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第一章!发酵工程概述

第一节!发酵工程的概念

一!发酵的概念

发酵!!"#$"%&’&()%"最初来自拉丁语#发泡$!!"#*"#""这个词%是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生+,-的现象&巴斯德研究了酒精发酵的生理意义%认为发酵是酵母在无氧条件下的呼吸过程%是#生物获得能量的一种形式$&也就是说%发酵是在厌氧条件下%糖在酵母菌等生物细胞的作用下进行分解代谢%向菌体提供能量%从而得到产物酒精和+,- 的过程&对生物化学家来说%关于发酵的定义是指微生物在无氧条件下分解代谢有机物质释放能量的过程&然而%发酵对不同的对象具有不同意义%发酵形式多样化%新的发酵产品不断涌现%除有机酸外%出现了氨基酸’抗生素’核苷酸’酶制剂’维生素’多糖’色素’生物农药’植物生长促进剂’免疫促进剂’单细胞蛋白’生物碱等发酵&而生物学家把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵&

二!发酵工程的概念

发酵工程!!"#$"%&’&()%"%.(%""#(%."是利用微生物特定性状和功能%通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系%是将传统发酵与现代的/01重组’细胞融合’分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术&也可以说是渗透有工程学的微生物学%是发酵技术工程化的发展&由于主要利用的是微生物发酵过程来生产产品%因此也可称为微生物工程&

发酵工程基本上可分为发酵和提取两大部分&发酵部分是微生物反应过程%提取部分也称为后处理或下游加工过程&虽然发酵工程的生产是以发酵为主%发酵的好坏是整个生产的关键%但后处理在发酵生产中也占有很重要的地位&往往有这样的情况(发酵产率很高%但因为后处理操作和设备选用不当而大大降低了总得率%所以发酵过程的完成并不等于工作的结束&完整的发酵工程应该包括从投入原料到获得最终产品的整个过程&发酵工程就是要研究和解决整个过程的工艺

和设备问题%将实验室和中试成果迅速扩大到工业化生产中去&现代发酵工程是以天然生物体和人工修饰的生物体为加工对象%集现代化高新技术为一体%生产产品或服务于人类社会的一种工程技术&

因此%发酵工程是发酵原理与工程学的结合%是研究由生物细胞!包括微生物’动植细胞"参与的工艺过程的原理和科学%是研究利用生物材料生产有用物质%服务于人类的一门综合性科学技术&生物材料包括来自于自然界的微生物’基因重组微生物’各种来源的动植物细胞&因此%发酵工程是生物工程的主要基础和支柱&

三!发酵工程的特点

!一"发酵工程主体微生物的特点发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工业&工

业微生物菌种是发酵工业的主体&能用于发酵生产的微生物即为工业微生物&发酵工程的菌种类型多种多样%但从工业化生产对菌种的要求来讲%发酵工业的菌种应具有如下特点(

!2"微生物种类繁多’繁殖速度快’代谢能力强&!-"微生物酶的种类很多%能催化各种生物化学反应&!3"微生物能够在廉价原料制成的培养基上迅速生长%并生成所需要的代谢产

物%产量高&!4"可以用简易的设备来生产多种多样的产品&!5"不受气候’季节等自然条件的限制&!6"根据代谢控制的要求%选择单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株

或野生菌株&!7"选育抗噬菌体能力强的菌株%使其不易感染噬菌体&!8"菌种纯%不易变异退化%以保证发酵生产和产品质量的稳定性&!9"菌种不是病原菌%不产生任何有害的生物活性物质和毒素!包括抗生素’激

素和毒素等"%以保证安全&

!二"发酵工程反应过程的特点发酵生产过程是利用生物体的生命活动来获取产品的%与化工生产过程相比%

发酵工程反应过程的特点如下(!2"发酵工业与其他工业相比%相对投资较少%见效快%具有经济和效能的统

一性&

- 发酵工程

!-"作为生物化学反应%通常是在温和的条件!如常温’常压’弱酸’弱碱等"下进行&

!3"原料来源广泛%通常以糖’淀粉等碳水化合物为主&!4"反应以生命体的自动调节方式进行%若干个反应过程能够像单一反应一

样%在单一反应器内很容易地进行&!5"发酵产品多数为小分子产品%但也能很容易地生产出复杂的高分子化合

物%如酶’核苷酸的生产等&!6"由于生命体特有的反应机制%能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位

的氧化’还原’官能团导入等反应&!7"生产发酵产物的微生物菌体本身也是发酵产物%富含维生素’蛋白质’酶等

有用物质&除特殊情况外%发酵液一般对生物体无害&!8"要特别注意在发酵生产操作中的杂菌污染%一旦发生杂菌污染%一般都会

遭受损失&!9"通过微生物菌种的改良%能够利用原有设备较大幅度地提高生产水平&

第二节!发酵工程的发展简史

远在有文字记载的历史以前%人类对发酵就已有所应用%但对其本质却长时间没有认识%而始终将它当作神秘莫测的东西&形成发酵工业只有近百年的历史%回顾整个发展进程%大致可以划分为以下4个主要阶段&

一!天然发酵阶段

此时期主要产品有各种饮料酒’酒精’酱’酱油’食醋’干酪’酸乳和酵母等&生产特点是手工作坊或家庭式生产%非纯种培养%凭经验传授技术%产品质量不稳定%产品为嫌气发酵产品&

远在4:::多年以前%我国古代人民在自己的实践中发现了发酵现象%并利用它来生产酒饮料和酿造食品%形成了发酵工程技术最早的产业)))酿造业&据我国龙山文化遗址的考证表明%当时民间已经掌握了酿酒技术%夏禹时代%酒的酿造已普遍流行于各地&*战国策+上有#仪狄作酒%禹饮而甘之%曰,后世必有以酒亡国者%遂疏仪狄而绝旨酒-$&在欧洲%有葡萄酒是神酿造的传说&在古希腊’古埃及都有酿造麦酒和葡萄酒的历史记载&

在3:::多年前的商代后期%人们发现发了霉的豆腐可以治外伤&在-5::年前!东周中期"就清楚疯狗的危害性而将其攻而杀之&在约2:::年前我国已开始

3第一章!发酵工程概述

用轻症天花病人的痘!人痘"对健康人进行接种以防传染%这种接痘方法后来传到国外%比2798年英国的琴纳!;<="%%"#"发明的牛痘接种约早了8::年&在约

35::年前的商代%就开始用人畜的粪便和秸秆’杂草沤制堆肥&约在-:::前的西汉后期就提倡采用豆粮隔年轮作的方法来提高粮食的产量!当时并不知道根瘤菌的存在及其固氮作用"等等&

在当时人们并不知道微生物与发酵的关系%对发酵的原因根本不清楚%只是依靠口传心授%一代代的传授着这种发酵的工艺&这一时期被称为自然发酵时期&因此在其后相当长的时期中传统发酵工艺并没有获得很大的突破&尽管如此%这些经验对后来的微生物学的发展及发酵工程的建立发挥了重要的作用&

268:年%荷兰博物学家安东.列文虎克!1%&>#?*’%@""A"%>)BC%263-)

27-3"发明了显微镜!放大倍数27:倍"%人类历史上第一次看到大量活的微生物&

29世纪中叶!2859年"%法国科学家路易.巴斯德!@)D(EF’E&"D#%28--)2895"用著名的F’E&"D#实验证明发酵原理%找到了葡萄酒和啤酒酸败的本质%发明了著名的低温杀菌法!G’E&"D#(H’&()%"&从而揭示了微生物和发酵之间的关系%这样人们对发酵的认识就发生了质的飞跃&

二!纯培养技术的建立

29世纪末到-:世纪3:年代%出现的发酵产品有嫌气的乳酸’酒精’面包酵母’丙酮I丁醇等/好气的柠檬酸’淀粉酶’蛋白酶等&该时期特点是表面培养%生产过程简单%对生产设备要求不高%生产规模不大&287-年%英国的布雷菲尔德!J#"!"KL"创建了霉菌纯培养技术%被称为近代细菌学之父&2882年%曾获得29:5年诺贝尔奖的德国利斯特.柯赫等!M)N"%O)B>%2843)292:"完成了细菌纯培养技术%被称为微生物纯培养技术的先驱&他利用明胶冷凝热熔的特性%制成了固体培养基%第一次分离得到了微生物纯种&2878年%丹麦的汉逊!P’%E"%"建立了啤酒酵母的纯培养方法&2897年%法国布赫纳!JDB>%"#%286:)2927"发现细胞萃取液仍有发酵现象%证明了任何生物都有引起产生发酵的物质)))酶的存在%导致了生物化学的出现&-:世纪初%人们用纯培养技术发现了梭菌能生产丙酮I丁醇&丙酮是制作炸药的原料%丁醇是重要的化工原料&第一次世界大战中%英国Q"(H$’%发明了丙酮I丁醇发酵%并实现工业化%服务于战争&第一次和第二次世界大战中%日本藤弁三郎发明了用砂糖发酵制取正丁醇%再通过化学反应生成异辛烷&

三!通气搅拌发酵技术的建立

通气搅拌发酵技术被称为发酵工程的第一次飞跃&29-8年%英国细菌学家弗

4 发酵工程

莱明发现了能抑制葡萄球菌生长的点青霉%其产物称为青霉素&这一发现在当时并没有引起人们的高度重视&到了-:世纪4:年代%第二次世界大战爆发%对抗感染药物的极大需求促使人们重新研究了青霉素&由于青霉素生产是需氧发酵%很容易受到杂菌污染%所以就借鉴了丙酮I丁醇发酵的经验%成功地建立起深层通气培养法和一整套培养技术%其中包括向发酵罐内通入大量的无菌空气’通过搅拌器将无菌空气打成气泡并均匀分布’培养基的灭菌和无菌接种等%使培养过程中的温度’GP值’通气量和营养物的供给等都得到了控制&这些技术为以后的微生物工业提供了新的概念和模式%成为当代微生物工业兴旺发达的开端&青霉素发酵从最初的表面培养发展成为深层培养%并不断改善培养条件&为了提高菌种的生产能力%同时开展了改良菌种的技术并获得很大成功&其间%青霉素的提取工艺也取得了迅速进展&经过半个世纪多的努力%目前青霉素的发酵水平’提取收率和质量有了大幅度的提高%从而推动了抗生素工业乃至整个发酵工业的快速发展%这是发酵工业的一个里程碑&2944年%瓦克斯曼发现了由链霉菌产生的链霉素%用于治疗结核杆菌引起的感染有特效&这个发现使人们对从土壤中寻找放线菌产生的新型抗生素充满了信心&此后陆续发现了抗革兰氏阴性’抗革兰氏阳性’抗病毒的广谱抗生素如氯霉素’金霉素和土霉素%抗真菌的制霉菌素%对青霉素耐药菌有一定疗效的红霉素以及抗肿瘤抗生素丝裂霉素+等&29-9)2959年的3:年间%从土壤中分离得到的能用于医疗的抗生素就有

3:多种&

四!现代发酵工程技术的发展

现代发酵工程时期是指利用现代分子生物技术即 /01重组技术所获得的#工程菌$’细胞融合所得的#杂交$细胞以及动植物细胞或固定化活细胞等%使发酵工业的范畴突破了利用天然微生物的传统发酵%逐步建立起新型的发酵体系%生产天然微生物或人体及其他动植物所不能产生或产量很少的特殊产物&这方面最重要的产品就是基因工程药品&所用的发酵设备是各种类型的新型生物反应器%甚至直接用转基因动植物作生物反应器&

2956年%日本木下祝郎发明了代谢控制发酵技术%使谷氨酸发酵生产实现产业化&代谢控制发酵技术是应用动态生物化学的知识和遗传学的理论选育微生物突变株%从/01分子水平上%控制生物的代谢途径%进行最合理的代谢%积累大量有用发酵产物的技术&295:)296:年%发酵工业两个显著进步(一是采用微生物进行甾体化合物的转化技术/二是以谷氨酸和赖氨酸发酵生产成功为契机的代谢控制发酵技术的出现&工业上微生物转化用于甾体化合物的脱氢’22I!I羟化’

5第一章!发酵工程概述

22I"I羟化’26I!I羟化’29I羟化等%反肉桂酸氨化生成苯丙氨酸%山梨醇氧化为山梨糖’山梨糖再转化为古龙酸!合成维生素+的中间体"等&

296:)297:年%许多氨基酸和核苷酸物质均可采用发酵法生产&同期%发现了石油微生物%开展发酵原料多样化的开发研究%出现发酵蛋白!单细胞蛋白"的研究和生产&发酵法生产单细胞蛋白是粮食工业化生产的最好捷径&297:年以来%特别是进入-:世纪8:年代以后%随着世界生物技术的发展%发酵技术有了突飞猛进的进步&如基因工程菌发酵’固定化!酶和细胞"技术应用’新型生物反应器的研究与设计’特殊环境微生物的研究’动物和植物细胞培养技术’传统发酵工业向综合生物技术工业发展和发酵工业清洁生产技术等&

第三节!发酵工程工艺流程及发酵类型

一!发酵工业工艺流程

发酵工业中%从原料到产品的生产过程非常复杂%包含了一系列相对独立的工序&一般来说发酵工业的生产过程主要包括以下环节(!发酵设备设计/"原料预处理/#培养基配制/$发酵设备和培养基灭菌/%微生物菌种制备和扩大培养/

&无菌空气的制备/’发酵/(发酵产品的分离和纯化/)发酵废弃物处理和资源化利用&这分别涉及一系列相关的设备和操作程序%它们共同组成了现代清洁生产的发酵工业过程&发酵工业工艺流程简图见图2I2&其中根据菌种’产品及设备等具体情况%有的发酵过程环节甚至更繁多&

图!"!!发酵工业工艺流程简图

6 发酵工程

二!微生物发酵主要类型

微生物发酵是一个错综复杂的过程%尤其是大规模工业发酵%要达到预定目标%需要采用和研究开发多种多样的发酵技术&其中发酵的方式就是最重要的发酵技术之一&通常按发酵中某一方面的情况%人为地进行分类&按获取能量的方式可分为好氧发酵和厌氧发酵&按发酵原料可分为糖质原料发酵和烃类原料!石油和天然气"发酵&按产物类型可分为初级代谢产物发酵和次级代谢产物发酵/或分为食品发酵’有机酸发酵’氨基酸发酵’维生素发酵’抗生素发酵’酵母培养&按发酵状态分有固态发酵’液态发酵’液体表面发酵’液体深层发酵&按菌种的种类分为单一纯种发酵和混合菌发酵&按发酵工艺类型分有分批发酵’连续发酵’流加补料发酵等&

目前我国和世界大多数国家发酵工厂都采用液体深层发酵&过去多采用单罐方式分批发酵%即在一个发酵罐内进行%发酵完毕即将产物进行提取&后来又发展为连续发酵’补料分批发酵等方式&液体深层发酵同固体发酵’表面培养等发酵相比有很多优点%主要为(!液体悬浮状态为很多微生物提供最适生长环境%菌体生长快%发酵产率高%发酵周期短/"在液体中%菌体’底物’产物以及发酵产生的热量易于扩散%使发酵可在均质或拟均质条件下进行%便于控制%易于扩大生产规模/

#厂房面积小%生产效率高%易进行计算机等自动化控制%产品质量稳定/$产品易于提取’精制等&因而它在现代发酵工业中被广泛应用&但液体深层发酵尚存在消耗能源多’设备复杂’需要较大的投资’有废物!液"排放等缺点%仍需不断改进&

在微生物发酵工业生产中%各种发酵方式往往是结合进行的%选择哪些方式组合起来进行发酵%取决于菌种和原料特性’设备状况’技术可行性’成本核算等方面&现代发酵工业大多数主流发酵方式采用的是好氧’液体’深层’分批’游离’单一纯种发酵方式结合进行的&这种组合发酵工艺的优越性有(

!2"好氧单一纯种微生物产生单一产品%是现代发酵工业的主流%而此发酵方式的结合是目前应用最多和最好的发酵方式%对大多数发酵工业是最佳的选择&

!-"液体悬浮状态是很多微生物的最适宜的生长环境%菌体’营养物’产物’热量容易扩散和均质%使产品较易达到高产’优质%发酵中液体输送方便%检测’控制和操作也容易实现自动化&

!3"深层’游离状态扩大了菌种与发酵基质的接触面%增加了发酵反应的效率%加快了反应周期&

!4"分批发酵对生物反应器中的发酵是间歇式操作%其主要特征是所有工艺变量都随时间而变%工艺变量主要是菌体’营养物’GP值’热量’产物的变更%变化的

7第一章!发酵工程概述

规律性强%比较容易控制逐级放大和扩大生产规模&!5"分批单一纯种的发酵%不易污染%菌种较容易复壮和改良&这些优势不是

绝对的%也不是对所有微生物都适用%对某一菌种来说%也可能变更其中一种或几种发酵方式%发酵效果会更好%效果更佳%效益也更好%因此%应积极研究与开发应用其他更多更好的发酵方式用于发酵工程&

第四节!发酵工程产品类型及发展趋势

一!发酵工程产品类型

发酵工程是生物工程中应用最广泛的&它是利用生物细胞的生长及其代谢活动生产各种有用物质的现代工业&随着基因工程和细胞工程等现代生物技术的发展和结合%人们通过细胞水平和分子水平改良或创建微生物新的菌种%使发酵工程的发酵水平大幅度提高%发酵产品的种类和范围不断增加%其中包括许多动’植物细胞产品&发酵工程产品类型常见约有下列6种&

!一"微生物菌体细胞如酵母菌’食用菌’微生物农药的生产&

!二"微生物酶类如各种酶种’酶制剂和各种曲类的生产&

!三"微生物代谢产物如初级代谢产物氨基酸’有机酸’有机溶剂’核苷酸’蛋白质’核酸和维生素等%

次级代谢产物抗生素’生物碱和植物激素的生产等&

!四"微生物的转化产物利用微生物代谢过程中的某一种酶或酶系将一种化合物转化成含有特殊功能

基团产物的生物化学反应&如将甘油转化为二羟基丙酮%将葡萄糖转化为葡萄糖酸%将山梨醇转化为!I山梨糖等&特别是甾体激素的转化受到了广泛的重视&

!五"工程菌发酵产物

-:世纪7:年代兴起的基因工程和细胞工程%取得了飞跃的发展&通过基因

8 发酵工程

工程和细胞工程创造出许许多多的具有特殊功能的#工程菌$%用发酵技术可以生产出更多更好的产品%发挥更大的经济效益&

!六"动物#植物细胞大规模培养的产物如利用木瓜细胞大规模培养生产木瓜蛋白酶%利用植物细胞培养技术生产天

然食用色素等&

二!发酵工程的应用领域

人类利用微生物生产各种产品已有数千年的历史&最初%微生物的应用仅限于食品与酿酒发酵&随着近代微生物工程或发酵工程的发展%应用领域逐渐扩展到环境保护’化工’能源’医药’轻工’农业及冶金等诸多行业&

!一"环境保护领域人类对环境资源的过度利用%严重地破坏了地球的生态环境%如何处理’分解

已经存在并继续产生的垃圾和存在于大气’土壤’水体中的有毒物质%是人类面临的严峻挑战&利用发酵工程治理环境污染%具有效率高’成本低’不存在二次污染等特点%受到了人们的广泛关注&特别是生物垃圾又是制造许多有重要经济价值产品的原料%在当今世界人口膨胀’食品和能源资源不足的情况下%对资源的充分再利用就显得意义更加重大&

利用微生物可以消除废水’废气’废渣对环境的污染&对有毒废弃物的微生物处理技术主要包括厌氧发酵法和需氧发酵法&前者利用专性厌氧微生物%如梭菌’拟杆菌和丁酸弧菌等/兼性厌氧菌%如大肠埃希氏菌!大肠杆菌"’芽孢杆菌等用于沼气’肥料和饲料的发酵&后者还可以在有氧条件下%利用某些产生菌胶的细菌和某些原虫的混合物处理工业和生活污水及废气&此外%发酵工程技术可防治环境污染%用微生物从矿山取宝%利用基因工程菌进行固氮等都是发酵工程的用武之地&

