Gene, dien di, pcr

- Định nghĩa, cấu trúc và chức năng của Gen - Kỹ thuật điện di ADN

I. Gen

1.Khái niệm :- Gen là một đoạn của phân tử ADN mang thông tin mã hoá một chuỗi pôlipeptit hay một phân tử ARN.Ví dụ: gen hemôglôbin anpha là gen mã hóa chuỗi pôlipeptid anpha tạo nên phân tử Hb trong tế bào hồng cầu.

I. Gen

2. Cấu trúc chung của Gen

Mỗi Gen gồm 3 vùng trình tự nucleotit :

Vùng điều hoà Vùng kết thúc

Vùng mã hoáMạch mã gốc 3’

Mạch bổ sung 5’

5’

3’

I. Gen

2. Cấu trúc chung của gen :

Vùng điều hòa -Vị trí: nằm ở đầu 3’ của mạch mã gốc của gen.-Chức năng: là nơi để ARN pôlimeraza nhận biết và liên kết để khởi động quá trình phiên mã, đồng thời cũng chứa trình tự nuclêôtit điều hòa quá trình phiên mã.

2. Cấu trúc chung của gen : Vùng mã hóa: mang thông tin mã hóa các axit amin

I. Gen

* Gen cấu trúc ở sinh vật nhân sơ Vùng điều hoà Vùng kết thúcVùng mã hoá

Gen không phân mảnh

Mạch mã gốc 3’


5’

3’

* Gen cấu trúc ở sinh vật nhân thực

IntronExon ExonExon IntronGen phân mảnh

Vùng điều hoà Vùng kết thúcVùng mã hoáMạch mã gốc 3’


5’3’

I. Gen

2. Cấu trúc chung của gen : Vùng kết thúc:

- Vị trí: nằm ở đầu 5’ của mạch mã gốc của gen.

- Chức năng: mang tín hiệu kết thúc phiên mã.

3. Phân loại GenDựa vào vai trò của các sản phẩm gen thì gen được chia

làm 2 loại: Gen cấu trúc: là gen mang thông tin mã hoá cho các sản

phẩm tạo nên thành phần cấu trúc hay chức năng tế bào. Gen điều hòa: là những gen tạo ra sản phẩm kiểm soát

hoạt động của các gen khác

I. Gene

Định nghĩa Điện di ADN Điện di ADN là quá trình phân tách một hỗn hợp các phân tử

ADN nhờ một chất nền cố định (gel) trong một điện trường. AND tích điện âm vì gốc photsphat hình thành khung đường

photsphate của phân tử AND tích điện âm trong điện trường di chuyển về phía cực dương. Bản gel hoạt động như một giá thể để phân tách các đoạn

AND Các lỗ trên bản gel được xem như các giếng chứa ADN

II. Điện di ADN trên gel Agarose

2.1 Định nghĩa Agarose Agarose gel tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước

(hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40-45oC.

- Cấu trúc Agarose không đồng nhất: vừa tích điện vừa trung hòa

- Agarose là một polyme trung tính tạo nên tính đông tụ của agar


Agarose có khả năng phân tách các phân tử ADN có kích thước lớn khác nhau trong khoảng 0.5 – 20 kb.


Hình 1: Agarose

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel

Kích thước phân tử: các phân tử ADNcó kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm.

Nồng độ agarose: Đoạn AND mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau.


Bảng 1: Các thông số điện di DNA bằng agarose gel

2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ dịch chuyển điện di trong agarose gel

Cấu hình ADN: Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau.


Hình 2: Điện di plasmid có cấu hình khác nhau

2.3 Cách tiến hành2.3.1. Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel Dung dịch đệm thường sử dụng trong

điện di agarose và polyacrymid là TBE(Tris-Boric acid-EDTA) và TAE(Tris-Acetic acid-EDTA).

Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 1x TBE hòa tan với hàm lượng agarose cần thiết đặt trong lò vi sóng đến khi tan hoàn toàn,đổ vào khuôn có các lượt cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết.


