ACIDI NUCLEICI

DNA: molecola depositaria dell’informazione genetica (lettura dell’informazione attraverso un codice a tre cifre)

RNA: molecola che regola l’espressione genica e permette la decifrazione del codice

DNA ed RNA sono entrambi lunghi POLIMERI di unità monomeriche ripetute (NUCLEOTIDI)

Nucleotide: 1) zucchero a 5 atomi di carbonio (pentoso)2) base azotata eterociclica 3) acido ortofosforico

Legame ZUCCHERO-BASE AZOTATA (legame N-glicosidico)Legame ZUCCHERO-ACIDO ORTOFOSFORICO (legame estere)

legame N-glicosidico

legame estere

acidoortofosforico

9 atomi

6 atomi

Formazione del legame fosfodiesterico tra due nucleotidi

Legame fosfodiesterico

5’

3’

Catena polinucleotidica polarizzata: estremità diverse

legami idrogeno

Antiparallelismo

Solo se l’orientamento è antiparallelo le basi possono formare legami idrogeno

Esperimenti che portarono alla scoperta del DNA

come molecola depositaria dell’informazione

genetica

Esperimento di Griffith: dimostrazione dell’esistenza del “principio

trasformante

(1928)

Miscela di batteri virulenti uccisi

al calore e non virulenti vivi

Conclusione:

batteri non

patogeni R

sono stati

trasformati in

batteri

virulenti

patogeni da

un “principio

trasformante”

R

S

S

S

R

S

S + R

RNA ?

Esperimento di Avery, MacLeod e MacCarty: dimostrazione che il

“principio trasformante”

è il DNA (1944)

Conclusione:

Il principio trasformante

è il DNA

Esperimento di Hershey e Chase (1952)

Conclusione:

è il DNA del fago

T2 ad infettare le

cellule batteriche

Risultati considerati da Watson e Crick per costruire il modello della

molecolda di DNA

Spettri di fibra del DNA

1950-1953 M. Wilkins e R. Franklin: analisi cristallografica mediante diffrazione ai raggi X

1)Forma elicoidale (doppia elica)2)Diametro costante: 2nm (20 A°)3)Periodicità di strutture: 3.4nm (34 A°)

0,34nm (3.4 A°)

1mm = 1000 µm; 1 µm = 1000 nm; 1nm = 10 A°

-due catene polinucleotidicheavvolte a spirale

-doppia elica avvolta in senso destrorso attorno ad un asse longitudinale

-gli scheletri Z-P sono esterni; le basi sono disposte internamente

-le basi sono perpendicolari all’asse longitudinale

-ponti idrogeno legano le basi delle due catene polinucleotidiche che si fronteggiano

-distanza P-asse longitudinale di 10 A° quindi diametro di 20 A°

1953: Watson-Crick (struttura molecola

DNA

- per rispettare il diametro di 20 A: purina-pirimidina(dimensioni di Cocran)

A=TG=C

(introduzione della complementarietà delle basi)

-Le due emieliche sono antiparallele

-la doppia elica compie un giro completo (360°=passo) ogni 10 coppie di basi. Se le coppie di basi sono separate da intervalli di 3,4A allora 3,4x10= passo di 34A (risultati di Franklin e Wilkins)

-le due emieliche sono sfasate di una distanza pari ai 3/8 del passo

solco maggiore 22A

solco minore 12A

-fissata la sequenza e l’orientamento di una emielical’altra risulta automaticamente determinata

(antiparallele e complementari)

(principio di equivalenza di Chargaff)

5’

3’ 5’

3’

22A12A

Forze che stabilizzano la doppia elica

• Ponti a idrogeno

• Interazioni tra le basi impilate

• Neutralizzazione delle cariche negative (fosfati)

grazie a

-controioni (DNA nudo)

-proteine “tipo istoni” (batteri)

-istoni (eucarioti)

Conformazione Z

-ha proprietà antigeniche (anti-DNA Z Ab)

-tratti di DNA Z sono normalmente intercalati nel DNA B

di cromosomi eucariotici

-presente in alcuni tratti di DNA ricco in citosine metilate

-scheletri Z-P con andamento a zig-zag

-doppia elica avvolta in senso sinistrorso

passo 44,6 A

x passo 12 coppie di basi

solco unico lungo l’intera lunghezza

Denaturazione DNA

1) Nucleo di rinaturazione: reazione lenta, dipendente

dalla concentrazione delle due emieliche

> concentrazione

> possibilità d’incontro

1) Allacciamento a cerniera: reazione rapida,

indipendente dalla concentrazione delle due

emieliche

Rinaturazione: raffreddamento lento

Rinaturazione

1) nucleo di

rinaturazione

2) allacciamento

a cerniera

Denaturazione e raffreddamento rapido

gomitoli statistici: DNA

perlopiù denaturato, solo

pochi appaiamenti

Proprietà chimico-fisiche

Assorbimento a UV 260 nm:

-C=C-C=C-C=C-C= doppi legami coniugati assorbono

la luce ad una determinata λ

Gli elettroni delocalizzati degli anelli aromatici delle

basi azotate sono eccitabili a 260nm

raffredamento a

20C°

Intervallo di fusione del DNA

50% di DNA risulta denaturato

La Tm dipende dalla

sequenza del DNA :

> GC > sarà la Tm

A 260nm il DNA a singola elica, data l’esposizione delle basi

azotate, assorbe una maggiore quantità di luce del DNA a

doppia elica

raffreddamento lento(effetto ipocromico)

rinaturazione

riscaldamento(effetto

ipercromico)

denaturazione

Denaturazione: effetto ipercromico - gli elettroni liberati dalla rottura

del legame idrogeno sono disponibili ad assorbire luce per eccitarsi

RAFFREDDAMENTO RAPIDO e RAFFREDDAMENTO LENTO

raffreddamentorapido

Curve di denaturazione e di rinaturazione del DNA

Il DNA è la molecola depositaria delle informazioni

necessarie alla cellula per svolgere tutte le sue funzioni

-ogni informazione si trova contenuta, sotto forma di

sequenza nucleotidica, all’interno di un circoscritto

segmento di DNA denominato gene

- tutte le informazioni contenute nella molecola di DNA

sono, nell’insieme, definite informazione genetica

Genoma

DNA codificante DNA non codificante(DNA spaziatore, strutturale… )

geni

DNA intergenicoSequenze genichecorrelate

Le dimensioni

del genoma

non riflettono

la complessità

degli organismi

Dimensioni del genoma in organismi diversi

1Kb = 1000bp

1 Mb = 1 milione bp

1 Gb = 1miliardo bp

Curve di rinaturazione del DNA genomico di cellule diverse

Sequenze altamente ripetute: rinaturazione rapida (>possibilità d’incontro)Sequenze mediamente ripetute: rinaturazione meno rapidaSequenze a singola copia: rinaturazione lenta

Il DNA di vitello rinaturaper il 40% più velocemente mentre la restante parte rinaturapiù lentamente di quello di E.coli

DNA selfish

DNA eucariotico

L’organizzazione del genoma umano (3.200.000.000 basi, bp): solo una porzione composta da 48.000.000 basi forma prodotti

maturi

RNA• Ribonucleotidi• Uracile al posto della Timina• Per lo più a singolo filamentoTipi di RNA:

Messaggero (mRNA)Ribosomiale (rRNA)Transfer (tRNA)sn- RNA sc-RNAsno-RNAmicro-RNA

L’Uracile sostituisce la T

Doppio e singolo filamento

Pirimidina

Purina

I palindromi

ESSEANNA

AEREAETNA GIGANTE I TRENI INERTI

asse di simmetria

403 304897 798

Il genoma è ricco di sequenze palindromiche (circa 6%)

Sequenze ripetute e invertite

Funzioni di regolazione-sito di riconoscimento per fattori di trascrizione-sito di riconoscimento per endonucleasi-sito di riconoscimento per proteine di inizio duplicazione

doppia elica a struttura lineare

struttura a croce

Nel DNA i palindromi possono dare origine a due

strutture diverse

sequenza più lunga

non simmetrica

GGGCCNNNNNNNNNNNGGCCC

5’ 3’

Molecole a singola elica: struttura a forcina

GGGCCNNNNNNNNNNNGGCCCCCCGGNNNNNNNNNNNCCGGG 5’3’

5’ 3’

DNA

Il DNA palindromicotrascrive una molecola di RNA a struttura in parte complementare

RNA

emi-elicastampo

5’ 3’G CC G

C GG C

G C

Sequenza NNNNNnon complementare

Struttura a forcina con un’ampia ansa non appaiata

-Singolo

-doppio

Molecola di RNA organizzata in

-singolo filamento

-tratti a doppia elica (appaiamento basi complementari)

-anse (appaiamento di basi complementari intervallate da non complementari)

