Formulacija biofarmaceutika

7/23/2019 Formulacija biofarmaceutika

1/46

1

2006 SPI USA, Inc.

Formulacija biotehnolokih

lekova/biofarmaceutika

Doc. dr Sneana Savi

2006 SPI USA, Inc.

Terminologija

2006 SPI USA, Inc.

Uvod

Danas, eritropoetin, insulin, interferoni pripadaju grupitop 10najprodavanijih lekova (lekovitih supstanci) naglobalnom nivou.

Generalno, broj tzv. protein- i peptid-based

farmaceutskih preparata iz godine u godinu raste. Pristupi u proizvodnji zavise od veliine proteina/peptida:

- primena transgenih biljaka i ivotinja- klasina rDNK tehnologija- klasina sinteza kod malih peptida (manje od 20 AK).

Da bi se u potpunosti iskoristio terapijski potencijalproteina potrebne visoko specifine formulacije.

2006 SPI USA, Inc.

Izazovi su:

- stabilizacija aktivne molekule

- formulacija za specifine puteve primene leka- u nekim sluajevima ciljna (drug-targeting)

isporuka leka

Visoko specifine formulacije


2/46

2

2006 SPI USA, Inc.

Generalna razmatranjaformulacije proteina i peptida

Stabilnost, bioloka/farmakoloka aktivnost proteina ipeptida su u velikoj meri zavisni od intaktne primarne,sekundarne, tercijarne i kvaternerne strukture.

Veoma su podloni modifikaciji posredstvom fizikih ilihemijskih sredstava/agenasa.

Treba razmotriti mogue promene tokom razvoja noveformulacije (Tabela 1).

2006 SPI USA, Inc.

Tabela 1. Glavni putevi degradacijepeptida i proteina

Oksidacija (O2, h ), npr. Met, Cys, TrpDeamidacija (T, pH), npr. Asn, GlnCepanje peptida (T), npr. Asp-XPromena na disulfidnoj vezi (pH) CysBeta-eliminacija (pH), npr. Ser, Thr, Cys,Lys

Formiranje disulfida (pH, O2) CysKovalentno agregiranjeCiklizacija (pH), npr. Asp, Glu

Denaturacija (T, pH)Nekovalentna agregacijaPrecipitacijaAdsorpcija

HemijskiFiziki

Putevi degradacije

2006 SPI USA, Inc.

este reakcije hemijske degradacije koje utiu na stabilnost

proteina i metode za njihovo analitiko odreivanje

2006 SPI USA, Inc.

este fizike reakcije koje utiu na stabilnostproteina i metode za analitiko praenje


3/46

3

2006 SPI USA, Inc.

Ovo bi se moglo oznaiti i kao nestabilnostin vitro u boci

denaturacija adsorpcija

2006 SPI USA, Inc.

Ovo bi se moglo oznaiti i kao nestabilnostin vitro u boci

agregacija precipitacija

2006 SPI USA, Inc.

Efekti degradacije mogu biti veomakompleksni...

gubitak bioloke aktivnosti promene FK profila promena farmakodinamije leka toksinost promena distribucije u organizmu promena puteva eliminacije promena antigenog/imunogenog

potencijala

2006 SPI USA, Inc.

Broj moguih promena je realno daleko vei, budui dase neki proteini hemijski modifikuju: glikozilacija,fosforilacija...

Ove neproteinske modifikacije, takoe, imaju veliki uticajna efekte leka (npr. glikozilacija esto kontrolie

cirkuliue polu-vreme, mehanizam eliminacije leka iimunogenost; fosforilacija u mnogim sluajevimadoprinosi biolokoj aktivnosti i specifinom delovanjuleka) formulacija treba da zatiti i ove neproteinskemodifikacije.

Nema generalnih pravila da se predvide efektiindividualnih degradacionih promena; naprotiv deavase da sline degradacione promene imaju varijabilniuticaj na farmaceutski kvalitet razliitih proteinskihlekova.


4/46 4

2006 SPI USA, Inc.

"Problemi " sa proteinima (in vivo uorganizmu)

Eliminacija B i T elijama Proteoliza endo/egzo peptidazama

Mali proteini ( 500 kD)

veoma hidrofilni naelektrisane molekule

ogranien prolaz krozbioloke membrane smanjena biolokaraspoloivost (eng.bioavailability, BA)

stabilnost je problem iprilikom primene i prilikomapsorpcije

velika pH i enzimska osetljivostspreavaju oralnu primenu

pored toga od nekihproteinskih lekova zahteva seveoma brz poetak dejstva

(npr. brzo delujui insulini ukontekstu unosa hrane iliprimena oksitocina u indukcijiporoaja i laktacije)

neke indikacije, pak, zahtevajuprodueno delovanje ilikontinuiranu isporuku leka,(npr. primena dugodelujuih bazalnih insulina kod terapijedijabetesa ili -interferonauterapiji multiple skleroze)


5/46 5

2006 SPI USA, Inc.

ZAHTEV neparenteralni putprimene

Bolja komplijansa neinvazivni put primene U tom cilju treba premostiti dve osnovne tekoe:1. Da se obezbedi efikasna i bezbedna primena proteina

treba razviti specijalne formulacije za razliite puteveprimene (novi sistemi za isporuku leka).

2. Da bi se kompenzovala znaajno manja iskoristljivostleka (zbog smanjene BA nakon neparenteralneprimene) potrebno je optimizovati i proces proizvodnjeproteina da bi se dobili pozitivni farmakoekonomski

ishodi.3. Od interesa su (istraivakog): enteralni, posebno

oralni put, pulmonarni i nazalni put primene proteina ipeptida...

2006 SPI USA, Inc.

Parenteralna isporuka

Put isporuke za oko 95% proteina Omoguuje brzu i potpunu apsorpciju Omoguuje da se primenjuju manje doze (manji

gubitak) Izbegavanje metabolizma prvog prolaza Izbegavanje zona koje nisu pogodne za proteine

(eng. unfriendly zones) Problemi sa predoziranjem i nekrozom Reakcije lokalnog tkiva/reakcije preosetljivosti Komplijansa prihvatanje od strane pacijenta!!!

2006 SPI USA, Inc.

Dakle, za sada ipak (realno),parenteralni put...

Najee se paranteralno lek primenjuje:iv, im i sc.

Primena proteina ovim putem moeznaajno da utie na farmakoloke efekteleka.

Npr., kada se lek primeni iv, trenutno jena raspolaganju za ispoljavanje dejstva,dok je za lek primenjen imili scpotrebnoneko vreme da se dostigne sistemskacirkulacija (depo efekat) i otuda FK profilileka variraju.

Osim na FK, put primene ima uticaja i naprimarnu distribuciju leka npr. kada seprimene scmanji i hidrofilni proteini imajutendenciju da u sistemsku cirkulaciju uupreko venskog sistema, dok vei i/ilihidrofobniji proteini imaju tendenciju da se

apsorbuju preko limfnog sistema. 2006 SPI USA, Inc.

Dakle, za sada ipak (realno),parenteralni put...

Parenteralni proteini tradicionalno su dostupni u boicama(eng. vials) koje se pune tenim, zamrznutim ili liofiliziranimoblicima proteinskih formulacija.

Tene formulacije su manje stabilne. Mnoge reakcije hemijske degradacije proteina su usporene ili

eliminisane u zamrznutom obliku ili u obliku liofilizata samalim sadrajem vode. Tene i zamrznute formulacije su isplativije (proizvodnja je

jeftinija), ali u transportu potrebno obezbeenje hladnoglanca.

Freeze-driedformulacije (liofilizati) zbog stabilnosti na sobnojt (i viim t) omoguen laki (ekonominiji) transport.

Tene formulacije proteina koji su povrinski aktivni pojavapene tokom transporta i rukovanja


6/46 6

2006 SPI USA, Inc.

Pakovanje biofarmaceutika za parenteralnu primenu:specijalne boice, pricevi, razliiti tipovi injektora.

Samo-medikacija primena leka od strane pacijenta specijalni aplikatori smanjenje bola (injektori bez igle isporuka lekajet streamureajima).

Ouvanje stabilnosti leka (prilikom primene ne sme doido agregacije ili parcijalne denaturacije proteina).

Proizvoa mora dokumentovati da biofarmaceutikzadrava specifine karakteristike u svim kljunimtakama proizvodnje, rukovanja/bilo koje manipulacije iprimene.

2006 SPI USA, Inc.

Ouvanje stabilnosti biofarmaceutika

skladitenje/uvanje

formulacija

primena/isporuka

1.2.

3.

2006 SPI USA, Inc.

Formulacija parenteralnih proteina

(biofarmaceutika)

Primarni zahtev sterilnifarmaceutski preparati

- termolabilni neprimenjiveterminalne toplotne metodesterilizacije!!!

- ne mogu se sterilisati nigasnom sterilizacijom ilisterilizacijom zraenjem

- ZAPRAVO, NIJE MOGUASTERILIZACIJA FINALNOGPROIZVODA!

- Proizvode se pod aseptinimuslovima.

2006 SPI USA, Inc.

Formulacija parenteralnih proteina(biofarmaceutika)

Ekscipijensi (sirovine) i oprema se tretiraju odvojeno sterilizacija vlanom ili suvom toplotom (Ph. Eur. 7.0),gasnom sterilizacijom ili jonizujuim zraenjem smanjenje biobardena.