!二"化工产品和新能源开发领域利用微生物可以生产乙醇’甘油’丙酮丁醇等化工原料和一些表面活性剂%还

可以生产乙酸!醋酸"’乳酸’丁酸’苹果酸及水杨酸等有机酸和右旋糖苷等多糖&现在%生物化工已被列为国家化工领域发展的重点%特别是发展有绿色能源之首的生物质能%一是气态生物能如沼气’氢气等%研制具有广泛应用潜力的新型燃料电池/二是利用农业废弃物生产液态生物能%如甲醇’乙醇等/利用微生物和发酵产品

9第一章!发酵工程概述

提高石油开采率&这样既可以开发无污染的新能源%又可保护生态环境&我国在利用废弃有机物发酵生产沼气方面做出了重大贡献%一些发展中国家把我国誉为#沼气之乡$&据有关部门统计%全国有大型沼气池2:::多座%发酵总容积超过

3:万$3%年产沼气逾2:亿$3&乙醇纳入能源系统是最理想的再生洁净能源%实验证明%用乙醇作燃料%可使二氧化碳的排放量减少9:R%有助于减轻温室效应&在我国%每年有5亿*6亿&农作物秸秆%可利用它制取-亿*3亿&乙醇%潜力非常大&据报道%基因工程用于乙醇生产取得了重大突破%将运动发酵单胞菌的关键酶基因同时转入大肠杆菌中%可实现糖化和发酵同时进行的目的&

能源和环境是可持续发展的重要主题%在可再生和洁净的氢能中%生物物质制氢’储氢具有广阔前景/经基因改良的油料作物%可以生产重要的化工原料&此外%重组微生物的生物降解污染物技术将成为环保的支柱性产业%现已发现多种微生物对土壤’水和空气中的多种污染物具有生物降解作用&

在精细化工产品的生产过程中%由于生物催化过程简单’成本低’效益高%使生物技术成为该领域的一支主力军%为化工企业带来了丰厚的经济效益&发酵生产过程在常温常压下进行%既省能源也省资源%而且低公害&发酵法生产的丙烯酰胺可做絮凝剂’土壤调节剂的配料’纸浆胶料等&还可用发酵法生产各种香料’长链脂肪酸等&

!三"农业生产领域由于/01重组技术打破了生物物种间远缘杂交的不亲和性%使其应用范围

更加广泛&在农业上除直接用于改造植物基因%以获得高产’稳产’优良转基因农作物外%还用于构建抗病虫害农作物及用于防治农作物病虫害的微生物%进行生物防治&在生物防治中%已知苏云金杆菌J&杀虫剂可杀死25:多种鳞翅目毛虫%广泛用于谷物’果树’蔬菜’玉米’烟草及森林多种植物的虫害防治中&近年来%科学家对其/01进行重组%再转化到假单胞菌体细胞内%实现了高效表达基因工程菌经发酵培养后使菌体灭活%作为杀虫剂获得成功&

近年来%我国科研人员已将水稻’大麦’小麦’棉花’大豆’番茄’白莲和青椒等

3:余种植物种子通过搭载式卫星或高空气球进行了太空育种%取得了理想的效果&一些微生物经太空育种处理后也获得了新的进展%据报道%一种金针菇经返回式卫星搭载后%比对照菌提前7*2:L出菇%增产25R&黑曲霉S2:2经太空旅行经历25L后%产生较大变异%选育出糖化酶活力比对照高-:R*3:R的变异株%这样可大幅度提高黑曲霉的糖化酶活力&实验结果证明%该菌生长速度加快%产酶旺盛期比对照提前2-*-4>&空间农业和空间育种技术尽管处于起步探索阶段%但

:2 发酵工程

是已经展现出其未来的发展前景%该项目的发展将会成为未来农业生产实现新飞跃的巨大动力&培育优质’高产’高效及多抗的农作物新品种是我国农业可持续发展的关键&菌种选育在提高作物产量’增加品种’改善栽培条件和遗传学研究方面发挥了重大作用&

利用发酵工程生产出来的抗生素在农业中有广泛的用途&由于抗生素具有内吸杀菌的特点&所以当抗生素用于防治植物病虫害时%使防病方法从体外保护进入内吸治疗%是植物病理学的一大发展&如灰黄霉素’放线菌酮等许多抗生素%能防治植物的真菌病和细菌病%其中大多属于内吸杀菌剂&目前%用抗生素防治水稻病害%如稻瘟病’纹枯病和白叶枯病等方面取得了很大成绩&用灭瘟素防治稻瘟病以替代汞’砷等化学农药%用春雷霉素’庆丰霉素防治稻瘟病%用有效霉素防治水稻纹枯病%用灭胞素防治水稻白叶枯病等&抗生素比有机合成农药喷洒浓度低而疗效高%并且容易被土壤微生物分解%不致污染环境%对食物的污染危险小%不会在人体内积累%很有发展前途&

!四"药品开发领域发酵工程可以从各方面改进医药的生产%开发新的产品%提高人类的医疗水

平&所以%在医药卫生领域%发酵工程应用最广泛%发展最迅速%潜力最大&现已从自然界中发现和分离了43::多种抗生素%并通过化学结构改造%共制备了3:::余种半合成抗生素&目前世界各国实际生产和应用于医疗的抗生素有2-:多种%连同各种半合成抗生素衍生物及盐类约35:种&其中包括抗细菌的抗生素%有杆菌肽’头孢菌素’四环素’链霉素’麦迪霉素和螺旋霉素等/抗真菌的抗生素%有灰黄霉素’制霉菌素等/抗肿瘤抗生素%有博来霉素’丝裂霉素和光神霉素等&此外%还有氨基酸’维生素和干扰素等产品&

维生素是六大生命要素之一%为整个生命活动所必需&维生素 1具有抗#三

+$保健功能之称%即抗癌’抗心血管疾病和抗白内障&维生素+和维生素;均系抗氧化剂&维生素+可阻止’破坏自由基形成%还具有激活免疫系统细胞的活力%刺激机体产生干扰素以抵御外来侵染因子等作用(维生素;可产生抗体增强机体免疫力%长期服用维生素;有益于抗衰老和防治前列腺癌及痴呆症等&作为维生素1的前体物质"I胡萝卜素以及维生素+和维生素;都可以通过微生物发酵获得&维生素+的发酵采用大小菌混合培养的方法实现了维生素+二步发酵生产的目标&为了进一步提高维生素+的产率%应用细胞固定化技术大大提高了维生素+的收率%最高可达到8:R以上%而且发酵周期缩短了203&据报道%我国一家公司引进一种基因工程菌生产维生素J%已形成工业化生产%生产规模由年产2-:&

22第一章!发酵工程概述

提高到4::&%生产成本降低4-<8R%发酵周期缩短了一半%发酵单位成倍增长%效价为8:::$.0$@以上&

甾体激素类药物对人体起着非常重要的调节作用&甾体激素可分为肾上腺皮质激素’性激素和蛋白同化激素三大类&这些天然的甾体激素%有的可以进行人工合成%有的可利用微生物学或其他方法对已有的化合物进行结构改造而获得生物活性更强的新化合物供临床使用&微生物转化甾体化合物的反应类型%至今已发现的有氧化反应’还原反应’水解反应’酯化反应’异构化反应’卤化反应和1环开环反应等&

在中药现代化中%发酵工程也取得了很大的进展%如用植物细胞反应器工厂化生产紫杉醇’银杏内酯’高蒿素’紫草宁和麻黄素等&用动物细胞反应器还可以生产单克隆抗体’干扰素’生长激素’生长因子和酶等药物&

!五"食品工业领域食品工业是世界上最大的工业之一%也是微生物技术最先开发应用的领域&

例如以糖类物质为主要原料酿造葡萄酒’白酒’黄酒和啤酒%以牛奶为原料生产奶酒’奶酪’酸奶等发酵乳制品%以淀粉类物质为主要原料生产谷氨酸’赖氨酸等%以豆类和谷物为原料生产酱油’醋’腐乳和泡菜等%以及用各种原料生产单细胞蛋白等&

近年来%发酵工程应用于食品生产和开发%促进了食品工业的飞速发展%主要体现在4个方面(一是对食品资源的改造与改良/二是将农副原材料加工成商品%如酒类’调味品等发酵产品/三是对产品进行二次开发%形成新的产品%如许多食品添加剂等/四是对传统食品加工工艺进行改造%降低能耗%提高产率%改善食品品质等&

酒类生产是发酵工程中利用微生物获得最早的产品之一%目前市场上供饮用的酒可分为酿造酒’蒸馏酒和配制酒三类&其中%蒸馏酒是指利用谷类’糖类等原料%经过酵母菌发酵后%蒸馏得到无色’透明的液体%再经陈酿’调制成透明的酒精含量大于3:R!体积分数"的酒精型饮料&我国的白酒是世界六大蒸馏酒之一%产品种类繁多%质量独具风格%深受消费者的喜爱和国际市场的好评&

柠檬酸主要存在于柠檬’柑橘等果实中%它是食品’医药’化工等领域应用最广泛的有机酸之一&柠檬酸的发酵已经实现了深层发酵的大规模生产%就目前市场占有率而言%它占酸味剂市场的7:R左右%我国产量居世界首位&

氨基酸是构成蛋白质的基本单位%是人体及动物的重要营养物质&氨基酸的制造是从28-:年水解蛋白质开始的%2956年用微生物直接发酵糖类生产谷氨酸

-2 发酵工程

研究成功%2964年我国利用发酵法生产谷氨酸进行大规模生产&发酵法生产谷氨酸被认为是现代发酵工业的重大突破%是氨基酸生产方法的重大革新&该成就大大推动了其他氨基酸发酵研究和生产的发展%形成了用发酵法制造氨基酸的新型发酵工业&目前%我国利用发酵法生产的谷氨酸钠!味精"产量居世界首位%赖氨酸的产量也居世界前列&

乳酸是食品工业的重要酸味剂’防腐剂%将乳酸制成饮料%可用于降低血压&中国乳酸发酵产业发展较快%年产量已达3万*4万&&近年来%日本大力发展乳酸菌发酵乳酸工业%并以此为原料生产可降解生物塑料%用于手术缝线’人造骨和人造皮肤等&

三!发酵工程的发展趋势

现代发酵工程技术是基因工程’酶工程’细胞工程技术等实现产业化的桥梁%具有巨大的发展空间&在生物技术与现代化工程技术相结合的基础上发展起来的新型工程技术%不仅为传统发酵工业’传统医药工业的改造及新型的生物技术工业提供了高效的生物反应器’新型分离技术和介质以及现代的工程装备技术%还提供了生产设备单元化’工艺过程最优化’在线控制自动化’系统综合设计等工程概念与技术以及用于生物过程优化控制的基础理论&生物化工技术在生物技术产业化方面起着重要作用%使生物技术的应用范围更加广泛&微生物在高新技术研究中%发挥了极重要的作用%如为基因工程的研究提供的质粒’黏粒和病毒载体及限制性内切核酸酶/连接酶’磷酸酶’磷酸激酶%以及医学诊断和发酵过程检测用的生物传感器和用于微电子中的生物芯片等&

发酵工程技术近年重点发展的是(!采用基因工程’细胞工程等先进技术%选育菌种%大幅度提高菌种的生产能力&"深入研究发酵过程%如过程中的生物学行为’化学反应’物质变化’发酵动力学’发酵传递力学等%以探索选用菌种的最适生产环境和有效的调控措施&#设计合适于合成产物的反应器和分离技术&$为了提高生产能力%将发酵工程与细胞固定化技术相结合%将发酵工程与酶工程相结合%会起到更加有效的催化作用&%将发酵与提取相耦合是当今的一个热门课题&

&发酵工艺的改进在发酵中的潜力仍不可忽视&发酵工程的下游加工由多种化工单元操作组成&由于生物产品品种多%性质

各异%故用到的单元操作很多%如沉淀’萃取’吸附’干燥’蒸馏’蒸发和结晶等传统的单元操作%以及新近发展起来的单元操作%如细胞破碎’膜过滤技术和色层分离等&一些新技术’新工艺’新材料’新设备的使用%大大提高了生物技术产品的产量和质量&

32第一章!发酵工程概述

代谢调控技术’连续发酵技术’高密度发酵技术’固定化增殖细胞技术’反应器技术’发酵与分离耦联技术’在线检测技术’自控和计算机控制技术’产物的分离纯化技术的发展%以及工艺’设备和工程等研究的进步%使发酵工程达到了一个新的高度&

生物工程的迅速发展提供了多种生物细胞%而这些生物细胞必须通过发酵才能获得商业化的产品&因此%发酵工程是实现产业化及加快研究成果转化为现实生产力’获得经济效益的必不可少的手段&生物技术的产生和发展涉及许多学科%随着遗传学’微生物学’细胞生物学’动物学’植物学’生物化学’分子生物学’化学与化学工程学’量子生物学’应用物理学’电子学及计算机科学等基础和应用学科及技术的发展%发酵工程必将发生新的变化并为人类创造出更大的经济效益&

思 考 题

2<何为发酵及发酵工程1

-<发酵工业有何特点1

3<简介发酵工业发展的历史进程’重要历史阶段和人物&

4<简述微生物工业发酵基本过程和主要环节&

5<简述发酵工程的主要类型&

6<什么是分批发酵和补料分批发酵1 分析两种发酵方式各有什么优缺点1

7<简述发酵工程的应用领域和主要产品类型&

8<试述发酵工程的发展趋势&

42 发酵工程

第二章!发酵设备

利用生物催化剂进行反应的生物技术过程%发酵设备在整个过程中%具有中心纽带的作用%是实现生物技术产品产业化的关键设备%是连接原料和产物的桥梁&在发酵设备内%生物催化剂!酶或细胞"作用于底物或基质合成细胞或产物%将廉价的原料升值为生化产品&

在生物反应过程中%若采用活细胞!包括微生物’动物或植物细胞"为生物催化剂%称为发酵过程或细胞培养过程&采用游离或固定化酶%称为酶反应过程&相应的设备也分为发酵罐’动植物细胞反应器和酶反应器&细胞反应器中的生物反应通过细胞中精确调控的酶系进行催化%所以比较复杂%经过一系列的生物反应将培养基的成分转化为新细胞或各种代谢产物&生物反应器的设计和操作%是生物工程中非常重要的工程问题%对产品的成本和质量有很大影响&微生物细胞反应过程%即发酵过程%以微生物的生命活动来获取各种产品%因此%发酵罐也围绕微生物的生命代谢活动展开&这就要求细胞生物反应器必须能保证生物体的生长特性和要求%满足生物体的不同生长阶段对温度’溶解氧’GP值’渗透压等的不同要求%同时考虑生物体可能受到的剪应力影响%还要求在运行中达到无菌的要求&

第一节!通风发酵设备

通风发酵设备是微生物发酵工业中主要的一类反应器&它有机械搅拌式’气升式’鼓泡式’自吸式等多种类型&

一!机械搅拌式发酵罐

!一"发酵罐的结构机械搅拌式发酵罐也称标准式或通用式发酵罐%是当前世界各国大多数发酵

工厂所采用的液体深层发酵的主要设备%其结构基本相同&罐身为立式圆筒形%有椭圆形底盖%圆筒高与直径之比为!-<5*3"T2%其容积为-:@*-::$3%有的可达

5::$3&为使通入的空气与培养基密切混合%还装有机械搅拌装置&搅拌器有弯

叶’箭叶’平叶涡轮式等多种&从搅拌程度来说%以平叶涡轮式最为激烈%功率消耗最大%弯叶式次之%箭叶式更次之&搅拌器的叶轮一般为6个&为了提高通气效果%发酵罐中装有挡板%如用竖型冷却蛇形管代替挡板也可以&

发酵罐设有夹套或蛇管作为灭菌时加热和发酵冷却时用&5$3 以下发酵罐一般用夹套传热/在大型发酵罐中%一般采用水平或垂直的蛇管&夹套结构简单%但从热交换速度来看%蛇管比夹套更有效&动’植物细胞培养不带挡板%转速

8*-:#0$(%%3片叶轮&由于发酵罐是密闭的容器%而微生物的生长繁殖代谢活动需要不断地消耗

氧%要求不断地供给新鲜空气以满足微生物生命活动的需要%因此发酵罐里有通气管&为保证通气效果%常在通气管末端装一个单管式或环形管式的空气分布器%它一般装在最低一挡搅拌器的下面’距罐底4:$$的地方%喷嘴向下以利于罐底部分液体的搅动%使固形物不易沉积于罐底&空气由分布管喷出%上升时被转动的搅拌桨打碎成小气泡并与液体混合和分散%因而加强了气I液接触的效果&

微生物在代谢活动中%分泌出一些大分子的并带有一定黏度的物质&这些物质在通风搅拌的情况下容易形成泡沫%如不及时除去会充满整个发酵罐%从排气管溢出%影响通风效果%也会造成污染&为避免泡沫产生%一般在培养基里加进消泡剂&在发酵过程中如泡沫过多%也需要加一定的消泡剂&此外%也可用消泡桨打破泡沫或装一个超声波发生器%利用超声波进行消泡&目前实际应用中是消泡剂与消泡装置同时使用&

发酵罐的机械搅拌器是由电动机经过皮带或齿轮减速后带动旋转的&它可装在顶部或底部&电机是发酵罐搅拌器的动力部分&根据培养基浓度’黏度’搅拌器的层数与直径来选择一定功率的电动机&功率太大%动力消耗太多%功率太小则带不动%因此一定要选择合适的电动机&小型发酵罐可以不用轴承/大型发酵罐除下端有底轴承支撑外%还有中间轴承%这样轴才不会晃动&为使设备运转安全%应有密封&密封装置有填料匣与端面轴封两种&

除以上结构外%发酵罐还附加有补料罐’酸碱罐’压力表’人孔及视镜等&图

-I2和图-I-分别为小型和大型标准式发酵的结构&

!二"发酵罐的几何尺寸标准式发酵罐是既有机械搅拌%又有压缩空气分布装置的发酵罐%其几何尺寸

及操作条件如图-I3和表-I2所示&

62 发酵工程

2<三角皮带转轴/-<轴承支架/3<联轴节/4<轴承/5%-6<窥镜/6%-3<取样口/7<冷却水出口/8<夹套/9<螺旋片/2:<温度计接口/22<轴/2-<搅拌器/23<底轴承/24<放料口/25<冷水进口/26<通风管/27<热电偶接口/28<挡板/29<接压力表/-:%-7<人孔/-2<电动机/

--<排气口/-4<进料口/-5<压力表接口/-8<补料口

图#"!!小型标准式发酵罐!参考曹军卫等<微生物工程<-::-"

二!机械搅拌自吸式发酵罐

这是一种不需要空气压缩机%而在搅拌过程中自行收入空气的发酵罐%如图

-I4所示&该发酵罐的关键部件是带有中央吸气口的搅拌器&目前国内采用的带有固定导轮的三棱空心叶轮的搅拌器%其直径!""为罐径!#"的203%叶轮上下各有一块三棱形平板%在旋转方向的前侧夹有叶片&当搅拌器叶轮旋转时叶片不断排开周围的液体或被甩出而使背侧形成真空%使导气管吸入罐外空气&吸入的空气与发酵液完全混合后在叶轮末端排出%并立即通过导轮向罐壁分散%经挡板折流涌向液面而均匀分布&

机械搅拌自吸式发酵罐的主要优点是%节约空气净化系统中的空气压缩机’冷却器’油水分离器’空气贮罐’总过滤器等设备!减少发酵设备3:R左右"%减少厂房占地面积/设备便于自动化’连续化%降低劳动强度%设备结构简单/由于空气靠反应液高速流动而形成的真空自行吸入%气I液接触良好%气泡分散较细%因而溶氧

