales fisicos o químicos incluyendo clima geomorfología intervalo de mareas aporte de
agua dulce pH concentración de nutrientes y salinidad entre otros factores Boto y Wellington
1984 Day el al 1989 El crecimiento del manglar estÆ relacionado principalmente con factores
edÆficos como el fósforo disponible P04 salinidad potencial de óxido reducción y posiblemente
concentración de amonio La comunidad bacteriana puede influir sobre estos factores edÆficos
por ejemplo en el reciclamiento del fosfato y el potencial de redox por bacterias sulfato
8
reductoras Sin embargo los factores edÆficos en manglares han recibido relativamente poca
atención Boto y Wellington 1984
El manglar de Balandra situado en una región semidesØrtica con niveles de precipitación
anual muy bajos 177 mm recibe un escaso aporte continental de nutrientes como el fósforo por
lo que es posible que existan otras fuentes de este elemento atrapadas en los sedimentos fosfatos
inorgÆnico s y que estÆn siendo liberadas por uno o varios mecanismos La solubilización de
fosfato inorgÆnico mediado por actividad microbio lógica podría ser uno de estos mecanismos
Dada la alta productividad reportada para los ecosistemas de manglar y considerando que
el manglar de Balandra presenta un estado aparentemente bueno y ha logrado permanecer a travØs
del tiempo las primeras implantaciones de este manglar se dieron hace 4120j lOO antes del
presente Pedrín AvilØs et al 1992 se podrían encontrar en este manglar BS FI asociadas a
la rizósfera de los mangles las cuales abastecerían de fosfato soluble a los Ærboles de mangle
Hasta donde tenemos referencias la existencia de B S FI asociadas a la rizósfera de los mangle s
no ha sido reportada en trabajos previos al presente estudio
Debido a que el mecanismo de solubilización de fosfatos inorgÆnico s a travØs de la
producción de Æcidos orgÆnicos por BS FI es considerado el mÆs importante se llevó a cabo la
bœsqueda y determinación de este grupo de bacterias heterótrofas en la rizósfera de los mangles
Avicennia germinans y Laguncularia racemosa en la laguna costera de Balandra Para el caso de
Rhizophora mangle esto no fue posible debido a que no se encontraron plÆntulas disponibles
9
2 OBJETIVOS
1 Detenninar la presencia de bacterias solubilizadoras de fosfatos inorgÆnico s B S FI
asociadas a la rizósfera de los mangles A germinans y L racemosa
2 Aislar B S FI asociadas a la rizósfera de los mangle s A germinans y L racemosa
3 Evaluar el potencial de solubilización de fosfato inorgÆnico de dos de las cepas de
BS FI aisladas en cultivo puro bajo condiciones in vitro
4 Identificar los Æcidos orgÆnicos producidos in vitro por las cepas aisladas
10
3 AREA DE ESTUDIO
El Ærea de Balandra figura 1 ha sido clasificada como un sistema Caleta Laguna de
acuerdo a las definiciones de Lankford 1977 y RuseIl 1969 citados por GutiØrrez SÆnchez
1987 y estÆ localizada al norte de la ciudad de La Paz en los 24019 15 N Y 1l0018 45 W El
clima es cÆlido y muy seco con una temperatura media anual de 290C La precipitación es baja
con un valor anual de 177 mm Anónimo 1979
La caleta tiene un ancho de 720 ID Y una longitud de 1150 In la profundidad varia de los
25 ID en la entrada hasta 0 5 ID En la parte sur existe un Ærea rocosa en la parte suroeste de la
entrada la cual queda expuesta durante la bajamar Al sureste de la caleta se localiza una
depresión de 6 In la cual durante la marea alta estÆ conectada a la Bahía de La Paz por medio de
un canal de mareas con orientación oeste noroeste En condiciones de marea baja esta depresión
queda parcialmente aislada de la bahía En la parte interna de la caleta se encuentra un cuerpo
lagunar que tiene un eje mayor de 990 ID de longitud con un ancho promedio de 324 In una boca
de 180 m de ancho y un canal de flujo y reflujo con una profundidad media de 1 10 ID La barrera
tiene una dirección norte sur orientada con la dirección de la corriente de la Bahía de La Paz
La vegetación de manglar que se distribuye en el margen de la laguna estÆ compuesta por
Rhizophora mangle L Avicennia germinans L L Laguncularia racemosa L Gaerth y otras
halófitas como Salicornia sp Pedrin AvilØs el al 1992
11
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m Manglar11II Pantano
LagunaCamino deasfalto
Linea de Costa
Linea de altitud
Sitio de muestreo
Figura 1 Localización del Ærea de estudio Tomado de Pedrín AvilØset 1992 Y Holguin 992
12
4 MATERIALES Y METODOS
4 1 Muestreo
El muestreo se realizó una sola vez el11 de mayo de 1993 durante la marea baja entre
las 9 y 10 a m Muestras de agua y suelo fueron colectadas para medición del pH por medio de
un potenciómetro Beckman y la salinidad del agua con un refractómetro 1 0 Para determinar
ortofosfatos se tomaron muestras de agua de la capa superficial con botellas de polietileno 500
mI de acuerdo con el mØtodo descrito por Strickland y Parsons 1972 Todas las muestras
fueron transportadas al laboratorio y analizadas inmediatamente excepto las muestras para
ortofosfatos las cuales fueron congeladas para su posterior determinación
Se colectaron 6 plantas jóvenes de dos especies de mangle A germinans y 1 racemosa
Las plantas fueron extraídas junto con una parte del sedimento en el que se encontraban y el
conglomerado raíz sedimento se colocó dentro de bolsas de plÆstico para su transporte al
laboratorio donde se realizó el siguiente procedimiento
1 Se desprendió cuidadosamente el sedimento que cubría las raíces evitando tocarlas y
fueron ligeramente enjuagadas en dos baæos seriados con agua de mar filtrada por arena y
despuØs a travØs de un cartucho Aqua Pure AP 110RC y desinfectada por radiación ultravioleta
2 Posteriormente en condiciones estØriles fueron enjuagadas una vez en agua de mar
artificial estØril
3 Las raíces de cada planta fueron colocadas por separado en medio de enriquecimiento
en seis matraces de 125 mI los cuales contenían 50 mI de medio líquido SRSM1 específico para
13
organismos solubilizadores de fosfato apØndice 1 A cada matraz se le asignó una letra la letra
inicial de la especie de mangle y un nœmero correspondiente al nœmero de rØplica
4 Las raíces fueron incubadas a 300C con agitación constante a 150 rpm durante 7 días
4 2 Aislamiento de bacterias solubilizadoras de fosfato inorgÆnico BSFI
