Genetyka sądowa
Transcript of Genetyka sądowa
GENETYKA SĄDOWA
GENETYKA SĄDOWA
Pobieranie materiału do badań DNA
Krew
Nasienie
Ślina
Mocz
Włosy
Zęby
Kości
Tkanki miękkie
Rodzaje śladów krwi
pasywne
(kapane)
nałożone
(smugi)
natryskowe
Testy wstępne - wykrywanie krwi ludzkiej
Testy wstępne - wykrywanie śladów nasienia
Lampa UV
Test na kwaśną fosfatazę
(Phosphatesmo KM)
Test PSA (antygen
specyficzny dla prostaty)
Badanie obecności
plemników pod
mikroskopem
Testy wstępne - wykrywanie śladów śliny
Lampa UV, Crimescope
alfa-amylaza (RSID), test skrobiowy (SALIgAE®)
Materiał porównawczy
krew lub wymaz z jamy ustnej
włosy
rzeczy użytku osobistego, odzież
osobista
materiał szpitalny (preparaty
histologiczne)
znaczki i koperty
Próbka materiału biologicznego
otrzymana z miejsca przestępstwa lub w
do badania spornego ojcostwa
Izolacja DNA Obliczenie ilości DNA i
jego jakości
PCR dla wielu markerów STR
Biologia
Separacja i detekcja produktów
PCR
(Allele STR)
Technologia
Wyznaczenie genotypu DNA
w próbce
Genetyka
Porównanie genotypu a
próbki z rezultatami z innych
próbek
Jeśli istnieje zgodność to
przeprowadza się porównanie
profilu DNA z bazą danych
Generacja raportu z
prawdopodobieństwem
przypadkowej zgodności
Figure 1.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Etapy badań DNA
Perpetrator’s sperm
mixed with victim’s
epithelial cellsOdciągnąć
nadsącz
SDS, EDTA i
proteinaza K
(bufor lizujący)
mieszanina
dowodów
biologicznych
SDS, EDTA i
proteinaza K + DTT
Inkubacja
37 oC
sperma
DTT liza
główki
plemnika
“Frakcja męska” „Frakcja żeńska”sperma
Metoda lizy preferencyjnej
Termocyklery
Automatyczne analizatory DNA - elektroforeza kapilarna
Profil
genetyczny
Identyfikacja genetyczna - w badaniach sądowych, odnosi się
do procesu zmierzającego do pozytywnej odpowiedzi na
pytania:
„Czy dwa otrzymane profile DNA są identyczne?”
„Czy istnieje wystarczający dowód, pozwalający ustalić, że dwa
profile DNA pochodzą z jednego źródła (od jednej osoby)?”
Porównanie wykazało brak
zgodności oznaczonego w
próbce dowodowej profilu
DNA z profilem genetycznym
oznaczonym w nadesłanym
materiale porównawczym.
Należy wykluczyć możliwość
pochodzenia próbki
dowodowej od podejrzanego.
Układ
polimorficzny B Dowód 2
D3S1358 14, 17 14, 15
VWA 15, 17 16, 19
D16S539 11 9, 13
D2S1338 19, 23 17, 20
Amelogenina X, Y X, Y
D8S1179 10, 15 13, 14
D21S11 28, 30 28, 30
D18S51 14, 17 18, 19
D19S433 12, 18.2 14, 15
TH01 6, 8 8, 9.3
FGA 19 22
OPINIA
KATEGORYCZNA
WYKLUCZENIE
Interpretacja wyników analizy genetycznej
Profil DNA oznaczony w
próbce dowodowej jest
zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla
podejrzanego A.
OPINIA
PROBABILISTYCZNA
Układ
polimorficzny A Dowód 1
D3S1358 16, 17 16, 17
VWA 14, 19 14, 19
D16S539 11, 12 11, 12
D2S1338 19, 24 19, 24
Amelogenina X, Y X, Y
D8S1179 14 14
D21S11 28 28
D18S51 14, 15 14, 15
D19S433 12, 13 12, 13
TH01 6, 9.3 6, 9.3
FGA 23, 24 23, 24
BRAK
WYKLUCZENIA
Interpretacja wyników analizy genetycznej
Wykazanie zbieżności profili
genetycznych bez oszacowania
przypadkowej zgodności nie ma
znaczenia dla sądu.