Formazione di tratti a doppia elica intramolecolare

La complementarietà induce la formazione di

molecole a conformazione complessa

tRNA maturo: struttura secondaria e terziaria

U G G C A U G A G G C U U C AmRNA

Diidrouracile

Ansa, braccio e stelo accettore

G G G

C C C3’OH 5’P

tRNA

mRNA

5’

5’

3’

3’

tripletta

TΨC

Appaiamento di basi non complementari che interagiscono

attraverso legami H tra le basi azotate

Interazioni insolite

implicate nella

stabilizzazione del

ripiegamento

terziario del tRNA

Il problema delle dimensioni del DNA (hDNA)

Cellula somatica umana:- nucleo 5µm Ø- DNA lungo 1,70 m, organizzato in 46 cromosomi

- 100 g di DNA

hDNA: ~1,7m

frogDNA: ~10m

Il problema delle

dimensioni del DNA

Virus/Batteri/Uomo

T4 : testa= 80x10-9 mDNA= 60x10-6 m

Batteri: 2-5 µmDNA= 1 mm

Cellula umana: nucleo 5 µmDNA= 1.7 m

Procariote

10 µm

1-2 µm

Eucariote

hDNA 1.7m

e.coliDNA 1.6mm

Cellulaprocariotica/eucariotica ~ 1/10

DNA procariotico/eucariotico ~1/1000

5 µm

E’ necessario ridimensionare il DNA cellulare

Domini indipendenti

• Domini indipendenti delimitati da

RNA

• Il DNA dei singoli domini si avvolge

intorno a proteine basiche

“histone like proteins”: HLP1,

HLP2…

Compattamento del DNA in E.coli: anse superavvolte

DNA circolare

Schema dicompattamento

DNAschematizzato

ripiegato

12nm

superavvolto

59

HLP legano il DNA (1,5mm) e lo compattano in cromosoma di dimensioni minori

DNA cellula procariotica: 50 anse superavvolte

Nella cellula eucariotica, il DNA è

stabilizzato e compattato dalle

proteine istoniche

hDNA: 1,7m/5µµµµm

nella cellula eucariotica ci sono 5 classi di istoni

5 classi di Istoni

PM (kDa) n. amminoacidi

- 17/28 200/265

-14 121/155

-15 135

-12 102

Identificazione degli ISTONI Albert KOSSEL, 1884

H1

H2A

H2B

H3

H4

Gli istoni sono proteine basiche (+)

dato l’elevato numero di Lys e Arg nelle code

H1 17000-28000 200-265 27% lisina 2% arginina

H2A 13900 129-155 11% lisina 9% arginina

H2B 13800 121-148 16% lisina 6% arginina

H3 15300 135 10% lisina 15% arginina

H4 11300 102 11% lisina 4% arginina

Tipo di istone PM n. aa % lisina % arginina

Dominio globulare con estremità NH2 e COOH sporgenti

N-TermC-Term

H1

H2A

H2B

H3

H4

Lisina e Arginina determinano la carica positiva degli Istoni

Dominio globulare

poco conservato

molto

conservati

Gli istoni, fatta eccezione per l’H1, si associano in un

ottamero

5 classi di Istoni

2 x H2A2 x H2B2 x H32 x H4

ottamero di istoni

NUCLEOSOMA: ottamero di istoni attorno al quale

il DNA si avvolge a doppio giro

nucleosoma di una cellula eucariotica

50bp

L’ottamero di istoni compatta il DNA, le code istoniche

neutralizzano le cariche negative dei fosfati

Organizzazione della cromatina in struttura a

“collana di perle”

Ruolo dell’istone H1 nel compattamento della

cromatina

Ipotesi: le code degli istoni interagiscono tra loro per aiutare la formazione della fibra di 30nm

Collana di perle e solenoide

eucromatina

eterocromatina

Eucromatina ed eterocromatina al microscopio elettronico

Eterocromatina:

-Facoltativa

(attivabile trascrizionalmente)

-Costitutiva

(non attivabile trascrizionalmente)

il DNA compattato è poco accessibile

Phosphorylation Kinases Phosphatases Activation/repression

Si può favorire l’accessibilità al

DNA agendo sulle code istoniche

-Chromatin modifications

a general term referring to the different covalent modifications

that can occur on the NH2-terminal ends of histone proteins.

Such modifications occur predominantly on conserved Lys

residues and include the addition of acetyl or methyl groups.