De cada matraz se tomaron 100 fll Y se inocularon por duplicado en medio SRSM1
sólido apØndice 1 utilizando la tØcnica de dispersión en placa a una temperatura de incubación
de 300 e durante 24 h
Se seleccionaron las colonias que mostraron halos de solubilización zonas claras y se
transfirieron para obtener crecimientos puros utilizando la tØcnica de estría en placa Para una
mejor detección de las colonias con actividad solubilizadora se adicionó el indicador de pH
pœrpura de bromocreso con un intervalo de 5 a 7
Los morfotipos coloniales fueron diferenciados utilizando un estereoscopio STEMI SR
Se realizaron preparaciones frescas a partir de colonias crecidas en medio sólido SRSM1 para
observar la morfología celular y la pureza de los aislamientos mediante microscopía de luz a 100
X con un microscopio Zeiss modelo K7
Se ha reportado que en la mayoría de los aislamientos de BS FI hay una pØrdida de su
capacidad para solubilizar fosfato de calcio despuØs de transferencias sucesivas Craven y
Hayasaka 1982 Sperber 1957 por 10 que los aislamientos de B S FI fueron almacenados a
partir de cultivos de 48 h en medio líquido SRSM2 apØndice TI en glicerol al 30 a una
temperatura de 400C y en tubo inclinado con medio SRSM2 apØndice TI manteniØndose estos
14
aislamientos en refrigeración a SOCo Para su reactivación las cepas fueron crecidas en medio
líquido SRSM2 a 300C y 120 rpm
Las especies de B S FI fueron enviadas a un laboratorio de la Universidad de Auburn
E UA para su determinación taxonómica por anÆlisis de cromatografia de gases de Æcidos
grasos bacterianos como metil Østeres provenientes principalmente de la membrana
citoplasmÆtica La composición de los Æcidos grasos fue comparada utilizando el Sistema de
Identificación Microbiana
4 3 Determinación del potencial de solubilización de fosfato inorgÆnico y crecimiento
poblacionaI
Dos especies aisladas de B S FI cuya producción de Æcidos ha sido reportada
anteriormente en la literatura Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus licheniformis fueron
seleccionadas para cuantificar su capacidad solubilizadora mediante la tØcnica descrita por
Strickland y Par sons en la cual se realizaron algunas modificaciones apØndice ID
Con la finalidad de determinar si la concentración de fosfato solubilizado estaba
relacionada con el crecimiento poblacional del cultivo a partir de los matraces con medio líquido
SRSMl se realizaron conteos por duplicado de UF C unidades formadoras de colonias en
medio sólido SRSM2 al tiempo cero y despuØs de cada 48 h utilizando el mØtodo de dilución en
placa durante 14 o 16 días segœn la cepa
El gØnero Bacillus forma endosporas resistentes a condiciones adversas y para saber
cuÆndo se producía el cambio de los diferentes estadíos de la población bacteriana se tomaron
fotomicrografias de preparaciones frescas tomadas de cultivos de ambas especies en medio líquido
15
SRSMl a las O 4 22 24 48 72 Y 96 h Para conocer en que porcentaje se encontraban presentes
los diferentes estadíos celulares se realizaron conteos de 10 fotomicrografias a diferentes tiempos
1 2 3 10 Y 16 días a partir de preparaciones fijas Se realizaron preparaciones permanentes
tiæendo con azul de metileno del primer y segundo día ademÆs de preparaciones fijas de los
días dØcimo y dieciseisavo utilizando el mØtodo de Shaeffer Fulton Bradshaw 1979 para poder
observar las esporas libres
4 4 Extracción e identificación de Æcidos orgÆnicos
Uno de los mecanismos principales propuestos para la solubilización de fosfato inorgÆnico
es la producción de Æcidos orgÆnicos por lo cual se procedió a la identificación de Æcidos
orgÆnicos producidos por las B S FI aisladas La tØcnica de extracción que se utilizó fue la
reportada por Smibert y Krieg 1981 apØndice IV
Se realizaron dos experimentos en el primero se utilizaron las cepas Al Bacilus
amyloliquefaciens Enterobacter taylorae Bacilus licheniformis Enterobacter asburiae y
Pseudomonas sturzeri En el segundo experimento se usaron las mismas pero se incluyeron
Enterobacter aerogenes y Kluyvera cryocrescens
Los Æcidos orgÆnicos fueron identificados comparando los tiempos de retención de
estÆndares de Æcidos orgÆnicos volÆtiles acØtico propiónico butírico isobutírico valØrico
isovalØrico isocapróico capróico y heptanóico y no volÆtiles pirœvico lÆctico oxalacØtico
oxÆlico malónico metilmalónico fumÆrico y succínico
Aunque no fue contemplado dentro de los objetivos el cuantificar los Æcidos orgÆnicos
producidos por las cepas ya que no se tenía un integrador con el objeto dar una estimación
16
aproximada de las concentraciones de los Æcidos producidos por las B S FI se determinó el Ærea
de los picos por medio de la integración por mØtodos geomØtricos El mØtodo utilizado dependió
de la simetría del pico y su posición con respecto a la línea base apØndice IV
4 5 Diseæo experimental y anÆlisis estadístico
El conteo de DF C fue realizado dos veces para cada cepa Se utilizaron por lo menos
tres rØplicas del cultivo y de cada rØplica se tomó una muestra de la cual se determinó el nœmero
de DF C por duplicado
Los experimentos sobre determinación del potencial de solubilización para B
licheniformis y B amyloliquefaciens se realizaron dos veces para cada cepa Se utilizaron por lo
menos tres rØplicas del cultivo por experimento y tres controles De cada rØplica incluyendo
controles se tomaron dos muestras para la cuantificación de fosfato soluble Se realizó el anÆlisis
de variancia con un sólo criterio de clasificación por rangos de Kruskal Wallis a un valor de
PSO OS
Para la identificación de los Æcidos orgÆnicos producidos por las B S FI se realizaron dos
repeticiones para la mayoría de las cepas
17
5 RESULTADOS
5 1 AnÆlisis químicos del agua y suelo
Los datos de las variables químicas Tabla 1 muestran que el pH del agua de mar fue
ligeramente mayor que el de los sedimentos Por otra parte el pH del sedimento de L racemosa
fue similar al de A germinarlS La concentración de ortofosfatos en el agua de mar fue baja
considerando que la concentración promedio en el mar es aproximadamente de 73 J1gl
TABLA 1 Variables químicas tomadas en la zona del manglar de Balandra
Salinidad del agua de mar 37 o
00
pH del agua de mar 8 2
pH del sedimento de A germinans 7 9