Hình 3: Dung dịch đệm TAE

2.3 Cách tiến hành2.3.1. Chuẩn bị dung dịch

đệm và bản gel. Khi bản gel đã đông cứng,

đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch đệm ngập bản gel khoảng 1-2mm.


Hình 4: Bản gel đặt trong buồng điện di

2.3 Cách tiến hành2.3.2. Nạp mẫu Mẫu ADN được tách chiết enzym giới hạn cắt

thành các đoạn có kích thước nhỏ, được trộn đều vào đệm nạp mẫu có thêm chất màu tạo thành hỗn hợp có màu xanh để kiểm tra kích thước các đoạn ADN thường chạy đồng thời cùng với mẫu ADN chuẩn.


2.3 Cách tiến hành2.3.3. Điện di Trong điện di thường sử dụng

nguồn điện thế 100V, cường độ 100mmA, thời gian chạy điện di trong khoảng 40 phút đến 1-2 giờ.Tùy theo chiều dài bản gel và mật độ yêu cầu tách các phân tử (có thể dựa vào vị trí các vạch màu, khi các vạch màu chạy được khoảng ¾ chiều dài bản gen có thể kết thúc điện di).


Hình 5: Máy điện di

2.3 Cách tiến hành2.3.4 Nhuộm bản gen và

soi gen: Kết thúc điện di, bản gen

được lấy ra nhuộm Ethyldium-bromid


Hình 6: Ethyldium-bromid

2.3 Cách tiến hành2.3.4 Nhuộm bản gen và soi gen: Bản gen sau khi nhuộm ETBR, rửa

nước thì được đặt vào máy có tia soi UV, để quan sát kết quả điện di, vị trí các đoạn điện di theo kích thước khác nhau, quan sát được những vệt sáng màu đỏ cam trên bản gel hoặc đặt bản gel vào các thiết bị chụp ảnh chuyên dùng để chụp ảnh.Trường hợp nhuộm bạc hoặc nhuộm SYBR-GREEN có thể xác định kết quả bằng mắt thường


Hình 7: Máy soi tia UV

Quá trình nhân đôi ADN1. Thời điểm, vị trí

- Vào kì trung gian, giữa 2 lần phân bào (Pha S của chu kì tế bào).- Diễn ra trong nhân tế bào.

2. Diễn biếna. Nhân đôi ADN ở sinh vật nhân sơ (vi khuẩn E. coli).Gồm 3 bước:- Bước 1 : Tháo xoắn phân tử ADN.Nhờ các enzim tháo xoắn, 2 mạch đơn của phân tử ADN tách nhau dần tại khởi điểm tái bản tạo nên 1 vòng tái bản gồm 2 chạc (hình chữ Y) mở xoắn theo 2 hướng ngược nhau và để lộ ra 2 mạch khuôn.

Quá trình nhân đôi ADNBước 2 : Tổng hợp các mạch ADN mớiEnzim ADN pôlimêrara xúc tác hình thành mạch đơn mới theo chiều 5’ – 3’ (ngược chiều với mạch làm khuôn). Các nuclêôtit của môi trường nội bào liên kết với nuclêôtit của mạch làm khuôn theo nguyên tắc bổ sung (A – T, G – X).+ Trên mạch khuôn 3’ – 5’, mạch mới được tổng liên tục.+ Trên mạch 5’ – 3’, mạch mới được tổng hợp gián đoạn tạo nên các đoạn ngắn (đoạn Okazaki). Sau đó các đoạn Okazaki được nối lại với nhau nhờ enzim nối Ligaza.-Bước 3: Tạo hai phân tử ADN conCác mạch mới tổng hợp đến đâu thì 2 mạch đơn xoắn đến đó tạo thành phân tử ADN con, trong đó có 1 mạch mới được tổng hợp còn mạch kia là của ADN ban đầu.

Quá trình nhân đôi ADN

b. Nhân đôi ADN ở sinh vật nhân thực.- Về cơ bản, sự nhân đôi ADN ở sinh vật nhân thực gần giống với sự nhân đôi ADN ở sinh vật nhân sơ, chỉ khác biệt ở một số điểm cơ bản sau:+ Sự nhân đôi ADN diễn ra đồng thời ở nhiều đơn vị nhân đôi trên cùng một phân tử ADN.+ Hệ enzim tham gia phức tạp hơn.