Prefiltracija za bulk biobardeni mehanike neistoe. Finalna filtracija bakterioloka kroz npr. membranske

filtre (0,22 m) Proizvodnja u istim sobama klasa istoe 100

(maksimum 100 estica veih od 0,5 m u kubnoj stopivazduha)


7/46 7

2006 SPI USA, Inc. 2006 SPI USA, Inc.

2006 SPI USA, Inc.

Formulacija parenteralnih proteina(biofarmaceutika)

Viralna dekontaminacija poto rDNK proizvodi rastu u kulturiMO elija treba ih testirati na prisustvo viralne kontaminacije.

Ne sme biti virusnog materijala u finalnom proizvoduporeklom od proizvodnog procesa.

Uklanjanje pirogena sterilizacija opreme i kontejnera navisokim temperaturama iznad 160C u toku produenogvremena (npr. 30 min na 250C suvom toplotom).

Uklanjanje pirogena poreklom iz bakterijskih izvora treba dabude integralni deo procesa proizvodnje; npr. jonsko-izmenjivaka hromatografija se uspeno koristi za smanjenjenivoa endotoksina u rastvorima (mahom poreklom iz gram-negativnih bakterija)

Ekscipijensi koji se koriste u formulacijama proteina trebatakoe da budu endotoxin free.

2006 SPI USA, Inc.

Voda za injekcije svee destilisana ili dobijena reversnomosmozom.

Agregirani endotoksini ne mogu proi kroz membranu zareversnu osmozu.

Uklanjanje endotoksina neposredno pre punjenja finalnogproizvoda u kontejner postie se primenom aktivnog uglja ilidrugih materijala velike kontaktne povrine koji hidrofobnoreaguju.

Endotoksini se mogu inaktivisati i primenom peroksida ilisuvom toplotom (30 min na 250C).


8/46


9/46 9

2006 SPI USA, Inc.

Anti-adsorpciona i anti-agregacionasredstva/primer insulina

Insulin moe da formira fibrilarne precipitate (dugestrukture ipkastog oblika prenika 0,1 m).

Niske koncentracije fosfolipida i PAM ispoljavajuinhibitorni efekat kod stvaranja fibrilarnih struktura +podeavanje pH.

PAM/surfaktanti takoe spreavaju adheziju proteina nameupovrinama i njihovo precipitiranje.

2006 SPI USA, Inc.

Puferi

Izbor pufera je vaan deo procesaformulacije zbog pH zavisnerastvorljivosti proteina i fizike ihemijske stabilnosti.

Izbor: fosfatni, citratni, acetatni. Primer vanosti izoelektrinetake

(pI): rastvorljivost humanog hormonarasta (hGH, pI oko 5).

ak i kratkotrajne promene pH moguda dovedu do agregacije.

Npr. pri suenju zamrzavanjem, kadajedna komponenta pufera kristalie, adruga ne (kod fosfatnog puferaNa2HPO4 kristalie bre od NaH2PO4)

pH jako pada tokom fazezamrzavanja. Druge komponente pufera ne

kristaliu, ve formiraju amorfnesisteme tako da su promene pHminimalne.

Rastvorljivost razliitih oblika hGH kaofunkcija pH

2006 SPI USA, Inc.

Konzervansi i antioksidansi

Metionin, cistein, triptofan, tirozin i histidin su AK kojelako oksidiu.

Ubacivanje inertnih gasova pri punjenju u boicestabilizuje preparat.

Primena antioksidanasa, kao to je askorbinska kiselinaili Na formaldehid sulfoksilat (!!!OPREZ - askorbinska uprisistvu jona tekih metala proksidans).

Viedozna pakovanja punjena u boice konzervansi(parabeni, fenol, benzil alkohol...) / Punjenje u boice -ne u ampule.

Jednodozna pakovanja/bez obzira na zapreminu NEkonzerviu se!

2006 SPI USA, Inc.

Sredstva za izotonizaciju

Pravila koja generalno vae za izotonizaciju parenteralnih preparataodnose se i na proteinske lekove rastvori soli, mono- i disaharida.

Mogu da utiu na strukturu/stabilnost proteina. Npr. eeri i polihidroksilni alkoholi mogu da stabiliu proteinsku

strukturu kroz princip "preferirajueg iskljuivanja".

Ovi aditivi/ekscipijensi poboljavaju interakciju solventa saproteinom i time sebe iskljuuju sa povrine proteina.

Protein se na taj nain primarno hidratie. Ova pojava se moe pratiti preko poveane termostabilnosti

proteina (termalnim tehnikama, npr. DSC tehnikom ilimikrokalorimetrijom).

Meutim, jaka interakcija ovog tipa moe dovesti do poveanjatendencije proteina za samoasociranjem.


10/4610

2006 SPI USA, Inc.

Rok upotrebe formulacijaproteinskih lekova

Proteini mogu da se uvaju:- u obliku vodenih rastvora- u obliku praka suenog

zamrzavanjem (eng. freeze-dried) liofilizati

- u osuenom oblikukomprimovani kao tablete.

Stabilnost rastvora proteinaveoma zavisi od pH, jonske

jaine, temperature iprusustva stabilizatora.

pH zavisna stabilnost rekombinantnog 1-antitripsina (rAAT); k konstanta brzinedegradacije; sadraj monomernog rAATopada i pri kiselom i pri baznom pH.Optimalna stabilnost postie se na pH 7.5

2006 SPI USA, Inc.

Suenje zamrzavanjem (freeze-drying) proteinskih formulacija

Proteini u rastvorima esto ne mogu da zadovolje zahteve zastabilnou za industrijski proizvedene farmaceutskeproizvode (> 2 godine), ak i kada se permanentno dre uuslovima friidera (hladni lanac).

Prisutna voda promovie procese hemijske i fizikedegradacije.

Suenje zamrzavanjem moe da obezbedi eljenustabilnost.

Tokom suenja zamrzavanjem voda se uklanjasublimacijom, a ne evaporacijom.

Razlikuju se tri stupnja u procesu suenja zamrzavanjem:1. Zamrzavanje2. Primarno suenje3. Sekundarno suenje.

2006 SPI USA, Inc.

Suenje zamrzavanjem (freeze-drying) proteinskih formulacija

Zamrzavanje- Temperatura proizvoda smanjuje se sa sobne na temperaturu ispod

eutektike temperature (Te), ili ispod temperature ostakljivanja (Tg)sistema. Tg je od znaaja ako su prisutne amorfne faze.

Primarno suenje- Kristalna i voda koja nije vezana za protein/ekscipijense uklanja se

sublimacijom. Temperatura je ispod Te ili Tg; temperatura je npr.-40C, a koristi se i vakuum.

Sekundarno suenje- Uklanjanje vode koja interaguje sa proteinom i ekscipijensima.

Temperatura u komori odrava se ispod Tg i raste postepeno, npr.,od -40C do 20C.

2006 SPI USA, Inc.40

I Zamrzavanje/smrzavanje(eng. freezing)


11/4611

2006 SPI USA, Inc.

41

Product temperature lower thanshelf temperature during primarydrying because energy is consumedas ice sublimes to vapor.

2006 SPI USA, Inc.


U prvom koraku temperatura vodenog sistema u boicama sesmanjuje.

Kristali leda ne poinju da se formiraju tano na Tsmrzavanja, ve dolazi do superhlaenja(potrebna je niatemperatura).

Kristalizacija se odigrava na temperaturi od -15C il i nioj, tj.neophodno je postii ove temperature tokom procesa.

Tokom koraka kristalizacije temperatura moe povremeno daraste u boici, zbog stvaranja/oslobaanja toplote

kristalizacije. Tokom stupnja hlaenja, dolazi takoe i do relativnog porasta

koncentracije proteina i ekscipijenasa, zbog rasta kristala naraun vodene faze preparata.

2006 SPI USA, Inc.


Formiranje kristala leda moe da uzrokuje precipitaciju jednogili vie ekscipijenasa, to moe da dovede do pomeranja pHvrednosti preparata ili promene jonske jaine ovo moe dadovede do denaturacije proteina.

Hlaenje boica se sprovodi sniavanjem temperature polica.

Bitna je dinamika hlaenja: mali kristali nastaju brzimhlaenjem; veliki kristali se formiraju smanjenjem brzinehlaenja.

Ako se dogodi da sistem formira amorfnu masu pri hlaenju, ane kristale, temperatura treba da se smanji ispod Tg temperature ostakljivanja (glas transition temperature).

U ovakvim, amorfnim sistemima, dramatino se menjaviskozitet u opsegu T oko Tg (stanje gume iznad odnosnostanje stakla ispod Tg).

2006 SPI USA, Inc.

II Primarno suenje

Na poetku stupnja primarnog suenja nema slobodne vode uboicama. -40C je tipi na T smrzavanja pre nego otponesublimacija smanjenjem pritiska u sistemu (vakuum).

Dakle, u ovom koraku dolazi do sublimacije vode u boicamapadom P. Sublimacija koristi E (2500 kJ/g leda).

Pad temperature se izbegava tako to police predaju toplotuboicama, tj. one se greju tokom ove faze proizvodnje.

Toplota se prenosi kroz boicu 1) provoenjem u direktnomkontaktu polica-boica; 2) zraenjem; 3) strujanjem gasa.

Kada se sva smrznuta ili amorfna voda koja nije vezana zaprotein ili ekscipijense ukloni, otpoinje sekundarno suenje.

Kraj primarnog suenja kada t proizvoda i t polica postanujednake ili kada padne parcijalni P vodene pare.


