Fetal Calf Serum-Free Generation of Functionally Active Murine Dendritic Cells Suitable for In Vivo...

7
Fetal Calf Serum-Free Generation of Functionally Active Murine Dendritic Cells Suitable for In Vivo Therapeutic Approaches Gabriele Mu Èller, Anke Mu Èller, Helmut Jonuleit, Kerstin Steinbrink, Claudia Szalma, Lydia Paragnik, Karen Lingnau,* Edgar Schmidt,* Ju Èrgen Knop, and Alexander H. Enk Clinical Research Unit, Department of Dermatology, *Institute of Immunology, University of Mainz, Mainz, Germany Standard protocols to generate mouse dendritic cells (DC) generally use culture medium supplemented with fetal calf serum; however, reinjection in vivo of DC cultured in fetal calf serum results in priming to xenogeneic proteins that clearly limits the use of such DC. We therefore established a fetal calf serum- free culture system for the generation of murine DC from bone marrow precursors. DC can be generated fetal calf serum-free using RPMI supplemented with 1.5% syngeneic mouse serum. Although the yield of DC grown under fetal calf serum-free conditions was somewhat lower than that of the standard culture, large numbers of DC could be generated without the exposure to xenogeneic proteins. The yield of fetal calf serum-free cultured DC was further enhanced by addition of the proin¯ammatory cytokines TNF-a and IL-1b with the combination resulting in up to 10% more DC. Phenotypically, CD11c + DC cultured fetal calf serum-free homogenously coexpressed the DC-speci®c molecule DEC-205 as well as the costi- mulatory molecules CD40, CD80, and CD86. In contrast, only a subpopulation of the CD11c + DC cultured in fetal calf serum-containing medium coexpressed these molecules. Functionally, fetal calf serum-free DC showed strong stimulatory capacity for naõ Ève allogeneic CD4 + and CD8 + T cells. Importantly, fetal calf serum-free DC showed spon- taneous in vivo migratory activity. Moreover, 5 3 10 5 subcutaneously injected TNBS-conjugated fetal calf serum-free DC were able to mediate contact sensi- tivity. Furthermore, the intravenous or subcutaneous injection of a single dose of 5 3 10 5 OVA-pulsed fetal calf serum-free DC resulted in the induction of an OVA-speci®c immune response in naõ Ève TCR trans- genic animals. Thus DC cultured under fetal calf serum-free conditions are suitable instruments for in vivo therapeutic approaches, especially in autoim- mune models. Keywords: DC vaccines/dendritic cell development/fetal calf serum-free culture conditions for DC/in vivo therapeutic DC approaches. J Invest Dermatol 114:142±148, 2000 D endritic cells (DC) are the most potent antigen- presenting cells (APC) within the immune system. They take up antigen within peripheral tissues such as skin and migrate via the lymph, or blood to draining lymph nodes, or the spleen, where they present processed antigens to naõ Ève T cells and deliver unique activating signals (Steinman, 1991; Cella et al, 1997; Schuler et al, 1997). The ability to deliver these signals distinguishes DC from other professional APC such as macrophages. To perform activation of unprimed T lymphocytes, immature DC from peripheral organs need to be activated. This differentiation process includes enhanced antigen-presenting activities, changes in the cell surface expression of MHC class II and adhesion molecules, induction of costimulatory molecules, and changes in the migratory activity (Caux et al, 1992; Cella et al, 1996; De Smedt et al, 1996). After this maturational process, DC possess all characteristics that make them ideal candidates for the generation of primary T cell responses. Because of their potency to induce primary T cell responses, DC are valuable tools for in vivo studies in experimental animal models; however, as DC are only a trace population in all tissues their preparation in suf®cient numbers is extremely tedious. Inaba and others reported the successful generation of large numbers of murine bone marrow-derived DC under the in¯uence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF) (Inaba et al, 1992); however, standard protocols for the generation of murine DC use culture conditions with xenologous sera such as fetal calf serum, necessitating the development of methods for the generation of functionally equivalent DC under fetal calf serum- free conditions for in vivo applications. To obtain large numbers of DC suitable for in vivo therapeutic approaches such as autoimmune disease models, we established a fetal calf serum-free culture system for the generation of murine DC from the mouse bone marrow. We herein describe that functionally active genuine DC can be generated fetal calf serum-free using media supplemented with 1.5% syngeneic mouse serum. DC generated without fetal calf 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 142 Manuscript received July 28, 1998; revised September 20, 1999; accepted for publication September 21, 1999. Reprint requests to: Dr. Alexander H. Enk, University of Mainz, Department of Dermatology, Langenbeckstraûe 1, 55131 Mainz, Germany. Email: [email protected] Abbreviations: CS, contact sensitivity; DC, dendritic cell; GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor; MS, mouse serum.

Transcript of Fetal Calf Serum-Free Generation of Functionally Active Murine Dendritic Cells Suitable for In Vivo...

����� ���� ������� �������� �� ����������� ���������� �������� ����� ������� �� �� ���� ������������������

�������� ������ � �� ������ ����� �� ����� ������ ���� ��� �� ������ ������� ����� ����� ������� �� � ��� ����� �� ������ ���� � �!� � � ���"� ��� �# � ���� ���� $������ % ��� &�!����� � �' &����������� �( ������ �' (�� ������ % �)������ �' ��� �� ��� �� ����� �

������� �������� �� ������� ���� �������� ��������� �������� �� ���� ����� ����������� ��� ����� ���� ���! �� ���" ���#������ �� ���� ���� ����� �� ����� ���� ��� ����� �� ������ ��$��������� ������� ���� ������ ������ ��� �� ����� ��% &� ������� ����������� � ����� ���� ������� ���� ������ �� ��� ��������� �� ���� ����� ���� ��� ������% �� ��� �� ������������� ���� ������� ���� '(�) ����������� ���*%+, ��������� ���� ���% ������� ��� ����� ���� �� � ��� ����� ���� ������� ���������� ������ ��� �� � ���� ���� �� ��� ������� ����"���� ����� �� �� ���� �� �������� ����� ����$���� �� $��������� �������% ��� ����� �� ��������� ������� ����� �� �� ���� �������� ���������� �� ��� ����-������� ����.���� �/������ )0�*� ��� ��� ����������� ������� �� � ��*1, ��� ��% (�������������" ��**�2 �� ���������� ���� ������� ����������� ���$������ �����������3� ������� �4��51+ �� ��� �� ��� ������������ �������� ��61" ��71" ��� ��78% )�

�������" ���� � ����������� �� ��� ��**�2 ������� �� ����� ���� �������������� ��������$������ ����� ��������% �����������" ����� ����������� �� ��� �� ����� ��������� ���������� ��9:�� ���������� ��62 ��� ��72 � �����%)���������" ����� ���� ������� �� ��� �� ����������� �� ���� ������� ��������% ������" +� *1+

����������� ��#����� �/;�����#����� ����� ����������� �� �� ���� �� ������� ������� ������������% �������" ��� ��������� � �����������#������ �� � ������ ���� �� +� *1+ <=������� ��������� ������� �� ������ �� ��� �������� �� ��<=�������3� ����� ������� �� ��9:�� ��' ���������� �������% ��� �� ����� ��� ����� ����������� ���������� �� ������� ��������� �� ������ ��������� ���������" ���������� �� ��������� ������% ����� � �� ������� ���������� ��������������������� ���� ��������� ������� ��������� �������� ���� ����������� �� ��������� � � ���� � �������������� !��"# $$$