72第二章!发酵设备

2<轴封/-%-:<人孔/3<梯子/4<联轴器/5<中间轴承/6<热电偶接口/7<搅拌器/8<通风管/9<放料口/2:<底轴承/22<温度计接口/2-<冷却管/23<轴/24%29<取样口/25<轴承柱/26<三角皮带转轴/27<电动机/28<接压力表接口/-2<进料口/-3<排气口/-4<回流口/-8<补料口/-5<窥镜

图#"#!大型标准式发酵罐!参考曹军卫等<微生物工程<-::-"

表#"!!标准式发酵罐的几何尺寸与操作条件

几何尺寸与操作条件 典型数值奥地利某公司

!-::$3"美国某公司

!23:$3"日本某公司

!5:$3"中国某厂

!2::$3"

$0#U2<7*4 3 2<83 2<8 -<94"0#U20-*204 :<338 ) :<34 :<-86%0#U208*202- 203 :<2:&0#U:<8*2<: 202: 2<: ) "2<: )搅拌转数

’U3:*2:::!#0$(%"9:*23: 7:*23: 245 25:

单位液体积的冷却面积

:<6*2<50!$-0$3"2<5 2<24

搅拌器层数 4层 4层 -层 3层通气量:<2*:<40**$ :<5 :<3*2<: :<6 :<5 :<-空气线速度

:<:--0!$0$(%"2<75

82 发酵工程

!!续表-I2

几何尺寸与操作条件 典型数值奥地利某公司!-::$3"

美国某公司!23:$3"

日本某公司!5:$3"

中国某厂!2::$3"

单位体积功耗

2*40!CQ0$3"-<5*3 4*5<4 3 2<3

装料系数#U7:R*8:R - 77 75 88 75电机功率0CQ 3:: 23:: 25: 23:

注(**$是每分钟单位反应器总体积的空气体积&

系数较高&其缺点是%进罐空气处于负压%因而增加了染菌机会/由于搅拌转数较高%有可能使菌丝被搅拌器切断%使正常生长受到影响&所以在抗生素发酵中很少采用%但在食醋发酵’酵母菌培养’生化曝气等方面已有成功的实例&

$<发酵罐筒身高度/#<发酵罐内径/"<搅拌排管器内径/%<挡板的厚度/&<下搅拌桨距底部的间距/(<两搅拌

桨的间距/$@<液位高度

图#"$!标准式发酵罐的几何尺寸

三!气升式发酵罐

机械搅拌发酵罐结构比较复杂%动力消耗大%而气升式发酵罐可克服上述缺点&这种发酵罐的特点是结构简单%冷却面积小%无搅拌传动装置%节省动力约5:R%料液可充满达8:R*9:R%不需加消泡剂%维修操作及清洗简便%杂菌污染少%操作时无噪声&但它不能替代好气量较小的发酵罐%对于黏度较大的发酵液溶氧系数亦较低&气升式发酵罐有多种型式%较典型的有内环流式和外环流式两种%如图-I5所示&其工作原理为空气在喷口以-5:*3::$0E的高速度喷入环流管&由于喷射作用%气泡被分散于液体中&上升管内的反应液密度较小%加上压缩空气的动能使液体上升%罐内培养液中的溶解氧由于菌体代谢而逐渐减少%在上升管上部平流口%气液分离%并随着发酵液中的溶氧的不断消耗%发酵液的比重增大%而从回流管下降到下平流管%进入下一个环流&当其通过环流管时由于气I液接触而被重新饱和&罐内发酵液在环流管内循环一次所需的时间称循环周期时间%发酵液的通风量与环流量之比称为气液比&发酵液在环流管内的流速称为环流速度%环流速度取值范围一般为2<-*2<4$0E&

92第二章!发酵设备

2<马达/-<联轴器/3<双端面轴封/4<轴/5<定子/6<冷却排管/7<消沫器/8<排气管/9<皮带轮/2:<空气进口/22<端面轴封/2-<自顺转子

图#"%!自吸式发酵罐!参考曹军卫等<微生物工程<-::-"

!’"内循环空气带升式发酵罐/!N"外循环空气带升式发酵罐)2%)-*压力表/#2*发酵罐内径/#-*环流管到发酵罐的距离/$*发酵液高度/+*环流量高度

图#"&!空气带升环流式发酵罐!参考曹军卫等<微生物工程<-::-"

:- 发酵工程

喷嘴前后压差和发酵罐罐压与环流量有一定关系&当喷嘴直径一定%发酵液柱高度也不变时%压差越大%通风量越大%相当于增加了液体的循环量&环流管高度对环流效率也有影响&实验表明%环流管高度应为4$%罐内液面不能低于环流管出口%也不可高于2<5$%因过高的液面高度可能产生#环流短路$现象&

目前气升式发酵罐也已成功地应用于有机酸!柠檬酸’衣康酸等"’酵母菌及氨基酸’多糖等的工业生产中&

四!通风固体发酵设备

固体发酵设备多用于酱油生产和酿酒%现在也用于农副产品生产微生物饲料&该设备具有设备简单’投资省’无污染’无废物生产等优点&

!一"自然通风发酵设备自然通风发酵设备要求空气与固体曲料密切接触%以供给空气和带走合

成代谢产生的热量&多采用木制浅盘%现多用不锈钢制作%尺寸根据需要确定%常用尺寸:<37$V:<54$V:<:6$或2$V2$V:<6$%底部和侧面打孔%放在架子上%架子一般分为数层%每层:<25*:<-5$%底层距地面约

:<5$&设备放在通风’保湿’排潮的曲房中%曲房的大小以一批曲料用一个曲房%便于管理&

!二"机械通风固体发酵设备机械通风固体发酵设备%采用鼓风机强化发酵系统的通风%曲层厚度大大增

加%制曲效率提高%同时便于控制曲层的温度%提高成品质量&

2<机械通风固体发酵设备如图-I6所示%曲料室多采用长方形水泥池%宽约-$%深2$%长度根据生产

场地及产量等选取%但不宜过长%以保持通风均匀/曲室底部高出地面%便于排水%池底有8W*2:W的倾角%使通风均匀/池底上有一层筛板%发酵固体曲料放在筛板上%料层厚度:<3*:<5$&曲料室的较低端与风道相连%其间设一风量调节闸门&曲池通风常采用单向操作%为充分利用冷量和热量%一般把离开曲层的部分空气经循环风道回到空调室%另吸入新鲜空气&空气通道的风速为2:*25$0E&因通风过程的阻力损失较低%可选用效率较高的离心式风机%通常选用风压2:::*3:::F’的中压风机较好&

2-第二章!发酵设备

2%7<输送带/-<料斗/3<曲料室/4<进出料机/5<循环风道/6<送料小车/8<空调室/9<鼓风机

图#"’!机械通风固体曲发酵设备!参考李艳等<发酵工程原理与技术<-::8"

-<机械通风发酵设备如图-I7所示%双层旋转式固体曲发酵设备%可实现自动化控制&我国采用单

层旋转制曲设备比较多&另外还有采用卧式固体发酵罐&罐内壁装有冷却装置%罐体可整体旋转%两例支撑轴为空心%设有空气进出口&根据报道3$3 以下卧式固体发酵罐已有工厂采用&

2<空气调节机/-<操作台/3<泵/4<旋转料床/5<送料机/6<下层培养室/7<破料机/8<旋转出料器/9<上层培养室

图#"(!双层旋转式固体曲发酵设备!参考梁世中<生物工程设备<-::3"

3<多功能浅盘式发酵图-I8所示的是用于生产米曲的多功能浅盘式发酵罐%此发酵罐中所有操作

均在培养容器内进行%包括基质的蒸汽灭菌’气体接种’用双流喷嘴!空气和水"提供补充基质水分%鼓风机进行强制通风’进行供氧与散热等&

-- 发酵工程

2<气孔/-<安全阀/3%7%2:<空气/4<水/5<鼓风机/6<电动机/8<蒸汽/9<浅盘

图#")!用于生产米曲的多功能浅盘式发酵罐!参考吴振强等<固态发酵技术与应用<-::6"

为了减少人工操作强度%人们又开发了连续的浅盘发酵罐系统&这种系统从接种培养物的制备’灭菌’冷却’接种’充填’干燥’粉碎和打包等操作全部连续完成&近来%在日本一些生产米酒的工厂里%人们已经开始利用电脑控制的机器人来完成这些操作&

4<箱式发酵装置箱式发酵装置有几种类型%它包括敞开固定箱式’密闭固定箱式’移动箱式和

多层箱式等&多层箱式发酵装置!图-I9"采用立式分组结构%每一箱体组由若干只!一般为4只"可活动的箱体组成&箱体规格-$V-$%箱体分成盛料的料床和通风槽两部分%组成一个可搬动的整体&箱体组和物料进出设备均重叠在一个方位上%一般出入料设备放在箱体组之下&装置的另一立面为吊梯!电梯"%翻料和出入料时可将箱体的料床自动搬移至电梯中%进行翻料或送到指定的位置&多层箱式发酵装置充分利用空间%节省发酵车间面积%在某些厂家有一定的应用价值&但该装置投资大%操作不便%监测困难&

5<转鼓式固态发酵罐图-I2:所示的是一个转鼓式发酵罐&培养过程中通过转鼓间歇转动来搅拌

和混合基质&由于转鼓转动与通气是同时进行的%因而促进了基质与新鲜空气接触%有利于热量的快速排除和氧供应&空气是循环的%在气路中装备增湿器!L’$G"#"对气流进行调节&

3-第二章!发酵设备

2<排气口/-<风量分布口/3<进冷风管/4<风机/5<回风道/6<料箱/7<料翻机构/8<搬运机构/9<出料螺旋/2:<支承架/22<输送机

图#"*!多层箱式发酵装置示意图!参考吴振强等<固态发酵技术与应用<-::6"

2%8%25<水/-<空气调节器/3%23%27<空气/4<变速箱/5<空气0水喷嘴/6%28<喷嘴/7<水箱/9<温度传感器/2:<不锈钢丝网盖/22<控制板/2-<电动机/24<拉西环/26<蒸汽

图#"!+!转鼓式发酵罐!参考吴振强等<固态发酵技术与应用<-::6"

转鼓式发酵罐中实现温度的精确控制是很困难的&因此%日本E>)B>D的生产中%通常仅仅在制曲过程的第一个阶段用此种发酵罐%而到第二个阶段时就把基质转到带有强制通气的填充床发酵罐&也就是说%洗涤’浸渍’排干’汽蒸和接种这些

4- 发酵工程

操作均在转鼓式发酵罐中进行&粗基质原料连同水被添加到转鼓中然后进行蒸煮操作&接种是采用充气式接种%而且培养开始就进行强制通气&最大基质装载量大约是25::C.&

在该反应器中%物料放置在水平或接近水平的连续或间断转动的鼓内%鼓内可以安装或不安装挡板&空气没有强制穿过料层%而是从料层顶部流动通过顶部空间/这种反应器历史悠久%早在-:世纪初就已用于淀粉酶的生产%第二次世界大战以后用于青霉素生产&

转鼓反应器在静态阶段其操作像浅盘反应器&间歇转动时可防止菌丝编织板结%这是与浅盘反应器的关键差异&与连续转动相比%间歇转动对霉菌菌丝的损伤较低%并可降低转动能耗&

在操作上%除了气流速率’温度及湿度外%搅拌频率!每分钟转速"也可以根据实际需要改变%而转动操作则可以由插入料床内的热电偶所测量到的温度激活&控制不同的转速可能使转鼓内物料的流动方式不同&对于典型的每分钟几转的低转速%在没有挡板的转鼓内%料层在转鼓内壁面以整体下滑的方式流动%导致料层混合较少&在这种情况下%转鼓不比浅盘反应器好/有两种方法可解决这一问题(一是使用

2:*5:#0$(%的较高转速/二是安装挡板%但必须注意高转速将产生较高的剪切作用%有可能导致微生物的损伤%不利于生长&另外%适当的通风将有利于温度调节及供氧%一般通气范围为:<2*:<66**$&

目前%此类反应器被应用于酒精’酶’制曲’植物细胞培养’根霉发酵大豆及丹贝等生产中&尽管转鼓式反应器中微生物的生长均匀而迅速%但在发酵初期菌丝体幼体可能因翻动而受到损伤%且原料易结球或因底物黏附于反应器壁上%造成传质不均&

此外%连续式发酵设备有塔式’转轴式和旋转盘式等多种型式&塔式通风固态发酵设备外形为塔式%内有-*6层塔板%培养物料从上而下分级传输&在每一层塔板上发酵一定时间后%传输至下一层%传送方式有多种&转鼓式通风固态发酵设备为倒放的圆柱筒&圆柱筒慢慢地连续转动%使内部物料随之翻动%起到通风搅拌的作用&若将圆柱筒壳体倾斜放置%可使物体连续缓慢地向较低一端移动%只要在较高一端不断补料%就可形成固体发酵&

第二节!嫌气发酵设备

嫌气发酵罐!也称密闭厌氧式发酵罐"在工业生产中主要用于啤酒和酒精的生产&由于没有溶解氧的要求%其结构相对比较简单&

5-第二章!发酵设备

2<压力表/-<排气/3<安全阀/4<人孔/5<洗涤器/6<冰盐水出口/7<冰盐水入口/8<啤酒出口/

9<洗涤+,-入口/2:<取样口

图#"!!!圆筒体锥底发酵罐

一!啤酒发酵罐

啤酒发酵罐应用的主要有露天式锥底

发酵罐%联合罐及朝日罐等%介绍如下(露天式锥底发酵罐在啤酒行业应用最

广&目前广泛采用的发酵设备是圆筒体锥底发酵罐!简称锥形罐"%发酵罐最大容量达

25::&&是-:世纪初期瑞士的0’&>’%发明%所以又称奈坦罐%见图-I22&发酵罐罐体为圆柱形%罐顶为椭圆封头%罐底圆锥形&锥底角度一般为6:W*23:W%以7:W角较好&罐高与直径比例一般为!2<5*6"T2%常采用3T2或4T2&罐预装有压力表’+,-排出口’安全阀’真空阀和人孔%罐内顶部装有清洗器%便于罐内洗涤%罐体装有温度计插孔’取样口’二氧化碳洗涤口’罐底有放料口&发酵罐的冷却装置一般分-*4段%根据罐体高度而定&罐锥底部分最好也能冷却&锥型罐的冷却形式多种多样%如扣槽钢外缠无缝管’冷却夹套内加导向板’罐外加氨管及长方形薄夹层螺旋’环形冷却带或米勒板式夹套内流动换热等&常用隔热层材料有(聚酰胺树脂’自熄式聚苯乙烯塑料’膨胀珍珠岩和矿渣棉等&外保护层一般采用:<7*2<5$$厚的合金铝板或:<5*:<7$$的不锈钢&由于锥型罐体积大%设备清洗均采用+XF!BK"’%(%.(%GK’B""清洗系统&锥型罐的优点是发酵速度快%易于沉淀收集酵母%减少啤酒及其苦味物质的损失%泡沫稳定性得到改善%对啤酒工业的发展极为有利&

联合罐是一种在美国出现的称为Y%(*"#EL的发酵罐%是由带人孔的薄壳圆柱体’拱形顶及有足够斜度以排除酵母的锥底组成%如图-I2-所示&一般圆柱部分高度和直径比为!2*2<3"T2%罐壁设有冷却板%罐体基础采用钢筋混凝圆柱体的形状按照罐底的斜度确定&圆柱体与罐体之间填入坚固的水泥砂浆%罐底与砂浆间有一层空心绝缘层&罐体耐压较小%为降低造价一般不设计成耐压罐!+,- 的饱和是在完成罐进行%否则应考虑适当的耐压"&罐中心设有+,- 注射圈%高度恰好在酵母层之上&+,-注入时%引起啤酒运动%使酵母浓聚于底部出口处%同时啤酒中的不良挥发成分被注入的+,-带着逸出&联合罐可采用机械搅拌%也可通过对罐体的精心设计达到同样的搅拌作用&

6- 发酵工程

朝日罐又称朝日单一酿槽%是日本朝日公司试制成功的前’后酵合一的室外大型发酵罐%如图-I23所示%罐体为斜底圆柱形发酵罐&高度与直径的比值为!2*-"T2&外都设有冷却夹套包围罐身与罐底&内部设有带转轴的可动排液管%用来排出酒液&酵母的分离依靠离心机来完成&

图#"!#!联合罐

!!!!!

2<可移动排液管/-<冷却夹套/3<发酵液进口/4<发酵液出口

图#"!$!朝日罐

2<压力表/-<排气/3<冷却水/4<进料/5<人孔/6<出口/7<温度计/8<冷却盘管/9<出口/2:<淋水收集槽/22<冷却水进口/2-<取样口

图#"!%!酒精发酵罐

二!酒精发酵罐

酒精发酵罐%结构较为简单%罐体采用圆柱形%底盖和顶盖均为碟形或锥形%如图-I24所示发酵罐宜采用密闭式%便于二氧化碳的回收&罐预装有人孔’视镜’二氧化碳回收管’进料管’接种管’压力表’测量仪表接口等&罐底有排料口’排污口%罐身上下有取样口’温度计接口’冷却水进出口等&对于大型发酵罐%靠近罐底也装有人孔%便于维修和清洗&

发酵液的冷却%中小型发酵罐多采用罐顶喷水淋于罐外壁进行膜状冷却%对于大型发酵罐%罐内装有冷却盘管或

7-第二章!发酵设备

盘管冷却与罐外喷淋联合冷却装置%罐外壁底部四周装有集水槽%避免车间积水&发酵罐的洗涤%采用水力喷射洗涤装置&

第三节!动植物细胞培养反应器

随着生物工程技术的发展%动植物细胞的培养逐渐从实验室规模培养过渡到生产规模的生物反应器中进行&动植物细胞培养是指动物或植物细胞在体外条件下进行培养繁殖%此时细胞虽然生长与增多%但不再形成组织&

动植物细胞与微生物细胞有明显的区别%首先动物细胞无细胞壁%动植物细胞对环境影响十分敏感&培养中动植物细胞对培养基的营养要求相当苛刻%并且生长缓慢%所以动植物细胞培养体系需要严格防止杂菌污染&

一!动物细胞培养反应器

早期培养动物细胞的生物反应器多半是借用培养细菌的发酵设备&近些年来%随着动物细胞大量培养技术的发展%新型的生物反应器正在不断出现&这些反应器都是针对动物细胞无细胞壁%不能耐受强烈搅拌与通风的剪切力而设计制造的&

图#"!&!液体悬浮培养的培养瓶

!一"动物细胞悬浮培养反应器由于动物细胞无细胞壁保护%采用一般发酵

罐的搅拌桨叶搅拌液体时%液体间的剪切力往往过大而破坏细胞%因此%实验室规模的悬浮培养反应器是依靠磁力驱动的搅拌器低转速搅拌!如

-:*5:#0$(%"%搅拌桨有用尼龙丝编织带制成船帆形%或者通过插入溶液中的硅胶管使氧气扩散到培养液内&图-I25是一种实验室内用于液体悬浮培养的培养瓶%容积为:<2*:<-@%培养液依靠磁力驱动的搅拌器低转速搅拌%而溶氧借助于液体上的空气表面曝气扩散%瓶内空气混有5R的+,-调节培养液酸碱度&据报道%此类培养瓶液体中细胞浓度可达到5V2:5个0$@&

由于动物细胞对搅拌时产生的剪切力较细菌敏感%因此搅拌速度一般为-:*2::#0$(%%故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器&近年来美国 0JZ!0"AJ#D%EA(BCZB("%&(!(B"公司开发的笼式通气搅拌器