12/4612

2006 SPI USA, Inc.

45

Protok pare iz komore u kondenzator

T

Spojni kanal

Police saboicama

Vakuumpumpa

Vrata

Protokvodene

pare

T P

Komora saproizvodom

Komorakondenzatora

VentilKalemovi

kondenzatora

2006 SPI USA, Inc.

Transfer toplote tokom procesasuenja zamrzavanjem

1. Direktnim provoenjem prekopolica i stakla do taakastvarnog kontakta

2. Provoenjem gasa

3. Prenos toplote zraenjem

Ts temperatura police

Tp temperatura sublimacijeproizvoda

Tc temperatura kondenzatoraTs>Tp>Tc

2006 SPI USA, Inc.

III Sekundarno suenje

U stadijumu sekundarnog suenja t polako raste da bi se uklonilavezana voda; P u komori je jo uvek smanjen.

Ova faza se zavrava kada proizvod dostigne t od 20C, kojuodrava u toku nekog odreenog vremena.

Sadraj rezidualne vode je kritian parametar, koji odreuje zavrnu

taku procesa. Vrednosti ispod 1% rezidualne vode u "kolause preporuuju!!! Stabilnost freeze-driedproteina u prisustvu redukujuih

lioprotektanata, kao to su glukoza i laktoza moe da budeproblematina (amino grupe proteina reaguju sa lioprotektantima usuvom stanju i dolazi do promene boje u uto-smeu).

Primena neredukujuih eera kao to je saharoza reava ovajproblem.

2006 SPI USA, Inc.

Suenje zamrzavanjem -summary

Zamrzavanje tenefaze/uzorka u kontejneru.

Rad pod punimvakuumom. Rastvara sublimie

ostavljajui samo vrste ilinerastvorne supstance.

Smanjuje sadraj vlagena


13/46

13

2006 SPI USA, Inc.

49Baxter Confidential

Merenje sirovina

(API i ekscipijensi)

Pripremanje rastvora upogodnom duplikatorskom sudu(dodavanje sastojaka u vodu za

injekcije)

Pranje i sterilizacijaprimarnih

kontejnera izatvaraa

Odmrzavanje i ubacivanjeaktivnog biofarmaceutika

Dodavanje AS u rastvor,

podeavanje pH , kontrola,

Bulk rastvor

Sterilna filtracija

bulk rastvora

Aseptino punjenje bulk rastvora

u primarnu ambalau i privremeno zatvaranje freeze-drying

Prenos u ureaj za Freeze-drying

i liofilizacija

Unutranji zatvara, prenos izfreeze dryer-aStavljanje aluminijumske

kapice

100% kontrolauvanje na pogodnoj t

(obino 2-8C)

Obeleavanje, sek.pakovanje, uvanje,

distribucija

ISO 8, Stepen D,

Klasa 100,000

ISO 5, Stepen A

Klasa 100

EMATSKI PREGLED PRIPREMERASTVORA I LIOFILIZATABIOFARMACEUTIKA

2006 SPI USA, Inc.

Priprema proizvoda za liofilizaciju

Priprema sterilnog rastvora - izradameanjem i filtriranjem.

Punjenje u boice. Parcijalno zatvaranje boica gumenim,

specijalno dizajniranim zatvaraima. Ubacivanje boica u komore za freeze dry

pod aseptinim usovima. Zamrzavanje svakog rastvora ispod

prethodno odreene kritine t. Primena kombinacije pogodne t i P za

sublimaciju leda iz proizvoda. Dalja primena t i P da se ukloni vezana voda

iz proizvoda. Automatsko zatvaranje boica. Vaenje boica iz komore i stavljanje

aluminijumskih kapica.

50

2006 SPI USA, Inc.

Automatizovani sistemi za transfer proizvodasa proizvodne linije u Freeze-Dryer

2006 SPI USA, Inc.

Freeze-DryerSubsistemi(ta mora dobro funkcionisati da bi proces liofilizacijebio uspean?)

52

Sistem za transfer toplote Sistem za hlaenje Sistem za vakuumiranje

Sistem za zatvaranje boica Sistem za ienje Kontrolni sistem Sistem za punjenje i vaenje boica

Tipina serija/ara liofilizovanog bifarmaceutika vredinekoliko miliona $


14/46

14

2006 SPI USA, Inc.

Ekscipijensi koji se koriste u formulacijifreeze-dried/liofilizataproteina

*Deava se kada je u boici prisutna mala koliina vrste faze.**Mehanizam delovanja lioprotektanata nije potpuno jasan. Od znaaja su:1. Lioprotektanti zamenjuju vodu kao stabiliui agens.2.Poveavaju Tg smee kola/zamrznuti sistem

3. Lioprotektanti e apsorbovati vlagu iz zatvaraa.4. Lioprotektanti e usporiti proces sekundarnog suenja i smanjiti mogunost za presuenje proteina

(sadraj rezidualne vode jako nizak).

razlog: zatita fizike struktureproteina**

Lioprotektanti: eeri i albumini

razlog: porast temperature kolapsaModifikatori t-kolapsa: dekstran,albumin/gelatina

razlog: elegancija/prevencija gubitkaproteina prilikom isparavanjaformulacije (*blowout prevention)

Sredstva za dopunjavanje:manitol/glukoza

2006 SPI USA, Inc.

54

Najprodavaniji liofilizovanibioloki/biofarmaceutski lekovi

2006 SPI USA, Inc.

Isporuka proteina: pristupi za kontrolu brzinei mesta isporuke lekova koji se primenjujuparenteralno, ili...

2006 SPI USA, Inc.

Najvie eksploatisani terapijski proteini:insulin, tkivni plazminogen aktivator,hormon rasta, eritropoetin, interleukini, ilikoagulacioni faktor VIII: vano je znatizato, kada i gde se oni lue. Tri su glavnaputa kojima elije meusobnokomuniciraju: endokrini, parakrini i

autokrini. Dozno-zavisan odgovor ovih lekova je

najee takav da pri visokim dozamaterapijski efekat nestaje. Prisustvo ovihmedijatora moe da aktivira kaskadudogaaja koji moraju biti paljivokontrolisani. Dakle, kljuni momenti zauspenu terapiju su: 1) pristup ciljnim(target) elijama; 2) zadravanje na mestuprimene i; 3) odgovarajue vremeisporuke.

Endocrine hormones a hormonesecreted by a distant cell toregulate cell functions distributedwidely through the body. The bloodstream plays an important role inthe transport process.

Paracrine acting mediators themediator is secreted by a cell toinfluence surrounding cells, shortrange influence.

Autocrine acting mediators theagent is secreted by a cell andaffects the cell by which it isgenerated, (very) short rangeinfluence.


15/46

15

2006 SPI USA, Inc.

Za parakrino i autokrino aktivirane proteine: specifino mestoisporuke je veoma poeljna opcija jer e se neeljeni efektideavati van mesta delovanja leka, npr. teki oblici neeljenihdejstava su se javljali nakon primene citokina kao to je tumornekrozirajui faktor, interleukin-2 nakon iv ili sc primene.

Ovakva neeljene dejstva ograniavaju terapijskuprimenu/potencijal leka.

Zato je razvoj specifinih nosaa za isporuku proteina na

odreeno mesto, odgovarajuom brzinom i u odgovarajuojdozi veliki izazov u oblasti farmaceutske tehnologije.

2006 SPI USA, Inc.

Prevazilaenje in vitro/in vivo problema saproteinima = formulacija proteinskih lekova

Modifikacija (mutageneza) sekvence AK uproteinskoj molekuli (primer insulinski analozikratkog i dugog dejstva)

PEGilacija

Proteinilacija

Inkapsulacija u Mikrosfere/Nanosfere Formulacija sa "permeabilizerima"

2006 SPI USA, Inc.

I Mutageneza na odreenom mestu

E343H

2006 SPI USA, Inc.

Omoguuje zamene AK na specifinimmestima u proteinu

Npr. zamena metionina leucinom e sa velikom

verovatnoom umanjiti oksidaciju molekula Strateko smetanje cisteina da proizvodi

disulfidne veze u cilju poveanja Tm(temperature topljenja)

Inenjering proteina (veliina, oblik, itd.)

Mutageneza na odreenom mestu -setite seinsulina


16/46

16

2006 SPI USA, Inc.

Humani insulin - kljuni regulatorhomeostaze glukoze

2006 SPI USA, Inc.

Humani insulin hemijske osobine i razvoj

razliitih formulacija insulina

Za formulaciju preparata insulina od znaaja je:- izoelektrina taka je na pH 5,3 (negativno naelektrisan pri neutralnom pH)

- osobina lakog asociranja u dimere i agregate vieg reda (heksamerni kompleksiu prisustvu jona Zn)

2006 SPI USA, Inc.

Humani insulin hemijske osobine i razvojrazliitih formulacija insulina

Komercijalni preparati insulina sadre i fenolne ekscipijense(npr. fenol, m-krezol ili metilparahidroksibenzoat), kaokonzervanse.

Dodatno, ova jedinjenja imaju sposobnost da se veu za

specifina mesta na insulin heksameru (est veznih mesta),to dovodi do konformacionih promena koje poveavajuhemijsku stabilnost insulina u komercijalnim preparatima.

Pored jona Zn i fenolnih konzervanasa savremene formulacijeinsulina sadre sredstva za izotonizaciju (glicerol ili NaCl) i/ilifizioloki pufer (fosfatni) da bi se umanjilo variranje pHvrednosti u nekim pH-osetljivim formulacijama.