&� ������ ����� *&�+ ��� � � ���� !��� � � ���� ,!���� �� � ����� *���+ -�� � � � ��� � ������#. �� ���� ! � ���� -�� � !���! ���� ������ �� �� ��� � � ������� )�� � � ���! � �� ����� ������ � � ���! ����� �� � � �!��� � - ��� � ��

!���� � !�������� � ���� � �� �/)� . ����� � � ����)�� �0�����)��� � ��� ��� *���� �� � 12213 ����� �� ��� 12243 �� ��� �� ���1224+# . � ������� �� ����)�� � ��� ��� ��� ����� ��� �� &� '����� �� !��'����� �� ��� �� �� �����! ����# .� !��'�������)���� �' !����� . ���! ������� ������� &� '���!���! ���� ���� � ��� �� �� ����)����# . �� ��''��� ������ !������� ����� � � ��� � ���� ,!���� �� � ����)������ � � ��� � � � ������'��� �"!������ �' ��� ����� (( � � �� ���� ���������� ����� �' ������������ ��������� � � � � ��� � � � ���������

����)��� *��" �� ��� 12253 ����� �� ��� 12263 &� ����� �� ��� 1226+#�'��� � �� �������� �� !������� &� !������ ��� � ������������� � ������ � �� ����� �� ������� '�� � � �� ������ �' !������ . �������!� ���#7����� �' � ��� !��� �� �� � ��� !������ . ���� ���!� ���� &�

��� )������ ����� '�� �� ���� ������ � �"!����� ��� � ���� ������3 �-�)��� �� &� ��� � �� � ����� !�!����� � ��� ������ � ���!��!������ � �'8��� � ����� �� �"������� ������#( ��� � � �� ��� ��!����� � � ������'� �� ������ �' �����

����� �' ��� � �� � �����-,����)�� &� ��� � � � 9� ���' ��� ������ �����! ���,���� � �������� � '����� *��,��:+*( ��� �� ��� 1225+3 �-�)��� ��� ���� !�������� '�� � � �� ������ �' ��� � &� �� ����� �� ����� � -�� "� ������ ���� �� ��'���� ���' ����� ���������� � � � ��)���!�� � �' ��� ��� '�� � ��� ������ �' ' ���� ���� �0�)��� � &� ��� '���� ���' ����,'��� �� ����� � '�� �� ���� �!!������� �# .� ����� ����� ����� �'&� ������� '�� �� ���� � ���!���� �!!���� �� �� �� ������ �������� ������� -� �������� �� � '���� ���' ����,'��� ����� ������'�� � � �� ������ �' ��� � &� '��� � � ���� �� � �����-#;� ���� �������� � �� ' ���� ���� ����)� �� � � &� �� ���� ������ '���� ���' ����,'��� �� � ����� �!!���� ��� -�� 1#<= �� �� ��� ���� ����# &� �� ������ -�� �� '���� ���'

>>55,5>5?@>>@A1<#>> B ��!���� � � 5>>> �� . � ������� '�� ( )��������)� &����������� ( �#

*65

�� ����!� �����)�� ��� 5C� 122C3 ��)���� ��!������ 5>� 12223����!��� '�� !�������� ��!������ 51� 1222#$�!�� � ��0���� ��D &�# ���"� ��� �# � �� % �)������ �' ��� ��

&�!����� � �' &����������� �� �� ��������E� 1� <<1F1 ��� �� ����� �#�����D � �G ����� ��#��� ��# �,��� �#�������)����� �D ��� �� ���� �� ����)���3 &�� �� ������ ����3 ��,��:�

��� ������,�����! ��� ���� � �������� � '�����3 ��� ���� ����#

���� � �- � ������ �"!������ � �� �� � ������������ '�� ����&�# : ���� ����� '���� ���' ����,'��� &� ��� )��� !��� ����������� �' �/)� ������ ��� . ���! ������# �����)��� &������� � ��,�� ��� � � �� ����� � !������ �!� �� ��� �� ������������� ����)��� � � ��� ���� �� � ��� �� �!���8� ��� ����!� ��� �� ����#

��.�$(��� �H& ��.�I&�

������� 7��7@� *�,5�+� �F� *�,5�+� � � :J7 *�,50+ ���� -������� � � � � ���� '������� �' � � ( ������ �' (�� ����� � ��� � � ���� �� CK15-� �' ���# :�� �� ���� �"!����� �� 8)� ���� -��� ��� � ��� ���!# IJ� .�$ &I11#1> ��� ��� �� � ����� *�� ��� !��)���� �� &��&� �� �� � � �# ��! �+ -��� ��� '�� �� ���� !���� � �"!����� ��*��! � �� ��� 122>+# �!!��"������� L>=K4>= �' � � !���! ���� . ������' � ��� � ����� �"!���� � . ���� ����!��� *.�$+ � �� ����� ���� � �IJ�F5FKFF2 !�!����#

���� ����� $��( 16L> -�� �!!���� ��� -�� 1>> (% !� ������ !����� 1>> �� ����!������ !����� <� 1>K<� 5�,�����!���� � ��� 5�������� �� � � 1>= ���,� ����)���� '���� ���' ���� �� 1#<= ���,� ����)���� �� *!����� 7��7@� ���� ����+#. � ���� ���� ��� � ��� �"!����� �� -�� ���,� ����)���� *1 �

<6��+# $��( 16L> �� -��� �� ��� ���� ��� *'���� ���' ���� ���� ��� ��'��� �� ����� 7��7@� ����+ -��� '��� �' ��� �� ���� ���� � �� ������ � ��� ����)� ����� �����#

����.���� ��� ������ �� ��� -��� ������� � � ���� !����� �# :� ���� �� ������ � ��� � � � ������ -���D < � ��,��: *�7�� �� �)�������� �+ !����� 1> � (�,L *$M& �������� ;������� � ����� �+!����� 1> � .H:,� *$M& �������+ !����� � � 1> � (�,1� *$M&�������+ !����#

���������� ��� �������� ����� � �������� ��� '�� ��� ����� � ��' &� -���D �&11� *��� � HL1C� �.��� $���)����� �&+� ����� ������(��� ��� � �� ������ ���� ��'��� ������ &��,5>< *&�� �)�� ������������ �+� �(��5�� ����� (( ���� (,��� (,�� *��� � 5�2� � ���� �� �������� ����� �+� �(��5�� ����� (( ��� (,�0 *��� � ��11C�� ���� �� +� �(��5�� �&C> *��� � 1�1>� � ���� �� +� �(��5�� �&C6*��� � ��,1� � ���� �� +� �(��5�� �&L> *��� � F@5F� � ���� �� +��(��5�� �&<L *��� � 7�52�1� �.��+� �(��5�� ���� �����! ���� *��� �:L@C>� �.��+� �(��5�� �&11�� ���� �����! ���� *��� � �1@4>#1<#11#< ��� �.��+� ���� �� ������ ����� *��� � FF&1�� ���� �� +� �(��5�� !������ �� ������ (�� *�����!�� � ���� �� +�!��8�� �(��5��5�@1 *�����!��� � ���� �� +� �&41 *��� � �5�� ���� �� +� �(��1#�� ���� � ���! ����� ��� � � '����-� � � �������� -��� ��� '��

��� ����� � �D � ������� ������ (��,:(.� *&�� �)�+� � ����� (��,��*��� �� 7����� ����� ����������� ����� � ����� �+� � ������ (��,&.�: *&�� �)�+#:�� ��!����� �"!����� �� � � '����-� � � �������� -��� ���D �&L

*��� � ��1#<� �.��+� �(��5�� �&C *��� � <F#6#45� �.��+� �(��5��$76KC�< *��� � ��,6�@��,1� �.��+� �(��5�� ����� (( (,�����0� (,����

*��� � �<@11L#1<#5� �.��+� �(��5�� �&L<$@755> *��� � $�FK675�� ���� �� +� �(��5�� �&11� *��� � �������� '�� ��� ����� � �+� �����!!� � �� *��� � ��$ 1C#<� �.��+#. � '����-� � ��� ���� ����� -��� ���D ���� � ����� (�� ����� *&� ���

I���� H��-��+� ���� � ������ (�� ����� *&� ��+� �&L,@�&C,�������,��� *����� �� 7������ 7������ ,������� � ����� �+� �&65�,:(.�@� ��,:(.� �������� *����� �� 7�����+#

�������� �������� .�� ����� ������ �� � *.H�7+ -�� !�� ����'��� �������� ��� *;���� ��� � ��+# .�� ������ �� ���'� �� *.H7�+ -��!�� ���� '��� ������ ����� *$�� ������ HN+# :�� � ����� �' �� ����������� 1=.H�7 � ����� �@��� -�� �!!���� �� � � ������ �' �/)� ����� ��� ># :�)� ���� ����� ���� -��� � ���� ��� -�� >#<= .H�7 � � ����-���� � ���!� ��� -��� ������� 5L ����� -�� � � �� ���O� ����������#:�� �� ���� !���� � ������ .H7�, �!�� ���� *1>��+ '���� ���' ����,'��������� &� -��� ���# � ���� �O� � ���� -�� !��'����� �� ������� ������������ ��� �8�� ��#

�������� �� ���� ��� ������� �� ���� -��� �����8��� � � � � ����� -��� ���������# 7� � �����- ����� -��� 9� �� '��� ����� � �'��� -�� � ���� �� � � ��!����� �' ��� ����� ����� �� ���� ��� ������ ������� �# :�� ��!����� �' ���! ������ � � (�,!�����)� ����������� � � ����� -��� � ������ '�� L<� �� L�� -�� $76KC�<,������� ����� (��� 755>,������ � ����� (�� &� ������� � � � �0�� ��� � �'

� ������ (�� �����# 7����,!�����)� ����� -��� ����)�� � � !����!���������� -��� � ������ -�� � �������� �' �� ���� �� � �������� '�� F>� ��L�� '����-� � ���!���� � ����� -�� �� �� !�� ���!���� � �� F4�� '��1>�� # . � �� ���� �� � �������� ��� -��� � ��,�&L� � ��,�&C�� ����� ������� *��,6�+� � ��,�&11�� � ��,��� ����� ((� � � � ��,755>@�&L<$# .� �!������ ���!���� � ����� ����,�� � (�� -�� �����,�� ��� �� � ������ -�� ���� � ����� (�� �� ���� �� � ������ ��$1C#<#$���� � � ����� -��� ������ �� <� 1>< ����� !���� � 6 -��� !�����

*������� ����� �+ � ����� �!!���� ��� -�� < � ����,��: !����� � 1> � ��(�,L !���� � � 8 �� )���� �' F��# $��( -�� ��� ������� ����� � � �!!���� ��� -�� ���,� ����)���� '���� ���' �������� �� ��'� -�� �� ���� �� ���������# ( ���� �"!����� ��� ����� -������������ -�� � � !��� 9�������� ������ �� .H:,� � � (�,1� ��� � ��� ����� ���� ����� �� ��''��� � ���� !�� ��# ������ -��� '�� *1��+-�� '��� ����� �)��� �� �� ���# I ��� < �' ����� � �� ��� � �����-��� �� ��� ����)�� '��� � � !������ ����!� ��� � '��� ����� � ������� '�� � ������� �� 5KF �# I ���� 4 �� C� ���!����)���� � �� ��� �&� -��� ����'��� �� ��� �'' � � !�����#

(�������� �� � ����������� . ���! ������ -��� � ��� �� '������� ���! ����# 7���9�� ���! ��� ����� -��� !��� ��� �� �� � ��� -��� ���� �# 7 � � . ���! ������ *�&L �� �&C+� �����! ������ � (�,!�����)� ����� -��� ��!����� �� � ������ -�� � � �!!��!������� ���� �� � �������� '����-�� �� ���!���� � ����� -�� �� �� !�����!���� �# ����� ���)���� �&L, �� �&C,!�����)� . ����� -��� !�����)����������� �� � �&L, �� �&C,����������� ���!����)���� '����-� � � �� ������� � �' � � �� '������ *!���� 2<=+# :�� !��!������ �' �/)������� . ����� -��� !�����)��� �������� �� � �&65�,:(.�@� ��,:(.��������� ����� *����� ��� 7������ ,������� � ����� �+ '����-�� �� �&L�� �&C ����������#

���������� �0' &� '��� '���� ���' ���� �� �� ������ -���!��!���� �� ��������� � � � ��� �� '�� &��5><P &� �� ��� ���� ��������� *����� ��+# �0�� ����� �' &��5><P &� -��� ��� �� � �������� ��� 6# �&LP �� �&CP . ����� *5� 1>< !�� -���+� �������� '��� ���! ���� �' �F� ���� *�,5 �+ �� ��������� ���)�� -��� ��������� -�� ��''��� ��� ������ ������ ��� �,5�,&�# ����� -��� ������ � 26 -���9��,������ !����� �� � 8 �� )���� �' 5>>�� !�� -��� � $��(@<= '�������' ���� '�� L �# QF�R. ����� � *QF�R.��� 1��� !�� -���� ����� ���7�� �� -���� ����� �+ -�� ����� '�� � ������� �� 1C �' �����#QF�R.��,� ���!������ -�� ������� �� ��0�� ��� �������� �� �� �#�����'������ -�� ��!����� �� ��� �!� '��� ���!������ ���!���#

��� ��������� �������� �'��� -�� � � � � ����� �-��� -�� �7��� ������ ��� �9������ �� ���� � � -�� !��'�����# :����� ����� -���� ������ '�� 5>�� �� L�� -�� ��� !������ �� ���� �� � ������������ �� � � �!����� �� �� ������ '�� ��� ����� � �# �'��� �-� -�� ��-�� ���� ����� *�7�@5= '���� ���' ����+ ����� -��� � ������ -�� ��,� � :(.�,�� S����� ���� � ���! ����� �� '�� 5>�� �� L��# 7�'�����0������ ����� -��� -�� �� �-���# ���� <>>>K1>>>> ����� -������������ �� 9�- ��������� �� � � :����� *7���� &���� �� ��� ��� J��-� ��+# &����� � � ���� ����� -��� ����� �� � � ���!���� �' ��'� ����� -��� !������ �� � � � :����� ����� (( ��'�-��� *7���� &���� �� +#

������� �������� �� �� ����� ����� ���� ������� &� '���7��7@� ���� -��� ������ � $��( -�� �� '���� ���' ���� � � ��)����� � ��� 4 �� ���������# I ��� > �' � � �"!����� � &� -������� �� -�� � � ���56 $�� :������� � ���� �� ��� ��� *������&���� �'� � ����� �+ '����-� � � � �� '������O� � ������� �#7���9�� &� -��� ��)����� � � -�� �� -�� '���� ���' ����,'��������# ����� -��� ���� �� ��� � �� �!!����� ���� -�� ��� � �1>� 1>6 &� -��� � S����� � ���)� ���� � �� � � ���� )�� �' 7��7@�����# ( S����� &� �"!������ �&11� *T2>= !�����)� �����+# .-� ��,'�� ��� ����� ���� -��� �����8��� � � �!��� � -��� ����)��# ���������� � �'�!��� � -��� ���� �� '�� . ����� -�� 7���� � ������ .�$ � � �� *��� ��<4K<24� � ���� �� + '����-�� �� ����!��)��� ,:(.� � � � ������ ��9������ �� ��������!�#

�� ���� �������>����� ���� ����� ���� ������� �/;�����#������� &� -��� ���- � $��(@1#<= ��# �� ��� < �' ����� � �� ��� � ����� -��� ��� �'����� �� '��� !�����# .-� ���� ����� &�-��� ��)�����# �'��� �-� -�� �� -�� ���� �7� &� -��� �!�� ���� -�� 1>�� .H7� '�� 1>�� # �'��� � ��� -�� �� � ���� ����,�� ��� � ��7�� &� -��� ����!� ��� � >#2= H��� � � <� 1>< ����� !�� ����-��� � S����� ����� ����# :�)� ���� ������ ���� -��� � ���� ��� -��

JI�# 11L� HI# 1 ��H%�$N 5>>> :�.�� ���: ��$%�,:$�� ��H�$�.(IH I: �%$(H� &�H&$(.(� ����� *6?

