Flusso delle informazioni biologiche

In ogni istante della propria vita ogni cellula umana contiene:

•46 cromosomi (20.000 geni)

•10-15.000 mRNA diversi

DNA RNA Proteine

Fegato Corteccia cerebrale

Muscolo liscio

Hanno tutte lo stesso genoma, perché queste cellule sono così diverse in morfologia e funzione?

Perché esprimono geni diversi

ESPRESSIONE GENICA

E’ un processo molto complesso e finemente regolato che permette ad

una cellula di rispondere dinamicamente sia agli stimoli ambientali che alle sue stesse

necessità di cambiamento

Misurare l’espressione di un gene significa....

Dare una valutazione quantitativa della

presenza dei trascritti (molecole di mRNA) o

delle proteine codificate da quel gene nelle

cellule in esame

I microarray possono misurare l’espressione di tutti i geni noti in poche ore

Misurare il trascrittoma

Rapidi miglioramenti nella misurazione dell’espressione dei geni

Trascrittoma

L'insieme di RNA messaggeri espressi da ogni cellula

Proteoma

L'insieme di proteine espresse da ogni cellula

Espressione genica differenziale: valuta le differenze nell’espressione genica tra due trascrittomi

cellule trattate con un composto esogeno a confronto con cellule non trattate

un tessuto tumorale a confronto con uno sano

Composto esogeno

Tecnologia dei microarraySfrutta la capacità di una data molecola

di mRNA di ibridizzare con il DNA stampo da cui è stata generata

Campione 1 Campione 2

cDNA Cy3Cy5

RNA

+

Acquisizione dell’immagine mediante scanner

Cy5Cy3

L’intensità della fluorescenza è proporzionale alla quantità di molecola target nella soluzione e, quindi, costituisce una stima della quantità di RNA per ciascun gene espresso dalla cellula.

Tipico esperimento Microarray

Fonti di confondimento in un esperimento microarray

• Qualità dell’RNA estratto• Retrotrascrizione• Marcatura• Deposizione delle sequenze sul vetrino• Disomogeneità della superficie del vetrino• Ibridazione• Lavaggi• Acquisizione dell’immagine

REPLICHE SPERIMENTALI

REPLICHE BIOLOGICHE

Stesso RNA testato su due vetrini distinti

RNA proveniente da campioni simili ma distinti

Analisi computazionale dei dati

L’espressione differenziale dei geni “più interessanti” viene confermata

con una metodica alternativa

Validazione del risultato mediante Real-Time PCR