pH del sedimento de L racemosa 7 88
Concentración de ortofosfatosen el agua de mar 14 33i0 59 J1g 1
18
5 2 Aislamiento
En todos los matraces que contenían raíces de A germinans la actividad solubilizadora
de los microorganismo s fue evidenciada cualitativamente por la clarificación del medio de
enriquecimiento líquido SRSMl Sin embargo para 1 racemosa la solubilización sólo fue
evidente en dos de los matraces Ll y L6
En todas las placas inoculadas con los cultivos de enriquecimiento de A germinans se
detectó la presencia de BS FI manifestada por la clarificación del medio sólido En el caso de
1 racemosano hubo crecimiento de ningœn microorganismo aœn despuØs de 60 h de incubación
a excepción de las placas Ll en las cuales se observó la presencia de un hongo las L5 donde
crecieron bacterias y las placas L6 en donde crecieron hongos y bacterias
A partir de las placas con actividad positiva se eligieron aquellas en que mejor se observó
la clarificación del medio Cada placa fue dividida en cuatro cuadrantes A B e y D La serie
que mostró mayor actividad fue la A3 y la que presentó menor actividad fue la serie A6 En las
placas correspondientes aL racemosa se observó que en la serie Ll hubo formación de halos en
la periferie de las colonias de hongos Para toda la serie L5 la actividad fue positiva Respecto a la
serie L6 se observó actividad œnicamente en L6A y L6D
Durante las transferencias sucesivas de los diferentes morfotipos coloniales que fueron
realizadas en medio sólido SRSMl adicionando el indicador pœrpura de bromocresol se
pudieron observar los halos de solubilización de color amarillo logrÆndose obtener 12
aislamientos coloniales con actividad solubilizadora positiva DespuØs de confirmar la pureza de
los 12 aislamientos Østos fueron enviados al Departamento de Patología de Plantas de la
Universidad de Auburn en donde fueron identificados de acuerdo a su composición de metil
19
Østeres de Æcidos grasos determinada por el Sistema de Identificación Microbiana resultando un
total de ocho especies identificadas Tabla 2 Solamente una cepa aislada de la rizósfera de A
germinans no fue identificada Esta cepa fue denominada como Al Sus cØlulas son móviles en
forma de bacilos de 3 a 4 lm de longitud y el morfotipo colonial es puntiforme convexo y de
borde entero Por otra parte los 3 aislamientos restantes resultaron ser rØplicas de algunas de las
cepas presentadas en la tabla 2
TABLA 2 Especies de B S FI aisladas de la rizósfera de los mangles A germinans yL racemosa No identificada
Avicennia germinans Laguncularia racemosa
Bacilllls licheniformis Bacilus licheniformisBacilllls amyloliquefaciens Pseudomonas stutzeri
Enterobacter aerogenes Chryseomonas luteola
Enterobacter taylomeEnterobacter asburiae
Kluyvera cryocrescens
AlO
20
5 3 Crecimiento poblacional bacteriano
Tanto para B amyloliquefaciens figura 2a como para B licheniformis figura 3a se
observó un rÆpido crecimiento durante los primeros 2 días y despuØs el crecimiento poblacional
permaneció constante a 10 largo del tiempo
En las preparaciones frescas de B amyloliquefaciellS datos no incluidos pudo obseIvarse
que al tiempo cero sólo existían cØlulas vegetativas entre las 4 y 22 hrs se observó un marcado
incremento en el nœmero de cØlulas A las 24 horas fue posible observar la formación de
endosp oras y a las 48 h se pudieron observar cØlulas con endospora algunas esporas libres y
muy pocas cØlulas vegetativas Finalmente a las 96 h la mayoría eran esporas libres aunque
todavía se observaron algunas cØlulas vegetativas
Para las preparaciones en fresco de B licheniformis al tiempo cero œnicamente se
encontraron cØlulas vegetativas La formación de endosporas y algunas esporas libres se manifestó
hasta las 72 h A las 96 h la mayoría eran esporas libres sin embargo todavía pudieron observarse
cØlulas con endospora
Con respecto a las preparaciones permanentes y fijas el porcentaje de los diferentes
estadíos por los que pasan las cØlulas de B amyloliquefaciellS y B licheniformis se muestra en
las figuras 2b y 3b respectivamente En ambas grÆficas se puede observar la dominancia de las
esporas libres en las œltimas etapas de los cultivos
21
E Au 10u
J8
wO
O6
OW
42JZ
2o
OO O
J O 2 4 6 8 10 12 14 16
TIEMPO DE INCUBACION DIAS
B100
W80
tZ
60WUOO 40
o
20
O
Figura 2 A Crecimiento poblacional de B amyloliquefaciens B Porcentaje de los diferentesestadíos de B amyloliquefaciens a diferentes tiempos de incubación
35096
22
E 10A
u
lL
J8
wO
6Oaw
AJ
ZO
O 1OJ
Figura 3 A Crecimiento poblacional de B licheniformis B Porcentaje de los diferentesestadíos de B licheniformis a diferentes tiempos
22
E 10 Au
lL
l6
w
O
O6
aW
4l
ZO
O 2OJ
Figura 3 A Crecimiento poblacional de B licheniformis B Porcentaje de los diferentesestadíos de B licheniformis a diferentes tiempos
23
5 4 Determinación del potencial de solubilización de B amyloliquefaciens y B
licheniformis
En el caso de B amyloliquefaciens figura 4 el potencial de solubilización fue medido
hasta los 16 días encontrÆndose una concentración promedio de fosfato de 395 mg1
Aparentemente el potencial de solubilización se incrementa conforme transcurre el tiempo sin
embargo la prueba de Kruskal Wallis indica que no existen diferencias significativas a un valor
de Ps 0 05 entre el fosfato solubilizado con respecto al tiempo
500
J
t 450
rO
r 1tW
1z 400I I 1
w r 11 I
1
1m iJ
11 350OJ1
O
300LL
J1OLL
250o 2 4 6 8 10 12 14 16
TIEMPO DE INCUBACION DIAS
Figura 4 Solubilización de fosfato por B amyloliquefaciens El fosfato soluble neto es igual al
fosfato total menos el fosfato del control Error estÆndar 1
24
Para B licheniformis figura 5 el potencial de solubilización fue medido hasta los 10 días
Se obselVó que la concentración mÆxima de fosfato 325 mgl ocurrió el segundo día
Posteriormente disminuyó manteniØndose constante hasta el dØcimo día En este caso la prueba
de Kruskal Wallis indica que si existen diferencias significativas a un valor de P 0 05 entre el
fosfato solubilizado con respecto al tiempo
r
40001
E
O1
300w
Z
WJ
m200
JJ
o L
f
o1 100
lLf
OlL
oO 2 4 6 8 10
TIEMPO DE INCUBACION DIAS
Figura 5 Solubilización de fosfato por B licheniformis El fosfato soluble neto es igual al fosfato
total menos el fosfato del control Error estÆndar 1
24