>#<= .H�7 � � � ��� ��� � � 5L ����� ��� �-���� � ���!� ��� -���������� -�� � ����������#

�� ���� ���������� �� ��9:�� <=� ��' ��������� � ����� &� -������- � $��(@1#<= �� �� ��������� ���)�# �'��� ��� �'�� �' � �� ��� � ����� �� '��� !����� � ��� < �' ������ &� -��� !����-�� <>�� IJ� !����� !���� *����� (((� �����+ � � ������ '�� � ������� �� 5 �# �'��� � ��� -�� �� -�� ���� �7�� &� -��� ����!� ��� � >#2= H���# :�)�� 1>< ����� -��� � S����� � ���)� ���� �� ����� ��������!����)���� !�� IJ� .�$ ��� ��� �� � ����# �'��� 1> �� ���� -��������8��� � � �!��� � ����)��# .���� �!��� ����� -��� ����������� -�� <�� !���� �' � � IJ� !�!���� �� �� ���� !�!���� �� ����# �'��� LC QF�R.�� -�� �����# �����'������ -�� ��!����� �� ��� �!� '��� ���!���������!���# &I11#1> ���� �� ������� �� ����� �� � S����� �' F> �� IJ�!�!���� � (:� �� ���� �� ���� �����)� � � � S����� �' &� !���� -�� �� ���� !����� ���)�� �� �� �����#

$��%�.�

@��� ����� �� �� ��� �� �������� �� '(�)����������� ��� *%+, ���� ��� &� !�������� -���!��!���� �� ��������� � � ������ � ����� �!!���� ��� -�� ����,��: � � ��(�,L# .� �������� � '���� ���' ����,'��� ����������� $��( -�� ��� � � �!!���� ��� -�� ���,� ����)������ �� ��� �� �� ��'� -�� �� ����# �� ��� 4 �' ����� � � ����� �'&� -�� ������� �� �� ������� � �� ������ ���! ����� �' ���������)�� '��� 1� 1>4 !��������# �� � � '���� ���' ���� �� ����� �-��� ���!����# ; � !���� ����� -��� ������ ��� '���� ���'����,�� ��� � � ��� ���� �� ����� � C#<� 1>6 *>#L<+ ����� -�� �� ������ ���! ����� ���� �� ����� �� !�� 1� 1>4 �����*����� )+# ��������� �' 1>= '���� ���' ���� �� 1#<= �� � $��( ��� �� � &� ����� �' <� 1>6 *>#F+# . � ���� �' 1#<= ��!��)�� �� �� �!����� '�� � � �� ������ �' ���� �� ������ �����#&�''��� � !����� ������ �' 7��7@� ���� -��� ���!���� � � ������� �� ������ -��� ���!������ ����)� � � � ������# I������ �'���� � $��( ������� � � ������ &� ����� �� ����� � �� �������� 5� 1>6 *>#F6+ &� !�� 1� 1>4 &� !���� �����# ����� �' &�'���� ���' ����,'��� �� � $��(@1#<= �� ������� � � ��� ������ �' ����� ����� �' ���� &� -�� �� �"!���� ��"� ��� ��� !����� �#

4����� �� ���� ���������� �� �� ��������� &��� ������ ��� ��''��� � ����� �� ����� � ��� � �- � ��� *#; � &� -��� ���- ��� ��� ���� $��(@'���� ���' ������ ����� � � � ������ � &� !�!����� -�� ������� ��# ����� &�-�� '�- ����!������ !��S����� � �� -��� �� ������ �� � � �!������� -�� �� ������ ��� �)�� � � ���� ���� -��� �����)�� *��� *�+#; � '���� ���' ���� -�� ��������� �� ���,� ����)���� �� � � �$��( ����� � ��� �8�� � ��''��� ��� � � � ���! ��������������� ��� ���� &� ���� �� '� � *��� *%+#

(��������� �������� �� �� �������� ��� �������� �������������� ����� &� �� ������ ��� ��''��� � ������� ����� � -��� ��)����� �� ��� 4 � � ��� ����� �� ����������� � � � ������� ��� �� ���# &� ���- � $��(@'�������' ���� ��� ���� �� ����� � �� -��� �� &� ������ -�� �� '����

���' ���� �"!������ �&11�� &��,5><� �&<L * �� � �- +��&C>� �&L< * �� � �- +� �&C6� �&L> * �� � �- + �� -��� ����� ����� ( * �� � �- + � � ����� (( �������� *��� 5+# &������� � $��( 1>= '���� ���' ���� � �-�� � ������� ���"!������ �' ����� (( � � �&C6 - ����� �&11�P &� ���- � 1#<= �� �� ��� � � ����� ����� ���� ���"!������ ����� ((�&��,5><� �&C>� � � �&C6# .���� ������� �' ���� � � ������ $��( ��� � ������� � � ����� �&11�P &� !�!����� ���"!����� � ����� ((� &��,5><� �&C>� � � �&C6 �� -��� �� � ������� �� ����� !�!����� �' ����� �"!����� � ����� ((� &��,5><��&C>� � � �&C6 �� ��� �� ��- ��)��� * �� � �- +#����� �' �� � �����- !���� ����� � $��(@�� ������� �

FC�L= ����� � �-� � � � ! � ���!� �' ����� &� *�&11�P�&��,5><P� ����� ((P� �&C>P� � � �&C6P+# ( � � ���� �� �' ����� � !���� ����� �' �� � � &� -��� ��- ����� � �� 1<�F#2=�� ������ ����� * �� � �- +#

(��������� �������� �� ����� ���� ������� �� ����� ����� ������� �� ��� ����-������� ����.���� �/��� ���)0�*� &� !���� ����� -��� ������ � $��(@1#<= �� ��$��(@1>= '���� ���' ����� ���!����)���# �� ������ �� ��� � �- �� � � �� � � �������� �' &� .H:,� � � (�,1� -��� ����� ��� � ����� ��� � �� � ����� ���� �� ��� 5 �' �����# �� ��� 4 �'����� &� -��� � ������ �� :����� # ����� �' �����!������!���� ����� � $��(@'���� ���' ���� ������� � � ������� ����� �'�&11�P@&��,5><P ����� � � ����� � '���� ���' ����,'����� ����� � *��� ?+# ����� � � � !���� �� �' .H:,� � � (�,1�'��� ��� 5 � ���� ������� � � � ������� &� ����� -�� 1>=���� &� �� ��� 4 �' ����� *��� ?+# ������� ����� ����� � .H:,� � � (�,1� �� � �� � ������� � � !���� ���� �' &� �� ��8 �� ��� � &�,�!���8� ������� �&11� � � &��,5><� �� ������� � ����� � !�������� �' �&C6 � � �&C> * �� � �- +# . � '���� ���'����,'��� ����� �' &� � � � !���� �� �' !��� 9�������������� �� ������� � � � � ��� ����� �' �&11�P@&��,5><P