Gli istoni sono covalentemente modificabili a

livello di numerosi residui amminoacidici

Le modificazioni istoniche cambiano l’interazione del DNA

con gli istoni e quindi l’accessibilità al DNA

-Chromatin modificationsa general term referring to the different covalent modifications that can occur on the NH2-terminal ends of histone proteins. Such modifications occur predominantly on conserved Lys residues and include the addition of acetyl or methyl groups.

-Chromatin remodellinga general term to reflect processes that alter the positioning and spacing of nucleosomes or the interactions between histones and DNA. These events are often performed by multiprotein complexes that use ATP hydrolysis to remodel the nucleosome (chromatin-remodelingcomplexes).

scaffold proteico

che rimane dopo

rimozione degli

istoni: il DNA

rimane attaccato

all’impalcatura

formando un serie

di lunghe anse

SCAFFOLD PROTEICO DI UN CROMOSOMA

Immagine al microscopio elettronico

Livelli di compattamento della

cromatina

Livelli di organizzazione della cromatina fino a

cromosoma metafasico

Struttura di un cromosoma metafasico

secondo il modello dei domini ad ansa o a loops radiali

Scaffold proteine non istoniche (~ 30)

Le microanse

sporgono di 3-4µm

Le anse di DNA hanno

inizio e termine in punti

contigui dell’impalcatura

Le anse sono unite

all’impalcatura da

brevi tratti di

DNA(DNA/strutturale

altamente ripetitivo)

Scaffold proteine non istoniche

(circa 30)

Le anse di DNA hanno

inizio e termine in punti

contigui dell’impalcatura

Le anse sono

unite

all’impalcatura

da brevi tratti di

DNA

(DNA/strutturale

altamente

ripetitivo)

89

HLP legano il DNA (1,5mm)

e lo compattano in

cromosoma di dimensioni

minori

Somiglianza del modello dei domini ad ansa

con il modello di compattamento del DNA

dei batteri

Morfologia di una cromosoma metafasico

coesine

CROMOSOMADICROMATIDICO

Divisione cellulare e cromosoma metafasico

Il compattamento

organizza i

cromosomi in

unità discrete e

separabili

metafase

interfase profase prometafase

anafase telofase

• Il cariotipo umano manca di cromosomi telocentrici

I cromosomi metafasici possono essere classificati in

base alla posizione del centromero

Ogni specie ha un numero tipico di cromosomi

Nell’uomo: 46 cromosomi (23 di origine paterna e 23 di origine materna)

22 coppie di cromosomi omologhi + 2 cromosomi sessuali (XX o XY)

corredo cromosomicoDIPLOIDE

CORREDO CROMOSOMICO

Nell’uomo il

numero diploide

è 46 e il numero

aploide è 23

XX

XY

I due cromosomi sessuali sono molto diversi tra loro per

FORMA, DIMENSIONI e CONTENUTO

X: cromosoma “grande”, contenente molti geni attivi

Y: cromosoma piccolo, contenente pochi geni molti dei quali

legati alla mascolinità

I cromosomi metafasici sono colorabili:

bandeggio dei cromosomi

Posizione del centromero e bandeggio

Lunghezzabracci

Identificazione/classificazione dei cromosomi è facilitata

dal bandeggio

Ogni coppia di omologhi è diversa dalle altre per posizione del centromero, forma, dimensioni, e bandeggio

La Diagnosi Prenatale può rivelare anomalie cromosomiche di struttura e di numero e molti difetti genetici

Allestimento preparati cromosomici

Aggiunta di un agente mitogeno

che induce proliferazione cellulare

Aggiunta di colchicina che

inibisce/disgrega il fuso

Blocco delle

cellule in

metafase

Trattamento con soluzione ipotonica che

richiamando acqua all’interno disperde i cromosomi

e rompe le cellule

Rottura delle cellule e fuoriuscita dei cromosomi

Colorazione del preparato

Allineamento dei cromosomi

omologhi

per forma e bandeggio

braccio

centromero

Posizione del centromero, lunghezza dei bracci, pattern di bandeggio aiutano ad identificare i cromosomi (1, 2, 3….), e ad appaiare gli omologhi

IDENTIFICAZIONE e NUMERAZIONEdei cromosomi omologhi

Trisomia del 21: sindrome di Down

Assetto cromosomico normale ed aneuploidie

Normale assetto

cromosomico diploide

assetto cromosomico

alterato

Anomalie cromosomiche