Para B licheniformis figura 5 el potencial de solubilización fue medido hasta los lO días
Se observó que la concentración mÆxima de fosfato 325 mgl ocurrió el segundo día
Posteriormente disminuyó manteniØndose constante hasta el dØcimo día En este caso la prueba
de Kruskal Wallis indica que si existen diferencias significativas a un valor de P 0 05 entre el
fosfato solubilizado con respecto al tiempo
400J1
E
O1
300w
Z
WJ
m
J 200J
J
o L
f
o1 100
LL
fOLL
oo 2 4 6 8 10
TIEMPO DE INCUBACION OlAS
Figura 5 Solubilización de fosfato por B licheniformis El fosfato soluble neto es igual al fosfato
total menos el fosfato del control Error estÆndar 1
25
5 5 Identificación y cuantificación de Æcidos orgÆnicos
Las tablas 3 y 4 muestran las concentraciones de Æcidos orgÆnicos producidos por las
cepas de bacterias aisladas se eligieron de entre todos los cromatogramas algunos de ellos los
cuales se presentan en el apØndice VI y vn
Cabe mencionar que en el primer experimento para Enterobacter taylorae no se
detectaron Æcidos orgÆnicos y en el caso de Bacillus lichenifornzis fue apenas detectable la
presencia del Æcido succínico por lo que no fue cuantificado
TABLA 3 Producción de Æcidos orgÆnicos por las especies de B S F 1 en primer experimentoNo detectado
CEPA Concentración de Æcidos orgÆnicos nglfllVolÆtiles No volÆtiles
AcØtico Isobutírico IsovalØrico LÆctico Succínico
A10 331 10 9
B amyloliquefaciens 62 5 11 3 25
B licheniformis 1 440 29 6
E asburiae 163 9 98 443 10 7
p stutzeri 52 7
26
TABLA 4 Producción de Æcidos orgÆnicos por las especies de B S F 1 en el segundoexperimento No detectado No cuantificado
CEPA Concentración de Æcidos orgÆnicos ngJll
VolÆtiles No volÆtil
AcØtico Propiónico Isobutírico IsovalØrico LÆctico
10 727
13 amylaliquefaciens 1 420 0 15 13 7
E aeragenes 7 88 517
E laylarae 646
B lichenifarmis 16
K cryacrescens 5 11
E asburiae 2 25 115
27
6 DISCUSION
Los ortofosfatos disueltos en las aguas lagunares o estuarinas son asimilados por los
manglares en una proporción de CsooN2SPt De la Lanza 1994 Estos requerimientos seæalan la
importancia del fósforo como limitante en la producción primaria En las aguas costeras la
concentración de ortofosfatos disueltos puede oscilar desde lo indetectable hasta contenidos altos
cercanos a 31O gIl De la Lanza 1994 Tomando en cuenta que la concentración promedio de
fósforo en el agua de mar es de 73 gIl Martin 1970 y considerÆndose como bajos los valores
menores de 31 gIl Boto 1982 para el tiempo en que se realizó el muestreo en el manglar de
Balandra la concentración de ortofosfatos en el agua de mar 14 33 gIl fue baja No existen
reportes de concentración de ortofosfatos en el manglar de Balandra con los cuales comparar los
valores obtenidos por nosotros sin embargo Nieto García y García Pamanes 1991 encontraron
en la Bahía de La Paz B C S en el mes de junio concentraciones de ortofosfatos con un valor
mÆximo de 13 63 gIl Y un valor mínimo de 3 72 gIl
La nutrición mineral de especies de manglar no se entiende bien aœn Medina el al 1995
y hasta el momento no estÆ determinado cuÆles son los requerimientos de fósforo para los
mangles Sin embargo considerando que una planta pequeæa del ambiente terrestre necesita de
aproximadamente 50 mg fósforo día y una planta grande 700 mg fósforo día Sneh 1990 es
probable que las B S FI asociadas a la rizósfera de mangle estØn contribuyendo con fósforo
soluble para los mangles
28
Los suelos de manglar tienen una elevada capacidad para absorber o inmovilizar los
nutrientes que entran con las mareas Esto ha sido demostrado con respecto a fosfatos y nitratos
por Hesse 1962 Debido a Østo la mayor parte del fósforo inorgÆnico en sedimentos de manglar
y probablemente tambiØn en el agua intersticial se encuentra en la forma de fosfatos de Ca Fe y
Al ó como fósforo reactivo soluble absorbido o incorporado en hierro hidratado y óxidos de
aluminio Alongi el al 1992 Sin embargo aunque la concentración de ortofosfatos registrada
en el manglar sea insuficiente para sostener los requerimientos de las plantas de acuerdo con
Pomeroy 1960 la tasa de flujo del fosfato disuelto es mÆs importante que su concentración para
mantenimiento de las altas tasas de producción orgÆnica El metabolismo de las B S FI en los
sedimentos del manglar liberaría el fosfato inorgÆnico atrapado en los sedimentos el cual puede
acumularse en el agua intersticial provocando gradientes de concentración que intervendrían en el
flujo del fósforo de los sedimentos hacia la columna de agua
El intercambio de fósforo entre sedimentos yagua es un fenómeno altamente complejo e
incluye la interrelación de procesos químicos biológicos y físicos Boström el al 1988 Un
transporte de difusión consecuente hacia el agua de la capa superficial puede ser retardado por
numerosos procesos pH temperatura y actividad microbiana entre otros que temporalmente o
permanentemente inmovilizan el fosfato Carlton y Wetze 1988
La remineralización de nutrientes en los sedimentos y su transporte a la columna de agua
es un mecanismo importante de la fertilización de las lagunas costeras Camacho bar y Alvarez
Borrego 1988 En los manglares tropicales y en los sedimentos costeros las bacterias juegan un
papel importante como mineralizadores del detritus orgÆnico y recicladores de nutrientes
esenciales Alongi 1994 En sedimentos de un manglar australiano las bacterias representaron el
29
91 de la biomasa microbiana tota constituyendo algas y protozoario s el 7 y el 2
respectivamente Alongi 1988 En las Æreas lodosas del río Fly en Australia se encontró una
correlación significativa entre las tasas de crecimiento específicas de bacterias con respecto al
fosfato disuelto orgÆnico e inorgÆnico en el agua intersticial y el fósforo total Alongi 1994
La disponibilidad de nutrientes es regulada por el estado de redox de los sedimentos
adyacentes y principalmente en la interfase con el agua Arenas Fuentes y De la Lanza Espino
1990 Los procesos de respiración de los microorganismos son esencialmente reacciones de
óxido reducción redox las cuales involucran diferentes agentes oxidantes o aceptores de
electrones como el oxígeno el nitrato el fierro el manganeso el sulfato y el carbonato Se ha
demostrado que en manglares la degradación de la materia orgÆnica ocurre principalmente a