2006 SPI USA, Inc.

Kod zdravih osoba insulin se lui u dva sluaja: 1) kao odgovor na unetu hranu,

2) i u cilju odranja bazalnog nivoa izmeu obroka i u toku noi

Insulin se oslobaa kao odgovor na variranje nivoa glukoze ukrvi, ime ne dolazi do hipoglikemije

Basal Insulin(~0.5-1.0 U/hr)

Bolus Insulin

(Meal Associated)

" Bolus" Insulin(nakon obroka)

60-80 jedinica/ml

Bazalni Insulin(~0.5-1.0 U/hr)

5-15 jedinica/ml

Efekat

insulina

Normalan pankreas


17/46

17

2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskihanaloga

Kratko-delujui (eng. short-acting - regularniinsulin; rapid-acting - analozi,)

Srednje-delujui (eng. intermediate-actinginsulins)

Dugo-delujui (eng. long-acting insulins)

2006 SPI USA, Inc.

Farmakokinetika preparata insulina

10-16dvojni0,5-1

10-16dvojni0,5-1

Do 10-161,5 hb


18/46


19/46


20/46

20

2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskihanaloga (srednje-delujui)

NPH insulin sa varijabilnom farmakodinamikom ifarmakokinetikom nije idealan izbor u terapiji insulin-zavisnogdijabetesa i veoma esto biva zamenjen dugo-delujuiminsulinom ili smeama brzo-delujueg i protaminovanog brzo-delujueg insulina.

Ali, ako se primenjuje pravilno (10-35 puta valjanje izmeudlanova, ili prevrtanje boice) primena NPH insulina jeekonomina alternativa dugo-delujuim insulinskimanalozima ili smeama.

2006 SPI USA, Inc.

Priprema NPH insulina za primenu iprimena iz pen injektora

2006 SPI USA, Inc.

Preparati humanog insulina i insulinskihanaloga (dugo-delujui)

3) DUGO-DELUJUI insulini (eng. long-acting)

Ultralente (iz 50-tih) i novi insulinski analozi

- Insulin glargin i Insulin detemir.

- Insulin glargin AK asparagin zamenjena glicinom napoziciji A-21, a na kraju B-lanca dodate su dverezidue arginina.

- Ova promena B-lanca dovodi do pomeranjaizoelektrine take insulina sa pH 5,3 na pH 6,7, toje blisko neutralnom pH u supkutanom tkivuhumanog organizma.

2006 SPI USA, Inc.

Insulin glargin

Uvoenje AK glicina na A-21 poziciju dobijeni protein inihemijski stabilnim u kiseloj sredini.

Dobijeni analog ima dobru farmaceutsku stabilnost i usporenubrzinu apsorpcije iz supkutanog tkiva, uz ouvanefarmakodinamske karakteristike humanog insulina.

Insulin glargin se formulie kao kiseli rastvor (pH =4.0), uz dodatak soli Zn i m-krezola (konzervans).

Nakon injiciranja u supkutano tkivo, insulin glarginprecipitira usled promene pH sredine.


21/46

21

2006 SPI USA, Inc.

Precipitat lagano oslobaa insulin, relativnokonstantnom brzinom u toku 24h, bezizraenog pika.

Ovakav profil doputa doziranje jednomdnevno u cilju odravanja bazalnog nivoainsulina

Insulin glargin se ne sme meati sa bilo kojimrastvorom/rastvaraem ili drugim insulinom.

Insulin glargin

2006 SPI USA, Inc.

Insulin detemir

Insulin detemir predstavlja najnoviji analoginsulina dugog dejstva. Izostavljanjem terminalne AK treonina sa

pozicije B-30 i vezivanjem miristinske kiseline zaAK lizin na poziciji B-29 dobijena je strukturakoja se reverzibilno vezuje za albumin uintravaskularnom i intersticijskom prostoruspora apsorpcija, produeno delovanje.

U oba sluaja poetak dejstva do 2h nakon injiciranja, praktinobez pika, trajanje dejstva do 24h. Insulin glargin jednodozno pakavanje, insulin detemir,

primena jednom ili dva puta dnevno.

2006 SPI USA, Inc.

Kombinacije (smee) insulina (eng.fixed ratio pre-mixed insulins)

Smee srednje- i kratko- delujuih insulina u fiksnomodnosu (npr. 70/30, 50/50, ...) humani NPH insulin iregularni insulin

Ili, smee brzo-delujuih analoga sa srednje-delujuim,

dobijenim dodavanjem protamina (insulin lispro iinsulin aspart) poetak dejstva 15-30 min nakonprimene, pik nakon 2,5 h, trajanje dejstva do 24h.

Smee u penovima 10-14 dana na sobnoj t, a one uboicama zadravaju aktivnost do 28-30 dana.

Neophodno energino prevrtanje ili valjanje boicevie puta pre primene.

2006 SPI USA, Inc.

Smee insulina (eng.fixed ratio pre-mixed insulin)

"Industrijske" meavine insulina pruaju ugodnostprimene i tanost doziranja.

Adekvatna kontrola glikemije sa 2-3 injekcije dnevno.

Meavine sa brzo-delujuim analozima proizvodenajbolje rezultate i savetuju se u terapiji.

Na primer: 75/25 75% protamin lispro, 25% lispro70/30 70% protamin aspart, 30% aspart50/50 50% protamin lispro, 50% lispro70/30 70% NPH, 30% regularni insulin50/50 50% NPH, 50% regularni insulin


22/46

22

2006 SPI USA, Inc.

FK profili humanog insulina i analoga

Rosenstock J. Clin Cornerstone. 2001;4:50-61.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Nivoiinsulinauplazmi

Vreme (h)

NPH (1020 hr)

Regularni (610 hr)

Ultralente (~1620 hr )

Glargin (~24 hr)

Aspart, Lispro, Glulizin (45 hr)

Detemir~18hr

2006 SPI USA, Inc.

Pakovanje , uvanje i primena insulina

(staklene boice, 10 ml i penovi, 3 ml)

Flex Pen

OptiClic

2006 SPI USA, Inc.

InnoLet ureaj za pakovanje iprimenu insulina (npr. NPH)

2006 SPI USA, Inc.

Primer nekih preparata insulina

registrovanih na domaem tritu

Insulini i analozi, parenteralni, kratkog dejstva Insulin humani, parenteralno 1. Actrapid HM; Hemofarm AD-Srbija rastvor za injekcije; 100 i.j./ml, boica 1x10 ml

2. Actrapid Flexpen; Novo Nordisk A/S-Danska rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml

Actrapid Novolet; Novo Nordisk A/S-Danska

rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml Insulin lispro, parenteralno Humalog Pen; Eli Lilly Export S.A. vajcarska rastvor za injekcije; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml

Insulin aspart, parenteralno Novorapid; Novo Nordisk A/S-Danska rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, boica, 1x10 ml

Insulin glulizin, parenteralno Apidra; Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh, Nemaka rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula, 5x3 ml

rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, boica, 1x10 ml


23/46

23

2006 SPI USA, Inc.

Primer nekih preparata insulina

registrovanih na domaem tritu

Insulini i analozi, parenteralni, srednje dugog dejstva Insulin humani, parenteralno Insuman Basal; Sanofi-AventisDeutschlandGmbh, Nemaka suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, uloak, 5x3 ml

Insuman Bazal Opti Set; Sanofi-AventisDeutschlandGmbh, Nemaka rastvor za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozerom u pen aplikatoru, 5x3 ml Insulin izofan, parenteralno Humulin Pen NPH; Eli LillyExport S.A.-vajcarska suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozeromu pen aplikatoru, 5x3 ml

Insulini i analozi, parenteralni, srednje dugog dejstva u kombinaciji sa insulinima kratkogdejstva

Insulin humani Mixtard 30 Penfill; Hemofarm Koncern A.D. Vrac po licenci Novo Nordiska A/S-Srbija suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula, 5x3 ml

Insulin kristalni i protaminizofan, humani Mixtard 50 Novolet; Novo Nordisk A/S-Danska suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozeromu pen aplikatoru, 5x3 ml

Insulin aspart, parenteralno 1. Novomix 30 Flexpen; Novo Nordisk A/S-Danska suspenzija za injekciju; 100 i.j./ml, karpula sa dozeromu pen aplikatoru, 5x3 ml

2006 SPI USA, Inc.

II PEGilacija

+

CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-C

H-CH-CH

|

|

|

|

|

|

|

|

|

|

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

HOH

OH

2006 SPI USA, Inc.

PEGilacija

PEG je netoksian, hidrofilan FDA odobren(inae farmaceutski ekscipijens),nenaelektrisan polimer

Produava se polu-ivot in vivo (4-400X) Smanjuje se imunogenost Poveava se otpornost na proteaze Rastu rastvorljivost i stabilnost Smanjuje se gubitak u depou na mestu

davanja injekcije

2006 SPI USA, Inc.

PEGilacija/opis

Kovalentno povezivanje PEG polimera za terapijskiprotein (potvreno kao dobra novija tehnologija zaisporuku leka).

Terapijski proteini se hemijski modifikuju kovalentnimvezivanjem PEG-a ili dekstrana ili eera ili seumreavaju sa drugim proteinima sa ciljem da se produi

vreme cirkulacije (prisustvo u sistemskoj cirkulaciji) i/ilida se izbegnu imunogenost ili toksinost proteinskihlekova per se.PEG-ilovani proteini oslobaa se neizmenjeni lek podfiziolokim uslovima, terapijski prihvatljivim brzinama.

PEG-ilovanje je postalo metod izbora za i.v. primenu terapijskihproteina.

Korist PEG-ilovanja se ogleda u poreenju sa ne-PEG-ilovanimproteinima


24/46

24

2006 SPI USA, Inc.

PEG-ilovani vs. nePEG-ilovanibiofarmaceutik u serumu

2006 SPI USA, Inc.

PEGilacija/opis

Prednosti PEG-ilovanja:1. Poboljanje farmakokinetike leka, tj. poboljani su rastvorljivost,

stabilnost - usporena resorpcija kontinuirano terapijskodejstvo.