8- 发酵工程

!图-I26"更有利于动物细胞的微载体培养%它靠3个导流筒在搅拌过程中产生的负压%迫使培养液流入中心管%再从导流管流出%从而使培养基和细胞在较低的转速下就可均匀混合&

2<培养基循环入口/-<环形分布器/3%2:<滤网!75+$"/4<气体交换后排出/5<培养基循环出口/6<排气口/7<气体进口/8<搅拌器中空轴/

9<消泡腔/22<通气腔/2-<不带细胞培养基进入交换

图#"!’!笼式通气搅拌器示意图!参考夏焕章等<生物制药技术<-::6"

此外%工业规模的动物细胞悬浮培养反应器较大规模的有2:$3%用来生产杂交瘤单克隆抗体&采用螺旋桨搅拌器%搅拌转速控制在每分钟几十转%,@!值达

2:>[2&另外%用扩散渗透通气装置取代传统的通风装置&该装置采用新鲜培养

9-第二章!发酵设备

液连续流加%而流出的培养液则通过旋转过滤器分离细胞后被排出%所以这种培养系统也称为灌注系统&

!二"动物细胞贴壁培养反应器多数动物细胞需附着在固体或半固体表面才能生长%细胞在载体表面上生长

并扩展成一单层%所以贴壁培养又称单层培养&传统的动物细胞培养反应器是滚瓶%利用滚瓶的缓慢转动%使动物细胞在滚瓶内壁贴壁生长繁殖&目前很多生物制品工厂就用4*3:@大小的滚瓶进行动物细胞贴壁培养来生产疫苗&-:世纪7:年代开发出中空纤维培养装置进行动物细胞培养%细胞密度可达2:9 个0$@数量级&2974年美国1$(B)%公司设计了第一台中空纤维生物反应器!>)KK)AI!(N"#IN()#"’B&)#"%称为\(&’!(N"#X!图-I27"&至今已有2:多家公司生产和销售类似的产品%近年来我国也有单位正在试制&该反应器是由数百乃至数千根中空纤维集束组成&该纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物%纤维壁厚为5:*2::+$%呈多孔性%内层为超滤膜%可以截留相对分子质量为2::::’5::::或2:::::的物质&内腔直径为-::+$%两端用环氧树脂等材料将纤维粘合在一起%并使内腔开口于外加的塑料圆筒%使形成两个隔开的腔&内腔用以灌流充以氧气的培养基%外腔用以培养细胞&该反应器既适于贴壁细胞培养%也适于悬浮细胞培养&当细胞接种于外腔后%细胞可附着于纤维表面%也可渗入海绵状纤维壁%2*3周后可占据所有纤维间空间%并在纤维表面堆积成数层%甚至 2: 多层细胞%细胞密度可高达

2:8 个0B$-%此时细胞的分裂停顿%但其代谢和分化功能可长期保持达数月之久&细胞可保持较高的存活性’健康的形态和核型&

2<;Z+出口/-<中空纤维/3<细胞接种管/4<培养基进口/5<中空纤维外部空间!;Z+"/6<培养基出口

图#"!(!,-./0-1234型圆柱状中空纤维反应器示意图

!参考夏焕章等<生物制药技术<-::6"

该反应器的优点是(!占地空间小/"产品产量’质量高/#生产成本低!生产

:3 发酵工程

2.纯化的单克隆抗体的生产成本%为用小鼠腹水生产成本的20-%搅拌式生物反应器生产成本的206"&其不足之处是(!不能耐高压蒸汽灭菌%需用环氧乙烷或其他消毒剂灭菌/"难以取样检测/#不能重复使用&动物细胞培养时间要比一般微生物培养时间长%其灭菌要求更严格&如果因操作不当而污染杂菌后%整个装置无法灭菌再生而报废%经济损失就较大&这是中空纤维反应器的最大缺点&

为了克服这些不足%OD等在2982年报道了另一种平床式中空纤维生物反应器!图-I28"&该反应器的核心是中空纤维反应室%它由3:::根长3:B$的中空纤维组成%分成3*4层%每层8::*9::根中空纤维%排成3:B$V3:B$%这样细胞贴附的总面积为2::::B$-%两端用硅橡胶或环氧树脂端封%并使纤维内腔开口于

2<反应器下座/-<空气0+,-进口/3<细胞接种口/4<新鲜培养基进口/5<空气0+,-出口/6<下层不锈钢微孔滤板/7<中空纤维床/8<中空纤维硅胶封口/9<中空纤维开口/2:<上层不锈钢微孔滤板/22<垫板/2-<反应器上座/23<用后培养基出口/

24<反应器前室/25<反应器后室/26<螺栓/27<蝶形螺帽

图#"!)!平床式中空纤维生物反应器示意图!参考夏焕章等<生物制药技术<-::6"

23第二章!发酵设备

两侧室&中空纤维材料为聚砜’聚丙烯酯%或用1$(B)%]$5:纤维&整个反应器用326号不锈钢制作%有下座’下层不锈钢微孔!-+$"滤板’中空纤维反应器’反应器后室’上层不锈钢微孔!-:+$"滤板’垫板和上盖%以及进出培养基的管道接口’接种细胞的管口和空气的管口&据报道%该反应器已成功地培养了Z\3S3’

QXI38’P"@’’ OI-’JPO和原代人胚肾细胞&培养原代人胚肾细胞时%用无血清培养基%细胞在5周内一直很稳定地产生尿激酶&

!三"固定床或流化床式生物反应器固定床或流化床式生物反应器最早也是用于化学工业和废水的处理%以后才

被开发用于动物细胞的培养%用以大量生产疫苗和基因工程产品&固定床反应器的特点是结构比较简单%装填的材料可以是一切对细胞无毒又有利于细胞贴附的材料%如不锈钢’玻璃环’玻璃珠’光面陶瓷’塑料等实心的载体/也可以是有孔的陶瓷’有孔的玻璃’有孔的聚氨酯塑料等&前一类材料%细胞只能生长在表面%因此细胞密度不会太高%但比较经济%液体流动阻力较小%多数可重复使用%因而被较多采用%特别是3*5$$的玻璃珠%有报道已将该反应器放大至2::@以上%用以生产口蹄疫疫苗&后者由于有孔%细胞可进入载体内%因而常可获得高密度细胞&但当载体过大时%在载体内的细胞常因营养物和氧的交换不够充分而影响其生长和代谢&近年来出现的几种新型生物反应器%在细胞密度和生产效率方面都有了很大的提高&

0JZ公司在原来的笼式通气搅拌式反应器基础上%开发出了+"KK(."%GKDE生物反应器&该反应器实际上是将通气搅拌与固定床巧妙结合的一种新型生物反应器!图-I29"&它在原来的+"KK(."%罐体中部装一篮筐%中间装填由5:R的聚酯纤维和5:R的聚丙烯制备的直径为6$$的小圆盘%称之为_(N#’I+"KK%它具有很大的比表面积!2-:B$-0B$3"和空体积!9:R"&既可用于贴壁细胞的附着%又有利于悬浮细胞在纤维间被固定&由于其特殊设计的搅拌装置%在搅拌中可产生负压%迫使培养基不断流经填料%有利于营养物和氧的传递&据报道%该反应器可使杂交瘤细胞和+P,工程细胞的密度达到2:8个0B$3床体积%单抗和&IF1的产量较用固体微载体培养分别高2-和-7倍&

二!植物细胞培养反应器

用于植物细胞培养的核心设备称为植物细胞培养反应器&此类反应器与微生物发酵用反应器有许多相同之处%也采用通用式发酵罐’鼓泡式发酵罐’气升式反应器’流化床式反应器’固定床式反应器’膜反应器及振动混合反应器等&植物细胞培养反应器已从实验室规模的2*3:@放大到工业性试验规模23:*-::::@&

-3 发酵工程

2<水套出水口/-<无细胞液/3<纤维圆盘篮筐/4<水套/5<抽液管/6<搅拌导流管出口/7<加或收FJZ/8<加培养基/9<进气/2:<收液/22<轴套/2-<可调水平收液管/

23<进气管线/24<无细胞培养基/25<浸透已通气培养基的圆盘床/26<聚酯纤维圆盘/27<筛网内气室中的气泡/28<培养基循环/

29<加温水套进水

图#"!*!5266-72896:;细胞培养反应器示意图!参考夏焕章等<生物制药技术<-::5"

植物细胞生物反应器的放大设计应首先考虑植物细胞的剪切力&图-I-:为大规模植物细胞培养反应器的常用设计图&在非机械搅拌或气体搅拌反应器中%平均剪切力与界面气速有关&也可用容易测定的传质参数来估算反应的剪切强度&但是在现阶段%植物细胞培养反应器的放大%在很大程度上是基于大量实验的经验性结果&

实际生产中%大规模植物细胞培养反应器有用于烟草细胞培养的机械搅拌罐!图-I-2"&虽然植物细胞培养所需的,@!值小于一般好氧微生物培养时所需的

,@!值%但高细胞浓度下培养液的黏度加大%因此%宜采用直径较大!搅拌叶直径为罐径的20-"的角度桨式搅拌器&反应器容积-:$3%搅拌转速为2:*4:#0$(%%连续培养%细胞生产能力为5<8-C.0!$3.L"&

植物细胞培养反应器的设计%可采用通风发酵设备的放大方法来进行&上述烟草细胞培养用-:$3反应器就是以,@!为基准的比拟放大方法设计制造的&

采用气升式反应器培养植物细胞也有一定的应用前景%与机械搅拌反应器相比%所受的剪切力低得多/无轴封装置%结构简单%制作方便%灭菌容易/操作费用低/可通过控制通气速率控制细胞的生长&

33第二章!发酵设备

2<培养基/-<无菌过滤器/3<接种/4<压力表/5<空气/6<搅拌速度计/7<叶轮搅拌器/8<泡沫探针/9<消泡剂/2:<酸/22<碱/2-%23%-:<探针/

24<温度计/25<加热0冷却/26<产品出口/27<无菌过滤器/28<自动控制器/29<空气/-2<光密度计!生物量"

图#"#+!植物细胞培养生物反应器的设计示意图!参考夏焕章等<生物技术制药<-::6"

根据实验证实%采用气升式反应器培养柠檬叶鸡眼藤细胞生产蒽醌%与其他反应器相比%有更高的生产率&

三!微藻培养光合生物反应器

海洋生物包括海洋动物!如鱼’虾’贝等"’海洋植物!如大藻和微藻"和海洋微生物&由于微藻主要是光能自养型%可通过光合作用来生长%因此%除与一般微生物发酵条件相近外%还需光照和氧解析%并大量供应二氧化碳&

典型且常用的微藻培养光合反应器是敞开式跑道池%自-:世纪6:年代设计出来%至今基本未变%只对其混合系统进行过改进&这类反应器的优点是成本低’建造容易&其缺点也非常突出%如培养效率低’培养条件无法控制’易污染’雨水会使培养基稀释’反应器中水分蒸发量大和能够进行生产的时间短!如北方冬天不能生产"等&

43 发酵工程

2<培养基配制罐/-<加热器/3<冷却器/4<预热器/5<蓄热器/6<-:$3培养基贮罐/

7<-:$3培养罐/8<贮罐/9<-:::@培养基罐

图#"#!!培养烟草细胞的装置

!参考李艳等<发酵工程原理及技术<-::8"

封闭式光合反应器的研制开发已有几十年历史%但其取得实际研究进展是近几年的事&封闭式光合反应器与敞开式反应器相比%具有培养效率高’培养条件易于控制’无污染’生长周期长和适合于所有微藻的培养等优点&封闭式光合反应器按其接收光的方式可分为两大类(一类是外部光源%另一类是内部光源&

外部光源封闭式光合反应器大部分处于中试规模%体积达2:$3%面积达几百平方米%多数为管道式和板式%也有罐式的&内部光源封闭式光合反应器在国外也有产品出售&这种反应器已全部实现计算机自动控制&反应器型式有多种%如罐式’管式等&

思 考 题

2<叙述发酵设备的功能和分类&

-<设计发酵设备时要本着哪些原则1 反应器必须具备哪些基本条件1

3<试述各种发酵罐的主要类型及其结构参数和性能指标&

4<简述机械搅拌自吸式发酵罐的机构特点及主要优缺点&

5<以液体发酵法生产食醋为例说明机械搅拌自吸式发酵罐的操作状况&

53第二章!发酵设备

6<简述通风固体发酵设备的优点’类型及结构特征&

7<简述啤酒发酵罐的类型及结构特征&

8<简述酒精发酵罐的结构特征&

9<发酵工业中%为了防止和减少染菌%应该从哪几个方面采取措施1

2:<动物细胞’植物细胞与微生物细胞相比较有哪些差异1 在设计动植物细胞培养反应器时%应当注意哪些因素才能获得预期的结果1

63 发酵工程

第三章!发酵工业原料和培养基

发酵工业用原料通常以糖质或淀粉质等碳水化合物!即糖类"为主%加入少量有机氮源和无机氮源%只要不含毒物%一般无精制的必要%微生物本身能有选择地摄取所需要的物质&微生物还可以利用非碳水化合物作基质%可利用天然气’正烷烃’石油提炼中的二次产品!醋酸’甲醇’乙醇等"和氢气&原料不同处理方法也不同&糖蜜原料用于酵母和酒精发酵%需进行加热杀菌和稀释%补充无机盐等预处理&淀粉质原料广泛用于生产酒精’柠檬酸’谷氨酸等发酵%需先将淀粉转化为葡萄糖等可发酵性糖或低分子糊精&碳氢化合物原料是指一定馏分的石油经冷却脱脂而获得的凝固点在[2:‘的油%加入适量无机盐进行接种发酵&甲烷’甲醇等碳源无需预先处理可用于生产酵母等单细胞蛋白&目前%发酵工业生产中所用的碳源主要是糖类和淀粉%以及非粮食原料如糖蜜’纤维素等&发酵工业对碳源的需要量很大%而糖和淀粉也是人类主要粮食’动物的主要饲料%随着世界人口的增加%这种矛盾更加突出&因此%现在广泛对纤维素’能利用+,- 的自养菌等进行研究%特别是将纤维素作为发酵原料开发是一个重要课题&

第一节!发酵工业原料和培养基组成

一!发酵工业原料选择的标准

发酵工业原料选择的标准如下(!原料中碳的可利用率高/"发酵产率高%而且尽可能使发酵残余物少/#原料质量好%成分稳定%污染变质少%易灭菌/$价廉%来源方便%易于贮存&最便宜的原料经常并不一定是最合适的原料%例如谷氨酸发酵%日本早先就采用较纯的葡萄糖’生物素’液氨为原料/过去我国进行了许多用甘蔗或甜菜糖蜜’玉米浆和尿素替代研究&由于粗原料成分变化大%难以控制%所以产酸率低%发酵周期长%还给产物的提取与精制以及废水处理带来很大问题&现在我国谷氨酸发酵已全部采用纯净的淀粉水解糖’生物素’液氨为原料&原来直接用淀粉发酵的柠檬酸等其他发酵工业也都尽可能地采用纯净的原料%可以促使产量增加和缩短发酵周期%同时提高产物的提取效率%反而比使用粗原料成本低’效益高&

二!发酵培养基中各种成分的定量

发酵培养基是供微生物生长繁殖和合成大量产物的培养基&所以要求发酵培养基既要有利于微生物的生长繁殖%防止菌体过早衰老%又要有利于产物的合成&因此%培养基中营养成分除碳源’氮源’无机盐’生长因子及水等五类物质外/还要有前体’促进剂和抑制剂等物质&

发酵培养基中的碳源物质除了提供合成细胞结构物质所需碳素外%更重要的是提供目的产物中的碳及合成产物的能源&所以%碳源物质在发酵培养基中的含量要远远大于其在种子培养基中的含量&例如%在谷氨酸发酵中%种子培养基中的糖量为2R*-<5R%而在发酵培养基中总糖量!初糖a流加糖"可以达到26R*28R%远高于在种子培养基中的含量&发酵培养基的碳源多为淀粉!E&’#B>"’淀粉水解糖!E&’#B>ED.’#"’糖蜜!$)K’EE"E"’有机酸!)#.’%(B’B(L"’低碳醇’脂质’烃类等&

氮源物质在发酵培养基中的含量因发酵目的产物不同而不同&如果目的产物无氮素的存在!如酒精发酵"%培养基中的氮仅够菌体繁殖之用就可以了&但如果目的产物中有氮素存在!如氨基酸发酵"%发酵对氮源的需求就要大大增加&通常所用的氮源可分为有机氮源和无机氮源&有机氮源如黄豆饼粉’花生饼粉’棉籽饼粉’玉米浆粉’蛋白胨’酵母粉’鱼粉’蚕蛹粉’发酵菌丝体和酒糟等/无机氮源如氨水’液氨’尿素’硝酸盐和铵盐等&

无机盐也是发酵培养基中必需的成分之一%在发酵当中对菌体生长和产物合成都有十分重要的影响&磷是所有微生物生长所必需的%对微生物的生长有明显的促进作用&但在有的发酵中%磷过量常会抑制产物的合成&例如%在谷氨酸生产中%若磷的浓度过高%会抑制6I磷酸葡萄糖脱氢酶的活性%导致代谢转向缬氨酸方向&许多其他次级代谢产物的产生也都受磷浓度的影响&但也有些产物的生产需要较高浓度的磷%如用黑曲霉!1EG"#.(KKDE%(."#"和地衣芽孢杆菌!J’B(KKDEK(B>"%(!)#$(E"对生产!I淀粉酶时%高浓度的磷能显著提高!I淀粉酶的产量&硫是青霉素’头孢菌素等分子中的组成元素&在这些产物的发酵培养基中%需要加入硫源&铁也是微生物有氧氧化必不可少的元素&但不同发酵对铁的需求不同&如%在柠檬酸发酵中%铁离子激活顺乌头酸酶%使柠檬酸转化为异柠檬酸%降低了柠檬酸的产量%所以柠檬酸发酵培养基中要少含铁& .’b%’+)’+D’ %等微量元素是某些酶的辅酶或激活剂&它们对微生物大量合成某些产物如氨基酸’抗生素’维生素等起到重要的作用&如4*8+.0$@的钴能大大提高庆大霉素的产量&O

a’

0’a’+’-a等与维持细胞一定的渗透压和细胞透性有关%并且还是许多酶的激活

83 发酵工程

剂&生长因子在发酵培养基中也必不可少%但要注意在某些发酵中生长因子的量需要控制适当%否则对产物合成造成极为不利的影响&最为明显的例子是用生物素亚适量法的谷氨酸发酵%生物素作为生长因子在培养基中的量应控制在5*2:+.0@%如果超过此量谷氨酸的产量将大大降低&这是因为只有在生物素不足时%菌体细胞膜合成才不完整%细胞膜渗透性加大%菌体才能把生成的谷氨酸及时排除体外%解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制作用&有些化合物加入到培养基后%能够直接在生物合成过程中结合到产物分子中去%而自身的结构并未发生太大变化%却能提高产物的产量%这类小分子物质被称为前体&这些前体物质有的是菌体本身能够合成的%如合成青霉素分子所需的缬氨酸和半胱氨酸%合成链霉素的肌醇等/有的是菌体不能合成或合成的很少%需从外界加入的%如合成青霉素\的苯氧乙酸等&因此%这些物质也作为发酵培养基的成分之一&前体使用的浓度要适当&因为虽然前体能促进产物合成%但许多前体对菌体有毒害作用%一般采取流加方式%减少一次加入量&促进剂是一类刺激因子%它们并不是前体或营养%这类物质的加入或可以影响微生物的正常代谢%或促进中间代谢产物的积累%或提高次级代谢产物的产量&而发酵过程中加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行%同时刺激另一代谢途径%以致可以改变微生物的代谢途径&促进剂和抑制剂的专一性很强%用量极微%使用得当%效果显著%但必须通过试验选择品种和确定用量%以防止产生不利影响&