&�# .H:@(�,1,������ '���� ���' ����,'��� &� '��� ��� 4� �-�� � ������ &� ���! ����� � � ! � ���!� �)� - � ������ �� -��� ����)��#

������������� �������� �� �� ���� ���������� �������-������� ����.���� &� !���� ����� -��� ������ �

����� )% 4����� �� ���� ���������� �� ��� ����� �� ��������������

����� �� ����� � &� ����� !�� 1>4 !���� �����

$��( 5� 1>6 *>#F6+$��(� 1#<= �� <� 1>6 *>#F>+$��( 1>= '���� ���' ���� C#<� 1>6 *>#L<+

�1>4 ��!����� &� !���� ����� -��� ������ � ����� �!!���� ��� -�� < ���,��: !���� � � 1> � !���� (�,L# ����� � � ���� ��� ��� � �- ���)� � ���� ��)� � ������ � � � ������� ��� �� ���# I ��� < �' ����� � �� ��� ������ -��� �� ��� �� ��� �'' � � !������ ����!� ��� � '��� ������ � � ������'�� � ������� �� 5 �# I ��� 4 � �� ��� � ����� -��� ����'��� ����)�� '��� � �!����� � � &� ����� -��� ������� ��# . � ���� � �- � � �& �' ������ *�&+ �'8)� � ��!� �� � �"!����� ��#

���� *% 4����� �� �������� ���� ���������� �� ��� ����������� ���� ��� ������� ���� ��% &�!����� �� � �����-!���� ���� ����� -��� ������ � $��( �� ��� � � < � ��,��: !����� � 1> � (�,L !����# &� ������ ����� � ��� 4 �' ����� ��� � �- # ������� � � � ������ -��� *�+ $��(@1>= '���� ���' ���� � � *�+ $��(@1#<= ��#

*66 �% ���$ �� �� .�� �I%$H�� I: (HJ��.(��.(J� &�$��.I�I�N

$��(@�� �� $��(@'���� ���' ���� �� ���������# &� � ��� 4 �'����� -��� ��� �� ��������� ����� '�� ������ ��� �&LP �� �&CP

. �����# :�� ������ &� -��� ��������� -�� � �!��� 9�������� ������ �� .H:,� � � (�,1� ��� � �� � ����� ���� �� ��� 5 �' �����# . ��� &� -��� ���!���� '��� ��� ���������� ��!����� '�� ������ ��� �/)� �&LP �� �&CP .����� � � ��$ '����-� � � ��� �� � �' � � ����� -�� &�� 5><�� ���� �� � ������ ��!��� �� ��� ���� ���� �����# �0�� ����� �' &��5><P &� -��� ��� '�� ��������� # . ���&��5><P &� �"!������ ������� ��� �� �' ��� ����� ((�������� � � ������������ �������� * �� � �- +# ; � ���!���� -�� &� ���- �� )� ��� ����� &� ���- -�� ��'���� ���' ���� -��� �0���� ���� � ���������� �' �&LP . �����*��� 6+# ���� ������ �' &� -�� .H:,� �� (�,1� ��� � �������� � � ������� ���������� ��!����� -�� (�,1� �� � �� ��� ��� �� �-� � � ���� ��� �''��� � � .H: ��� � *��� 6+# . � ����� ����������� �' &� -�� ��� .H:,� � � (�,1� ������� � �'�� �� � ������ � . ���� ���������� ��!�����# . � ���� ������-��� ����� �� - � �&CP . ����� -��� ��� � � � ��$ * ��� �- +# . �� ��������� �' '���� ���' ����,'��� &� -�� ������ ���� �' .H:,� � � (�,1� ������ � � ��� �8�� ���� ������� ���������� ��!����� �' &� '�� ������ ��� . �����#; � &��5><P '���� ���' ����,&� -��� ��� � ����� �'&��5><P ��,&� ���!������ ��)��� �' ���������� ��!�����-��� �����)��#

������� �������� �� �� ����� ����� ���� ������� I � �' � � � ������������� �' &� �� ���� �� � ��� �������������)���# .� ������ ��������� ����)��� �' �� &�� &� -��� ������'���� ���' ����,'��� �� ��������� � � ������� -�� � � ��� ������56 �� ���������# .� � 1>6 ������� &� -��� � S����� �#)# � ��7��7@� ����# .-� ��,'�� ��� ������ �!��� � '��� � S������ ����� -��� ����)�� '�� ���������� �# .� ��� ��'� . ���� ������ .����� -��� ���� �� -�� � ��,.�$�,� �� �� ���� �� � ��������*��� ++# ( S����� &� -��� �������� �� ��� 9������ �� *��� ++#&� -��� �������� � ����� �� ���� �� . ����� � �!�� �� . ���� �����#I� ���� � ������ � �� ��,&� ��� ���� �� ������� �� . ���� ����� � �!��� '����-� � � ���)� �� � S����� #

@������>�� �� ����� ����� ���� ������� �������������� ����������� .� ������ - �� �� �!�� ���� &� ������'���� ���' ����,'��� ��� ���� �� � ��� �� ���� �� ����)���� <� 1><

.H7�,�� S����� &� !�� ���� -��� � S����� ����� �����#�'��� < � ���� -��� � ���� ��� � � � ���� �� ������� ��� ��������� # .-� ��,'�� ��� ����� ��� �-���� � ���!� ��� -���������� �� � � � �� ���O� ����������# ���� �� ������� )���!���� ��� �!!������� �' 1= .H�7 �� ��� � ��� �8�� � ����-���� � ���!� �� ��-��� ������� *��� 8+# ���� � �� �����)��.H7�,�� S����� &� ���� � �-�� � ��� �8�� � ��� �-���� ����!� �� �'��� � ���� �� -�� .H�7 - � ���!���� -�� � �� ���� �� ���! *���! � �� �����)�� &� ��� �+# ( ����� �' ���� .H7�,&� �� ���� -�� �� �!���8� �� � � � ���� �� -�� &H:7��� �� ����� � � ��� �8�� � ��� �-���� � ���!� ��# .��� ����� ��� �!�� ���� &� ������ '���� ���' ����,'��� ��� ���� �� � ��� ���!���8� ��� � ���!� ��� �� �� �� �� ����#

�� ���� ������ �� ��9:�� <=� ��' ��������� � ����� ��<=������� ����� ���� ������� ����� �� &� -������- � $��( �� ��� � � 1#<= ��# I ��� < &� -��� !����-�� <> �� IJ� !����� !����# :�)�� 1>< I)����� ,!���� &�*IJ�,&�+ �� !���� &� *&�+ -��� � S����� ����� ����� ��� ���)� ����� ���!����)���# .� �� �-��)� ���� ����� ����� �!��� ����� -��� ����������� -�� <�� IJ�F5FKFF2 !�!���� *PIJ�!�!+!���� �� �� ���� !�!���� *P�� ��#+ �� ����# �!��� ����� �'��� ��� �� � ����� � �� �����)�� ������� &� !����'������ � � �!���� �� �' IJ�F5FKFF2 !�!���� *&�P IJ�!�!+� - ����� �!����'������ -�� ��� -�� � � �� ���� !�!���� *&�P �� ��#+*��� A+# � ��� �8�� ��� ���� ��� !����'������ ���� �� �����)��- � �!��� ����� '��� ���� � S����� -�� IJ� !����� ,!����&� -��� ����������� -�� IJ� !�!���� �� ���� *IJ�,&�PIJ�!�!+# . �� '���� ���' ����,'��� ������ &� !���� -�� IJ� �� ���� ��� ���� �� !���� �/)� IJ� .�$ �� . ����� �� ����#. � � S����� �' � �0�� ���� �' !���� &� ������ � '�������' ����,�� ��� � � ����� ������� � � � � ����� �' � ���� ���� � ���!� �� �������� ���� �� '���� ���' ���� !����� ���!� � ��# ; � ����������� -�� IJ� !�!���� �� ���� � � '���� ���' ����,�� ��� � � ����� � ���� � ������� �

���� 5% 4����� �� �������� ���� ���������� �� ��� ��������� �� �� �� ��� A �� ����% &� !���� ����� -��� ������ � � � !���� �� �' < ���,��: !���� � � 1> � (�,L !����# ���� ��� ��� ��)� �� � � ��'�# �� ��� < � �� ��� � ����� -��� ��� �'����� �� '��� ����� !����� � � ������ '�� � ������� �� 5 �# ����� &� -��� ��)����� �� ��� 4# &� -��� ���� �� �� ��������� � � � ������� ��� �� ���# ����� �� :��� � ������ ���� ����� � � ������-��� �"����� �� ��'�-��� ���� �# &�� !���� �' ����� � � ����� ��� � �- #

JI�# 11L� HI# 1 ��H%�$N 5>>> :�.�� ���: ��$%�,:$�� ��H�$�.(IH I: �%$(H� &�H&$(.(� ����� *6+

!����'������ -�� �������# ( �� ������ � � � S����� �' '���� ���'����,'��� ������ &� ����-�� � ����� �� ����� � �' � � ���!���8� ���!� �� �� � � !����'������ � ���!� �� �� ����� ���� ���� !�!���� ��� � -�� ��!�������� )��� ��-#

&(��%��(IH

&� ��� -��� ��������� �� �'8��� � ��� '�� . ����� *���� �� �� ���12213 �� ��� �� ��� 1224+# 7����� �' � ��� ������� �� ����)��� �/)�. ���! ������ � �� ��� � ������� � ����� '�� �� ���� � ���!�����!!���� �� � ��)���� ������� ������3 �-�)��� � � �� ���� �� �'&� �� ��� ������� �� � ��� ����� ��)��� � !���! ���� ���� � � �������������� � ����� ���! ��� ������# $��� ���� ( ��� �� ����!����� � � ������'� �� ������ �' ����� ����� �' ���� &� ��� � � � 9� �� �' ��,��: *( ��� �� ��� 1225+# ( � ���� ���� �� -�� � �- � �� (�,L� � �- �� ������� &�' ���� � '�� �� � � ��� � � ����� � � ��� �������������!����� �' ��� � �� � �����-,����)�� &�#1 ��� !����������������� ��� �- �� ����� �!!���� ��� -�� �� ��� �� �'"� ������ ����� �� �� '���� ���' ���� '�� � � �� ���� �� ������ �'��� � &� '��� !�������� ����� ��� � � � � �� � �����-3

���� ?% (�������� �� ����� ���� ������� �� ���� ���������� ��� ����-������� ����.���� B ��������� ��� ��� ������� ����%&� !���� ����� -��� ������ � � � !���� �� �' < � ��,��: !���� � � 1> � (�,L !���� ��� '���� ���' ����,'��� � � '���� ���' ����,�� ����� � �����������# �� ��� 5 �' ����� 1> � .H:,� !���� � � 1> � (�,1� !���� -��� ����� �� � � ������ ��� � �� � ����� ���� # �� ��� < � �� ��� � �����-��� ��� �'����� �� '��� ����� !����� � � ������ '�� � �� �� 5 �# &� -��� ��)����� �� ��� 4 � � ���� �� �� ���������# ����� �� :��� � ������ ���� ������ � ������ -��� �"����� �� ��'�-��� ���� �# &�� !���� �' ����� � � ����� ��� � �- #

���� 6% ������������� �������� �� ����� ���� ������ ������������������� ��� ����-������� ����.����% ������ ��� �/)� �&LP. ����� -��� !��!���� �� ���������# &� ������ � $��(�� ��� � � 1#<= �� �� 1>= '���� ���' ���� -��� ��������� -�� � �!��� 9�������� ������ �� .H:,� � � (�,1� ��� � �� � ����� ���� ����� 5 �' �����# �� &� -��� ��� �� ���������� �' 5� 1>< . ����� � � ������ ��� ��$# . � 8��� � �-� � � ������ �' 8)� � ��!� �� ��"!����� ��#

1�� �������� �� ��������� �� �� � �� �� ��D (�,L � � ��� � � ����� � ���� ����������� ��!����� �' ��� � �� � �����-,����)�� �� �����������# �� ���� ��������� �� �������� ������ 1226 *�����#+

*68 �% ���$ �� �� .�� �I%$H�� I: (HJ��.(��.(J� &�$��.I�I�N

�-�)��� ��!������� '�� �� ���� �!!������� � � � �� �' &� �� ������� '���� ���' ����,�� ��� � � ����� �� �� �� !����������� ���� &� � ��� !��� � ��� � ������� � ���� �� '���� ���' ����,!�������� �� ����#

;� � ���'��� �������� �� � '���� ���' ����,'��� ����� ������ '������ &�# ���� -� ��!��� � �)�� ����� ������ � �� ����-� � ��� ������ �' ����� ��� �� �' ' ���� ���� ����)� ���� &�-�� �� � � �� �' '���� ���' ����# I� ���� ���� ������ � ���&11�P@&��,5><P &� �� �� �� ������ � $��( 16L> ���� ��� � � 1#<= ���,� ����)���� �� �� ��� ��# ����� �' &�!���� ����� � $��( �!!���� ��� -�� �� ������� � �� &�������# � � ���!������� &� ������ -�� �� '���� ���' ���� �� -����� �� )� ��� ���� ���- '���� ���' ����,&� �"!������ �&11��&��,5><� �&<L� �&L<� �&C>� �&C6� �&L>� ��� ����� (� � ������ (( ��������# ; ����� �&11�P '���� ���' ����,'��� ������&� ����� ���� ���"!���� ����� ((� &��,5><� �&C>� � ��&C6� � � �"!������ �' � ��� �������� � ��� ���� '���� ���'����,&� �� ������� ���� �#�#� � ����� (( �� @�&C6 �� � � � �����((��-@�&C6��- !�!����� ���� �� ����� ��� ��# �� '���� ���'����,'��� ������ &� � �- � ���� ����� �� �"!������ �'��� ����� (( � � ������������ ��������� � ��� ����� ���� ���"!���� � ���� ����� &� � � &� ������ � '���� ���' ����,�� ��� � � ����� �� � � ���� ��� �' �����#�� 8��� ��� ��� � � �������������� !����'������ ���� ���� ��

�� ������� � ��� 8 �� ��� �� � ��S�� ��''��� ��� � � � ������������!����� �' ��,&� ����� '���� ���' ����,&� -��� ����������3 �-�)��� �� � ��� �� ���� � �� &� -��� � ��� �� '�� &��,5><P

&� !���� �� � ��� �� � ������ ��� !����'������ ������# &��,5><P

&� -��� '� � �� �"!���� �0�� ��� �� �' ��� ����� (( � ������������� �������� � ��� '���� ���' ���� �� ��,&� * ��� �- +# . � � � ���������� ��!����� �' ��� !��!������ � -���"!����� �� �� �������#���� 9�������� ������ �� ���� �� �� �' )���� ��!���� �� '��

� � �������� �' &�# ( 9�������� ��� ��� � ���� � .H:,�� (�,1� (�,6� � � ��� � ��� � ������ ��� ������ �' � � ��� � �������&�D ��- �������� �' ! ����������� !�������� �' ��������,���� �������� � � ��� ����������� ' ���� � �� ���� *�������� � �� ��)��� ��� 122L3 ������� �� ��� 122<+ � � �� ���� *$��� �� � �� ���� 12253 $��� � �� ��� 1226+# �� � �� ��0� �� &� ����� ����)������� ����� �� �������� # $��� ���� .H:,� -��� �- �� �� ��0���� '�� � � ��)���!�� � �' �� &� *��"�� ��� 1225+# �����)��� .H:,� -�� � �- �� � � �� � ��������� �' ���� &� �� ������ '��� � � �� � �����-�- ����� .�:,�1 -�� � �- �� �)� �������� �!!����� � �''����*N����� � �� ��� 1224+# I� ���� � �- � �� � � � !���� �� �' � �!��� 9�������� ������ �� (�,1� � � .H:,� '��� ��� 5 ����

���� 8% @������>�� ����� ���� ������� ����� �� �������������� �����������% &� -��� ���- � $��(@1#<= �� � � �!�� ����-�� 1>�� .H7� '�� 1>�� # �'��� � ��� -�� �� -�� ��,�� ��� � ������ &� -��� ����!� ��� � >#2= H��� � � <� 1>< ����� !�� ����-��� � S����� ����� ����# < � ������ ���� -��� � ���� ���� � � 5L �������� �-���� � ���!� ��� -��� �������# . � �"!����� � -�� !��'����� '������� � �-� � �0�� ������#

���� A% <=������� ����� ���� ������� ����� �� ������9:�� <=� ��' ��������� � ����� �� ����� &� -��� ���- � $��(@1#<= �� � � !���� -�� <>�� IJ� !����� !���� �� ��� <# :�)� � 1><

&� -��� � S����� !�� IJ� .�$ ��� ��� �� � ����# �'��� 1> � �!��� �����-��� ����������� -�� <�� !���� �' � � IJ� !�!���� *PIJ�!�!+ ���� ���� !�!���� *P�� ��#+ �� ����# �'��� LC QF�R.�� -�� �����#�����'������ -�� ��!����� �� ��� �!� '��� ���!������ ���!���# . ���"!����� � -�� ��!����� 8)� ����� -�� ������� ������#

���� +% ������� �������� �� �� ����� ����� ���� �������%&� -��� ������� -�� ��� ��� ���56 �� �������� � � � ������� ����� ��� � � 1>� 1>6 &� -��� � S����� � ���)� ���� � �� 7��7@� ����� ��� ># .-� ��,'�� ��� ����� ���� -��� ������ � � �!��� � ����)��#���������� � �' �!��� � -��� ��� ����� �� � � � ������ �� 9������ ����������!�# . ���� ����� -��� ���� �� -�� � �� ���� �� � ������ ���� ��.�$,� � �� �# *�+ ���� � � �' . ����� -�� .�$,� � �� �� ���� ��� ������,:(.�3 *�+ �������� �' ��� 56,���� ��� � S����� &� � ��� � .���� �����#

JI�# 11L� HI# 1 ��H%�$N 5>>> :�.�� ���: ��$%�,:$�� ��H�$�.(IH I: �%$(H� &�H&$(.(� ����� *6A

1>= ���� &� ���� �� �� ������ ��� '���� ���' ����,'����� ����� �# ������� ����� ��������� -�� (�,1� �� .H:,�������� � � !�������� �"!������ �' �&C6 � � �&C>#: ���� ����� � � ����� �� ��������� �' '���� ���' ����,'���&� -�� ��� (�,1� � � .H:,� ������� � � ��� �8�� � � ������� . ���� ���������� ��!�����# ; � ����� ��� � �� � � �������(�,1� � �-�� � � ���� ���� �''���� � &� ������ ! � ���!�� � ����������� ��!�����# . �� �����)���� �� � �� ����� -�� ���� � ����� �-� � � �� .H:,� ��� � �� � � ���� ���� �''���� � � ��������� �' �� &� *�� ���� �� ��� 1224+# . �� ��''��� ����� � �� �� ����� !�������� �� �� � � ��''��� � ����� �' � � &��� ������ �� ���� *�� � �����- ����� ���� !���! ���� �����+#; � ��,&� -��� ���!���� -�� '���� ���' ����,&� '�� � ���!��� �� �� �������� ������ ��� . ������ � ��� �8�� � ��''��� ��� � . ���� !����'������ -��� �����)�� ��� �� ��,&� �"!���� � ��������� ! � ���!� � � '���� ���' ����,&�# . � '���� ���' ����,&�,������ �-�)��� ���� �� ��� � �� ����� �' &��"!����� � �0�� ��)��� �' ����� (( � � ������������ ��������#. � '��� � �� � �� ��� &� � � ��$ � ������� -�� �� � . ������� ���� �� � ���!������ . !����'������ #I � !�)���� ��0����� � '�� � � �� �' �� ���� �� ������ &� '��

�� ���� � ���!���� �!!���� �� �� � ��� ' ���� �� ����)��� �� ����# ;� ���� � �- � �� &� ������ '���� ���' ����,'��� !��������������� ����)��� �� ����# &� '��� �,50 �� ��� � �� -��� � S������ � � ���� )�� �' 7��7@� ���� -��� '� � �� ������� �� � ��!��� # H� ����� -��� '� � � � � ���! ����# ; � &� -���� S����� ����� ���� (,�0,�"!����� � ����� ���� �� '� � � � ����� � � ���! ��� �� �� � � � �!��� # . �� 8 �� � �� � ������� � -�� ���� � -��� � �-� � � �� � ���)� ���� � S�����&� ������� �� � � �!��� - ��� � �� � ������ -�� ��,�!���8� .���! ������# ( � �� ���� � � ���� �' ������� &� � �!��� -��� �- �� ���� � ��"��� 5L !���,� S����� *( ���� �� ��� 1224+#7������ � ��� ��������� ����)��� -� ���� ������ � �� '���� ���'����,'��� ������ &� ��� ' ���� ���� ����)� �� ����# � ����� � �������)�� .H7�,�� S����� &� � �-�� � ��� �8�� � ��� �-���� ����!� �� - � � ���� ��� -�� .H�7 � � � �� ���������� ���#. �� � �� ��� ���� �' &� �!�� ���� -�� .H7� -�� �'8��� � ��� ��� �� ���� �� ��������� � �/)� � �����#:�� ������ � � ' ���� �� ����)��� �' &� ������ -�� �� '����

���' ���� -�� � )��������� � � IJ� .�$ ��� ��� �� ����������# �!��� ����� '��� ���� � �� �����)�� IJ�,!���� ��,&�� �-�� � ��� �8�� ��� ���� ��� ��,�!���8� !����'������ - � ����������� -�� IJ�F5FKFF2 !�!���� �� ���� �� ���!���� -�� �!��� ����� '��� ���� � �� �����)�� !���� &�# &� !���� -�� IJ� !����� � S����� ����� ���� �� � ���)� ���� -��� ���� ��!���� �/)� .�$ �� . ����� �� ����# $���������� !���� '���� ���'����,'��� �� ������ &� ��� �� � ��� � ��� � ���!� ������ �� "� ��� ��� '���� ���' ����,!����� � � �/)� � ����� �� ���'���� ���' ����,�� ������ &�# % ��� �-� ��)���� ��!���� ��������� � ������'� �� �' &� ������ � '���� ���' ����,�� ��� � ������ �� !��� � ����� '�� � � � ����� �' � ������ ��� ��� ������ *������ �� ��� 12263 ��������� �� ��� 12263 ��������� �� ���1224+# 7� � �����-,�� ������ &� !���� -�� � ����� (,����������!�!���� -��� � �- �� �� !��� � � ����� �' ������"�� .���! ������ *�.�+ � � � � '�� � � � ����� �' � ��������� ��� �� ���� *��������� � � ������� 122<3 ������ �� ��� 1226+#������� ����� (�,15,��� �'����� �� )� ��� ���� ���- &� -���� �- �� ���)� �� �''����)� ���� )���� � ��S)� �� �� ����*U��)���� �� ��� 1226+# �����)��� ��� � &� ������ �� ���� -�� ������ !����� !���� �.� ���� �� ���� � ���� � �� ���� *�������� ��� 1226+# ( � �� �� �!!���� $H�,!���� &� -���������'��� ��� � � ��� � ���� ����� *7�����-��� �� ���1226+3 �-�)��� ��� &� ��� � � ��� ������ -��� ������ � ����� �� ��� � � "� ������ ����# 7������ � ��� �!���8�� ������ �''���� �� &� ������� ���� � ��� � !��� � ������ ������ � ���!� �� ���� �� ���!� � �� �' � � '����� ����# ( ����� ������ ������� �� � �!���8� ��� ���������� ��� � �� �

������� ����,�''���# ( �� �� ������� ������ �� �� ������ ��������� &� �� ������ -�� �� '����� !����� � !��)��� ������ ���)� �����# :�� � ��� �!!���� �� &� �� ������ '���� ���' ����,'��� ��� ��!���� � �����#

� � ��� �� �� ������� �� �� �� �� �!������ ��� "�� � � #���� ��� ��

����� $���� �� �������� � � ����� � �� "�! "�� �������� �� � ���� �� � �

������ � %��� ������������ ����

$�:�$�H���

7�����-��� &� H��� ��� � ���� &� ������ �D &� ������ ����� !���� -�� $H� ���!��� � � ���� ,!���� �� � ����� � )���� � � � )�)�# & �'� �� 1CLDL6<KL45�1226

��" �� &������ &����� � �� �� ���� &� 7� � ���� �D ��,��: � � .H:,���!����� � � � �� ������ �' �� ������ �� ��� � � �����# (���� F6>D5<CK561�1225

����� �� �� �������� &� ������ �� �� �� �� � �� �� ��)��� �� �� ����� �D������� �' �&L> � �� ������ ���� �������� !������� �' �� ��)��� �'� ������� ,15 � � � � ��� � ���� ���������� ��!�����D .,. ��! )�� �������)���� # & �'� �� 1CLD4L4K4<5� 1226

����� �� ������� :� �� ��)��� �� �D I���� � �������� � � � ���� !���� �� �' ���� �' �� ������ �����# �� )��� ������� 2D1>K16� 1224

������ ��� �������� �(� ������ ;�� ����� �.� :��� �& ��D ��!����,!������ ������ ����� � ��� � ���� ,�!���8� �.�,�������� !�������)� ������� ���# & �'� �� 1CFD5CFK5C4� 1226

&� ����� .� ��S�� 7� ������� �� ���!�� ��� �� ��� � �� &� 7���������� �� %���� �� ��� I� ����� �D $������� �' �� ������ ���� ����� � � �������� ����!�!������� ����� � )�)�# & �'� �� 1CLD1L1FK1L5L� 1226

( ��� �� ( ��� �� $��� � H� ��� �� &��� � �� (�� ��� �� �������� ������ �� $�D �� ������ �' ����� ����� �' �� ������ ����� '��� ������ � �����- ������ �!!���� ��� -�� ��� ������@�����! ��� ���� �,�������� � '�����# & �'� �� 146D162FK14>5� 1225

( ���� �� �� �� � �� � ���� �� �� �� � ��D ( )�)� �������� �' �� ������ ����� ���� !���� ����� �� �&LP . �����# & �'� �� 1C<D51FFK51L1� 1224

�� ���� �� � %� ����� �� ���� ��� � �� ����� �� �� �� ���� �� � �! �� � ���D ���� 9�������� ������ �� � � !�������� �� � � ��� �������� �'!��� � ��� ����������� �� ������ ����� ��� :��,'��� �� ����� �# �� &������� 54DF1F<KF1L5� 1224

��������� �(� U��� � .� ������ ;�� U��)���� �� ������,����� �&� &���� �7������ �.D 7� � �����-,����)�� �� ������ ����� ���)� �� !��� � ��S)� �� '��!�!���� ����� � ������ )���� ��# ���� ����� 1<D2LK1>F� 1224

��! � ��� ���������� �7� �� &ND ( ����� �� � ���� �' � ���� �����!�!����� �' �&LP�&CP.�$�� � �������� � )�)�# ������� 5<>D145>K145F�122>

������ �� � ���� � �� $����'� �� ������� ��D ��� � �� ������ ����� ������ � )���� -�� ������ !����� !���� ������"�� . ���! ������ ���� �� ����� ���� � )�)�# & �'� �� 1CFDF14KF55� 1226

��������� �� ������ �D 7� � �����-,�� ������ �� ������ ����� !���� -�� � ����� (,���������� !�!���� ��� !��� � � ����� �' ������"�� . ���! ������# & �'� ��1C5D56>K56<� 122<

��������� �� � ���� &� ������ �D ( ����� �' � ������ ��� ��� �� � �� ������-,�� ������ �� ������ �����# & ������� 1<6D521CK5256� 1226

$��� � H� �� ��� �D � � ����������� ������� �� �������� ����� ��� ����� �� � �� �� � � �������� ���� ������ �!�� ��� ���� � (�� �!�� ��# 1F *FKL+D 56<K542� 1225

$��� � H� $����� &� ���� �� �� �� �� ���� 7� H�����-����� &� �� ��� �D�� ������ �' ����� �� ������ ����� '��� �� �����D � ��!��)�� ��� ��-�� �!����� ������ �� ��� ���� �!!����������# & ������� �� ��� 126D1F41<1�1226

������� :� �� ��)��� �� �D �'8��� � !���� ����� �' ������ � ���� �� ������ �� �� ������ ����� �� ��� ��� �� �� ��� ������@�����! ��� ���� �,�������� � '����� !�� � ������� L � � ��- �������� �� .H:,# & �'� ��142D11>2K111C� 122L

������� :� ����� �� &� ���� �� �� ��)��� �� �D &� ������ ����� �� �����!� ��������� � � � �� ��� ����!��� �� �� �� ����� ������������� � � � ��S�� �������!��������� ���!��" ����� (( ���!����� �D ��- �������� �� ������ ��� � ��������� !������# & �'� �� 1C5DFC2KL>>� 122<

�� ��� �� . � �� 7� $��� � HD &� ������ �����D '��� �� ���� ����� �� ��S��!������ � .,����,�������� ��� ���# ��� �� ������ ������� 115DF14KFFF�1224

���� �� $�D . � �� ������ ���� ������ � � ��� ���� � ��� ��� �����# ���� *��������� 2D541K526� 1221

N����� � N� .���� �� ��-� �� ( ��� �D �� ������ � �''���� �' .7:,1 � �.H:, � � � ��)���!�� � �' �� ������ ����� '��� !���� ����� � � � ������ � �����-# ���� ����� 1<D1LLK1<F� 1224

U��)���� �� �� ���� 7� ��������� �(� $���� � �&� ����� �.� ������ ;�D (�,15� �� ����� �� ������ ����� ���)� �� �''����)� ���� )���� � ��S)� �� � )�)�#��� ( + ���� ��� 42<D5CLK52L� 1226

*67 �% ���$ �� �� .�� �I%$H�� I: (HJ��.(��.(J� &�$��.I�I�N