travØs de la respiración anaerobia con el sulfato como aceptor de electrones o agente oxidante
Es posible que en Æreas de manglar donde el sulfato no es muy abundante la respiración anaerobia
mediada por fierro y manganeso sea significativa Nedwell el al 1994 Se ha detectado tambiØn
en sedimentos de manglar emanación de metano Giani el al 1995 La información expuesta
anteriormente nos da una idea de la riqueza y complejidad de la comunidad bacteriana presente en
sedimentos de manglar De la presencia de determinados grupos bacterianos en los sedimentos
así como de las complejas interacciones entre los miembros de la comunidad dependerÆ la
disponibilidad y concentración de nutrientes en el manglar
Por lo general en sedimentos de manglar las condiciones son mÆs oxidantes cerca de la
interfase agua sedimento y mÆs reducidas en los sedimentos profundos El fósforo inorgÆnico
disuelto y posiblemente el fósforo orgÆnico disuelto estÆn involucrados en reacciones complejas
con fierro manganeso e hidróxido s para formar precipitados insolubles bajo condiciones
30
aeróbicas sin embargo estos son redisueltos cuando el redox llega a ser lo suficientemente
reducido Day el al 1989 Un incremento en la temperatura afectaría indirectamente la
disponibilidad de nutrientes debido al incremento de la actividad biológica La actividad
microbiana aumenta el consumo de oxígeno y decrece el potencial de redox Con bajos
potenciales de redox los aceptores de electrones como el nitrato y el sulfato son usados para la
mineralización de la materia orgÆnica que dan como resultado productos reducidos que afectan el
ciclo del fósforo de varias maneras Por ejemplo cuando la concentración de oxígeno se agota
con la profundidad la reducción del sulfato produce sulfuro lo cual disminuye el potencial de
redox provocando la solubilización del fosfato inorgÆnico
Entre otros factores que influyen sobre la disponibilidad del fósforo se encuentra el pH de
la solución del suelo A valores de pH intermedios predominan los iones difosfato HP04
Devlin 1980 los cuales pueden estar asociados a iones de calcio y magnesio en un 44
aproximadamente Riley y Chester 1989 Los valores puntuales de pH de la solución de los
suelos de A germinans y L racemosa registrados en Balandra caen dentro del rango 7 6 8 2
de los reportados por Waisel 1972 para los ecosistemas de manglar Sin embargo las
condiciones en las que se realizó este muestreo no son suficientes como para asegurar que el
fosfato del sedimento se encuentre asociado a iones de calcio en el manglar de Balandra y por lo
tanto no disponible para las plantas Estudios como los de Camacho Ibar y Alvarez Borrego
1988 muestran que existe un intenso petacheo distribución en forma de manchas de las
propiedades de las aguas intersticiales de los sedimentos con grandes diferencias dentro de cortas
distancias TambiØn encontraron variaciones temporales grandes de las propiedades de la columna
de agua que pueden ser efecto del petacheo e infiltración de aguas intersticiales provocadas por
31
cambios en el nivel del mar La biota puede causar la mayoría del petacheo fisico construcción de
madrigueras en este tipo de ambiente que luego a su vez resulta en un espectro de condiciones
fisicas y químicas que afectan las propiedades de las aguas intersticiales La plantas pueden
causar el petacheo en el suelo a travØs del desarrollo y actividad del las raíces La difusión de
oxígeno a travØs de las raíces puede crear microzonas con elevado Eh potencial de redox dentro
del sedimento reducido Howes el al 1981 La distribución de raíces y rizomas es muy
heterogØnea resultando una distribución tambiØn heterogØnea de la materia orgÆnica La fauna
bentónica principalmente organismos escarbadores pueden contribuir a la heterogeneidad del
sedimento Los escarbadores tambiØn facilitan la circulación del agua intersticia afectando la
distribución vertical y horizontal del la salinidad nutrientes y otras propiedades El petacheo de
los parÆmetros fisicos y químicos y la infiltración del agua causa una situación muy dinÆmica para
el amonio y el fosfato reactivo La precipitación y disolución de minerales autigØnicos que no han
sido transportados pero sí formados en el lugar y la adsorción y desorción de partículas
orgÆnicas e inorgÆnicas del sedimento son procesos que afectan fuertemente la distribución del
fosfato y del amonio Camacho Ibar y Alvarez Borrego 1988
La liberación del fosfato bajo condiciones aeróbicas puede darse a partir de valores de pH
del agua superficial de 9 5 Seitzinger 1991 Este autor encontró que en un intervalo de pH entre
8 y 9 el flujo de fosfatos del sedimento al agua fue bajo Este flujo se incrementó apartir de un pH
de 9 5 probablemente como resultado de la solubilización de complejos de fierro y aluminio El
pH de la columna de agua se incrementa durante periodos de alta producción primaria Boström
el al 1988 Se ha demostrado que la actividad fotosíntetica de algas epipelÆgicas influye en la
liberación del fósforo del sedimento a la columna de agua superficial por la formación y
32
rompimiento de la microzona oxidada Carlton y Wetzel 1988 Las plantas vasculares tales
como Zostera y Spartina pueden actuar como bombas de fosfato es decir toman el fósforo del
sedimento por medio de las raíces y 10 liberan a la columna de agua a travØs de las hojas Este
mecanismo es cuantitativamente importante en la ruta del fósforo para los sistemas estuarinos Mc
Roy et al 1970
En este trabajo se lograron aislar a partir de la rizósfera de los mangle s nueve especies
de bacterias una de ellas no identificada con la capacidad de solubilizar fosfato de calcio en un
medio para producción de Æcidos a partir de glucosa como fuente de carbono AdemÆs se
obselVó solubilización producida por hongos Estos resultados hacen suponer que la actividad
solubilizadora de fosfatos mediada por microorganismos es abundante en la rizósfera del mangle
La capacidad de solubilización de algunas bacterias de los gØneros Bacillus y
Pseudomonas ha sido reportada para agua y sedimentos marinos por Promod y Dhevendaran
1987 Asimismo en una especie similar a B amyloliquefaciens se ha demostrado la capacidad
de mineralización de fósforo orgÆnico Fassbender 1978 Por otra parte B amyloliquefaciens
