Laporan Praktikum Genetika

SOUTHERN BLOTTING

Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, A. Nurfitriana, R. Arita

Universitas Indonesia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Departemen Biologi

Mei 2012

Abstrak

Southern Blotting adalah metode yang digunakan untuk mendeteksi sekuen DNA spesifik pada suatu DNA sampel

menggunakan probe atau komplementernya. Prinsip kerja dari Southern Blotting adalah transfer molekul DNA yang telah

dipisahkan oleh gel elektroforesis ke membran nilon. Membran nilon adalah tempat hibridisasi antara sekuen DNA

spesisfik dengan probe. Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks yang stabil antara dua rangkaian nukleotida yang

saling komplementer melalui perpasangan basa-basa nitrogennya. Probe adalah DNA untai tunggal yang merupakan

komplemen dari DNA target. Teknik hibridisasi terdiri atas 3 jenis yaitu Southern Blotting, Northern Blotting dan

Western Blotting. Aplikasi dari Southern Blotting adalah mengetahui ukuran fragmen DNA, mendeteksi alel mutan

penyebab penyakit tertentu serta DNA fingerprinting.

Kata kunci: hibridisasi; Southern Blotting; probe

1. Pendahuluan

Tujuan pelaksanaan praktikum Southern

blotting antara lain untuk memahami prinsip dan

tahapan kerja dari Southern Blotting, serta

mengetahui aplikasi dari Southern Blotting.

Southern Blotting adalah metode pemisahan,

elektroforesis, transfer ke membran

nitroselulosa dan hibridisasi dengan probe

(Hartl & Jones 2005: 61). Prinsip dasar dari

metode Southern Blotting adalah transfer

molekul DNA dari gel elektroforesis ke

membran nilon atau penyaring nitroselulosa

(Tripathi 2010: 1186). DNA diekstraksi dari

jaringan (darah, tulang, dan sebagainya),

kemudian dilakukan proses digesti dengan

lokasi yang spesifik oleh enzim restriksi. DNA

kemudian didenaturasi secara in situ dan

*) Kelompok 2A 1

dipindahkan ke membran nilon (Brown & Joy

Ho 2005: 85).

Teknik hibridisasi terdiri dari tiga jenis,

yaitu Southern Blotting, Northern Blotting, dan

Western Blotting. Southern Blotting merupakan

teknik yang digunakan untuk mendeteksi DNA.

Teknik tersebut dilakukan dengan cara

memisahkan molekul DNA menggunakan

teknik elektroforesis kemudian molekul DNA

tersebut ditransfer ke membran nitroselulosa dan

dihibridisasi dengan probe DNA yang telah

dilabel dengan unsur radioaktif (Martin 1996:

65). Northern Blotting menggunakan prinsip

yang sama dengan Southern Blotting, yang

membedakan adalah Northern Blotting

digunakan untuk mendeteksi ekspresi RNA.

Western blotting berfungsi untuk mendeteksi

protein dengan prinsip yang sama dengan

Southern Blotting dan Northern Blotting

(Tomashefski dkk. 2008: 60). Salah satu contoh

protein yang dapat dideteksi dengan

menggunakan metode Western Blotting adalah

antibodi (Schleif 1986: 291-292).

Tahap-tahap kerja dalam Southern Blotting yaitu

pertama elektroforesis fragmen DNA dengan gel

agarosa. Kedua, denaturasi molekul DNA untai ganda

menjadi molekul DNA untai tunggal. Ketiga, transfer

molekul DNA ke membran nitroselulosa. Keempat,

hibridisasi probe radioaktif pada fragmen DNA. Kelima,

membran dibersihkan. Keenam, deteksi band DNA

dengan menggunakan autoradiography (Tamarin &

Leavitt 1991: 315). Probe adalah DNA untai tunggal

yang dapat membentuk pasangan basa dengan urutan

komplementer pada polinukleotida untai tunggal lain

yang merupakan DNA target. Proses tersebut dikenal

dengan sebagai penyatuan kembali (annealing) atau

hibridisasi. Untuk mengidentifikasi urutan sasaran,

probe harus diberi label unsur radioaktif atau

nonradioaktif (Marks dkk. 1996: 239). Probe adalah

DNA untai tunggal yang dilabel dengan unsur radioaktif

dan berkomplemen dengan urutan DNA tertentu

(Tamarin & Leavitt 1991: 315).

Aplikasi dari Southern Blotting yaitu dapat

mengetahui ukuran fragmen DNA target, studi forensik

seperti DNA fingerprinting dan paternity test (Klug &

Cummings 1994: 427). Laboratorium forensik

menggunakan Southern Blotting untuk menganalisis

DNA fingerprints dari sampel darah atau semen yang

tertinggal di tempat kejadian perkara (Bolsover dkk.

2011: 111). DNA fingerprinting adalah teknik analisis

DNA yang digunakan untuk mengetahui identitas

seseorang, serta membedakan individu dengan individu

lain dalam satu spesies dengan cara mengidentifikasi

pola khas dalam komposisi DNA mereka masing-masing

(Rosen & Gothard 2010: 146). Aplikasi lain dari

Southern Blotting adalah untuk diagnosis leukemia dan

limfoma dengan menggunakan probe yang spesifik

untuk translokasi atau penyusunan gen kembali (Provan

& Gribben 2010: 60).

2. Metodologi

Alat yang digunakan pada praktikum Southern

Blotting adalah membran nitroselulosa berukuran 20 x

20 cm atau 20 x 14 cm, kertas Whatman 3 MM, tissue,

kertas basah, wadah, dan pemberat. Bahan yang

digunakan pada praktikum Southern Blotting untuk

campuran larutan A adalah 300 mL 5 M NaCl, 50 mL 10

M NaOH, dan 650 mL air, untuk campuran larutan B

2

adalah 200 mL 10 M amonium asetat, 4 mL 10 M

NaOH, dan 1796 mL air (Davis dkk.1994: 184).