三!工业上常用作碳源的淀粉质原料

!一"淀粉的性质淀粉呈白色无定形结晶粉末%存在于各种植物组织中&在显微镜下观察淀粉

的颗粒是透明的%大致可分为圆形’椭圆形’多角形三种&淀粉没有还原性%也没有甜味%不溶于冷水和酒精%淀粉在热水中膨胀%粒度增大%呈胶体状&淀粉可分为直链淀粉!’$?K)E""和支链淀粉!’$?K)G"B&(%"两种&直链淀粉是葡萄糖经!I2%4I糖苷键脱水缩聚而成螺旋形不分支长链%聚合度在2::*6:::之间%相对分子质量达2:::::&用热水溶解时形成黏度较低的不稳定胶体溶液在5:*6:‘静置较长时间后会析出晶形沉淀&支链淀粉是支叉分子%直链部分的葡萄糖以!I2%4I糖苷键连接%分支点上葡萄糖以!I2%6I糖苷键连接%聚合度2:::*3::::%相对分子质量可达6V2:6&用热水溶解时形成糊状物&

淀粉遇碘液时%碘从螺旋形中间通过%与直链淀粉之间构成吸附化合物而呈蓝色反应&支链淀粉遇碘液时%碘不能通过!I2%6I糖苷键结合的分支点%只能和支点外部的二十几个葡萄糖基结合%故呈红到紫红色反应&

93第三章!发酵工业原料和培养基

!二"淀粉质原料淀粉质原料!E&’#B>?$’&"#(’K"中含淀粉量较高%而且来源广泛’价格便宜&淀

粉质原料及其水解液是发酵工业常用的碳源&使用最广的淀粉质原料是工业淀粉’谷类’薯类等&

工业淀粉是以谷类’薯类等农产品为原料加工而成%是白色或微带浅黄色阴影的粉末&按照原料的不同可分为谷类淀粉和薯类淀粉&谷类淀粉结构致密’颗粒较小%如大米淀粉颗粒直径在3*8+$/薯类淀粉结构疏松’颗粒较大%如木薯淀粉颗粒直径在5*35+$&所以谷类淀粉较薯类淀粉更难水解&普通的谷类和薯类淀粉含直链淀粉27R*-7R%其余为支链淀粉/而黏玉米’黏高粱和糯米等淀粉不含直链淀粉%全部为支链淀粉&一般精制淀粉的淀粉含量在84R左右%而粗制淀粉的淀粉含量在78R左右&常用的工业淀粉有玉米淀粉’小麦淀粉’苷薯淀粉’马铃薯淀粉等&玉米淀粉及其水解糖液是抗生素’核苷酸’氨基酸’酶制剂等发酵常用的碳源%小麦淀粉’苷薯淀粉等常用在有机酸’乙醇等发酵中谷类包括大米’高粱’大麦’小麦等&其种植面积广泛%产量大%淀粉含量也比较高&其中大米常用在氨基酸’啤酒’黄酒等发酵中%高粱’大麦’小麦常用在白酒发酵中&

薯类是适应性很强的高产作物%我国以甘薯’马铃薯和木薯等为主&甘薯晾晒成干后成为甘薯干%其淀粉含量可达76R%并且纤维素含量少%蛋白质含量适度%是生产酒精’柠檬酸的好原料&马铃薯又叫土豆’山药蛋’洋山芋%在我国东北’西北’内蒙古等地产量很大&马铃薯一般可分为工业用’饲用’食用’种用四类%作为发酵工业碳源的是淀粉含量高’蛋白质含量较低的工业用马铃薯&木薯是很强健的多年生植物%盛产于我国南方的两广’福建’海南岛等地区&木薯干不仅淀粉含量可高达到73R左右%而且淀粉品质较纯’淀粉颗粒大%加工方便&因此%木薯是我国生产工业淀粉的第二位原料%同时也是南方地区酒精生产的主要原料&

四!工业上常用作氮源的蛋白质类原料

发酵工业常用的蛋白质原料主要有黄豆饼粉’花生饼粉’棉籽饼粉’玉米浆’蛋白胨’酵母粉’鱼粉等&它们都含有丰富的蛋白质’多肽和游离氨基酸%是微生物生长良好的营养物质&在含有这些物质的培养基中%微生物一般都表现出生长旺盛的特点&黄豆饼粉被广泛用于抗生素发酵中的有机氮源&根据油脂的含量可将黄豆饼粉分为全脂黄豆粉!油脂含量在28R以上"’低脂黄豆粉!油脂含量在9R以下"和脱脂黄豆粉!油脂含量在-R以下"三类%见表3I2&

:4 发酵工程

表$"!!各种黄豆粉的成分 R

组分 脱脂黄豆粉 低脂黄豆粉 全脂黄豆粉

蛋白质 48<6:*5-<8: 4:<63*46<32 33<75*38<::

油脂 :<43*2<59 3<99*24<4: 29<54*-:<46

灰分 5<88*7<-: 5<2:*7<34 4<5-*4<82

水分 6<27*9<48 4<7:*22<:: 8<84*9<-9

玉米浆是玉米淀粉生产的副产品%是用亚硫酸浸泡玉米所得的浸泡液的浓缩物&固体物质含量在5:R以上%是一种非常容易被微生物利用的氮源%含有丰富的氨基酸’还原糖’磷’微量元素’生物素等%成分见表3I-&

表$"#!玉米浆的成分!参考李艳等<发酵工程原理及技术<-::8"

总固体物0R 灰分0R 维生素0!+.0."

乳酸 25<: O -:<: 硫胺素 !42*49还原糖 5<6 F 2<:*5<: 生物素 :<34*:<38水解后的自由还原糖 6<8 0’ :<3*2<: 叶酸! :<-6*:<6总氮 4<: . :<::3*:<3: 烟酰胺 !3:*4:

!!其中氨基酸占!!总氮含量

1K’ -5<: _" :<:2*:<3: 核黄素 3<9:*4<7:1#. 8<: +D :<:2*:<3:cKD 8<: +’ :<:2*:<3:@"D 6<: b% :<::3*:<8:F#) 5<: FN :<::3*:<:2S># 3<5 Z( :<::3*:<:2XK" 3<5 +K :<::3*:<:2\’K 3<5F>" -<:"& 2<:+?" 2<:

玉米浆的用量应根据淀粉原料的不同’糖浓度及发酵条件不同而异&一般用量为:<4R*:<8R&

蛋白胨’酵母粉’鱼粉’蚕蛹粉等也是很好的有机氮源&蛋白胨由各种动物组织和植物水解制备&工业上使用的蛋白胨有血胨’肉胨’鱼胨’骨胨等&不同蛋白胨之间磷含量差异较大%对于需控制磷浓度的发酵来说%要注意品种的选择和使用效果&酵母粉由水解啤酒酵母和面包酵母制得%其质量和含量与酵母品种有关&

24第三章!发酵工业原料和培养基

蚕蛹粉主要用在制霉菌素的发酵中&需要注意的是(以上各种蛋白质原料均是由天然原料加工制作而成的%成分复

杂%且因原料产地’加工方法’原料品种等不同%营养物质的含量也随之变化%对发酵有较大影响&因此必须对这些蛋白质原料的来源’品种’质量加以适当的选择&最好在原料变动时进行小型发酵试验&

五!发酵培养基中的无机盐和生长因子

!一"磷酸盐磷是某些蛋白质和核酸的组成成分%腺苷二磷酸!1/F"’腺苷三磷酸!1SF"

是重要的能量传递物质%参与一系列的代谢反应&磷酸盐在培养基中还有缓冲作用&微生物对磷的需要量一般为:<::5*:<:2$)K0@&工业生产上常用O3F,4.

3P-,’O3F,4 和0’-PF,4.-P-,’0’P-F,4.-P-,等磷酸盐%也可用磷酸&

!二"硫酸镁镁是许多重要的酶!如己糖磷酸化酶’异柠檬酸脱氢酶’羧化酶等"的激活剂%

而硫为菌体合成含硫蛋白质提供硫源&所以 .Z,4.7P-,是发酵工业中常用的无机盐类& .Z,4.7P-,中含镁9<87R%发酵培养基配用:<-5*2.0@时%镁浓度为-5*9:$.0@&

!三"钾盐微生物生长需钾量一般约为:<2.0@!以O-Z,4 计%以下同"&当培养基磷盐配

用2.0@O3F,4.3P-,时%同时供给了钾%其钾浓度约为:<389.0@&如果磷盐采用

0’-PF,4.2-P-,时%应另外配用:<3*:<6.0@的O+K%钾浓度为:<35*:<7:.0@&

!四"微量元素一般作为碳源’氮源的农副产品天然原料中本身就含有某些微量元素%不必另

加&但某些发酵可能对某些微量元素有特殊要求%例如以醋酸或石蜡为碳源发酵谷氨酸时对铜离子含量要求较高&因此%这些发酵需在培养基中补加一些含有微量元素的无机盐&工业上常用的含微量元素的无机盐有 %Z,4.4P-,等&

!五"生长因子工业上提供生长因子的主要是一些农副产品原料%常用的有玉米浆’麸皮水解

液’糖蜜’酵母水解液等&玉米浆不仅含有丰富的蛋白质’多肽和游离氨基酸%而且

-4 发酵工程

含有丰富的维生素’生物素%既可作为有机氮源使用%又可提供生长因子&糖蜜是苷蔗或甜菜制糖后剩余的母液%其中含有大量的生物素%是作为提供生长因子的最常用原料&麸皮水解液是干麸皮与水按一定比例配合加压酸解而得%可以代替玉米浆&有些谷氨酸生产菌以硫胺素!维生素J2"为生长因子%可在其培养基中添加硫胺素盐酸盐水溶液&有些生产氨基酸的缺陷型菌种还以油酸’甘油’苏氨酸等为生长因子&

六!发酵生产的前体物质和促进剂!抑制剂

!一"前体在有些氨基酸’抗生素和核苷酸的发酵中必须添加前体才能获得较高的产率&

工业上常用的前体见表3I3&

表$"$!几种常用的前体

产物 前体 产物 前体

青霉素c 苯乙酸等 维生素J2- 钴化物

青霉素, 烯丙基I巯基乙酸 丝氨酸 甘氨酸

青霉素\ 苯氧乙酸 色氨酸 吲哚’氨茴酸

链霉素 肌醇’精氨酸等 蛋氨酸 -I羟基I4I甲基硫代丁酸

金霉素 氯化物 异亮氨酸 #I苏氨酸

红霉素 丙酸’丙醇等 苏氨酸 高丝氨酸

灰黄霉素 氯化物

!二"促进剂在某些氨基酸’抗生素和酶制剂发酵生产过程中%可以在发酵培养基中加入促

进剂&尤其是在酶制剂发酵过程中%加入促进剂%可以改进细胞的渗透性%同时增强氧的传递速度%改善了菌体对氧的有效利用%大大增加了产酶量&常用促进剂有各种表面活性剂!洗净剂’吐温I8:’植酸等"’二乙胺四乙酸’大豆油抽提物’黄血盐’甲醇等&如栖土曲霉394-生产蛋白酶时%在发酵-*8>添加:<2R@Z洗净剂!即脂肪酰胺磺酸钠"%就可使蛋白酶产量提高5:R以上&添加培养基:<:-R*2R的植酸盐可显著地提高枯草杆菌!&-./001((123/0/("’假单胞菌!)(41"56758-("’酵母!9-..+-:57;.4("’曲霉!<(=4:>/001("等的产酶量&在3536葡萄糖氧化酶发酵时%加入金属螯合剂二乙胺四乙酸!;/S1"对酶的形成有显著影响%酶活力随二乙胺四乙酸用量而递增&又如添加大豆油抽提物%米曲霉蛋白酶可提高

34第三章!发酵工业原料和培养基

287R的产量%脂肪酶可提高25:R的产量&抗生素发酵中促进剂也有应用(在四环素发酵中加入硫氰化苄或-I巯基苯并噻唑可控制S+1循环中某些酶的活力%能增强戊糖循环%促进四环素的合成/巴比妥药物能增加链霉素产生菌丝的抗自溶能力%对链霉素生物合成有促进作用&

!三"抑制剂有些抑制剂可抑制某些合成产物的途径而使代谢向所需产物的途径转化%常

常被用在抗生素和有机溶剂发酵中&氯霉素’植酸’草酸等能抑制噬菌体的繁殖%可用于氨基酸发酵&常用的抑制剂见表3I4&

表$"%!发酵工业上常用的抑制剂

产物 被抑制产物 抑制剂

链霉素 甘露糖链霉素 甘露聚糖

去甲基链霉素 链霉素 乙硫氨酸

四环素 金霉素 溴化物’硫脲

去甲基金霉素 金霉素 硫磺 化 合 物’乙 硫氨酸

头孢菌素+ 头孢菌素0 !I蛋氨酸

利福霉素J 其他利福霉素 巴比妥药物

甘油 乙醇 亚硫酸盐

第二节!发酵工业培养基的种类

发酵中的培养基有很多类型&按照不同的分类依据可以有不同的划分&常用的划分依据有3种%即按原料的化学纯度不同划分’按培养基的物理状态不同划分和按培养基的用途不同划分&

一!不同原料纯度的培养基

按照预料化学纯度的不同可以将发酵培养基分成天然培养基’合成培养基和半合成培养基3种&

!一"天然培养基天然培养基!D%L"!(%"L$"L(D$"是指采用一些化学成分不清楚或化学成分不

恒定的物质作为培养基的原料%主要是一些动’植物组织或微生物的浸出物’水解

44 发酵工程

液等&前文提到的很多有机碳’氮源物质都属此类%如牛肉膏’蛋白胨’酵母膏’玉米浆’各种淀粉水解液’糖蜜%等等&天然培养基的优点是取材方便’营养丰富’价格低廉%适用范围广/缺点是原料质量不稳定%不利于发酵控制&

!二"合成培养基合成培养基!L"!(%"L$"L(D$"是用各种成分明确’稳定的化学试剂配制的培

养基&例如%微生物上分离培养放线菌的高氏一号培养基&合成培养基的优点是培养基中各成分含量比例完全清楚%便于发酵控制’重复性强/缺点是营养单一’价格较高’适用范围较窄&

合成培养基主要用于实验室的研究和检验工作%除某些产品有特殊要求的发酵工业!如人类疫苗’各种以工程菌生产的高纯度的多肽类药物"外%一般发酵工业考虑到成本问题%其培养基成分大都以天然原料为主%如各种工业废物’废液’农副产品等&

!三"半合成培养基半合成培养基!E"$(IL"!(%"L$"L(D$"是既含有天然成分%又含有纯化学试剂

的培养基%如培养真菌的F/1培养基&严格地说%发酵中使用的培养基实际上多为半合成培养基%完全天然的培养基或完全由各种化学试剂配成的合成培养基是很少的&

二!物理状态不同的培养基

按照发酵培养基的物理状态的不同可以分为固体培养基’液体培养基和半固体培养基&

!一"固体培养基固体培养基!E)K(L$"L(D$"是外形呈固体的培养基&固体培养基在发酵工业

上的应用主要有以下几个方面(!2"实验室的菌种分离’纯化’鉴别’鉴定’保藏等工作%如各种加入琼脂作为凝

固剂的培养基&!-"由各种天然固体基质制成的固体培养基%主要用在各种固体发酵上%如传

统酿造工业的制曲%蛋白酶发酵等&目前食用菌生产基本都用的是各种固体基质%如麸皮’木屑’棉籽壳等等&

!3"由血清或硅胶配制成的特殊培养基%用于培养专门的微生物%一旦凝固就

54第三章!发酵工业原料和培养基

不能再融化&!4"滤膜培养基%用于实验室的分离计数&污水处理厂的活性污泥和生物膜也

可以算作是特殊的固体培养基&前两种用途是固体培养基在发酵工业上的主要用途&

!二"液体培养基液体培养基!K(dD(L$"L(D$"是外形呈液体的培养基&液体培养基中8:R*

9:R为水%由于有利于营养成分溶解%有利于搅拌和管道运输%有利于传质%有利于发酵产物的分离和提取以及便于进行操作和管理等诸多优点&液体培养基才是现代和未来大规模工业发酵所使用的培养基&很多固体发酵都在向液体发酵转型%如大型食用药用菌的培养’动植物组织的培养等等&实验室也用液体培养基作为菌种扩大培养和代谢研究之用&

!三"半固体培养基半固体培养基!E"$(IE)K(L$"L(D$"是外形呈半固体的培养基&一般通过加入

较低比例的凝固剂来达到半固体的效果%如加入:<5R的琼脂!正常的固体培养基的加入量是-R"&这种培养基呈现出容器放倒时不流下%剧烈振荡会破碎的特点&半固体培养基在发酵上应用较少%主要用于实验室的微生物运动性观察!穿刺培养"’噬菌体效价测定!双层平板法"以及某些厌氧菌的保藏等工作&

三!工业发酵中用途不同的培养基

工业发酵中的培养基按照用途有两种不同的分类方法(

!一"实验室常用的培养基按照用途又可以分成选择培养基和鉴定培养基两类&

2<选择培养基选择培养基!E"K"B&"L$"L(D$"是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某种

物理化学因素的抗性而设计的培养基%目的是使混合样品中的劣势菌群变成优势菌群%从而提高该菌的筛选效率&一般这种培养基除了选用待富集菌适合的生长条件外%同时还会加大一些特殊的抑制剂来抑制竞争菌群&

分析该培养基成分我们发现%除了碳源!葡萄糖"’氮源!蛋白胨"’大量元素!OP-F,4’ .Z,4.7P-,"’生长因子和微量元素以及凝固剂!琼脂"以外%还有

3种成分(孟加拉红’链霉素和金霉素&这3种成分就是在选择培养基中作为抑

64 发酵工程

制剂使用的成分%其中孟加拉红可以抑制细菌和放线菌%链霉素和金霉素抑制细菌&

-<鉴别培养基鉴别培养基!L(!!"#"%&$"L(D$"是在培养基中加入一种与待测菌的某种无色

代谢物发生显色反应的指示剂%从而在适当的培养后用肉眼即可分辨出待测菌&最常见的鉴别培养基就是在饮用水’牛乳等的细菌学检验中经常用到的伊红美蓝培养基!;)E(% "&>?K"%"JKD" "L(D$%; J"&

伊红和美蓝是两种苯胺染料%可以抑制ca细菌以及某些c[细菌%在低GP值时会显色&多种肠道菌群%尤其是大肠杆菌!?*.50/"在; J上会显示出特征明显的不同菌落从而被方便的鉴别出来&

!二"在发酵生产中常用的培养基按照用途划分的话可以分成3类(孢子培养基’种子培养基和发酵培养基&

2<孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子用的培养基&这种培养基的目的是使发酵菌种

在不发生变异的前提下尽可能多的繁殖孢子&所以对孢子培养基配制的基本要求就是在营养基本保证’理化条件适宜的前提下%营养不要太丰富!特别是有机氮源"%否则不易产孢子&因此%生产实践上常用各种天然基质来做孢子培养基%如大米和小米常用作霉菌孢子培养基%因为它们含氮量少’疏松’表面积大%所以是较好孢子培养基&在具体选择孢子培养基时最好根据实验来确定%不同菌种的差异是很大的&例如%棉铃红粉病菌在F/1培养基上的产孢量最高%其次为马铃薯淀粉和胡萝卜培养基%豆芽汁’番茄汁和玉米汁培养基的产孢量较少%琼脂培养基的产孢量最少&