Quá trình nhân đôi ADN3. Nguyên tắc nhân đôi- Nguyên tắc bổ sung: A liên kết với T của môi trường và ngược lại, G liên kết với X môi trường và ngược lại -Nguyên tắc bán bảo tồn: Phân tử ADN con được tạo ra có một mạch của ADN ban đầu, một mạch mới được tổng hợp.- Nguyên tắc nửa gián đoạn: Trên 1 chạc chữ Y có 1 mạch mới được tổng hợp liên tục và một mạch mới được tổng hợp gián đoạn.4. Ý nghĩaĐảm bảo quá trình truyền đạt thông tin di truyền được nguyên vẹn qua các thế hệ.

Quá trình phiên mã

Là quá trình truyền thông tin di truyền trên mạch mã gốc của gen (ADN) sang mARN theo nguyên tắc bổ sung Quá trình xảy ra trong nhân, vào kì trung gian của quá trình phân bào.


2. Cấu trúc và chức năng của các loại ARN:

Quá trình phiên mã3.Cơ chế phiên mã:a. Thời điểm : xảy ra trước khi tế bào tổng hợp prôtêin.b. Thành phần tham gia: Các loại enzim, các loại nuclêôtit tự do (A, U, G, X) Một phân tử AND khuôn.c. Diễn biến:

Quá trình phiên mãBước 1. Khởi đầu:Enzym ARN pôlimeraza bám vào vùng điều hoà làm gen tháo xoắn để lộ ra mạch gốc có chiều 3’→ 5’ và bắt đầu tổng hợp mARN tại vị trí đặc hiệu.

Bước 2. Kéo dài chuỗi ARN:Enzym ARN pôlimeraza trượt dọc theo mạch gốc trên gen có chiều 3’ → 5’ và các nuclêôtit trong môi trường nội bào liên kết với các nucluotit trên mạch gốc theo nguyên tắc bổ sung:Agốc - Umôi trường Tgốc - Amôi trườngGgốc – Xmôi trường Xgốc – Gmôi trường


Quá trình phiên mãBước 3. Kết thúc:Khi Enzym di chuyển đến cuối gen, gặp tín hiệu kết thúc thì quá trình phiên mã dừng lại, phân tử ARN: được giải phóng. Vùng nào trên gen vừa phiên mã xong thì 2 mạch đơn đóng xoắn ngay lại.Ở sinh vật nhân sơ, mARN sau phiên mã được dùng trực tiếp làm khuôn tổng hợp prôtêin.Ở sinh vật nhân thực, mARN sau phiên mã được cắt bỏ các đoạn intron, nối các đoạn êxôn tạo mARN trưởng thành rồi đi qua màng nhân ra tế bào chất làm khuôn tổng

Ở sinh vật nhân sơ, mARN sau phiên mã được dùng trực tiếp làm khuôn tổng hợp prôtêin.Ở sinh vật nhân thực, mARN sau phiên mã được cắt bỏ các đoạn intron, nối các đoạn êxôn tạo mARN trưởng thành rồi đi qua màng nhân ra tế bào chất làm khuôn tổngd. Kết quả : một đoạn pt ADN→ 1 Pt ARNe. Ý nghĩa : hình thành ARN trực tiếp tham gia vào quá trình sinh tổng hợp prôtêin quy định tính trạng


Quá trình dịch mã1. Khái niệmLà quá trình chuyển mã di truyền chứa trong mARN thành trình tự các aa trong chuỗi polipeptit của prôtêin.

Quá trình dịch mã2. Cơ chế dịch mã - Ri của Prokaryota có hệ số lắng 70

S, gồm 2 tiểu đơn vị : tiểu đơn vị nhỏ (30S) và tiểu đơn vị lớn (50S).

- Khi chứa dịch mã 2 tiểu đơn vị này tách rời nhau, khi dịch mã chúng ghép lại.