ha sido utilizada para mejorar la eficiencia de la inoculación con hongos ectomicorr˝zicos en
semillas de abeto Duponnois y Garbaye 1991 Para el caso de Pseudomonas stutzeri no se
cuenta con ninguna información sobre su capacidad de solubilización
En el caso de Enterobacter aerogenes se ha reportado que habita en agua suelo aguas
residuales y heces de humanos y animales Richard 1984 Esta especie estÆ cercanamente
relacionada con Escherichia coli en cuyo gØnero se ha reportado capacidad para solubilizar
fosfatos Sperber 1957 Sundara y Sinha 1963 Sin embargo en el caso de Enterobacter
taylorae œnicamente se reporta como patógeno oportunista Tanto como para Kluyvera
33
cryocrescens y Chryseomonas lllteo a no se ha reportado capacidad de solubilización K
cryocrescens se puede encontrar en el agua suelo aguas residuales y hospitales donde es
probablemente un infrecuente patógeno opOltunista de humanos Brenner 1984 Por otra parte
C luteola solo se reporta como patógeno oportunista en humanos
Estos resultados reflejan la falta de estudios sobre la actividad solubilizadora de fosfatos
por microorganismo s en general la cual debe ser importante para sostener a los ecosistemas de
marisma y manglar ya que estos microorganismos pueden proveer a las plantas de fosfato
asimilable Se desconoce la patogeløcidad de las bacterias aisladas en este trabajo sin embargo
aunque algunas de ellas pertenecen a especies bacterianas reportadas como patógenos
oportunistas son cepas benØficas para los mangles
Sundara y Sinha 1963 reportan que bacterias del gØnero BacillllS aisladas de la rizósfera
de trigo a los 14 días solubilizaron de 112 mgl a 157 mgl de fosfato encontrando que B
circulans solubilizó mÆs fosfato 157 mgl Promod y Dhevendaran 1987 encontraron que
fosfobacterias en sedimentos marinos de los gØneros Vibrio y Pseudomonas liberaron un
mÆximo de fosfato despuØs de 72 h De estos dos gØneros la solubilización mÆxima reportada fue
para Pseudomonas 0 550 mgl Los autores tambiØn encontraron una relación entre la liberación
de fosfato y el crecimiento encontrando que el mÆximo de crecimiento a una absorbancia de 600
nm coincide con el mÆximo de solubilización Hasta donde nosotros sabemos en el ambiente
marino la mayor concentración de fosfato solubilizado que se ha reportado fue de una cepa
aislada de la rizósfera de un pasto marino Craven y Hayasaka 1982 la cual solubilizó a los seis
días 300 mgl Comparando el potencial de solubilización de B amyloliquefaciens 395 mgl y B
ltcheniformis 325 mgl podemos decir que es varias veces mayor que el obtenido para la cepa de
34
Pseudomonas aislada por Promod y Dhevendaran 1987 y ligeramente mayor que el obtenido
por Craven y Hayasaka 1982 Estas concentraciones teóricamente proveerían a las plantas de
mangle de sus requerimientos diarios de fosfato Sin embargo estas aseveraciones deben tomarse
con cautela debido a que los resultados obtenidos bajo condiciones in vitro distan mucho de 10
que puede ocurrir in situ
Al comparar el crecimiento poblacional de ambas cepas de Bacillls con respecto a su
potencial de solubilización encontramos que estÆ relacionado con la presencia de cØlulas
vegetativas En B licheniformis la esporulación ocurre despuØs del segundo día figura 3b por
lo que cuando se realizó la primera determinación del fosfato solubilizado al segundo día el
100 de la población eran cØlulas vegetativas Se puede observar que tambiØn al segundo día la
solubilización de fosfato fue mayor figura 5
En el caso de B amyloliqllefaciens la formación de endosporas ocurre mÆs rÆpido que
para B licheniformis La medición del fosfato solubilizado se realizó a partir de que el nœmero de
cØlulas vegetativas había decrecido en mÆs de un 50 figura 2b Si se hubiera determinado el
fosfato solubilizado al primer día posiblemente se hubiera registrado una concentración mÆs alta
con respecto a las obtenidas La diferencia en cuanto a la apatición de las endosporas para ambas
especies de Bacilus puede deberse a que el metabolismo de B amyloliquefaciens es mÆs activo
que el de B licheniformis Estas bacterias fueron crecidas en un medio con glucosa Cuando en
un cultivo crecido con glucosa se agota esta fuente de carbono del medio el crecimiento
vegetativo cesa y varias horas despuØs las esporas comienzan a aparecer Si se aæade mÆs glucosa
al cultivo justo al final del periodo de crecimiento la esporulación se inhibe La glucosa
probablemente impide la esporulación por represión del catabolito que inhibe la síntesis de las
35
enzimas específicas que participan en la formación de las estructuras de la espora Brock et al
1987 Por otra parte las concentraciones de fosfato registrado despuØs de que el nœmero de
cØlulas vegetativas disminuye drÆsticamente posiblemente sean resultado del fosfato acumulado
producto de la solubilización y de la autolisis bacteriana aunado a la actividad de las cØlulas
vegetativas que aunque disminuyen no desaparecen
En el segundo experimento sobre detección de Æcidos orgÆnicos y cuantificación debido a
que se redujo la velocidad del registrador a 5 mm min se produjo un ensanchamiento de los picos
haciØndolos mÆs evidentes Esto permitió la detección y cuantificación de Æcidos diferentes al
primer experimento Por otra parte en el segundo experimento no fue posible cuantificar los
Æcidos isovalØrico y el lÆctico debido a la sobredemanda de utilización del cromatógrafo
Los Æcidos orgÆnicos producidos por las bacterias aisladas en este trabajo fueron producto
de la fermentación de la glucosa sin embargo se requiere realizar otros estudios para profundizar
mÆs sobre los resultados obtenidos
Se encontró que la mayoría de las cepas produjeron Æcido lÆctico a excepción de
Enterobacter taylorae El poder de solubilización de los Æcidos acØtico lÆctico isovalØrico y
succínico entre otros ha sido probado experimentalmente por Jobnston 1952 quien demostró
que la solubilización no depende solamente del pH de la solución usada sino que estÆ relacionada
con la estructura del la molØcula orgÆnica que es el factor mÆs importante que contribuye para la
solubilización de los fosfatos de calcio Es decir que la solubilización no estÆ directamente
relacionada con la concentración del Æcido orgÆnico sino con el tipo de Æcido presente