Ocena statystyczna dowodu !
Częściowy profil genetyczny,
który oznaczono w próbce
dowodowej nie pozwala na
przeprowadzenie
wnioskowania odnośnie
zgodności profili DNA.
Układ
polimorficzny B Dowód 3
D3S1358 14, 17 14
VWA 15, 17
D16S539 11
D2S1338 19, 23
Amelogenina X, Y X, Y
D8S1179 10, 15 10
D21S11 28, 30
D18S51 14, 17
D19S433 12, 18.2 12
TH01 6, 8
FGA 19
OPINIA
NIEROZSTRZYGAJĄCA
BRAK
ROZSTRZYGNIĘCIA
Interpretacja wyników analizy genetycznej
Trudności w profilowaniu i brak
pozytywnych wyników w analizie
kontaminacja obcym materiałem
mała ilość DNA/degradacja DNA
działanie inhibitorów
fizyczne i chemiczne czynniki degradujące
monozygotyczne bliźniaki
chimeryzm/heteroplazmia
materiał biologiczny z tkanek nowotworowych
(LOH-onkogeny/MSI-geny naprawcze)
bloczki histologiczne
złe przechowywanie próbek
błąd człowieka/zawodność aparatury
pochodzeniu odzwierzęcym badanego materiału biologicznego
stwierdzenie, czy wynik jest „dobry” czy „zły” zależy od wiedzy i doświadczenia eksperta
zasadniczym elementem oceny jest morfologia „pików”
Problemy z determinacją płcibłędna interpretacja wyników genotypowania
delecja genu amelogeniny
przemieszczenie odcinka z genem SRY z
chromosomu Y do X (niepłodni mężczyźni XX z
genem SRY i kobiety XY – Y bez genu SRY)
chimeryzm zupełny po przeszczepie (biorca kobieta
a dawca mężczyzna)
aberracje chromosomowe (XXY, XXX, XYY, X0,
CAIS – fenotypowo kobieta XY)
inaktywacja 5-alfa-reduktazy (XY- kobieta)
Wymagania i standardy współczesnej
opinii genetycznej
Atestacje dotyczące testów biegłości w badaniach genetycznych w zakresie śladów biologicznych i ustalania ojcostwa, zgodne z aktualnymi zaleceniami Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Sądowej (ISFG), Komisji Genetyki Sądowej PTMSiK* oraz Europejskiej Sieci Instytutów Kryminalistycznych (ENFSI)
Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie badań śladów biologicznych, muszą być przeprowadzane w zakresie minimum 10 loci oraz markera płci*
Badania dla potrzeb atestacji laboratoriów w zakresie ustalania pokrewieństwa, w tym ojcostwa, muszą być przeprowadzane w zakresie minimum 13 loci oraz markera płci systemu CODIS*
Wartość szansy ojcostwa (PI) wymagana, aby wyniki atestacji zostały uznane za prawidłowe, w przypadku potwierdzenia ojcostwa musi wynosić co najmniej 1 000 000, a wykluczenie ojcostwa musi być wykazane co najmniej w 4 loci genowych*
Akredytacja laboratoriów wg normy PN-EN ISO/IEC 17025
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych
Rozpoznanie zwłok opiera się na:
dowodach pozamedycznych
(daktyloskopia, odzież, przedmioty)
dowodach medycznych
oględziny zewnętrzne
oględziny wewnętrzne
badania genetyczne
Identyfikacją zajmują się medycy sądowi i antropolodzy
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych
Oględziny zewnętrzne
Oględziny zewnętrzne zwłok, w zależności od stanu zwłok
pozwalają na ustalenie:
- wieku, płci, wzrostu, wagi ciała, rozmiaru „obuwia”
- owłosienie głowy
- koloru tęczówek
- cech twarzy, rąk, stóp, budowy ciała, co powinno być
zarejestrowane na zdjęciach lub filmie
- znaki szczególne (znamiona, blizny, zniekształcenia)
- uzębienie (w Polsce bardzo rzadko ludzie leczą się u
jednego stomatologa i posiadają kartę stomatologiczną)
- superprojekcja i metoda Gerasimowa - do odtworzenia
wyglądu twarzy
Najlepszy materiał sekcyjny do badań DNA
krew (zwłoki bez widocznego rozkładu gnilnego)
nienaruszone stomatologicznie zęby
trzon kości piszczelowej lub udowej
guzowatość kości potylicznej
chrząstka żebrowa
wątroba lub śledziona (w wyjątkowych przypadkach)
Ustalanie tożsamości zwłok nieznanych
Oględziny wewnętrzne
Oględziny wewnętrzne czyli sekcja zwłok pozwala na ustalenie
stanu zdrowia tj. schorzeń narządów wewnętrznych, przebytych
operacji, zmian pourazowych, np. wygojonych złamań kości.