- Mỗi Ri có 3 vị trí liên kết với tARN: vị trí A là nơi đính kết với tARN đã nạp aa, vị trí P là nơi đính kết với tARN mang aa đã liên kết chuỗi polypeptid đang được tổng hợp, vị trí E là nơi tARN giải phóng khỏi chuỗi và Ri.

Ribosome

Quá trình dịch mãa. Vị trí: diễn ra trong tế bào chất của tế bàob. Diễn biến: 2 giai đoạn Giai đoạn 1: Hoạt hoá axit amin- Dưới tác động của 1 số enzim, các a.a tự do trong môi trường nội bào được hoạt hoá nhờ gắn với hợp chất ATP- aa + ATP → aa hoạt hoá - Nhờ tác dụng của enzim đặc hiệu, a.a được hoạt hoá liên kết với tARN tương ứng→ phức hợp a.a – tARN.- aa hoạt hoá + tARN → Phức hợp aa - tARN

Quá trình dịch mã

Giai đoạn 2: Tổng hợp chuỗi pôlipeptit (3 bước)Bước 1. Mở đầu+ Tiểu đơn vị bé của ribôxôm gắn với mARN ở vị trí nhận biết đặc hiệu (gần bộ ba mở đầu) và di chuyển đến bộ ba mở đầu (AUG).+ aa mở đầu - tARN tiến vào bộ ba mở đầu (đối mã của nó – UAX- khớp với mã mở đầu – AUG – trên mARN theo nguyên tắc bổ sung), sau đó tiểu phần lớn gắn vào tạo ribôxôm hoàn chỉnh.

Quá trình dịch mãBước 2. Kéo dài chuỗi polipeptit+ aa1 - tARN tiến vào ribôxôm (đối mã của nó khớp với mã thứ nhất trên mARN theo nguyên tắc bổ sung), một liên kết peptit được hình thành giữa axit amin mở đầu với axit amin thứ nhất.+ Ribôxôm chuyển dịch sang bộ ba thứ 2, tARN vận chuyển axit amin mở đầu được giải phóng. Tiếp theo, aa2 - tARN tiến vào ribôxôm (đối mã của nó khớp với bộ ba thứ hai trên mARN theo nguyên tắc bổ sung), hình thành liên kết peptit giữa axit amin thứ hai và axit amin thứ nhất.+ Ribôxôm chuyển dịch đến bộ ba thứ ba, tARN vận chuyển axit amin mở đầu được giải phóng.Quá trình cứ tiếp tục như vậy đến bộ ba tiếp giáp với bộ ba kết thúc của phân tử mARN. Như vậy, chuỗi pôlipeptit liên tục được kéo dài.

Quá trình dịch mãBước 3. Kết thúc- Khi ribôxôm chuyển dịch sang bộ ba kết thúc (UAA, UAG, UGA) thì quá trình dịch mã ngừng lại, 2 tiểu phần của ribôxôm tách nhau ra. Một enzim đặc hiệu loại bỏ axit amin mở đầu và giải phóng chuỗi pôlipeptit, quá trình dịch mã hoàn tất. Trong dịch mã, mARN thường không gắn với từng riboxom riêng rẽ mà đồng thời gắn với một nhóm ribôxôm (pôliribôxôm hay pôlixôm) giúp tăng hiệu suất tổng hợp prôtêin.

Điều hòa hoạt động gene Khái quát: 1. Khái niệm điều hòa hoạt động gen:

Điều hòa hoạt động của gen là điều hòa lượng sản

phẩm của gen được tạo ra.

Ví dụ: Ở vi khuẩn E.coli các gen tổng hợp những

enzyme chuyển hóa đường lactôzơ chỉ hoạt động khi

môi trường có lactozo

Điều hòa hoạt động gene

Hình: Cấu trúc chung của operon

Một hệ thống gồm các gen cấu trúc có liên quan về chức năng thường được phân bố liền nhau thành từng cụm và có chung một cơ chế điều hòa gọi là Operon. Bao gồm

A, B, C: cụm các gen cấu trúc kiểm soát các polipeptit có liên quan về chức năng, tổng hợp mARN

R: gen điều hòa kiểm soát tổng hợp pr ức chế (k là t.phần của Operon)

P (vùng khởi động của operon): chứa 1 trật tự nucleôtit đặc thù, giúp enzim RNA polimeraza nhận biết mạch mã gốc để tổng hợp mARN, và là điểm khởi đầu quá trình phiên mã.