-<种子培养基孢子培养基是供孢子发芽生长出大量菌丝体%或不产孢子的菌种繁殖出大量

细胞%并且具有较高的活力和纯度的培养基&种子培养基是直接为发酵提供种子的培养基&作为大规模工业发酵的种子是有严格要求的%如种子要有一定的浓度’种子要活力旺盛’不能有杂菌污染等等&种子培养基的设计就是要达到这些要求&因此%种子培养基的营养应该较孢子培养基丰富’氮源含量要高些%且最好是有机氮源和无机氮源都有!有的有机氮源能刺激孢子发芽%而无机氮源的分解利用迅速"保证种子繁殖旺盛&另外%种子培养基的成分配比上要尽量接近发酵培养基%这样种子接种到发酵罐后就能尽快适应发酵培养基%缩短延滞期&总的来说%种子培养基就是要设法让菌种繁殖’长菌体%同时避免菌种老化或进行发酵&

74第三章!发酵工业原料和培养基

3<发酵培养基发酵培养基是供菌种生长繁殖和合成发酵产物的培养基&它既要能保证接种

的种子能长到一定的浓度%又要保证菌体能迅速合成发酵产物&因此%发酵培养基中除含有发酵菌种正常生长所必需营养元素外%还含有发酵产物迅速合成所需的前体’产物促进剂和抑制剂以及保证发酵正常进行的消泡剂等物质&由于具体的发酵菌种和发酵设备’工艺千差万别%因此发酵培养基也种类繁多%生产中一般要通过小试’中试’投产实验再确定&

第三节!工业发酵营养基质的配制方法

一!淀粉质原料制糖工艺及培养基的配制方法

!一"淀粉的组成和特点淀粉是一种白色无定形结晶粉末%存在于很多植物组织中&由于微生物分解

淀粉必须有相应的胞外淀粉酶%所以大多数微生物并不能够直接分解利用淀粉&因此%在很多发酵工业产品的生产中%都需要先把淀粉水解%制成水解糖后再使用%如谷氨酸等很多氨基酸发酵%抗生素发酵’有机酸发酵等&

淀粉的本质是由很多葡萄糖分子通过!I2%4I糖苷键和!I2%6I糖苷键连接而成的具有一定层次构造的化学大分子&淀粉的形状有圆形’椭圆形和多角形3种&一般含水分高%含蛋白质少的植物淀粉颗粒大些%多呈圆形或椭圆形%如马铃薯’木薯的淀粉/反之多呈较小的多角形%如大米淀粉&不同种类的淀粉其颗粒大小一般不同%如马铃薯淀粉颗粒平均大小为2::*25:+$!长轴长度"/红薯淀粉为2:*-5+$/而大米淀粉通常为-*8+$&

淀粉的本质是碳水化合物%含碳44<4R%含氢6<-R%含氧49<4R&淀粉是由葡萄糖脱水聚合成的%可以表示为!+6P2:,5"8&不同种类的淀粉葡萄糖的数目和结构有很大不同&淀粉可以分为直链淀粉和支链淀粉两种&不同的植物直链淀粉和支链淀粉的含量不同&直链淀粉与支链淀粉的比较见表3I5&

淀粉没有还原性%也没有甜味%不溶于冷水%也不溶于酒精’乙醚等有机溶剂&淀粉在热水中能吸收水分而膨胀%最后淀粉颗粒破裂%淀粉分子溶于水中形成一种糊状胶体溶液%这就是糊化&各种淀粉的糊化温度不一样%如马铃薯淀粉为5:R*55R%玉米淀粉为55R*6-<5R%大米淀粉为6-R*69R&淀粉中含有较高的水分%如马铃薯淀粉含水约-:R&但是由于水分子和淀粉分子中的羟基!),P"形成氢键%使得淀粉呈现晶体结构&

84 发酵工程

表$"&!直链淀粉与支链淀粉的比较

比较项目 直链淀粉 支链淀粉

分子结构 直链状 树枝状

含量 2:R*-5R 75R*9:R糖苷键 !I2%4I糖苷键 !I2%4I糖苷键’!I2%6I糖苷键分子质量 小%一般几万 大%可达数百万聚合度# 低%2::*6::: 高%2:::*3::::::溶解性 胶体 加温加压才溶解为糊化粉

黏度 低 高

遇碘反应 蓝色%络合反应 紫红色%非络合反应

!!#指淀粉分子中葡萄糖的数目&

利用淀粉质原料制备淀粉要经过粗淀粉的精制过程%因为在粗原料中除淀粉外还含有很多杂质%主要是蛋白质’纤维素’脂类物质’灰分等等&在淀粉厂中可以通过过筛’沉淀’离心等方法予以分离&精制后的淀粉纯度一般为83R*84R&

!二"淀粉水解的原理在工业生产上把淀粉通过一定方法水解为葡萄糖的过程称为淀粉的#糖化$过

程%所制得的糖液称为淀粉水解糖液&水解的方法有酸法’酶法’酸酶结合法等&淀粉的这一糖化水解过程实际上并不是单纯的淀粉水解为葡萄糖的过程&首先%淀粉水解成葡萄糖会有糊精’低聚糖’麦芽糖等中间产物的生成/其次%反应生成的葡萄糖之间会发生复合反应%生成龙胆糖’异麦芽糖以及其他低聚糖/另外%还有一部分葡萄糖会发生分解反应%生成5I羟甲基糠醛%然后再进一步分解为一些有机酸和有色物质&5I羟甲基糠醛是淀粉水解液色素产生的根源&这3个方面的反应同时发生%以第一个反应为主%其关系可以通过图3I2表示&

2<淀粉的水解反应淀粉的水解反应是淀粉糖化过程中的主要反应&反应的本质是淀粉分子的

!I2%4I糖苷键和!I2%6I糖苷键被打开%淀粉被不断支解%分子质量逐渐减小&在这个过程中%生成了很多中间产物%如糊精’各种低聚糖等%葡萄糖在反应的开始阶段产生并不多%因为糖苷键的断裂是随机的&反应的总趋势是向小分子物质发展%淀粉$糊精$低聚糖$葡萄糖&反应生成的这些二糖’三糖’四糖等物质对发酵一般是不利的&在谷氨酸发酵的糖化中%二糖’三糖’四糖以及四糖以上多糖的含量%直接影响了糖化率’谷氨酸发酵的产酸率’糖酸转化率%并严重危及谷氨酸的提取%尤其是在味精发酵中出现轻质麸酸%给味精生产带来巨大的损失&糊精是若干分子

94第三章!发酵工业原料和培养基

图$"!!淀粉水解过程中发生的化学反应

质量大于低聚糖%含有不同数目的脱水葡萄糖单位的总称&糊精具有还原性’旋光性’能溶于水’不溶于酒精%因分子大小不同%遇碘会呈现红色’紫色’蓝色等不同颜色&工业生产中可以通过无水酒精或碘溶液检验糖化过程中糊精的存在和水解情况&随着水解的进行%糖液的还原性逐渐增加%甜度!还原基团决定"加大%葡萄糖的含量也逐渐上升%并且开始有副反应发生&

-<葡萄糖的复合反应在淀粉水解过程中%一部分葡萄糖在热和酸的作用下可以发生聚合反应%生成

一些二糖等低聚糖%这就是淀粉水解过程中的葡萄糖的复合反应&这里的二糖%一般不是-分子葡萄糖通过!I2%4I糖苷键聚合成的麦芽糖%而是其他二糖%如通过

!I2%6I糖苷键聚合成的异麦芽糖%通过"I2%6I糖苷键聚合成的龙胆二糖等等&这种复合反应是可逆的&

事实上%工业生产常利用其逆反应%将水解糖液适当稀释%并加酸再水解一次%然后经中和’脱色’过滤再作为发酵培养基碳源%以提高葡萄糖的利用率&葡萄糖的复合反应对发酵是有害的%如谷氨酸发酵%复合反应生成的低聚糖不仅降低了淀粉原料的水解效率%更重要的是这些低聚糖一般不能被谷氨酸发酵微生物所利用%甚至抑制其生长/另外%这些低聚糖还使发酵液残糖增加%降低糖酸转化率%增加谷氨酸提取精制难度&所以%在制备淀粉水解液时应尽量削弱葡萄糖的复合反应&

3<葡萄糖的分解反应在淀粉的水解过程中%葡萄糖除发生聚合反应外%还发生较弱的脱水反应%生

成5I羟甲基糠醛%5I羟甲基糠醛不稳定%又进一步分解成乙酰丙酸’甲酸等%这些物

:5 发酵工程

质相互聚合%或与氨基酸聚合%生成有色物质&

!三"淀粉酸水解制糖工艺

2<淀粉水解糖制备方法概述根据水解所用的催化剂的不同%主要有3种方法(酸解法’酶解法和酸酶结合法&!2"酸解法&酸解法!’B(L>?L#)K?E(E$"&>)L"是淀粉水解糖制备的传统方法%

它是以无机酸!现在也用有机酸"为催化剂%在高温高压下将淀粉水解为葡萄糖的方法&

该法的优点是(工艺简单’水解时间短’设备生产能力大&目前广泛采用此法&该法的缺点是(高温高压以及酸的腐蚀对设备有一定要求/副反应多%影响水解糖液的质量/对原料要求严格%原料淀粉颗粒必须大小均匀%否则造成水解不均一彻底&

!-"酶解法&酶解法!"%H?$">?L#)K?E(E$"&>)L"是用专一性很强的淀粉酶将原料淀粉水解为糊精和低聚糖%再用糖化酶继续水解为葡萄糖的制糖工艺&酶解法一般分两步进行%第一步是利用!I淀粉酶将淀粉水解为糊精和低聚糖%这步使淀粉的溶解性增加%故称液化!K(dD(!(B’&()%"/第二步是用糖化酶将糊精相低聚糖进一步水解为葡萄糖%称为糖化!E’BB>’>!(B’&()%"&此法又称作双酶水解法!L)DNK"I"%H?$">?L#)K?E(E$"&>)L"&

优点(条件温和%设备要求低/酶专一性强%副反应少/淀粉液初始浓度较高%要求较低!颗粒大小可以不均一"/糖液颜色浅%较纯净&

缺点(生产周期长!常需数十个小时"%需要专门的设备!如培养酶的设备"%过滤困难!酶是蛋白质"&但是随着酶制剂工业的发展%酶法取代酸法是淀粉水解糖技术发展的必然趋势&

酸法和酶法制糖工艺的比较见表3I6&!3"酸酶结合法&酸酶结合法!’B(LI"%H?$">?L#)K?E(E$"&>)L"是结合了酸法

和酶法的水解糖制备工艺%兼具两者特点&根据酸法和酶法使用的先后顺序又分为酸酶法和酶酸法两种&

!酸酶法(酸酶法是先将淀粉用酸水解成低聚糖和糊精%再用糖化酶将其水解为葡萄糖的工艺&有些原料的淀粉%如玉米’小麦的淀粉颗粒坚实%用!I淀粉酶短时间内往往作用不彻底%因此有些工厂就先用酸将淀粉水解到一定程度!/;值约

25"%再用糖化酶糖化%解决了这一问题&

"酶酸法(酶酸法是先用!I淀粉酶将原料淀粉水解到一定程度%过滤除去杂质后%再用酸完全水解的工艺&该法适用于较粗的原料%如大米淀粉%可以弥补酸法

25第三章!发酵工业原料和培养基

表$"’!酸法和酶法制糖工艺比较

!参考贺小贤<生物工艺原理<-::3"

比较项目 酸法 酶法

葡萄糖值!/;值" 92 98

淀粉原料浓度 28R*-2R 34R*4:R

葡萄糖含量!干重" 86R 97R

灰分 2<6R :<2R

蛋白质 :<:8R :<2R

5I羟甲基糠醛 :<3R :<::3R

色度 2:<: :<-

淀粉转化率 9:R 98R

工艺条件 高温高压 较温和

过程耗能 高 低

副产物 多 少

生产周期 短 长

设备规模 小 大

设备生产能力 大 小

设备要求 耐高温高压%耐腐蚀 不需耐高温高压%耐腐蚀

葡萄糖收率 较低 较酸法高约2:R

对原料要求较高的缺点%提高原料利用率&总的来说酶法较酸法更好&酸酶结合法各项指标基本介于二者之间&

-<淀粉酸解法工艺流程水解一般以盐酸作为催化剂%产物为糖液即可%不需精制成葡萄糖&工艺

流程(淀粉$调浆$过筛$加酸$进料$糖化$放料$冷却$中和$脱色$过滤$

糖液

技术条件一般选择(!2"淀粉乳浓度28R*-2R&!-"盐酸用量为干淀粉的:<5R*:<8R%使淀粉乳GP值达到2<5左右&!3"进料压力:<:-*:<:3 F’&!4"水解压力:<-8 F’&!5"水解时间一般25$(%左右&

-5 发酵工程

!6"水解终点检查%一般用无水酒精检查无白色反应为止&

3<淀粉水解速度的影响因素淀粉水解的各种条件%如淀粉乳浓度的高低’酸的种类和浓度’水解温度和压

力等都会通过影响水解过程的3个反应影响最终糖液的质量&另外%糖化设备对糖液质量也有一定影响&

!2"淀粉乳浓度的影响&淀粉乳浓度低%水解容易%糖液/;值高%质量高%但是原料的糖化速度低/反之糖化质量下降但速度较快&因此需要根据原料’设备等实际情况选择合适的淀粉乳浓度!一般为28R*-2R%或用糖度表示为28W*29WJe%用波美度表示为2:<5*2-WJf"&例如%精制淀粉乳的浓度可比粗制淀粉乳的浓度选择高些&在设备和生产周期允许的前提下%应该尽量提高水解糖液的质量%采用较低的淀粉乳浓度&

!-"酸的种类和浓度的影响&酸在淀粉水解中提供氢离子!Pa"%是水解的催化剂&不同的酸有不同的催化效能!表3I7"%工业上普遍使用的是盐酸和硫酸&

表$"(!不同酸的催化效能比较

!参考张克旭<氨基酸发酵工艺学<299-"

酸的种类 相对催化效能 酸的种类 相对催化效能

盐酸 2::<:: 亚硫酸 4<8-硫酸 5:<35 醋酸! :<8:草酸 -:<4-

盐酸的催化效能最高%但是缺点是催化副反应的能力也强%以及腐蚀性较强&硫酸也是一种常用的催化剂%虽然催化效能较盐酸略差%但是腐蚀性较小%副反应催化较弱%且硫酸的运输’储存比盐酸方便&但硫酸存在加热蒸发使管道结垢的问题&

酸的浓度或用量也对水解有很大影响&酸的用量大%水解快%但副反应也强%因此酸的用量要适当&

!3"糖化温度和时间的影响&淀粉水解的加热介质是水蒸气%由于糖化锅有专门管道不断排出不凝性气体%因此锅内充满水蒸气%其温度和压力是正相关的&工业上一般控制压力&水解压力也存在一个最适值的问题&压力低%水解慢%压力高水解虽然快%但副反应也快%并且锅体腐蚀也快&据经验%一般控制水解压力在

:<-8*:<3- F’&!4"糖化锅结构的影响&淀粉水解过程都是在糖化锅内进行的%因此糖化锅的

结构是否合理对水解糖液的质量也有一定影响&首先%糖化锅的容积不能太大&

35第三章!发酵工业原料和培养基

淀粉水解时间不长!25$(%左右"%要保证进料放料迅速%尽量避免副反应&锅体太大%也会使蒸汽难以均匀作用%造成水解不彻底&其次%锅的外形要合理&工业发酵糖化锅一般采取封闭罐形结构&径高比在2T!2*2<5"之间&径高比太大%锅体太矮%直径过大%锅内死角增加%影响糖化进行/径高比太小%锅体过高%锅内上下水解不均匀&最后%糖化锅的附属管道设计应保证进出料迅速%尽量缩短辅助时间&

!5"影响糖化终点的因素&糖化终点的掌握对糖液最终质量的控制有重要作用&由图3I-可以看出%由于副反应的存在%糖化时间过长反而会降低糖液的葡萄糖含量&在图中%最佳糖化终点应在&点%考虑到放料也需要时间%因此要稍微提前一点时间放料!图中<点至@点"&

图$"#!糖化终点与糖化时间的关系

4<淀粉水解糖液的中和!脱色和压滤淀粉水解糖液在进入发酵罐前必须经过预处理%即中和’脱色和压滤&从糖化锅出来的糖化液是酸性的%因此必须先中和&另外%糖液中的蛋白质’

氨基酸等杂质也可以用中和至等电点GP值的办法将沉淀除去&一般GP值调到

4<6*4<8%不同种类的淀粉原料略有不同%生产实践中可先通过小试确定最佳

GP值&中和所用的碱性物质一般有两种选择(纯碱!0’-+,3"或烧碱!0’,P"&纯碱温和%但中和过程中易产生泡沫!+,-"/烧碱则容易造成局部过碱%产生焦糖%对发酵不利&

所以使用纯碱一般要先将其溶于一倍热水中%缓慢加入/烧碱则要边加入边搅拌%并不断测糖液的GP值&中和的温度也很重要&中和温度过高%影响下步脱色效果/过低%黏度大%影响过滤&从糖化锅出来的糖化液温度很高!24:*25:‘"%需先通过缓冲桶降温&中和过程中一般保持7:*8:‘&

糖液内的杂质尤其是有色物质对发酵过程和发酵产品的色泽都有不利影响%

45 发酵工程

应当在发酵前设法除去&脱色本身也是去除糖液之中杂质的过程&脱色的具体方法主要有传统活性炭脱色法’离子交换树脂脱色法和新型磺化煤脱色法&

脱色结束后%要进行压滤&压滤要注意以下几点(!压滤温度要适宜&压滤温度过高%则中和至等电点的蛋白质沉淀不完全%蛋白质的溶解度受温度影响%高温过滤温度下降后蛋白质又会沉淀出来%降低了过滤效果/而过滤温度过低又使糖液黏度过大%增加过滤阻力%所以一般选取过滤温度为6:*7:‘/"压滤机要定时出渣%一般压滤4*5次出渣一次%防止滤布堵塞/#滤布要保持清洁%经常清洗%必要时更换滤布&

!四"淀粉酶水解制糖工艺除了酸水解工艺以外%淀粉的另一大水解工艺就是酶水解法&由于酶法主要

用到了!I淀粉酶和糖化酶两种酶%因此又叫双酶水解法&酸水解工艺有一些固有的缺点%-:世纪6:年代以来%国外酶水解理论上取得了长足进展%日本更是率先实现了酶法制糖的工业化生产&酶法制糖条件温和’糖液质量高%是淀粉水解制糖工艺未来的发展趋势&

双酶水解法较之酸水解法设备要复杂一些&酸法的核心设备就是糖化锅%而酶法则有很多附属设备&双酶水解法的主要设备和工艺流程见图3I3&

2<调降配料槽/-%8<过滤器/3%9%24%27<泵/4%2:<喷射加热器/5<缓冲器/6<液化层流罐/7<液化液贮罐/22<灭菌罐/2-<板式换热器/23<糖化暂贮罐/25<压滤机/

26<糖化暂贮罐/28<贮糖罐/29<水/-:<蒸汽/-2<!I淀粉酶/--<氯化钙/-3<碱液/-4<淀粉/-5<糖化酶

图$"$!双酶水解法的主要设备和工艺流程

!参考韦革宏等<发酵工程<-::8"

2<液化双酶水解法的第一个步骤是通过!I淀粉酶的催化作用水解原料淀粉%使淀粉

55第三章!发酵工业原料和培养基

液黏度不断下降%流动性增强%故称液化&

!I淀粉酶能水解淀粉中的!I2%4I糖苷键%生成,型葡萄糖&!I淀粉酶不能水解淀粉中的!I2%6I糖苷键%但能越过!I2%6I糖苷键继续作用&!I淀粉酶的作用是从淀粉内部开始的%其水解具有一定的随机性&!I淀粉酶的水解产物主要是麦芽糖和葡萄糖以及少量其他低聚糖%!I淀粉酶再水解麦芽糖内的!I2%4I糖苷键是很难的&例如%一般直链淀粉的水解产物含麦芽糖约87R%葡萄糖约23R&!I淀粉酶水解支链淀粉的方式与直链淀粉相似%能水解淀粉中的!I2%4I糖苷键%但不能水解