Należy odpowiedzieć na pytania:
jak długo od śmierci i w jakich warunkach
pozostawały poszczególne fragmenty ciała
czy poszczególne fragmenty należą do tego samego
osobnika (dopasowanie anatomiczne, zgodność
serologiczna lub testy DNA)
czy poszczególne części ciała należą do osobnika tej
samej płci
jaki wzrost i wagę ciała miała ofiara
Identyfikacja zwłok rozkawałkowanych
Metody identyfikacji zwłok*
porównanie profilu genetycznego DNA
porównanie odcisków palców
badanie uzębienia i innych danych odontologicznych
badania radiologiczne
porównanie danych medycznych (przebyte zabiegi lecznicze i
chirurgiczne)
porównanie znaków szczególnych (blizny, tatuaże)
porównanie danych rysopisowych
identyfikacja rzeczy osobistych
identyfikacja na podstawie dokumentów ujawnionych przy
zwłokach lub szczątkach
rozpoznanie przez świadków, członków rodziny lub znajomych
*opracowane podczas V Konferencji Komisji Interpolu do spraw Identyfikacji Ofiar Katastrof Masowych i Klęsk Żywiołowych, która odbyła się w Lyonie w 1993r
Profil DNA ofiary
z katastrofy
Profil DNA z
dowodowego materiału(szczoteczka do zębów
należąca do ofiary)
Bezpośrednie porównanie
Analiza pokrewieństwa
D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D
?
syn
żona
ofiara D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D
10,10 9,109,138,98,1411,13 syn
żona10,12 8,108,98,128,1211,13
10,10 9,1211,139,911,1412,13
?,10 9,??,139,??,1411,? or
?,13
ofiara
(ojciec)
uzyskany
profil
domniemany
profil ofiary
profil ofiary z
katastrofy
Figure 24.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press
Barkoding DNA – narzędzie do opisu bioróżnorodności
1. Opis i ewidencja bioróżnorodności
2. Analizy ekologiczne i fitogeograficzne
3. Analizy kryminalistyczne
4. Ustalanie składu żywności oraz leków
5. Kontrola „bezpieczeństwa biologicznego”
6. Zapobieganie i identyfikacja nielegalnego handlu zwierzętami lub roślinami będącymi pod ochroną
7. Klasyfikacja i opisywanie nowych gatunków
Sprawy kryminalne
Proces analizy mitochondrialnego DNA
oczyszczenie i pobranie materiału do badania
izolacja mtDNA
amplifikacja regionu HV1/HV2 metodą PCR
sekwencjonowanie amplikonów regionu
HV1/HV2
porównanie sekwencji badanych
porównanie sekwencji badanych z referencyjną
sekwencją Andersona
sprawdzenie z bazą danych częstości
haplotypowej danej sekwencji
Interpretacja wyników sekwencjonowania mtDNA
wykluczenie – różnica dwóch lub
więcej nukleotydów pomiędzy
badanymi próbkami
brak rozstrzygnięcia – różnica w
jednym nukleotydzie pomiędzy
badanymi próbkami
brak wykluczenia – brak różnicy w
sekwencji nukleotydów pomiędzy
badanymi próbkami
Analiza klasycznych cech grupowych w
badaniach o ustalenie ojcostwa
układ AB0
antygeny erytrocytarne: MNSs, Rh, Kell, Jk(a,b), Fy(a,b)