2. Produeno vreme cirkulacije, tj. smanjena koliina proteinapotrebna za terapijski efekat, smanjena uestanost primene lekazbog poboljane biodistribucije, redukovan renalni klirens...

3. Smanjena toksinost, poboljan bezbednosni profil, redukovanaimunogenost, redukovana proteoliza.

PANJA!!!Bioloki lekovi se proizvode pod kontrolisanim uslovima i novo-generisani proteini se podvrgavaju post-translacionim modifikacijama.Veoma su osetljivi na proizvodne uslove i samo male promene mogu dautiu na bioloku aktivnost. Post-translacione modifikacije doprinosekompleksnosti, npr. stepen glikozilacije moe da utie na receptorskovezivanje, PEG-ilovanje takoe na vezivanje za receptore imetabolizam leka.

2006 SPI USA, Inc.

Mesta i postupci PEG-ilovanja

Nasumino PEG-ilovanje Site-specific

-NH2 grupa Lys

N-terminalna NH2 grupa

Boni lanci Histidina

Serine

Cysteine

Tyrosine

Kompleksna smea konjugata saPEG-om prikaenim za razliita

mesta

Jedan PEG proizvod dobro zbogkonzistentnosti proizvoda to se

oekuje u savremenoj proizvodnjilekova

N-terminalna NH2 grupa

Prirodni Cys tioli

Polisaharidne komponenteglikoproteina

...

...

2006 SPI USA, Inc.

PEGilacija/primeri

Primeri nekih odobrenih PEG-ilovanih lekova primena novihPEG-konstrukta (Sekhon, 2010):

1. Pegademase bovine (Adagen) PEG-bovine adenozindeaminaza u terapiji kombinovanog sindromaimunodeficijencije, kao alternativa transplataciji kostne sri izameni enzima genskom terapijom.

2. Pegaspargase (Oncaspar) PEG-ilovana L-asparaginaza zatretman akutne limfoblastine leukemije kod dece koja supreosetljiva na prirodni nemodifikovani oblik L-asparaginaze)

3. PEG-ilovani interferon alfa-2a (Pegasys) - PEG-ilovaniinterferon alfa za terapiju hroninog hepatitisa C i hepatitisa B.

4. PEG-filgrastim (Neulasta) (PEG-ilovani rekombinantni metionilhumani granulocitni koloni-stimulirajui faktor za terapijuneutropenije indukovane hemoterapijom kod tekih kancera).

5. Doxorubicin HCl (Doxil) PEG-ilovani liposomi koji sadredoksorubicin za tretman kancera.


25/46

25

2006 SPI USA, Inc.

Primer PEG-ilovanih biofarmaceutika

1990Increased serumhalf-life

Severe combinedimmunodefficiency(SCID)

BovineAdenosineDeamidase

EnzonAdagen

1994Increased serumhalf-life, lessalergic reactions

Acute lymphoblasticleukemiaAsparaginaseEnzonOncaspar(Pegaspargase)

2003New role:hGHreceptorantagonist

AcromegalyhGHPfizer /Nektar

Somavert(Pegvisomant)


NeutropeniaG-CSFAmgen /Nektar

Neulasta

(pegfilgrastim)


Hepatitis CIFN-2aHoffmann-La Roche

/ Nektar

Pegasys

(PEGIFN-2a)


Hepatitis CIFN-2bSchering-Plough /Enzon

PEG-Intron

(PEGIFN-2b)

Year ofUS

approval

Engineeringrationale

Therapeuticindication

Originalprotein

CompanyName

2006 SPI USA, Inc.

1. Adagen, www.fda.gov

2006 SPI USA, Inc.

www.fda.gov

2006 SPI USA, Inc.


26/46

26

2006 SPI USA, Inc.

Potencijalna mesta PEG-ilovanja:

-amino grupe 10 Lys / 11 Lys -amino grupe N terminalnog Cys Imidazolil azot His

Hidroksil grupe 14 Ser, 10 Thr and 5 Tyr

Interferon - 2b / 2a

2006 SPI USA, Inc.

PEGIntron

Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, Michael Grace, James Bausch, Ronald Bordens and Daniel F. WyssStructural and biological characterization of pegylated recombinant interferon alpha-2b and its t herapeutic implications

Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 547-570

Smea monoPEG-ilovanih pozicionih izomera nasumino PEG-ilovanih na razliitim AK reziduama

100%Non-Pegylated IFN-2bNot Done15

13.2%11%C1Trypsin/V-814

0.7%14%S163K112Subtilisin13

1.1%13%K49V-812

4.5%22%H7Subtilisin11

0.9%8%K83Trypsin/V-810

3.6%9%K121Trypsin/V-89

7.3%6%K164Trypsin8B

6.9%15%K131Trypsin/V-88A

0.8%23%Y129Trypsin/V-8/Subtilisin

7

47.8%37%H34Subtilisin6

1.1%To be det.To be determinedNot done5

1.5%32%K133Trypsin4

1.3%25%K121/134Trypsin3

5.7%13%K31Trypsin/reduced2

3.6%7%Di-PEG/mono-PEGmixture, sites unknown

Not done1

Chrom.Area %

RelativeBioactivity

Pegylation SiteProteolyticEnzyme

Peak

2006 SPI USA, Inc.

PEGASYS

Smea monoPEG-ilovanih pozicionih izomera nasumino PEG-ilovanih na specifinim Lizin reziduama

Foser S. et al.: Improved biological and transcriptional activity of monopegylated interferon-alpha-2aisomers. Pharmacogenomics J. 2003, 3(6), 312-319.

2006 SPI USA, Inc.

PegIntron PegasysCompound Peginterferon alpha-2b Peginterferon alpha-2a

PEG 12 kDa linear 40 kDa branched

Company Schering-Plough Hoffmann-La Roche

Pegylation reagent MPEG-SC 12000 40 KD branched PEG r eagentApproximate MW 31 kDa 60 kDa

Reaction pH Around 6.5 > 8.0

Coupling Position Monopegylated predominantlyat His34 (48%), at His7, Cys1,Ser163, Tyr129, numerous Lys

(Youngster et al., 2002)

Monopegylated, four majorpositional isomers at Lys31,Lys121, Lys131, and Lys134(Bailon et al., 2001)

In vitro anti-viralactivity

Approximately 28% of theoriginal activity

7% of the original activity

Systemic clearance inhealthy adults

10-fold lower mean clearancethan unmodified IFN alpha-2a(Glue et al., 2000a)

100-fold lower mean clearance thanunmodified IFN alpha-2a (Algranatiet al., 1999)

Pegasys vs. PegIntron


27/46

27

2006 SPI USA, Inc.

PegIntron PegasysMaximum serumconcentration Cmax

After 15-44 hrs After 72-96 hrs (Modi et al.,2000a)

Volume ofdistribution

0.99 L/kg (1.4 L/kg forunmodified IFNalpha-2b) (Glue et al., 2000a)

6-14 L (Harris et al., 2001)

Duration oftherapeutic plasmaconcentration

80 hrs 168 hrs

Form Lyo Powder for injection(reconstitution with WFI),doses: 0.050, 0.080, 0.120

and 0.150 mg/0.5ml

Liquid formulation (0.360mg/ml) for sc injection,dose: 0.180 mg/0.5ml

Storage 25 C, after reconstitutionone day at +2 to +8 C

+2 to +8 C

Dosage Once per week Once per week

Pegasys vs. PegIntron

2006 SPI USA, Inc.

Proteinilacija

+

Proteinski lek ScFv (antitelo)

2006 SPI USA, Inc.

Proteinilacija

"Kaenje" dodatnog ili sekundarnog(neimunogenog) proteina za in vivozatitu.

Produava se polu-vreme eliminacije invivo(10X).

Umreavanje sa serumskim albuminom. Umreavanje ili povezivanje

inenjeringom molekula proteina sadelovima antitela.

2006 SPI USA, Inc.

Inkapsulacija u nosae(mikro, nano...!?)

Brojni izazovi:-rastvorljivost (veina biofarmaceutika su hidrosolubilni lekovi)-nedovoljna in vitrostabilnost (shelf life)

-slaba bioloka raspoloivost

-suvie kratka in vivostabilnost (half life)-izraeni neeljeni efekti, potreba za ciljnom isporukom

-regulatorni aspekti/primena (nedostatak prihvatljivih ekscipijenasa)-problem sa industrijskom proizvodnjom (dizajn proizvodnih linija zalarge scaleproizvodnju)Teorijski, inkorporiranje leka u estini nosa moe da ga zatiti oddegradacije in vitroi in vivo, da obezbedi "kontrolisano" oslobaanje, aoekuje se i ciljna isporuka leka.


28/46

28

2006 SPI USA, Inc.

Mikroestice: mikrokapsule i mikrosfere/ nanoestice

Koloidni sistemi generalno, ali ne neophodno, izraeniod polimera (biodegradabilni ili ne, koji su generalnoprepoznatljivi kao bezbedni, FDA- general recognized assafe (GRAS) polymers)).Najvie korieni sintetski polimeri su : polilaktid (PLA),poliglikolid (PGL), polilaktid-ko-glikolid (PLGA),polimetilmetakrilat (PMMA), polialkilcijanoakrilat (PACA),polistiren, etilceluloza (EC) i dr. Makromolekuli prirodnogporekla koji su najee korieni su: albumin , elatina,hitin, hitozan, alginati, derivati skroba, dekstran, kazein i

lipidi. Veliina mikroestica nalazi se u opsegu od 1-1000m,a nonoestice su submikronskih veliina odnosno manjeod 1m (INN def. 100 nm i manje).