!I2%6I糖苷键&由于分支处的!I2%6I糖苷键的存在%使产物还含有异麦芽糖和带分支的低聚糖&例如%一般支链淀粉水解产物为73R麦芽糖%29R葡萄糖%8R异麦芽糖以及少量带分支的低聚糖&!I2%6I糖苷键的存在使!I淀粉酶的水解速度下降%因此支链淀粉比直链淀粉水解速度慢&淀粉液总的水解趋势是大分子逐渐变成小分子%速度也是开始较快%末期较慢&

!I淀粉酶主要由以下几种微生物通过发酵生产(黑曲霉!<(=4:>/001(8/>4:"’黄曲霉!<(=4:>/001(A0-B1("’枯草芽孢杆菌!&-./001(((123/0/("’巨大芽孢杆菌!&-./001(>-3+-:/17"等&国内一般都使用枯草芽孢杆菌%较易培养&!I淀粉酶制剂有两种形式(固体和液体&液体酶制剂价格较低%但需低温保存%且活力丧失快/固体酶制剂价格较高%但较易保存%活力损失也较慢&!I淀粉酶系蛋白质%保存时应尽量避光’低温’干燥并加入一些酶的保护剂防止其变性失活&

酶的本质是蛋白质%因此其作用的发挥受很多条件影响%如底物状态’GP值’温度以及作用环境中的某些物质等&天然淀粉是以颗粒状存在的%有一定晶型%

!I淀粉酶很难直接作用&因此淀粉在液化前必须先加热糊化%破坏其晶体结构%使淀粉分子充分浸出%再加入!I淀粉酶&据试验%淀粉颗粒的水解速度和淀粉糊化液的水解速度之比为2T-::::&刘延奇等研究酶催化水解对马铃薯淀粉结构的影响%认为!I淀粉酶对马铃薯淀粉的作用是从颗粒的表面开始的%酶只在淀粉颗粒的表面进行反应%导致颗粒的表面被腐蚀水解&近年来更有报道通过微波改性淀粉再用!I淀粉酶水解%经过微波改性的淀粉对酶敏感性更强&从生物化学知识我们知道%酶的催化效能随温度升高而提高%但是酶作为一种蛋白质%温度太高就会变性%因此每种酶都有一个最适催化温度&一般的酶其最适催化温度多在4:‘左右&!I淀粉酶对温度的耐受力较强%如国内以枯草芽孢杆菌生产的!I淀粉酶

J_7658%6:‘保温2:$(%几乎没有活力损失%而一般的酶则大部分失活了&生产上希望尽量快的完成液化%因此液化温度较高%一般选88*9:‘%并加入钙离子作为保护剂&若能进一步提高液化温度%将会使液化速度更快%但是需要!I淀粉酶有更好的温度耐受能力&目前国内外都有了研究耐高温!I淀粉酶的报道%可以说这

65 发酵工程

是双酶水解法的热点问题&同温度一样%每种酶也都有自己最适的GP值&!I淀粉酶在GP6<:*7<:较稳定%在GP5以下失活严重%最适GP值为6<-*6<4%如图3I4所示&但最适GP值也与温度相关%温度高则最适GP值偏碱%反之偏酸&

图$"%!!"淀粉酶活力与9<值关系

当然还有其他影响因素影响酶的活力&研究表明%淀粉乳中淀粉和糊精分子的存在本身就对!I淀粉酶有一定的保护作用&例如%8:‘加热2>%在淀粉乳浓度

2:R的情况下%酶活力残余94R/而在没有淀粉乳的情况下%酶活力仅残余-4R%如图3I5所示&

图$"&!!"淀粉酶稳定性与淀粉乳浓度关系

!I淀粉酶实质上是一种金属酶%其活性非常依赖钙离子&如果没有钙离子%则其活性几乎完全消失&图3I6表示!I淀粉酶活力与钙离子浓度的关系%由图可见%低浓度的钙离子对酶的活性提高有重要作用&工业上一般使用+’+K- 或+’Z,4%保持+’-a在:<:2$)K0@左右&钠离子对!I淀粉酶的稳定也有一定作用%一般使用也是浓度:<:2$)K0@左右&

酶的用量也会影响酶解速度&这要依酶的活力和原料而定&例如%国产

J_7658%水解薯类淀粉用量一般8*2:个活力单位0.淀粉&

75第三章!发酵工业原料和培养基

图$"’!!"淀粉酶活力与钙离子浓度关系

淀粉的液化速度是先快后慢%且液化产物多为双糖%因此没必要为追求更高的液化液/;值而延长液化时间&酶解法虽然没有酸解法那么强的副反应%但是液化毕竟是在高温下进行的%时间过长%一部分已经液化的淀粉又会重新结合成大分子!类似淀粉糊化时间过长引起的淀粉老化现象"%给糖化带来不便&因此一般液化时间2:*25$(%%控制液化液/;值2:*-:即可&工业上常用碘液显色法控制液化终点&

液化的具体工艺主要有4种(一次升温液化法’连续进出料液化法’喷射液化法和分段液化法&前两种方法较传统%后两种方法是近年来发展很快的新方法&液化结束后%升温至2::‘2:$(%灭酶%压滤去渣%降温就可以进行糖化了&

-<糖化!2"糖化酶的作用特点&糖化酶又称葡萄糖淀粉酶%其作用是将!I淀粉酶液化

产生的糊精等物质进一步水解成葡萄糖&糖化酶不同于!I淀粉酶%它的作用方式是从底物的非还原末端一个分子一个分子地切下葡萄糖单位%产生!I葡萄糖%因此是一种外切酶&糖化酶既可以作用于!I2%4I糖苷键%也可作用于!I2%6I糖苷键%但速度较慢!约为前者的203"&

糖化酶主要来源于曲霉属!<(=4:>/001("和根霉属!C+/D5=1("及拟内孢霉属!?8"57;.4("的微生物&曲霉类常用的是黑曲霉!<(=4:>/001(8/>4:"%糖化温度高’GP值低%速度快%且不论液体’固体都可进行大规模培养%是国内糖化酶主要来源&但黑曲霉产生的糖化酶往往不纯%常含有转苷酶!催化葡萄糖基转移%生成含有!I2%6I糖苷键的非发酵性低聚糖%如异麦芽糖"等杂质%因此使用前应设法尽量纯化&根霉类常用的如雪白根霉!C+/D5=1(8/B41("’龚氏根霉!C+/D5=1(.5+/("等%其所产糖化酶系纯’活力高!糖化液/;值可达98%而黑曲霉的糖化酶只能达到

96"%但缺点是不易大规模培养%尤其是液体培养活力很低%因此还没有大规模使用&糖化酶的保存条件和失活速度与!I淀粉酶基本接近&

85 发酵工程

!-"糖化工艺条件&不同来源的糖化酶最适反应条件一般不同&一般最适

GP值偏酸性%最适温度5:‘左右&如曲霉类最适GP4<:*4<5%最适温度55*6:‘/拟内孢霉类最适GP4<8*5<:%最适温度5:‘&糖化过程温度宜尽量高些%

GP值低些%这样糖化速度快%糖液质量高%而且不易染杂菌&糖化酶用量主要根据酶活决定&一般3:R淀粉浓度%加酶8:*2::活力单

位0.淀粉&糖化速度开始很快%/;值达到顶峰后会下降%这是由于酶中的杂质催化了葡萄糖转移反应等副反应而消耗了葡萄糖所致%见图3I7&所以糖化要及时结束&一般糖化时间在-4>左右%糖化终点可用无水酒精检验&糖化设备与液化设备也基本相同&

图$"(!典型糖化曲线

糖化结束后%升温至2::‘5$(%灭酶%降温’过滤进入贮罐准备发酵使用&总的来说双酶法制糖比酸法条件温和且生产的糖液质量高&酶法制糖现在又有了新的发展%即固定化酶在淀粉制糖中的应用%这将使酶法水解工艺更上一个台阶&

!五"水解糖液质量要求不论是酸法还是酶法亦或是两者结合的方法制得的水解糖液必须达到一定的

要求才能用于发酵生产&主要要求有(色泽为浅黄/透光率要求%6:R/无糊精反应/还原糖含量为28R左右//;值要%9:R/GP 值介于4<6*4<8/并要求无杂菌%不变质%蛋白质等杂质含量合格&

二!糖蜜原料培养基的制备过程

糖蜜!A’E&"$)K’EE"E"是制糖工业的废液%是一种很有潜力的发酵原料&糖蜜

用于发酵生产%可降低成本%节约能源%便于实现高糖发酵工艺&国内使用糖蜜作为发酵原料还不普遍%但在国外%糖蜜已经是一种普遍采用的碳源&例如%日本生产的味精%主要碳源就是糖蜜&

95第三章!发酵工业原料和培养基

糖蜜根据来源的不同%分为甘蔗糖蜜!B’%"$)K’EE"E"和甜菜糖蜜!N""&$)K’EIE"E"&还有一种糖蜜称为高级糖蜜!>(.>"E&$)K’EE"E"%是指甘蔗榨汁后加入适当硫酸或用酵母转化酶处理%使其含糖量有大幅度提高!7:R*8:R"的糖蜜&另外%葡萄糖工业上不能再结晶的葡萄糖母液也称葡萄糖蜜!.KDB)E"$)K’EE"E"&

!一"糖蜜原料的性质和组成糖蜜的外观是一种黑褐色’黏稠的液体%GP5<5左右%其成分不同种类有一定

差异%如表3I8所示&

表$")!糖蜜的一般组成!参考张克旭<氨基酸发酵工艺学<299-"

种类 甜菜糖蜜0R 甘蔗糖蜜0R 高级糖蜜0R

总固形物 78*85 78*85 86*9-

总糖 48*58 5:*58 7:*86

0 :<-:*-<8: :<:8*:<5: :<:5*:<-5

总灰分 4<:*8<: 3<5*7<5 2<8*3<6

O-, -<-*4<5 :<8*-<- :<-*:<7

+’, :<25*:<7: :<25*:<8: :<25*:<35

Z(,- :<2:*:<5: :<:5*:<3: :<:7*:<-5

F-,5 :<:2*:<:- :<::9*:<:7 :<:3*:<--

., :<:2*:<2: :<-5*:<8: :<2-*:<-5

!二"糖蜜原料的预处理糖蜜的预处理%主要包括澄清处理和脱钙处理%在某些发酵中!如谷氨酸发

酵"%还要做去除生物素的处理&糖蜜中含有一定比例的灰分%影响菌种生长%也影响产品纯度&糖蜜中还含有

大量的胶体物质!如蛋白质"%如不除去%则在发酵中会造成大量泡沫%影响发酵生产&糖蜜的澄清处理%主要目的就是除去其中的灰分和胶体物质&具体澄清方法主要有两种(硫酸处理法和石灰处理法&前者的主要工艺流程(稀释!2T2"$调

GP值!P-Z,4"至-<:$加热!95*2::‘"-:$(%$中和!25R石灰乳"$沉淀过滤$澄清液&后者主要工艺流程(稀释!2T2"$调GP值!25R石灰乳"至7<5$加热!2::‘"3:$(%$中和!P-Z,4"$沉淀过滤澄清液&两种方法各有优点%但是

:6 发酵工程

不论哪种方法%都要注意反应过程中产生了大量不溶性的钙盐%尤其是硫酸钙%一定要去除彻底%否则影响发酵&例如%糖蜜原料蒸馏酒的发酵%若糖蜜原料澄清处理后硫酸钙去除不彻底%则在蒸馏时就会结块%严重影响生产的进行&

糖蜜中含有较多的钙盐%虽然澄清处理去除了一些%但一般仍要进行脱钙处理&通常加入一些钙离子的沉淀剂以脱钙%如 0’-Z,4’0’-+,3’0’-Z(,3’

0’3F,4’草酸’草酸钾等&例如%以纯碱!0’-+,3"进行脱钙%向糖蜜中加入4R的纯碱%稀释到3:R%8:‘加热3:$(%%沉淀过滤%糖蜜中钙盐浓度可降到:<:-R*:<:6R&

糖蜜的具体预处理方法还有很多%如王玉香等在以甘蔗糖蜜为碳源发酵生产黄原胶的研究中提到了8种糖蜜的预处理方法(!取糖蜜稀释液!含糖量5R%下同"加入黄血盐搅拌均匀后静置%过滤收集滤液/"取糖蜜稀释液加入黄血盐%搅拌均匀后加入活性炭%静置后过滤收集滤液/#取糖蜜稀释液加入黄血盐%搅拌均匀后加入硅藻土%静置后过滤%收集滤液/$取糖蜜稀释液加入黄血盐%搅拌均匀后加入;/S1煮沸过滤%收集滤液/%取糖蜜稀释液加入硅藻土%静置过滤%收集滤液/

&取糖蜜稀释液加入活性炭%静置后过滤%收集滤液/’取糖蜜稀释液加入硅藻土和活性炭混合处理%静置后过滤取滤液/(取糖蜜稀释液加 P-Z,4 调GP 值至

-<:*-<8%再加+’!,P"-调GP值至7<-左右%68‘保温3:$(%后加入活性炭%过滤收集滤液&

在谷氨酸等的发酵中%糖蜜原料除了澄清和脱钙处理%还要设法去除生物素&生物素等关键生长因子的含量对这类应用营养缺陷型菌株进行代谢控制发酵的生

产至关重要&一般甘蔗糖蜜含生物素2*3+.0.甜菜糖蜜也含生物素:<3*2+.0.%而谷氨酸发酵要求发酵液生物素含量低于2:+.0@%以发酵液含糖蜜2:R计%生物素浓度也超过规定几十倍甚至上百倍%因此必须大量脱除生物素&脱除生物素的具体方法有活性炭处理法’树脂处理法’亚硝酸处理法’辐射处理法等&

思 考 题

2<发酵工业原料选择的标准是什么1

-<简述发酵培养基中的成分及各成分的定量

3<发酵工业上常用的碳源有哪些1 各有什么特点1

4<简述发酵工业中常用作氮源的蛋白质类原料的种类及特点&

5<发酵培养基的碳氮比对菌体的生长和产物生成有哪些影响1

6<简述发酵培养基中所含的无机元素及其生理功能&

7<什么是生长因子’前体’产物促进剂和抑制剂1 试举几例&

26第三章!发酵工业原料和培养基

8<简述发酵培养基的种类及其成分特点&

9<配制发酵培养基时应注意哪些问题1 本着什么原则进行配制1

2:<某个培养基配方为(葡萄糖’蛋白胨’淀粉酶’铜’镁’锌离子%你认为是否合理1

22<分析淀粉水解制糖的意义%并说明发酵工业制备糖液的各种工艺及各自优缺点&

2-<酸水解淀粉制糖的原理和工艺%请分析其影响因素&

23<说明双酶法水解淀粉制糖的工艺及特点&

24<试述糖蜜原料的性质和预处理方法&

25<影响培养基质量的因素有哪些1

26<查找一篇有关通过培养基配比提高产品质量的文献资料&

-6 发酵工程

第四章!发酵工业灭菌

第一节!常用的灭菌方法及原理

一!化学灭菌法

化学灭菌是用化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法&一般化学药剂

无法杀死所有的微生物%而只能杀死其中的病原微生物%所以是起消毒剂的作用%而不能起灭菌剂的作用&能迅速杀灭病原微生物的药物%称为消毒剂&能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物%称为防腐剂&但是一种化学药物是杀菌还是抑菌%常不易严格区分&

化学药剂灭菌法的原理是利用药物与微生物细胞中的某种成分产生化学反

应%如使蛋白质变性’核酸的破坏’酶类失活’细胞膜透性的改变而杀灭微生物&化学药剂灭菌法可用于器皿’生产小器具’双手’实验室和无菌室的环境灭菌%

但不能用于培养基灭菌&常用的化学药剂有(石炭酸’甲醛’氯化汞’碘酒’酒精等&化学药品灭菌的使用方法%根据灭菌对象的不同有浸泡’添加’擦拭’喷洒’气态熏蒸等方法&表4I2列出了常用化学药剂及使用方法&

表%"!!常用消毒化学药剂及使用方法

化学消毒剂 用途 常用浓度 备注

2<氧化剂!!高锰酸钾 皮肤消毒 :<2R*:<-5R!!漂白粉 发酵工厂环境消毒 -R*5R 环境消毒可直接使用粉体

-<醇类!!乙醇 皮肤及器物消毒 7:R*75R 器物消毒浸泡3:$(%3<酚类

!!石炭酸浸泡衣服’擦拭房间和桌面’喷雾消毒 2R*5R

!!来苏水 皮肤’桌面’器物消毒 3R*5R4<甲醛 空气消毒 2R*-R!2:*25$@0$3"!加热熏蒸

5<胺盐

!!新洁尔灭 皮肤器械消毒 :<2R*:<-5R 浸泡3:$(%

二!射线灭菌法

射线灭菌法的原理是微生物细胞在紫外线照射下细胞中/01遭到破坏%形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物%抑制/01正常复制/空气在紫外线照射下产生的臭氧!,3"也有一定的杀菌作用&

常用的射线有紫外线’]射线和-射线’高速电子流的阴极射线&以紫外线最常用%波长-6:%$左右灭菌效率最高&一般用3:Q 紫外灯照射3:$(%&紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用%但是细菌的芽孢和霉菌的孢子对紫外线的抵抗力较强&紫外线的穿透力低%只能用于表面灭菌%对固体物料灭菌不彻底%也不能用于液体物料灭菌&一般用于无菌室’接种台和培养间等空间灭菌&空气中悬浮杂质多%灭菌效率低/温度高%灭菌效率高/湿度大%紫外灯的使用寿命长&

三!干热灭菌法

干热灭菌法的灭菌机制主要是在干燥高温条件下%微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原反应速度迅速增加%使微生物的致死率迅速增高&氧化作用导致微生物死亡是干热灭菌的主要依据&微生物对干热的耐受力比对湿热强得多%因此%干热灭菌所需要的温度较高’时间较长&干热灭菌的温度和时间关系见表4I-&

表%"#!干热灭菌需要的温度和时间

灭菌温度0‘ 27: 26: 25: 24: 2-2

灭菌时间0$(% 6: 2-: 25: 28: 过夜

最简单和常用的干热灭菌是将金属或其他耐热材料制成的器物在火焰上灼

烧%称为灼烧灭菌法&在实验室的接种操作中%就是采用这种方法&大多数的干热灭菌是利用电热或红外线在某设备内加热到一定温度将微生物杀死%例如%实验室内常用的干燥箱对玻璃器具等的灭菌%常采用26:‘%2-:$(%&干热灭菌用于灭菌后要求保持干燥的物料和器具等&

四!湿热灭菌法

湿热灭菌法的原理是借助蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质’酶和核酸分子内部的化学键%特别是氢键受到破坏%引起不可逆的变性%使微生物死亡&在有水分存在的情况下%蛋白质更易受热而凝固变性&湿热灭菌的温度和时间需根据灭菌对象和要求来决定&一般%水分含量增加%蛋白质凝固变性的温度显著降

46 发酵工程

低&卵蛋白水分含量与凝固温度的关系如表4I3所示&

表%"$!卵蛋白水分含量与凝固温度的关系

卵蛋白含水量0R 5: -5 25 5 :

凝固温度0‘ 56 76 96 249 265

杀死微生物的极限温度称为致死温度&在致死温度下%杀死全部微生物所需的时间称为致死时间&高于致死温度的情况下%随温度的升高%致死时间也相应缩短&一般的微生物营养细胞在6:‘下加热2:$(%即可全部被杀死%但细菌的芽孢在2::‘下保温数十分钟乃至数小时才能被杀死&不同微生物对热的抵抗力不同%常用热阻来表示&热阻是指微生物细胞在某一特定条件下!主要是指温度和加热方式"的致死时间&一般评价灭菌彻底与否的指标主要是看能否完全杀死热阻大的芽孢杆菌&表4I4列出某些微生物的相对热阻和对灭菌剂的相对抵抗力&

表%"%!某些微生物的相对热阻和对灭菌剂的相对抵抗力!与大肠杆菌比较"

灭菌方式 大肠杆菌 霉菌孢子 细菌芽孢 噬菌体或病毒

干热 2 -*2: 2::: 2湿热 2 -*2: 3V2:6 2*5苯酚 2 2*- 2V2:9 3:甲醛 2 -*2: -5: -紫外线 2 -*2:: -*5 5*2:

!一"微生物受热的死亡定律在一定温度下%微生物的受热死亡遵循分子反应速度理论&在微生物受热死

亡过程中%活菌数逐渐减少%其减少量随残留活菌数的减少而递减%即微生物的死亡速率!L’0L3"与任何一瞬时残存的活菌数成正比%称之为对数残留定律%用下式表示(

!![L’L3UE’!4I2"

式中(’)培养基中残存的活菌数%个/3)灭菌时间%E/E)灭菌反应速度常数或称

为菌比死亡速率%E[2%E值的大小与灭菌温度和菌种特性有关/L’L3)活菌数的瞬

时变化速率%即死亡速率%个0E&式!4I2"通过积分可得

56第四章!发酵工业灭菌

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式中(’:)灭菌开始时原有的菌数%个/’&)灭菌结束时残留的菌数%个&根据上述的对数残留方程式%灭菌时间取决于污染程度!’:"’灭菌程度!残留

的活菌数’&"和灭菌反应速度常数E&如果要求达到完全灭菌%即从’&U:%则所需的灭菌时间3无限延长%事实上是不可能的&实际设计时常采用’&U:<::2!即在2:::批次灭菌中只有2批次是失败的"&

菌体死亡属于一级动力学反应式!4I2"&灭菌反应速度常数E是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据&不同微生物在同样的温度下E值是不同的%E值越小%则微生物越耐热&温度对E值的影响遵循阿仑乌斯定律%即

!!EU<"[.?CH!4I4"

式中(<)比例常数%E[2/.?)活化能%=0$)@/C)气体常数%4<2868V2<98=0!$)K.