O (vùng vận hành): là trình tự nulêôtit đặc biệt, tại đó prôtêin ức chế có thể liên kết làm ngăn cản sự phiên mã.



Operon Lac:

P (vùng khởi động của operon):

-O (vùng vận hành):

-Z, Y, A: Các gen cấu trúc quy định tổng hợp các enzim tham

gia vào các phản ứng phân giải đường lactose có trong môi

trường để cung cấp năng lượng cho tế bào.

Hình: Sơ đồ hoạt động của các operon Lac khi môi trường không có lactozo



Hình: Sơ đồ hoạt động của các gen trong operon Lac khi môi trường có lactozo

Khi môi trường có lactôzơ:

Lactôzơ + prôtêin ức chế thay đổi cấu hình

prôtêin ức chế không liên kết được với vùng vận

hành ARN pôlimeraza liên kết với vùng khởi động

mARN (gen Z, Y, A) enzym phân giải lactôzơ.


Protein

1. Định nghĩaProtein là những đại phân tử được cấu tạo theo

nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axít amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein.

• Axit amin - đơn phân tạo nên proteinAxit amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là

nhóm amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của axit amin.

Người ta đã phát hiện ra được tất cả 20 axit amin trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống, được chia làm những nhóm khác nhau

Protein

2. Các bậc cấu trúc của Protein2.1 Cấu trúc bậc 1 Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi polypeptide. Đầu

mạch polypeptide là nhóm amin của axit amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của axit amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các axit amin trên chuỗi polypeptide.

Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các axit amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các axit amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein.

Protein

2. Các bậc cấu trúc của Protein

2.2 Cấu trúc bậc 2 Là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi

polypeptide trong không gian. Bao gồm:

- Xoắn alpha- Tấm beta- Ngoặc or cuốn ngẫu nhiên- Được cố định bởi các liên kết hyđro

giữa những axit amin ở gần nhau.

Protein

2. Các bậc cấu trúc của Protein2.2 Cấu trúc bậc 2Xoắn α - Xoắn alpha với 3,6 aa/ xoắn- Chuỗi bên (R) hướng ra ngoài và

có thể tương tác với nhóm R khác- Lk H // với trục xoắn α, giúp

xoắn α k bị cong và làm cho cấu trúc cứng hơn

Protein

Protein

2. Các bậc cấu trúc của Protein

2.2 Cấu trúc bậc 2Tấm β- Tấm β được tạo nên bởi sự nối

bên của cách mạch β- Mỗi mạch β chứa 5-8 aa, tạo

thành cấu trúc cứng- Một tấm β có thể có 2 mạch β

chạy cùng hoặc ngược chiều nhau

2. Các bậc cấu trúc của Protein2.2 Cấu trúc bậc 2Ngoặc or cuốn ngẫu nhiên- Là cấu trúc ngắn hình chữ U,

3-4aa/ ngoặc- Tạo nên bởi glycine or

Proline- Ngoặc giúp nối các xoắn

Alpha or tấm beta- Nằm trên bề mặt protein

Protein

2. Các bậc cấu trúc của Protein2.3 Cấu trúc bậc 3 Từ cấu trúc bậc II, nhờ các loại liên kết khác nhau

như disunfit, liên kết ion, liên kết kỵ nước nối các Aa ở các vị trí khác nhau lại với nhau làm cho phân tử protein cuộn xoắn lại chặt hơn, chuyển từ cấu trúc dạng sợi sang cấu trúc dạng khối (cầu, bầu dục ..

Ở cấu trúc bậc III, phân tử protein đă hình thành các trung tâm hoạt động do có điều kiện để tập hợp các Aa thích hợp lại gần nhau để tạo tâm hoạt động protein bậc III có hoạt tính sinh học và tham gia thực hiện các chức năng sinh học của chúng như chức năng xúc tác (enzyme), chức năng điều tiết ….