2006 SPI USA, Inc.

Postoje dve vrste mikroestica:mikrokapsule, koje predstavljaju

sisteme gde je aktivna (lekovita) supstanca potpunookruena jasno odvojenim zidom kapsule, (a i b) i

mikrosfere, gde je aktivna (lekovita)supstanca potpuno dispergovana u matriksu (c)

a) b) c)

2006 SPI USA, Inc.

Mikrokapsule

Sistemi kod kojih je aktivna supstanca (lekovita,delujua) smetena u rezervoar (jezgro) obavijenoovojnicom od drugog materijala najee

makromolekularne ili polimerne supstance u cilju zatiteaktivne supstance od degradacije pod uticajemspoljanjih faktora (faktora okoline) npr. vlage, kiseonika,svetlosti i dr. (in vitro)

2006 SPI USA, Inc.

Mikrokapsule dobijene od Ca-alginata i hitozanakompleksiranjem/jonofornim geliranjem na granici faza


29/46

29

2006 SPI USA, Inc.

Mikrokapsule - primena

Zatita okoline (mesto u organizmu) od neeljenog delovanjaaktivne komponente (leka), npr zatita gastrointestinalnog trakta odpotencijalno iritantnih ili ulcerogenih lekova (npr. naproksen natrijumu obliku mikrokapsula u Intestinal Protective Drug ApsorptionSystem).

Usporeno/ kontrolisano oslobaanja lekova i odvajanje odinkompatibilnih sastojaka odgovarajueg preparata.

Intenzivno se istrauju kao nosai za kontrolisano oslobaanjeproteina (npr. humani hormon rasta, eritropoetin i interferoni) zaparenteralnu primenu.

Oblikovanjem leka u mikrokapsule mogu se promeniti (poboljati)fizika svojstva lekovite supstance (vana za izradu finalnogfarmaceutskog oblika).

2006 SPI USA, Inc.

Mikrosfere

Mikrosfere su matriksne mikroestice uglavnom sferinogoblika, kod kojih je aktivna (lekovita) supstanca dispergovanahomogeno ili heterogeno u polimernom materijalu kojiispunjava celi volumen estice.

- potencijalni nosai sa kontrolisanim oslobaanjem zaparenteralnu primenu, za lekove jakog dejstva

- mogunost kontrole njihove veliine, naelektrisanja,hidrofobnosti ili hidrofilnosti povrine, izgleda povrine.

- mogunost oslobaanja leka konstantnom brzinom u perioduduem od mesec dana, kada se primene parenteralno.

2006 SPI USA, Inc.

ematski prikaz principa proizvodnje mikrosfera (skrob) sinkapsuliranim lekom

Mikrosfere

2006 SPI USA, Inc.

Mikroestini nosai (model NSAIL)


30/46

30

2006 SPI USA, Inc.

Odre

ivanje

veliinei

distribu

cijev

eliin

e

SvjetlosnimikroskopOlympus BX50

Morfologija i povrinskekarakteristike

Elektronski mikroskop DSM 940 A

Evolution 300 spektrofotometarOdre

ivanjesadrajanaproksena

Peristaltikapumpa

Aparatura sa protonomelijom DFZ 60

Diss

olutio

ntest

Interakcije polimera i leka

Interakcijepolimeraileka

Reolok

aispitivanja

Rotacioni reometar Rheolab MC 120 Mettler-ToledoDSC 1 STAReSystem

Nicolet i S30 FT-IR Spectrometer

3.

2006 SPI USA, Inc.

Etilcelulozne mikrosfere sa nimesulidom za ciljanu isporuku u kolonu skenirajui elektronski mikroskop (SEM)a) morfologija povrine b) unutranja struktura

a

b

Mikrosfere

2006 SPI USA, Inc.

Inkapsulacija proteina umikroestice/mikrosfere

100 m

2006 SPI USA, Inc.

Tipovi mikrosfera

Dva tipa mikrosfera ne-biodegradabilne biodegradabilne Ne-biodegradabilne

keramike estice polietilen ko-vinil acetat Polimetaakrilna kiselina/PEG

Biodegradabilne (poeljno) elatina, hitozan, alginati Polimlena-ko-glikolna kiselina (PLGA)


31/46

31

2006 SPI USA, Inc.

Oslobaanje iz mikrosfera

Hidrofilne (npr. elatina) Najbolje za trenutno (eng. burst) oslobaanje

hidrofobne (npr. PLGA) Dobre za postepeno oslobaanje (vakcine...) Meutim postoji tendencija za denaturacijom

proteina Hibridne (amfifatske)

Dobar profil postepenog oslobaanja Odravaju proteine nativnim/aktivnim

2006 SPI USA, Inc.

Mikrosfere za oralnu isporuku pH zavisna isporuka

pH 2 pH 7

2006 SPI USA, Inc.

pH osetljive mikrosfere

Gel/mikrosfere sistem sa polimetakrilnomkiselinom + PEG

U eludanom sadraju (pH 2) pore seskupljaju i spreavaju otputanje proteina

Pri neutralnom pH (tanko crevo) porebubre i dolazi do oslobaanja proteina

Proces suavanja i bubrenja/irenja poraoznaen je kao kompleksacija (pametnimaterijali)

2006 SPI USA, Inc.

1. Primer/FDA odobrene hGH PLGA mikrosfere zapedijatrijsku primenu kod deficijencije hormonarasta

Odobrene 1999. godine (FDA)

PLGA je biodegradabilni polimer koji sa razlae na mestuinjektovanja (s.c.) u mlenu i glikolnu kiselinu. Degradacija moepotrajati nekoliko nedelja do preko godinu dana i zavisi, izmeuostalog, od odnosa izmeu mlene i glikolne kiseline, geometrije

sfera i stepena kristalininiteta polimera (kristalna vs. amorfnafaza).

Velike strukture sa velikim udelom mlene kiseline koja kristaliesporo se degradiraju.

hGH mikrosfere pripremaju se spray-drymetodom: Zn-hGHkompleks suspendovan u rastvor PLGA u metilen hloriduubacuje se u formi spreja u tean azot koji je na vrhu smrznutogsloja etanola.

Dobijaju se mikrosfere prenika oko 50m.


32/46

32

2006 SPI USA, Inc.

1. Primer/FDA odobrene hGH PLGA mikrosfere zapedijatrijsku primenu kod deficijencije hormona rasta

Serumske koncentracije hGH kodpedijatrijskih pacijenata posle s.c.injekcije hGH koji je inkapsuliran umikrosfere.

Kod Nutropin Depotmikronizirani hGH uronjen je ubiodegradabilne PLGAmikrosfere.

"Burst"oslobaanje oko 50%

doze u prva dva dana, nakonega sledi period usporenogoslobaanja.

2006 SPI USA, Inc.

1. Primer/FDA odobrene hGH PLGA mikrosfere zapedijatrijsku primenu kod deficijencije hormonarasta

2006 SPI USA, Inc.

2. Sandostatin LAR (oktreotid acetatinjektibilna suspenzija)

2006 SPI USA, Inc.

Nove strategije za kontrolisano oslobaanje proteina se kontinuiranorazvijaju.

ema (sledei slajd) daje prikaz tehnologije dobijanja dekstran-baziranih mikrosfera za s.c. ili i.m. primenu kod koje je izbegnut"burst"efekat zapaen kod PLGA mikrosfera, sa gotovo 100%koeficijenta inkaspulacije.

Ne koriste se organski solventi u procesu dobijanja. Tako se izbegava direktna interakcija rastvorenog proteina sa

organskom fazom, ime se znaajno umanjuje mogunostdenaturacije proteina.

Dobijeni profili kontrolisanog oslobaanja IgG antitela u f-ji brzinedegradacije dekstran matriksa.


33/46

33

2006 SPI USA, Inc.

ematski prikaz pripreme mikrosfera za kontolisano oslobaanjeproteina iz dekstran (DexHEMA = modifikovani dekstran = dekstranhidroksietilmetakrilat) mikrosfera. Ne koriste se organski solventi, akoeficijent inkapsulacije je rutinski > 90%. Polimerizacija:umreavanje dekstrana HEMA jedinicama.

2006 SPI USA, Inc.

Nanonosai za proteinske lekove ?!Ciljna isporuka leka ili "targetovanje"

Oekivanja:

2006 SPI USA, Inc.

Ciljna isporuka leka

Razlozi:- lek nikada ne dostie ciljno mesto, zato to se brzo eliminie u

intaktnom obliku iz organizma preko bubrega ili se metabolikiinaktivira.

- samo mali deo leka dostie ciljno mesto. Vei deo leka distribuirase u druge organe neeljeni efekti; zapravo, akumulacija leka na

ciljnom mestu je oekivanje, a ne pravilo.- veina lekova velike Mw, kao i hidrofilni molekuli (mnogi proteini)

ne ulaze lako u eliju. Ovo je problem, ako se oekuje isporuka ueliju da bi se ispoljio terapijski efekat.

CILJ:1. Specifina isporuka na mesto delovanja

2. Zadravanje leka dok se ne inaktivie i detoksikuje.

2006 SPI USA, Inc.


Farmakokinetska razmatranja vezana za ciljnu isporuku proteina:- lekovi sa visokim ukupnim klirensom- ciljno mesto sa relativno malim protokom krvi- porast brzine eliminacije slobodnog leka bilo iz centralnog ili

kompartmentagde se javlja terapijski odgovor ima tendenciju dapovea potrebu za ciljnom isporukom leka; ovo implicira veubrzinu ulaska lek-nosa konjugata da se odri terapijski efekat.