Cara kerja pada praktikum Southern Blotting yaitu

pertama gel agarosa dicelupkan ke dalam larutan A pada

suhu kamar selama 30 sampai dengan 45 menit. Larutan

A dipindahkan dan diganti dengan larutan B. Gel

diinkubasi selama 30 sampai dengan 45 menit. Kedua,

500 mL larutan B ditambahkan ke dalam wadah dan

kertas basah diletakkan di atas pelat kaca pada wadah.

Ketiga, gel diletakkan di atas pelat kaca. Keempat,

membran nitroselulosa diletakkan di atas gel. Kelima,

dua lembar kertas Whatman 3 MM diletakkan di atas

membran nitroselulosa. Keenam, tumpukan tissue

diletakkan di atas kertas Whatman 3 MM. Ketujuh,

pemberat diletakkan di atas tumpukan kertas tissue dan

biarkan selama semalam hingga semua molekul DNA

dari gel berpindah ke membran nitroselulosa.

Kedelapan, setelah molekul DNA berpindah ke

membran nitroselulosa, semua lapisan yang ada di atas

membran nitroselulosa dipindahkan dan membran

nitroselulosa dihibridisasi dengan larutan yang

mengandung probe radioaktif. Kesembilan, membran

nitroselulosa yang telah dihibridisasi kemudian

dibersihkan (washing). Kesepuluh, membran

nitroselulosa divisualisasi dengan autoradiography

(Davis dkk.1994: 184-185).

3. Pembahasan

Inkubasi gel agarosa pada larutan A bertujuan

untuk mendenaturasi untai ganda molekul DNA menjadi

untai tunggal sehingga dapat ditempeli dengan probe.

Gel diinkubasi pada larutan B bertujuan untuk

mengembalikan pH ke pH netral. Kertas basah, kertas

Whatman 3MM, dan kertas tissue berfungsi sebagai

sumbu kapilaritas tempat molekul DNA berpindah

(Davis dkk.1994: 185). Proses washing pada membran

nitroselulosa bertujuan untuk menghilangkan probe

radioaktif yang tidak berikatan. Autoradiography

berfungsi untuk melihat fragmen DNA yang telah

ditempeli dengan probe radioaktif (Russell 1994: 301).

Sampel yang merupakan satu anggota keluarga

adalah sampel M, Dad 1, dan Kid 1. Sampel tersebut

dapat dikatakan sebagai satu keluarga karena sampel

anak (Kid 1) mengandung band-band DNA dari sampel

M dan sampel Dad 1.

4. Kesimpulan

Southern Blotting adalah teknik yang digunakan

untuk mendeteksi DNA spesifik dengan menggunakan

probe. Probe adalah DNA untai tunggal yang

merupakan komplemen dari DNA target yang sudah

dilabel unsur radioaktif. Prinsip kerja Southern Blotting

adalah transfer molekul DNA ke membran nitroselulosa

setelah dipisahkan dengan elektroforesis. Aplikasi dari

Southern Blotting antara lain untuk mengetahui ukuran

fragmen DNA dan analisis DNA forensik yaitu DNA

fingerprinting dan paternity test.

Daftar Pustaka

Bolsover, S. R., E. A. Shephard, H. A. White & J. S.

Hyams. 2011. Cell biology: a short course. 3rd

ed. John Wiley & Sons, Inc., New Jersey: 432

hlm.

Brown, R. D. & P. Joy Ho. 2005. Multiple myeloma:

methods and protocols. Humana Press Inc.,

New Jersey: 306 hlm.

3

Davis, L.G., W.M. Kuehl & J.F. Battey. 1994. Basic

Methods in Molecular Biology. Appleton & Lange

Paramount Publishing, USA: xii + 777 hlm.

Hartl, D.L., E.W. Jones. 2005. Genetics: Analysis of

Gene and Genomes, 6th ed. Jones and Bartlett

Publishers, Inc., USA: xxv + 854 hlm.

Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of

Genetics. 4th ed. Macmillan Publishing Company,

USA: xvi + 779 hlm.

Marks, D. B., A. D. Marks & C. M. Smith. 1996. Basic

medical biochemistry: a clinical approach. Terj.

dari Biokimia kedokteran dasar: sebuah

pendekatan klinis oleh B.U. Pendit. EGC,

Jakarta: ix + 770 hlm.

Martin, R. 1996. Gel Electrophoresis: Nucleic Acids.

BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford: xii +

175 hlm.

Provan, D. & J. Gribben. 2010. Molecular hematology.

Blackwell Publishing Ltd., West Sussex: 428

hlm.

Rosen, J. & L. Q. Gothard. 2010. Encyclopedia of

physical science. Facts On File, Inc., New York:

xv + 748 hlm.

Russell, P. J. 1994. Fundamental of

Genetics. Harper Collins College Publisher, USA:

xvi + 528 hlm.

Schleif, R. 1986. Genetics and Molecular Biology. The

Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.,

USA: xix + 626 hlm.

Tamarin, R. & R.W. Leavitt. 1991. Principles of

Genetics, 3rd ed. Wm. Brown Publishers, USA:

xvi + 607 hlm.

Tomashefski, J. F., P. T. Cagle, C. F. Farver & A. E.

Fraire. 2008. Dail and hammar’s pulmonary

pathology: neoplastic lung disease. 3rd ed.

Springer Science+Business Media, LLC., New

York: 869 hlm.

Tripathi, G. 2010. Cellular and biochemical sciences.

I.K. International Publishing House Pvt. Ltd.,

New Delhi: 1392 hlm.

4