Protein

2. Các bậc cấu trúc của Protein2.4 Cấu trúc bậc 4Là cấu trúc bậc cao nhất của

protein. Nó bao gồm nhiều chuỗi polipeptid cuộn lại với nhau.

Vd: IgG có 4 chuỗi polipeptide, 2 chuỗi nặng, 2 chuỗi nhẹ

Protein

3. Chức năng Protein Bảo vệ cơ thể Globulin miễn dịch G là loại kháng thể lưu thông trong máu và nhận biết hạt

ngoại lai gây hại.- Xúc tác cho phản ứng sinh hóa : enzym xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa

học xảy ra trong tế bào- Thu nhận thông tin: protein thông tin, như một số loại hormone, truyền tải tín

hiệu để phối hợp các quá trình sinh học giữa các tế bào, mô, cơ quan khác nhau. Ví dụ: hormone tăng trưởng

- Thành phần cấu trúc : những protein này cung cấp cấu trúc và nuôi dưỡng tế bào. Trong một phạm vi lớn hơn, chúng còn cho phép tế bào di chuyển. Ví dụ: Actin hình thành từ nhiều tiểu đơn vị, giúp co cơ và duy trì hình dạng tế bào

- Vận chuyển các chất: các protein này bám vào những nguyên tử và phân tử nhỏ bên trong tế bào và lưu thông trong cơ thể.Ví dụ : hêmôglôbin.

Protein

4. Tính chất protein4.1 Biến tính protein Dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như tia cực tím, sóng siêu âm, khuấy cơ

học... hay tác nhân hóa học như axit, kiềm mạnh, muối kim loại nặng,... các cấu trúc bậc hai, ba và bậc bốn của protein bị biến đổi nhưng không phá vỡ cấu trúc bậc một của nó, kèm theo đó là sự thay đổi các tính chất của protein so với ban đầu. Sau khi bị biến tính, protein thường thu được các tính chất sau:

+/ Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ nước vốn đã chui vào bến trong phân tử protein

+/ Khả năng giữ nước giảm+/ Mất hoạt tính sinh học ban đầu+/ Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzim proteaza do làm xuất hiện các liên kết

peptit ứng với trung tâm hoạt động của proteaza+/ Tăng độ nhớt nội tại+/ Mất khả năng kết tinh

Protein

4.2 Tính kỵ nước củaProtein Do các gốc kỵ nước của các axitamin(aa) trong chuỗi polipeptit của

protein huớng ra ngoài các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ nước.

Độ kỵ nước có thể giải thích như sau: do các gốc aa có chứa các gốc R-không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước.

VD: chúng ta có các aa trong nhóm 7aa không phân cực :glysin, alanin, valin, pronin, methionin, lơxin, isoloxin chúng không tác dụng với nước.

Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của protein. VD: có 7aa liên kết peptit với nhau, trong đó có 3aa không phân cực( kỵ nước ) nếu như các aa này cùng nằm ở 1 đầu thì tính tan sẽ giảm so với khi các aa này đứng sen kẽ nhau trong liên kết đó.

Protein

4.3 Tính chất của dung dịch keo Khi hoà tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng

bán thấm.Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo:+/ sự tích điện cùng dấu của các protein.+/ Lớp vỏ hidrat bao quanh phân tử protein.Có 2 dạng kết tủa Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì

protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu.Kết tủa không thuận nghịch: là sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây

kết tủa thì protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa

Protein

4.4 Tính chất điện ly lưỡng tính Acid amin có tính chất lưỡng tính vì trong aa có chứa cả

gốc axit(coo-) và gốc bazo(NH2-) suy ra protein cung có tính chất lưỡng tính.