- da bi se maksimalno uveao efekat ciljne isporuke, oslobaanjeleka iz nosaa treba da se svede na kompartmentgde se oekujeterapijski odgovor.

- Dva su tipa ciljne isporuke/targetovanja:- pasivno prirodna raspodela- aktivno promena prirodne raspodele


34/46

34

2006 SPI USA, Inc.


Transport leka putem nosaa zavisi od fizikohemijskihkarakteristika, naelektrisanja/Mw, hidrofobnosti povrine,prisustva liganada za interakciju sa odgovarajuim receptorima.

prolaz kroz endotelnu barijeru krvnih sudova razlike upermeabilnosti normalno vs. patoloko stanje (tumori izapaljenje...)

estice veliine oko 100 nm mogu da uu u tumorsko tkivo... Rastvorni nosai za ciljnu isporuku proteina:- Monoklonska antitela (Mab) kao ciljni terapijski sistemi: humana i

humanizovana antitela

- bispecifina antitela- imunokonjugati: kombinacije izmeu antitela i aktivnesupstance...

- Nas interesuju koloidni/estini nosai za ciljnu isporukuproteina

2006 SPI USA, Inc.

2006 SPI USA, Inc.


Razvoj irokog spektra nano-nosaa za lekove i dijagnostika sredstva nanomedicina (National Institutes of Health)

Nanoestice mogu da oponaaju ili menjaju bioloke procese (npr. infekciju,inenjering tkiva, de novosintezu...)

Veliki broj tipova nanonosaa se istrauje: nanovlakna, samoagregirajue polimerne

nanostrukture, nanomembrane, nano-silikonski ipovi za lekove, proteine,nukleinske kiseline ili isporuku peptida i oslobaanje i biosenzori i laboratorijskadijagnostika

Nanoestini sistemi za isporuku leka: nanokapsule vezikularni sistemi kod kojihje lek u upljini okruen polimernom membranom, dok su nanosfere matriksnisistemi kod kojih je lek fiziki i uniformno dispergovan

Nanoestice su vrste, koloidne estice koje se sastoje od makromolekularnihsupstanci i koje variraju u veliini od 10 nm do 1000 nm (do 100 nm pravenanoestice)

OSNOVNE KARAKTERISTIKE I VRSTE NANODISPERZNIH SISTEMA

Nanodisperzni sistemi

LiposomiNanoemulzijevrste lipidne nanoestice

Razvoj nanodisperznih sistema kao nosaa lekovitih supstanci

Polimerne nanoestice

1960-ih Intralipid

1970-ih Diazemulus

1990-ih Ambisome, DaunoXome , Doxil

polimerne nanoestice 1970-ih vrste lipidne nanoestice 1990-ih


35/46

35

Nanoestice

Nanoestice - estice/vezikule veliinemanje od 1 m (100 nm)

polimerne vrste lipidne nanoesticenanoestice (eng. solid lipid nanoparticles,SLN)

Nanoestice danas:- kontrolisana isporuka lekovitih supstanci- zatita lekovite supstance od nepoeljnih uticaja organizma na putu do

ciljnog mesta- smanjenje neeljenih efekata

- poboljana bioloka raspoloivost aktivne supstance- zatita inkorporirane supstance od negativnog uticaja spoljanjih faktora(svetlost, temperatura, vlaga)

UNAPREENJE POSTOJEE FARMAKOTERAPIJE

Slika ematski prikaznanosfere i nanokapsule

OPTE KARAKTERISTIKE SLN

vrste lipidne nanoestice - vodeno koloidne disperzijeestica submikronskih dimenzija (50 1000 nm)

vrsto jezgro obino je sastavljeno od glicerida kogaokruuje sloj fosfolipida i blok kopolimera adekvatnekonzistencije (slika)

Ciljna isporuka lipofilnih i ambifilnih lekovitih supstanci

Slika ematski prikaz liposoma (A) nanoemulzija(B) i vrstih lipidnih nanoestica (C)

(A) (B) (C)

INKORPORIRANJE L.S. U SLN

Tri modela inkorporiranja lekovite supstance (slika) : model vrstog rastvora (levo) model rezervoar-membrana (lekom obogaen rezervoar)

(sredina) model rezervoar-membrana (lekom obogaena

membrana) (desno)

Slika Tri modela inkorporiranja lekovite supstance u SLN

NANOSTRUKTURIRANI LIPIDNINOSAI

Sleeda generacija posle vrstih lipidnih nanoestica Obezbeuju vei stepen ugraivanja lekovite supstance u

odnosu na SLN, zbog tenih lipida, spreavaju oslobaanjeaktivne supstance u toku uvanja

NLC tehnologija prua tri tipa nanostruktura:1) imperfektan tip (slika), 2) amorfni tip, 3) multipli tip

(stvaranje tenih uljanih nanopregradica)

Slika Formiranje savrenih lipidnihkristala u SLN (gore, zid od cigle) ikristalne reetke sa mnogimnesavrenostima u NLC


36/46


37/46

37

2006 SPI USA, Inc.

Ciljna isporuka leka-karakteristike vane za isporuku leka primenom

nanoestica -

Veliina estica i PDI (raspodela esticapo veliini) su najvanije karakteristikenanoestica.

One odreuju in vivodistribuciju, biolokusudbinu, toksinost i sposobnost ciljneisporuke.

Takoe, utiu na optereenje lekom,oslobaanje leka, stabilnost nanoestica. Nanoestice mogu da prou krvno-

modanu barijeru (BBB) nakon otvaranja 2006 SPI USA, Inc.

Polimerna nanoestica: preuzimanje od humane dendritine elije

konfokalna mikrografija

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -

Karakteristike povrine N: asociranje leka za konvencionalnenosae dovodi do modifikacije FK profila (distribucije leka), poto selek uglavnom distribuira sistemom mononuklearnih fagocita (MPS,

jetra, slezina, plua, kostna sr). N moe da prepozna imunski sistem domaina nakon i.v. primene

i fagocitozom se uklanjaju iz cirkulacije.

Pored veliine estica hidrofobnost povrine odreuje sudbinu invivo opsonizacija Nkoje nisu modifikovane na povrini

masivnoienje MPS sistemom.

Cilj targetovanje produenje cirkulacionog vremena N in vivosmanjenjem opsonizacije

Ovo se postie oblaganjem N hidrofilni polimer/surfaktantsistemima, formulisanjem N sa biodegradabilnim kopolimerima sahidrofilnim karakteristikama (npr. PEG, PEO, poloksameri,poloksamini, Polisorbat 80).

2006 SPI USA, Inc.

Pristupi da se postigne pasivno targetovanje,produeno oslobaanje primenom dugo-cirkuliuihnosaa i ciljna isporuka leka


38/46

38

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -

PEG zakaen za N spreava opsonizaciju komplementom i drugim

serumskim faktorima. PEG molekuli sa konformacijom tipa "etke"redukuju fagocitozu i

aktivaciju komplementa, dok su povrine sainjene od PEG oblika"peurke" aktivatori komplementa i favoriziju fagocitozu.

Zeta potencijal N koristi se za karakterizaciju povrinskognaelektrisanja N (zavisi od elektrinog potencijala estica iuslovljen je sastavom estice i medijuma/vehikuluma stabilnostdisperzije (treba da je vei od 30 mV) prevencija agregacijeestica.

Zeta potencijal se koristi da se proceni da li je naelektrisana aktivna

supstanca inkapsulirana unutar centra N ili na povrini.

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -

Kapacitet optereenja lekom: treba da bude visok, uzsmanjenje koliine materijala za matriks N

Postie se na dva naina: inkorporiranje u trenutku formiranjaN, ili apsorpcijom/adsorpcijom nakon formiranja N(inkubiranjem N sa koncentrovanim rastvorom leka)

Optereenje lekom i efikasnost inkapsulacije zavise odrastvorljivosti leka u matriksu (tip ekscipijensa: vrst polimer iliteni disperzioni agens), Mw, interakcije lek-polimer iprisustva odreenih funkcionalnih grupa kod molekula leka, tj.matriks ekscipijenasa.

Makromolekularni lekovi/proteini inkapsuliraju se u N sanajveom efikasnou dostizanjem izoelektrine take (pI)

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -

Oslobaanje leka: vano je da se razmotre istovremenooslobaanje leka i biodegradacija polimera; zavisi od:

- rastvorljivosti leka, desorpcije adsorbovanog leka,difuzije leka kroz matriks N, erozije matriksa N ili

degradacije, kombinacije procesa erozije i difuzije- u sluaju nanosfera gde je lek uniformno distribuiran

oslobaanje leka se odigrava difuzijom i usled erozijematriksa

- mehanizam i brzina zavise uglavnom od tipainkorporiranja leka

- Aparature za praenje oslobaanje leka iz N!!!

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -

- Nanoestini sistemi za lekove u terapiji kancera:- Hidrogeli hidrofobni polisaharidi za terapijske proteine i

vakcine

- Micele i liposomi blok-kopolimer micele sferinisupramolekularni agregati amfifilnog kopolimera (slika)- Nanosistemi, Nanoelije, Dendrimeri, Nanocevice,

Polimersomi, Kvantum dots...


39/46

39

2006 SPI USA, Inc.

Ciljna terapija pomou micela kaonosaa za peptide

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -

- Hidrogel sistem na bazi holesterol pullulan-a (-1,4- ;-1,6-glucan) polisaharidni polimer iz maltotrioze.- etiri molekula holesterola formiraju samoagregirajue

hidrofobno jezgro sa pullulanom postavljenim spolja(hidrofilni deo).