specyficzne białka surowicy krwi: układ GM,
haptoglobiny (HP)
izoenzymy zawarte w krwinkach czerwonych: APC
(kwaśna fosfataza krwinkowa), PGM
(fosfoglukomutaza), ESD (esteraza D), GLO
(glioksolaza), GPT (aminotransferaza), PGP (fosfataza
fosfoglikolanowa)
antygeny układu zgodności tkankowej HLA
Badanie ojcostwa testami genetycznymi DNA
?Pobranie krwi lub wymazu z jamy
ustnej do badania
Izolacja DNA
Amplifikacja 15 polimorficznych
markerów genetycznych techniką
PCR (Identifiler)
Rozdział produktów amplifikacji techniką
zautomatyzowanej elektroforezy – sekwenator ABI
Prism 377
Interpretacja 5-kolorowego cyfrowego obrazu
elektroforezy
• w teście tym tylko 1 mężczyzna nie będący ojcem, na milion nie będących ojcami pozostanie
niewykluczony
• wykluczenie ojcostwa stwierdzane jest średnio w 9 spośród 15 układów
• brak wykluczenia ojcostwa jest praktycznie równoznaczny z jego udowodnieniem
• prawdopodobieństwo napotkania innego mężczyzny, którego ojcostwo nie zostałoby wykluczone w
teście wynosi średnio 1 na 9 miliardów
Dziecko
Matka
Mężczyzna będący
ojcem
biologicznym
?
Zasady dziedziczenia
1) dziecko ma dwa allele dla każdego markera
autosomalnego (jeden od matki i jeden od
biologicznego ojca)
2) dziecko dziedziczy mitochondrialny haplotyp
DNA po matce (wyłączając mutacje)
3) dziecko płci męskiej dziedziczy haplotyp
chromosomu Y po ojcu (wyłączając mutacje)
Mężczyzna nie
będący ojcem
biologicznym
Zaginione
dziecko
Domniemana
matka
Domniemany
ojciec
?
Test na ojcostwo
Odwrotny test na ojcostwo(identyfikacja zaginionego dziecka)
?
Parametry biostatystyczne
Prawdopodobieństwo wykluczenia ojcostwa (PE)
definiuje się jako prawdopodobieństwo, z jakim zastosowany zestaw markerów genetycznych pozwala na wykluczenie niesłusznie pozwanego mężczyzny; czyli określa procent mężczyzn w populacji, którzy nie mogą być biologicznymi ojcami dziecka ze względu na brak wspólnego allela
Szansa ojcostwa (PI)
interpretując wyniki badań genetycznych rozważamy dwie hipotezy - jedną potwierdzającą ojcostwo, a drugą zaprzeczającą ojcostwu badanego mężczyzny. Wielkość współczynnika PI informuje nas o tym, dla której hipotezy otrzymane wyniki badań genetycznych są bardziej prawdopodobne. Przykładowo, wartość PI = 1 000 000 oznacza, że otrzymany wynik badań genetycznych jest 1 000 000 razy bardziej prawdopodobny przy założeniu, że badany mężczyzna jest biologicznym ojcem, niż przy założeniu, że ojcem dziecka jest inny mężczyzna
Prawdopodobieństwo ojcostwa (P)
obliczane na podstawie szansy ojcostwa (PI) oraz tzw. prawdopodobieństwa a priori, którego wartość przyjmuje się najczęściej jako 0.5. Gdy wartość P przekracza 99.999999%, szansa ojcostwa (PI) wynosi przynajmniej 1 000 000
Katedra i Zakład Medycyny Sądowej UJCM