Técnicas de Estudio a Nivel Molecular

DNA RNA

- Southern Blot-PCR- FISH- Secuenciación

-Northern Blot-RT-PCR-Microarray

Técnicas mas utilizadas para el estudio de

DNA

Enzimas de restricción (endonucleasas)

De origen bacteriano. Reconocimiento y corte de secuencias especificas (palindromicas) de 4 a 6 pbSistema de protección bacteriana.

Enzyme Site   Enzyme Site

AluI AG'CT   NotI GC'GGCCGC

BamHI G'GATCC   PstI CTGCA'G

BglII A'GATCT   PvuII CAG'CTG

EcoRI G'AATTC   SalI G'TCGAC

HaeIII GG'CC   Sau3AI 'GATC

HhaI GCG'C   SmaI CCC'GGG

HincII GTY'RAC   SpeI A'CTAGT

HindIII A'AGCTT   TaqI T'CGA

HinfI G'ANTC   XbaI T'CTAGA

HpaII C'CGG   XhoI C'TCGAG

KpnI GGTAC'C   XmaI C'CCGGG

MboI 'GATC      

Formación de extremos cohesivos

Formación de extremos romos

BamHI 5´--G‘ GATCC--3´ 3´--CCTAG’ G--5´

---G´ 3´ 5´ GATCC--- ---CCTAG 5´ 3´ ’G---

HaeIII ---GG CC------CC GG---

HincII ---GTC GAC------CAG CTG---

---GG CC--- ---CC GG---

---GTC GAC------CAG CTG---

USOS

•Tecnología de DNA recombinante

Inserción en plásmidos

Creación de moléculas híbridas

•Mapas de restricción (caracterización de un gen)

•Análisis de mutaciones

•Creación de bibliotecas genómicas

•Preparación de la muestra para técnicas posteriores (por ej. Southern Blot)

Southern Blot

Dos muestras A y B de simple cadenaSe blotearon sobre la membrana Se Incuba con la sonda marcada

Solo la sonda complementaria se“pega” a la secuencia correspondiente

Se revela por autoradiografía o por quimioluminiscencia.

Gel de agarosa 0.7% con 14 muestras corridasTras la digestión con EcoRI.

Placa radiográfica revelando las cepas positivas Para el gen de interés.

Southern.exe

Polymerase Chain Reaction

Desarrollada por Kary Mullis en 1983 en California y publicada por primera vez en Science en 1985.

Amplificación de fragmentos específicos de hasta 10.000 bp

Ensayo de corta duración, de alta especificidad y reproducibilidad

Pequeñas cantidades de DNA

Se necesita conocer la secuencia o al menos la sec. flanqueante

Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54

Ciclos deTemperatura

Preparaciónde la mezcla

Análisis de resultados

PCR

Pcr.exe

Termocicladores modernos

Máquina de PCR primitiva

Real Time PCRTécnica utilizada para monitorear el progreso de una reacción de PCR a medida que transcurre (tiempo real). 

Pueden detectarse y cuantificarse cantidades mínimas de producto de PCR (DNA, cDNA or RNA).

Está basado en la detección de fluorescencia producida por una molécula reportera. Esto ocurre debido a la acumulación del producto de PCR en cada ciclo de amplificación.

Estas moléculas fluorescentes pueden ser colorantes que se unen a la doble hebra de DNA (ej. SYBR® Green ) o secuencias específicas (ej. Molecular Beacons or TaqMan® Probes).

No es necesario pos procesamiento de la muestra.

Real time PCR es fácil de llevar a cabo, con alta sensibilidad y mayor especificidad

También puede estudiarse expresión mediante el uso de RNA como molde

Secuenciación de DNA

Método de Sanger

FISH

Detección de translocaciones Estudios de cariotipo

Cromosomas marcados con sondas teloméricas

Y un colado!!!!!

Hibridación in situ para localización de expresión en tejidos. a) embrión de pez b) nucleolo

Técnicas mas utilizadas para el estudio de

RNA

RT-PCR

Northern Blot

Y LO MAS NUEVO!!!!....

LO QUE ESTÁ DE MODA.....

Microarray

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