- Ove holesterolske N stabilizuju zarobljene proteineformiranjem hibridnog kompleksa; stimuliu imunskisistem, bivaju lako preuzete od dendritinih elija.

- Vee hidrogel estice mogu da inkapsuliraju Mabs...

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -

2006 SPI USA, Inc.


nanoestica -


40/46

40

2006 SPI USA, Inc.

Proizvodnja biofarmaceutika

Kompleksna i varijabilna

U proizvodnji biofarmaceutika mogu se koristiti elijemikroorganizama (npr. E. coliili kulture plesni), linije sisarskih elija,linije elija biljaka i mahovina u bioreaktorima razliite konfiguracije,ukljuujui fotobioreaktore.

Dva osnovna koraka:- Upstream processing (razvoj i odravanje kulturaelija)- Downstream processing (hemijsko i fiziko odvajanje neophodni za

izolovanje i preiavanje proizvoda iz sloene smee kultivisanihelija).

- Proteini kod kojih je neophodna glikolizacija - biraju se elije sisara,gljiva ili sistemi bacilovirusa.

- Dve najee koriene plesni: Saccharomyces cerevisiaei Pichiapastoris.

2006 SPI USA, Inc.

Proizvodnja biofarmaceutika

- Plesni daju visoke prinose proteina, cena je prihvatljiva (proteini vei

od 50 kD), mogu se ukloniti signalne sekvence i sprovestiglikolizacija.

2006 SPI USA, Inc.

Pet kljunih mesta u proizvodnjibiofarmaceutika

1. Ekspresioni sistem za gen od interesa2. Proizvodni sistem kompatibilan sa MO

3. Sistem za preiavanje4. Priroda aktivne supstance5. Farmaceutska formulacija i uvanje

2006 SPI USA, Inc.

1. Ekspresioni sistem: Vektor + Domain

1. Identifikovanje, izolovanje i kloniranjekodirajueg gena za sintezu eljenogproteina

Konstrukcija vektora koji sadri: Gen

Kontrolore ekspresije (promoteri, signal za sekreciju)Insertovanje vektora u izabrani MO/eliju-

domaina Escherichia coli

Saccharomyces cerevisiae

elije sisara Genetski modifikovane biljke


41/46

41

2006 SPI USA, Inc.

1. Ekspresioni sistem: Vektor +Domain

2006 SPI USA, Inc.

2. Sistem za proizvodnju

Svrha Optimizacija uslova preivljavanja za genetski

modifikvane MO Tako da mogu da proizvedu eljeni protein Sa odgovarajuim/isplativim prinosomMaterijali & Metode Izbor medijuma za kultivaciju elija Izbor uslova za kultivaciju Izbor opreme za kultivisanje:fermentor, ureaj

za kultivaciju elija

2006 SPI USA, Inc.

3. Sistem za preiavanje

Svrha ekstrakcija proteina iz kompleksnog medijuma

za rast Postie se blizu 100% istoe

Bez promene strukture proteinaMaterijali & Metode Redosled koraka preiavanja Filtracija/ultrafiltracija Precipitacija/resolubilizacija Hromatografija (jono-izmenjivaka, affinity, itd.)

2006 SPI USA, Inc.

4. Priroda aktivne supstance

Proteini Lanci AK Sekvenca AK kodirana genom od interesa Savijanje u 3-D konformaciju Da se dobije bioloka aktivnost Post-translacione modifikacije koje zavise

od domaina (npr. glikolizacija)


42/46

42

2006 SPI USA, Inc.

5. Farmaceutska formulacija i uvanje

Svrha Odravanje bioloke aktivnosti Odravanjem molekula u aktivnoj

konformaciji u rastvoru

Materijali & Metode Stabilizacija (albumin, glicerol)

uvanje na niskim t

2006 SPI USA, Inc.

Flow-karta procesa

Ubiranje

Preiavanje

Formulacija

Poetni materijal

Fermentacija-kultivacija

2006 SPI USA, Inc.

Sistem banaka elija

Poetnimaterijal

Roditeljska elijska linija

Master banka elija (MCB)

Banka elijaza proizvodnju (MWCB)

Proizvodnja supstrata

Poslednje razvijenebanke elija (LECB)

Genetskatransformacija

razmnoavanje/rast

razmnoavanje/rast

razmnoavanje/rast

2006 SPI USA, Inc.

Sistem banaka elija


43/46

43

2006 SPI USA, Inc.

Flow-karta procesa

Poetnimaterijal

Fermentacija -kultivacija

Razliiti ekspanzioni sistemi(fermentor, roller boca, sudovi za fermentaciju)Sistemi za kultivaciju elija, dovod vazduha

Razliiti medijumi za kultivaciju(potpuno sintetski ili sadre komponenteanimalnog porekla)

2006 SPI USA, Inc.

Flow-karta procesa

UbiranjePoetnimaterijal

Fermentacija-kultivacija

Sistem za diskontinuiranu proizvodnju (fermentor)

Sistem za kontinuiranu proizvodnju (nekoliko ubiranja supernatanta kultureelija

2006 SPI USA, Inc.

Flow-karta procesa

Ubiranje

Preiavanje

Poetnimaterijal

Fermentacija -kultivacija

Razliite strategije ekstrakcije(iz supernatanta ili oteenjem elija)Razliite metode preiavanja(zavisno od potencijalnih kontaminanata)

2006 SPI USA, Inc.

Preiavanje: Potencijalnikontaminanti

Neistoe povezanesa proizvodnimprocesom

Derivati iz elijskih

supstrata Derivati iz kultura elija Derivati koji se javljaju

tokom procesapreiavanja(Downstream process)

Neistoe unutarsamog proizvoda

agregati modifikovani oblici

lekovaMikrobiolokikontaminanti:mikoplazme, virusi, plesni

Toksinost: teki metali, rezidueorganskih rastvaraa, antibiotici

P i j kl j j


44/46

44

2006 SPI USA, Inc.

Preiavanje: uklanjanjekontaminanata

Serija nekoliko metoda: Precipitacija Filtracija Tena hromatografija bazirana na razliitim fizikim ili

hemijskim principima Afinitet, hidrofobnost, molekulska masta, elektrini

naelektrisanje

2006 SPI USA, Inc.

Flow-karta procesa

Ubiranje

Preiavanje

Formulacija

Poetnimaterijal

Fermentacija-kultivisanje

Stabilizacija(zavisno od tipa proteina i puta primene)uvanje

2006 SPI USA, Inc.

Tok tipinog procesa proizvodnjebiofarmaceutika

(Feed2)

(Feed3)

(Feed4)

Chrom1Chrom3

Cryo-preservation

Concentration/Diafiltration

Centrifuge

Viral RemovalFiltration

(Feed1)InoculumExpansion

(SpinnerBottles)AmpuleThaw

Chrom2

2006 SPI USA, Inc.

Media Prep

Working CellBank

Sub-Culture

Inoculum

Sub-Culture

Sub-Culture

Sub-Culture

Sub-Culture

Large Scale Bioreactor

WaveBag

Seed Bioreactors

Fermentation

150LBioreactor

750LBioreactor

5,000LBioreactor

26,000LBioreactor

DepthFiltration

Collection

Centrifuge

Harvest/Recovery

HarvestCollection

Tank

1,500L

FilterChromatography

Skid

Anion ExchangeChromatography (QXL)

Column EluateHoldTank

8,000L

EluateHoldTank

6,000L


Skid

Protein AChromatography

Column

ChromatographySkid

Column

EluateHoldTank

20,000L

Hydrophobic InteractionChromatography (HIC)

EluateHoldTank

20,000L

ViralInactivation

EluateHoldTank

5,000L


Skid

Anion ExchangeChromatography

(QFF -Fast Flow)

Column

Post-viralHold

Vessel3,000L

Viral Filtering Ultra FiltrationDiafiltration

BulkFill

Purification

24 days 31 days

8 days

1 day


45/46

45

2006 SPI USA, Inc.

uvanje - zamrzavanje

Niska temperatura redukuje rastmikroorganizama (MO) i metabolizam

Niska temperatura redukuje denaturacije Niska temperatura redukuje adsorpciju Zamrzavanje je najbolje za uvanje/skladitenje u

duem vremenskom periodu

Zamrzavanje/odmrzavanje moe da denaturieproteine

2006 SPI USA, Inc.

uvanje - pakovanje

Glatki stakleni zidovi - najbolji za redukcijuadsorpcije ili precipitacije

Izbegavati polistirensku ambalau ilikontejnere sa silanilom ili plastinimoblogama

Tamni, opalescentni zidovi smanjuju

oksidaciju indukovanu osvetljenjem Kontejneri sa dobrim zaptivanjem...

2006 SPI USA, Inc.

uvanje aditivi(pomone materije)

Dodatak stabiliuih soli ili jona (Zn+ zainsulin)

Dodatak poliola (glicerol i/ili polietilen glikol

PEG) kao solubilizatora/korastvaraa Dodatak eera ili dekstrana da bi se

vezala voda ili smanjio rast MO

Primena povrinski aktivnih materija(surfaktanata) da bi se smanjile adsoprcija iagregacija

2006 SPI USA, Inc.

uvanje - suenjezamrzavanjem

Jedno od najefikasnijihsredstava/postupaka za pripremu vrstih,hemijski aktivnih proteina

Dobro u sluaju uvanja u duem

vremenskom periodu Uklanja znaajnu koliinu vode iz

proteinske reetke, u tolikoj meri, da nekiproteini mogu biti deaktivirani


46/46

46

2006 SPI USA, Inc.

Formulacija biofarmaceutika

Documents

Transcript of Formulacija biofarmaceutika