Hasta donde tenemos conocimiento no existen referencias sobre producción de Æcidos
orgÆnicos por parte de las especies bacterianas aisladas en este trabajo en las condiciones
36
experimentales empleadas por nosotros Posiblemente esto se deba a que en estas especies no se
había reportado con anterioridad la capacidad para solubilizar fosfatos inorgÆnicos No obstante
Banik y Dey 1983 experimentaron con bacterias del gØnero Bacilus aisladas del suelo en un
medio con sacarosa y fosfato de calcio y no encontraron correlación entre la cantidad de Æcidos
orgÆnicos libres en el medio y la solubilización de fósforo Sin embargo las bacterias produjeron
Æcido 2 ketoglucónico y Æcido succínico los cuales mostraron una gran capacidad para solubilizar
fosfatos inorgÆnicos Para el gØnero Bacilus se reporta la producción de Æcido lÆctico como
producto final de la fermentación de la glucosa Tortora etal 1992 10 cual fue confirmado para
nuestras cepas de B amy oliquefaciens y B licheniformis En el caso del gØnero Enterobacter se
reportan varios productos finales de la fermentación tales como etano Æcido lÆctico Æcido
fórmico butanediol bióxido de carbono e hidrógeno En cuanto a las cepas pertenecientes a este
gØnero y aisladas por nosotros se detectó el Æcido lÆctico para Enterobacter aerogenes y
Enterobacter asburiae pero no así para Enterobacter tay orae En el caso de Pseudomonas
aunque su potencial de solubilización ha sido reportado por Promod y Dhevendaran 1987 el
mecanismo por el cual realiza esta solubilización no fue investigado Una característica general de
este gØnero es que no es fermentativo sin embargo puede producir pequeæas cantidades de
Æcido a partir de la glucosa por medio de respiración aerobia Brock et al 1987 Las reacciones
clÆsicas del ciclo de los Æcidos tricarboxilicos son encontradas en todas las especies de
Pseudomonas que han sido examinadas así como la mayoría de las hexosas y compuestos
relacionados son degradados por la vía metabólica de Entner Doudoroff Palleroni 1984 No
podemos explicar la presencia de Æcido lÆctico detectada en el cultivo de Pseudomonas stutzeri
ya que en la respiración aerobia el Æcido pirœvico producido no se reduce a Æcido lÆctico No
37
obstante este resultado necesita confirmarse debido a que este Æcido œnicamente se detectó en el
primer experimento La solubilización de fosfato por P stutzeri posiblemente se deba a la
presencia de otro tipo de Æcido orgÆnico no detectado en los experimentos
Tomando en cuenta el alto nœmero de cepas con capacidad de solubilizar fosfato aisladas
en este trabajo aunado a la detección de hongos con capacidad para solubilizar fosfatos se
considera que la actividad solubilizadora mediada por microorganismos en la rizósfera de los
mangle s es abundante Es posible que el mecanismo de solubilización del fosfato de los
aislamientos obtenidos sea a travØs de la producción de Æcidos orgÆnicos
Es probable que así como ocurrió bajo condiciones in vitro las B S FI asociadas a las
raíces del mangle y aisladas en este trabajo tengan la capacidad para solubilizar el fósforo
inmovilizado en los sedimentos Uno de los mecanismos por los cuales este proceso podría ocurrir
sería a travØs de la producción de Æcidos orgÆnicos La presencia de microorganismos fosfato
solubilizadores en la Iizósfera de los mangle s resultaría benØfica ya que el fosfato liberado estaría
mÆs cerca de la raíz pudiendo así ser fÆcilmente absorbido por las plantas Por otra parte la
rizósfera proveería exudado s los cuales a su vez nutrirían a los microorganismos de la rizósfera
así como a la comunidad microbiana presente en sedimentos
En sedimentos de manglar así como en la rizósfera de los mangle s existe una rica
comunidad bacteriana El potencial de solubilización de fosfato de esta comunidad microbiana
sería el resultado de las complejas interacciones entre los microorgallismos que la componen
38
8 RECOMENDACIONES
Debe considerarse la participación de otros microorganismos hongos para futuras
investigaciones debido a que estos pueden tener mÆs potencial para solubilizar fosfato que las
bacterias Por otra parte sería factible determinar el potencial de solubilización de todas las cepas
aisladas en este trabajo así como el potencial de solubilización de la comunidad microbiana de la
rizósfera ya que Øste estaría determinado por la participación e interacción de todos los miembros
de la comunidad La inclusión de otras fuentes de carbono en el medio de cultivo posiblemente
nos permitiría aislar mayor cantidad de microorganismos solubilizadores de fosfato
Se requiere estudiar y analizar los factores fisicos químicos y biológicos que intervienen
en el flujo del fósforo ya que Østos determinan la disponibilidad de fósforo para las plantas
Para tener una mejor evidencia de la importancia de las B S FI en el sostenimiento de los
mangle s se podrían realizar experimentos in vira inoculando plÆntulas de mangle con las
bacterias fosfato solubilizadoras para determinar si la planta absorbe el fosfato que la bacteria
solubiliza
En este trabajo nos abocamos a identificar y cuantificar a groso modo los Æcidos orgÆnicos
producidos por las B S FI Sin embargo la relación entre los Æcidos orgÆnicos y la solubilización
del fosfato de calcio debe ser estudiada en detalle Por otra parte la cuantificación de Østos sería
mejor determinarla con un integrador para lograr una mejor aproximación de las concentraciones
encontradas
39
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1
APENDICE 1
Constituyentes del medio de aislamiento para organismos solubilizadores de fosfato
de acuerdo a Sundara Rao y Sinha 1963 modificado 1 SRSM1
1000 mI agua destilada
Glucosa 10 0 g
Fosfato de calcio tribÆsico 5 0 g
NH4 2S04 0 5 g
KCI 0 2 g
MgS04 7Hp 03 g
MnS04 Hp 0 004 g
FeS04 7HP 0 002 g
NaCl 20 0 g
Extracto de levadura 0 5 g
Pœrpura de bromocresol 0 1 g
Agar 15 0 g
Ajustar pH a 7 2 con NaOH estØril a 1 N despuØs de autoclavear
Compuestos modificados se incrementó la concentración debido a que las bacterias marinastienen mayor requerimiento de CI y Mg Dawes 1986
Medio de cultivo líquido SRSMl
Se esteriliza el fosfato insoluble requerido en matraces Erlenmeyer y el medio líquido se