Protein

Hình: Cấu trúc chung của aa

PCR ( Polymerase Chain Reaction)

1. Định nghĩaKỹ thuật PCR( Phản ứng chuỗi trùng hợp) là phương pháo invitro để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy rất cao mà chỉ cần có một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế

2. Thành phần tham gia phản ứng- Mạch khuôn AND- AND polymerase- 2 mồi( mồi xuôi, mồi ngược)- 4 loại nu ( A, T, G , C)- Dung dịch đệm- Nước- Ion Mg


2. Thành phần tham gia phản ứng2.1 Mạch khuôn ADN- Chứa vùng gen cần nhân bản (Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không

được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb) ( k nên chứa chất ức chế Enzym Polymerase)2.2 Mồi Gồm : mồi xuôi và mồi ngược. Các cặp mồi được thiết kế để nhận biết được sợi có

nghĩa của AND mà cần tái bản, còn mồi kia nhận biết được sợi đối nghĩa. Đặc điểm

- Dài khoảng 15-30 nu- Hàm lượng GC khoảng 50%- Nhiệt độ gđ gắn mồi của từng cặp mồi như nhau- Mồi phải chọn đặc trưng cho DNA cần khuếch đại và không trùng với các trình

tự lặp lại trên gen.


2. Thành phần tham gia phản ứng2.3 AND polymeraseLà các enzym xúc tác cho quá trình lắp ráp các Nu vào

mạch AND mới đang tổng hợpTag AND polymerase được tách từ Thermus aquaticus. - Chịu nhiệt tốt- Sinh trưởng tối ưu ở 70-72 độ C- Tổng hợp theo chiều 5’-3’


2. Thành phần tham gia phản ứng2.4 dNTPCần phải có bốn loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP để tạo nên mạch

mớiNồng độ mỗi loại nucleotide phải ở dạng cân bằng, ứng với khoảng

20÷200µM cho mỗi loại nucleotide2.5 Ion MgIon Mg 2 là thành phần không thể thiếu được của phản ứng PCR, nồng độ

Mg+2tối ưu để thực hiện PCR từ150÷200µM. - Co- factor quan trọng của AND polymerase- Ổn định cấu trúc xoắn kép của AND.Nếu quá ít, E k hoạt động, quá nhiều, Phản ứng k đặc hiệu.(bắt cặp lộn xộn

trên mạch khuân)


2. Thành phần tham gia phản ứng2.6 Dung dịch đệm (buffer)- Ổn định các DNA polymarase, DNA, nucleotid- Tris-HCl 100µM, pH = 8 ở 25 độ C- KCl 500µM- Triton X- 100/ Tween2.7 NướcMôi trường hoạt động cho những thành phần còn lại


3. Các giai đoạn PCR3.1 Biến tính ADN

Dùng để tách 2 mạch của AND khuôn thành 2 mạch đơn, ở 90- 98 độ C, trong khoảng 30s- 1p. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới


Hình: AND biến tính

3. Các giai đoạn PCR3.2 Gắn mồi

Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống từ từ, vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuôn theo nguyên tắc bổ sung. Các mồi được thiết kế sao cho đầu 3’ định hướng đoạn trình tự cần nhân nên quá trình tổng hợp AND sẽ diễn ra trên 2 mạch. Qua suốt vùng t. tự đó.


3. Các giai đoạn PCR3.3 Kéo dài chuỗi

Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C trong vài chục giây đến 1 phút để DNA- polymerase tổng hợp sợi mới. Trong thực tế, thời gian và nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi DNA cần khuếch đại.AND polymerase gắn vào đầu 3’ tự do của mồi và sử dụng dNTP để tổng hợp các mạch mới theo chiều từ 5’-3’Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép mẹ tổng hợp 2 sợi DNA kép con. Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25 đến 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72°C trong khoảng từ 5 đến 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của PCR. Sau đó hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm.



Hình: Các bước thực hiện trong một chu kỳ PCR

Thêm về PCR:Số lượng bản sao sau n chu

kỳ là :A x 2^n

( a: là số đoạn khuônn: là số chu trình thực hiện)


Hình: Thành phần 1 p. ư PCR

CHÚNG EM XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN THẦY CÔ VÀ CÁC ANH

CHỊ ĐÃ LẮNG NGHE

Gene, dien di, pcr

Science

Transcript of Gene, dien di, pcr