agrega por separado despuØs de esterilizar Rose 1957
11
APENDICE II
Constituyentes del medio para la reactivación y preservación de microorganismos
solubilizadores de fosfato de acuerdo a Sundara Rao y Sinha 1963 modificado 2
SRSM2
1000 mI agua destilada
Glucosa 10 0 g
KfP04 3 O 1 1 g
NH4 2S04 05 g
KCl 0 2 g
MgS04 O 03 g
MnS04 O 0 004 g
FeS04 O 0 002 g
NaCl 20 0 g
Extracto de levadura 0 5 g
Agar 15 0 g
Ajustar pH a 7 2 con NaOH estØril a 1 N despuØs de autoclavear
Compuestos modificados se incrementó la concentración debido a que las bacterias marinastienen mayor requerimiento de Cl y Mg Dawes 1986
ID
APENDICE ID
Determinación del potencial de solubilización de fosfato inorgÆnico
1 La cepas seleccionadas se reactivaron en 50 mI de medio líquido SRSM2 en matraces
de 250 mI con agitación constante 120 rpm a 300C durante 16 h
2 En una microcentrifuga eppendorf las cØlulas fueron centrifugadas tres veces a 14000
rpm con solución salina para eliminar en cuanto fuera posible el fosfato soluble que contiene el
medio SRSM2 En el caso de B amyloliquefaciens se utilizó la solución fisiológica salina al
0 85 y se centrifugó durante 20 segundos Para B licheniformis la solución salina se usó al
3 3 centrifugando durante 10 segundos Posteriormente con la misma solución salina y
utilizando un espectrofotómetro Spectro Master modelo 415 a una longitud de onda de 540 nm
se ajustó a 10 la densidad óptica de la suspensión bacteriana para trabajar con el mismo nœmero
de bacterias iniciales en cada experimento
3 Un mililitro de la suspensión anterior fue transferida a matraces de 500 mI que
contenían 100 mI de medio SRSM1 Para B amyloliquefaciens se utilizaron 3 rØplicas y tres
controles y para B licheniformis 4 rØplicas con sus respectivos controles Los cultivos fueron
incubados de acuerdo a las condiciones de temperatura y agitación antes especificadas por un
período de 16 días para B amyloliquefaciens y de 14 días para B licheniformis
4 Para la determinación de fosfatos de rØplicas y controles se tomaron dos muestras de
500 111 cada una en tubos eppendorf y se centrifugaron a 14000 rpm durante 20 segundos para
B amyloliquefaciens y durante 10 segundos para B licheniformis De cada una de las muestras
se tomaron 20 111 Y se aforaron a 50 mI con agua destilada La concentración total de fosfato
IV
soluble fue determinada utilizando la tØcnica descrita por Strickland y Parsons 1972 Como
especifica la tØcnica todo el material utilizado se lavó previamente con mezcla crómica para
eliminar los fosfatos presentes en los detergentes
La concentración de ortofosfato soluble de las suspensiones bacterianas se midió cada 48
h durante los periodos antes mencionados
v
APENDICE IV
Extracción de Æcidos orgÆnicos
Las cepas de B S FI fueron crecidas y transferidas a medio líquido SRSMl en matraces
de 125 mI DespuØs de 100 h de incubación y agitación constante 30oC y 120 rpm 1 mI de cada
suspensión bacteriana se colocó en tubos con tapa de rosca de 12 x 75 mm Como control se
utilizó medio no inoculado Las muestras fueron acidificadas agregando 0 2 mI de Æcido sulfœrico
al 50 volvol Se agregaron 04 g de NaCl y 1 mI de dietil Øter El contenido del tubo se
mezcló suavemente invirtiØndolo cerca de 20 veces para extraer los Æcidos orgÆnicos libres en la
fase Øter
La separación de la fase Øter se llevó a cabo dejando reposar la emulsión durante 20 mino a
goC y posteriormente se extrajo la capa Øter superior de la suspensión acuosa
La capa Øter se filtró a travØs de CaC 2HzO aproximadamente un cuarto del volumen
del Øter y un mililitro mÆs de Øter se adicionó sobre el CaC 2HzO El Øter se evaporó en un
rotavapor wheaton a 160 rpm y 350C Posteriormente los Æcidos orgÆnicos extraídos fueron
suspendidos en 1 mI de Øter y transferidos a tubos eppendorf De esta fase Øter se inyectaron de
lJll a 4 Jll al cromatógrafo de gases para detectar Æcidos orgÆnicos de cadena corta
Para extraer los Æcidos orgÆnicos no volÆtiles primero fueron derivatizados conversión a
metil Østeres para la detección por cromatografia de gases mediante el siguiente procedimiento
Un mililitro de cada muestra se colocó en tubos de 12 x 25 mm se agregaron 2 mI de
metanol y 04 mI de Æcido sulfœrico al 50 EstÆ mezcla se calentó a 600C durante 30 mino
VI
DespuØs se agregó 1 mI de agua y 0 5 mI de clorofonno cerrando el tubo apretadamente e
invertiØndolo suavemente aproximadamente 20 veces
La capa de cloroformo del fondo fue extraída y transferida a tubos eppendorf Se inyectó
de 1l1 a 4l1 de muestra en el cromatógrafo de gases
Cuantificac˝ón de Æcidos orgÆnicos
El Ærea de los picos mÆs o menos simØtticos se calculó con la fórmula AZ H EF
siempre y cuando fuera posible medir EF ancho a la mitad de la altura del pico en los casos en
los que no fue posible se utilizó la fónnula AZ H BC 2 En donde H o H es la altura y
BC es la base del triÆngulo Para definir BC se trazaron tangentes a los lados del pico y en la
intersección con la basal se definió el ancho en la base del pico En el caso de los picos
asimØtricos se utilizó el mØtodo de Kaiser el cual emplea la siguiente expresión AZ H WO 85
Wo 15 2 En esta fónnula se utiliza el 11ancho promedio que se calculó en base al ancho en una
parte asimØtrica del pico al 0 85 de la altura y el ancho de una parte asimØtrica del pico al
0 15 del la altura Anónimo 1984
VIl
APENDICE V
Programa de operación del Cromatógrafo de gases
Las muestras fueron inyectadas en un cromatógrafo de gases VARIAN 6000 utilizando
una columna capilar Fused Silica marca Nukol 15m 0 53mm ID y 0 5m grosor de la película
y operado bajo las siguientes condiciones Nz a una tasa de flujo 2 mlImin a una tasa de flujo
30 mlmin aire a una tasa de flujo 300 mlImin Temperatura de inyección 240oC programado con
una temperatura inicial 700C durante 5 min incrementÆndose 80C min hasta llegar a I400C
manteniØndose a esta temperatura durante 5 mino Se utilizó un registro de 1 IDV con una
velocidad de la grÆfica de 10 mmmin en el primer experimento y de 5 mmmil1 en el segundo
experimento Temperatura del detector de ionizaC˝ón de flama 2400C y una sensibilidad de
detección de 8xlO ll AFS
IJ
al
IJalo
oQ
ÞOOOOl
rfÌ
IJ
s
o
IJ
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IJoQ
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