O"/H)绝对温度%O&培养基在灭菌以前%存在各种各样的微生物%它们的E值各不相同&式!4I4"

也可以写成

!!K.EU [?-*3:3CHaK.<

!4I5"

这样就得到只随灭菌温度而变的灭菌速度常数E的简化计算公式%可求得不同温度下的灭菌速度常数&细菌芽孢的E值比营养细胞小得多%细菌芽孢的耐热性要比营养细胞大&同一种微生物在不同的灭菌温度下%E值不同%灭菌温度越低%E值越小/灭菌温度越高%E值越大&如硬脂嗜热芽孢杆菌2528%2:4‘时E值为:<:34-$(%[2%2-2‘时E值为:<77$(%[2%232‘时E值为25$(%[2&可见%温度增高%E值增大%灭菌时间缩短&表4I5列出几种微生物E值&

表%"&!!#+=时不同细菌的!值 $(%[2

菌种 E值 菌种 E值

枯草芽孢杆菌_Z5-3: :<:43*:<:63 硬脂嗜热芽孢杆菌_Z627 :<:43硬脂嗜热芽孢杆菌_Z2528 :<:23 产气梭状芽孢杆菌F13679 :<:3

66 发酵工程

!二"杀灭细菌芽孢的温度和时间成熟的细菌芽孢除含有大量的钙I吡啶二羧酸成分外%还处于脱水状态%成熟

芽孢的核心只含有营养细胞水分的2:R*3:R&这些特性都大大增加了芽孢的抗热和抵抗化学物质的能力&在相同的温度下杀灭不同细菌芽孢所需的时间是不同的%一方面是因为不同细菌芽孢对热的耐受性是不同的%另外培养条件的不同也使耐热性产生差别&因此%杀灭细菌芽孢的温度和时间一般根据试验确定%也可以推算确定&例如%M’>%计算2::*235‘范围内大多数细菌芽孢的温度系数I2:!温度每升高2:‘时速度常数与原速度常数之比"为8*2:%以此为基准推算不同温度下的灭菌时间%结果见于表4I6&

表%"’!多数细菌芽孢的灭菌温度与时间

温度0‘ 2:: 22: 225 2-2 2-5 23:

时间0$(% 2-:: 25: 52 25 6<4 -<4

五!介质过滤除菌法

介质过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质%以阻截空气中所含微生物%而取得无菌空气的方法&通过过滤除菌处理的空气可达到无菌%并有足够的压力和适宜的温度以供好氧微生物培养过程之用&

介质除菌原理(将过滤介质填充到过滤器中%空气流过时借助惯性碰撞’阻截’扩散’静电电极吸附’沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中%达到除菌的目的&

填充床过滤器有(!2"纤维或颗粒介质填充床过滤器(过滤介质包括棉花’玻璃纤维’腈纶’涤纶’

维尼纶或活性炭等&!-"折叠式硼硅酸超细纤维过滤器(过滤介质有超细玻璃纤维&!3"烧结金属’陶瓷过滤器&膜过滤!绝对过滤"器(膜过滤的原理是利用微孔滤膜!$(B#)G)#)DE$"$I

N#’%""对空气进行过滤%膜的孔径为:<-:*:<45+$%大于这一孔径的微生物能绝对截留&膜过滤器的过滤介质有聚四氟乙烯’偏聚二氟乙烯’聚丙烯和纤维素脂膜等&

表4I7列出了各种灭菌方法的特点及适用范围&

76第四章!发酵工业灭菌

表%"(!各种灭菌方法的特点及适用范围

灭菌方法 原理与条件 特点 适用范围

火焰灭菌法 利用火焰直接把微生物杀死

方法简单’灭菌彻底%但适用范围有限

适用 于 接 种 针’玻 璃棒’试管口’三角瓶口的灭菌

干热灭菌法 利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌

灭菌后物料可保持干燥%方法简单%但灭菌效果不如嗜热灭菌

适用于金属或玻璃器皿的灭菌

湿热灭菌法 利用高温蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌

蒸汽来源容易’潜力大’穿透力强’灭菌效果好’操作费用低’具有经济和快速的特点

广泛应用于生产设备及培养基的灭菌

射线灭菌法 用射线穿透微生物细胞进行灭菌

使用方便%但穿透力较差%适用范围有限

一般只用于无菌室’无菌箱’摇瓶间和器皿表面的消毒

化学试剂灭菌法 利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细胞等进行灭菌

使用方法较广%可用于无 法 用 加 热 方 法进行

常用于环境空气的灭菌及一些表面的灭菌

过滤除菌法 利用过滤介质将微生物菌体细胞过滤进行除菌

不改变物性而达到灭菌目的%设备要求高

常用于生产中空气的净化除菌%少数用于容易被热破坏的培养基的灭菌

第二节!培养基与发酵设备的灭菌

尽管灭菌的方法很多%但发酵生产中对培养基和设备的灭菌%以湿热灭菌法应用最为普遍%灭菌效果最好&

一!培养基的灭菌

培养基灭菌最基本的要求是杀死培养基中混杂的微生物%再接入纯菌以达到纯种培养的目的&在利用蒸汽对培养基灭菌的过程中%由于蒸汽冷凝时会释放出大量的潜热%并具有强大的穿透能力%在高温及存在水分的条件下%微生物细胞内的蛋白质极易变性或凝固而引起微生物的死亡%故湿热灭菌法在培养基灭菌中具有经济和快速的特点&但高温虽然能杀死培养基中的杂菌%同时也会破坏培养基中的营养成分%甚至会产生不利于菌体生长的物质&因此%在生产上除了尽可能杀死培养基中的杂菌外%还要求尽可能减少培养基中营养成分的损失&合理选择灭菌条件是关键%这就要求必须了解在灭菌过程中温度’时间对微生物死亡和培养基

86 发酵工程

营养成分破坏的关系&一般最常用的灭菌条件是2-2‘%-:*3:$(%&工业化生产中培养基的灭菌采用湿热灭菌的方式%主要有两种方法(分批灭菌

和连续灭菌&

!一"液体培养基的灭菌

图%"!!培养基分批灭菌过程中温度变化情况

!参考韦革宏等<发酵工程<-::8"

2<分批灭菌分批灭菌又称为间歇灭菌%就是将配制好

的培养基全部输入到发酵罐内或其他装置中%通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温

度后维持一定时间%再冷却到接种温度%这一工艺过程也称为实罐灭菌&分批灭菌过程包括升温’保温和冷却3个阶段%图4I2为培养基分批灭菌过程中温度变化情况&图4I-为分批灭菌的进汽’排汽及冷却水管路系统&在培养基灭菌之前%通常应先将与罐相连的分空气过滤器用蒸汽灭菌并用空气吹干&分批灭菌时%先将输料管路内的污水放掉冲净%然后将配制好的培养基用泵送至发酵罐!种子罐或补料罐"内%同时开动搅拌器进行灭菌&灭菌前先将各排气阀打开%将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热%当罐温升至8:*9:‘%将排汽阀逐渐关小&这段预热时间是为了使物料溶胀和受热均匀%预热后再将蒸汽直接通入到培养基中%这样可以减少冷凝水量&当温度升到灭菌温度2-2‘%罐压为2V2:5F’!表压"时%打开接种’补料’消泡剂’酸’碱等管道阀门进行排汽%并调节好各进汽和排汽阀门的排汽量%使罐压和温度保持在一定水平上进行保温&生产中通常采用的保温时间为3:$(%&在保温的过程中应注意%凡在培养基液面下的各种入口管道均通入蒸汽%即#三路进汽$%蒸汽从通风口’取样口和出料口进入罐内直接加热/而在液面以上的管道口则应排放蒸汽%即#四路出汽$%蒸汽从排汽’接种’进料和消沫剂管排汽/这样做可以不留灭菌死角&保温结束时%先关闭排汽阀门%再关闭进汽阀门%待罐内压力低于无菌空气压力后%立即向罐内通入无菌空气%以维持罐压&在夹套或蛇管中通冷水进行快速冷却%使培养基的温度降至所需温度&

分批灭菌不需要其他设备%操作简单易行%规模较小的发酵罐往往采用分批灭菌的方法&主要缺点是加热和冷却所需时间较长%增加了发酵前的准备时间%也就相应地延长了发酵周期%使发酵罐的利用率降低&所以大型发酵罐采用这种方法在经济上是不合理的&同时%分批灭菌无法采用高温短时间灭菌%因而不可避免地

96第四章!发酵工业灭菌

2<接种管/-%4%25%27<排汽/3<进料管/5%2:%2-%24<进汽/6<进气管/7<冷疑水/8<冷却水进口/9<排料管/22<取样管/23<冷却水出口/26<消沫剂管/28<出气管

图%"#!分批灭菌的进汽#排汽及冷却水管路系统!参考罗大珍等<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏&但是对于极易发泡或黏度很大难以连续灭菌的培养基%即使对于大型发酵罐也不得不采用分批灭菌的方法&

-<连续灭菌在培养基的灭菌过程中%除了微生物的死亡外%还伴随着培养基营养成分的破

坏%而分批灭菌由于升降温的时间长%所以对培养基营养成分的破坏大%而以高温’快速为特征的连续灭菌可以在一定程度上解决这个问题&连续灭菌时%培养基可在短时间内加热到保温温度%并且能很快地被冷却%保温时间很短%有利于减少培养基中营养物质的破坏&连续灭菌是将培养基通过专门设计的灭菌器%进行连续流动灭菌后%进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式&也称之为连消&图4I3是连续灭菌的设备流程图&连续灭菌是在短时间加热使料液温度升到灭菌温度

2-6*23-‘%在维持罐中保温5*8$(%%快速冷却后进入灭菌完毕的发酵罐中&

!二"固体培养基的灭菌固体培养基一般为粒状’片状或粉状%流动性差%也不易翻动%加热吸水后成团

状%热传递性能差%降温慢&如果固体培养基较少%采用常规的湿热灭菌的方法就可

:7 发酵工程

2%9<蒸汽/-<配料预热罐/3<泵/4<连消塔/5<维持塔/6<冷却管/7<无菌培养基/8<冷却水管

图%"$!培养基连续灭菌流程图!参考李艳等<发酵工程原理及技术<-::8"

以%如果灭菌物品量较大%如大量食用菌培养基的灭菌%则可采用传统的灭菌方法%即自制的土蒸锅&通常用砖砌成灶%放上铁锅%锅的直径为2::*22:B$%上面用铁板卷成桶!也可用砖或木料"%蒸锅高2$%附有蒸帘和锅盖&蒸料时采取水开后顶气上料的方法%即先在蒸帘上撒上一层2:B$厚的干料%以后哪冒气往哪撒料%直到装完为止&但料不要装到桶口%应留有25B$左右空隙%以保证蒸汽流通&用耐高温塑料将桶口包住%外面用绳固定住%塑料布鼓气后呈馒头状%锅内温度达

98‘以上%计时灭菌->%自然冷却!闷锅"&这种灭菌方法不能达到完全灭菌的目的%只能达到半灭菌状态&

另一种固体灭菌的设备是采用转鼓式灭菌器%常用于酱油厂和酒厂&该设备能承受一定的压力%形状如同一个鼓%以:<5*2#0$(%转动%培养基能得到较为充分的混匀%轴的中心是一带孔的圆管%蒸汽沿轴中心通入鼓内培养基中进行加热%达到一定温度后%进行保温灭菌&灭菌结束后用真空泵对转鼓抽气%降低鼓内压力和培养基的温度&

!三"分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌相比较各有其优缺点&分批灭菌的优点主要表现在以下

几个方面(!设备要求低%不需另外的设备进行加热和冷却/"操作技术含量低%适用于手动操作/#适合于含有固体颗粒或较多泡沫培养基的灭菌/$适合于小的发酵罐中培养基的灭菌&与连续灭菌相比较%分批灭菌的不足之处主要是对培养基营养成分破坏较大%在大规模生产过程中破坏更为严重%同时培养基反复的加热与冷却使能耗增加和发酵周期延长%降低了发酵罐的利用率&

当进行大规模生产%发酵罐较适宜采用连续灭菌&连续灭菌的温度较高%灭菌时间较短%培养基的营养成分得到了最大限度的保护%保证了培养基的质量%另外

27第四章!发酵工业灭菌

由于灭菌过程不在发酵中进行%提高了发酵设备的利用率%易于实现自动化操作%降低了劳动强度&当然连续灭菌对设备与蒸汽的质量要求较高%还需外设加热’冷却装置%操作复杂%染菌机会多%不适合含有大量固体物料培养基的灭菌&

!四"影响培养基灭菌的因素培养基要达到较好的灭菌效果受多种因素的影响%主要表现在以下几个方面(

2<培养基成分培养基中的油脂’糖类和蛋白质会增加微生物的耐热性%使微生物的受热死亡

速率变慢%这主要是因为有机物质会在微生物细胞外形成一层薄膜%影响热的传递%所以就应提高灭菌温度或延长灭菌时间&例如%大肠杆菌在水中加热6:*65‘2:$(%便死亡/在2:R糖液中%需7:‘4*6$(%/在3:R糖液中%需7:‘3:$(%&灭菌时%对灭菌效果和营养成分的保持都应兼顾%既要使培养基彻底灭菌又要尽可能减少培养基营养成分的破坏&相反培养基中高浓度的盐类’色素会减弱微生物细胞的耐热性%一般较易灭菌&

-<培养基成分的颗粒度培养基成分的颗粒越大%灭菌时蒸汽穿透所需的时间越长%灭菌难%颗粒小%灭

菌容易&一般对小于2$$颗粒的培养基%可不必考虑颗粒对灭菌的影响%但对于含有少量大颗粒及粗纤维培养基的灭菌%特别是存在凝结成团的胶体时会影响灭菌效果%则应适当提高灭菌温度或过滤除去&

3<培养基的GP值

GP值对微生物的耐热性影响很大&微生物一般在GP6<:*8<:时最耐热/

GPU6<:%氢离子易渗入微生物细胞内%从而改变细胞的生理反应促使其死亡&培养基GP值愈低%灭菌所需的时间愈短&培养基的GP值与灭菌时间的关系见表

4I8&

表%")!培养基的9<值与灭菌时间的关系

温度0‘孢子数0!个0$@"

灭菌时间0$(%

GP6<2 GP5<3 GP5<: GP4<7 GP4<52-: 2:::: 8 7 5 3 3225 2:::: -5 -5 2- 23 2322: 2:::: 7: 65 35 3: -42:: 2:::: 34: 7-: 28: 25: 25:

4<微生物细胞含水量微生物含水量越少%灭菌时间越长&孢子’芽孢的含水量少%代谢缓慢%要很长

-7 发酵工程

时间的高温才能杀死&因为含水量很高的物品%蛋白质不易变性!表4I9"%但在灭菌时%如果是含水量很高的物品%高温蒸汽的穿透效果会降低%所以也要延长时间&

表%"*!卵蛋白凝固时水分与温度的关系

水分0R 5: -5 28 6 :凝固温度0‘ 56 74*78 8:*9- 245 26:*27:

5<微生物性质与数量各种微生物对热的抵抗力相差较大%细菌的营养体’酵母’霉菌的菌丝体对热

较为敏感%而放线菌’酵母’霉菌孢子对热的抵抗力较强&处于不同生长阶段的微生物%所需灭菌的温度与时间也不相同%繁殖期的微生物对高温的抵抗力要比衰老时期抵抗力小得多%这与衰老时期微生物细胞中蛋白质的含水量低有关&芽孢的耐热性比繁殖期的微生物更强&在同一温度下%微生物的数量越多%所需的灭菌时间越长%因为微生物在数量比较多的时候%耐热个体出现的机会也越多&天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成的培养基%一般含菌量较高%而用纯粹化学试剂配制成的组合培养基%含菌量低&

6<冷空气排除情况高压蒸汽灭菌的关键问题是为热的传导提供良好条件%而其中最重要的是使

冷空气从灭菌器中顺利排出&因为冷空气导热性差%阻碍蒸汽接触欲灭菌物品%并且还可降低蒸汽分压使之不能达到应有的温度&如果灭菌器内冷空气排除不彻底%压力表所显示的压力就不单是罐内蒸汽的压力%还有空气的分压%罐内的实际温度低于压力表所对应的温度%造成灭菌温度不够%如表4I2:所示&检验灭菌器内空气排除度%可采用多种方法%最好的办法是灭菌锅上同时装有压力表和温度计&

表%"!+!空气排除程度与温度的关系

蒸汽压力0’&$罐内实际温度0‘

未排除空气 排除203空气 排除20-空气 排除-03空气 完全排除空气

:<3 7- 9: 94 2:: 2:9:<7 9: 2:: 2:5 2:9 2252<: 2:: 2:9 22- 225 2-22<3 2:9 225 228 2-2 2-62<5 225 2-2 2-4 2-6 23:

7<泡沫在培养基灭菌过程中%培养基中发生的泡沫对灭菌很不利%因为泡沫中的空气

形成隔热层%使热量难以渗透进去%不易杀死其中潜伏的微生物&因而%无论是分

37第四章!发酵工业灭菌

批灭菌还是连续灭菌%对易起泡沫的培养基均需加消泡剂%以防止或消除泡沫&

8<搅拌在灭菌的过程中进行搅拌是为了使培养基充分混匀%不至于造成局部过热或

灭菌死角%在保证不过多的破坏营养物质的前提下达到彻底灭菌的目的&

!五"培养基灭菌时间的计算

2<分批灭菌分批灭菌时间的确定应参考理论灭菌时间作适当的延长或缩短&如果不计升

温与降温阶段所杀灭的微生物个数%把培养基中所有的微生物均看作是在保温阶段!灭菌温度"被杀灭%这样可以简单地利用式!4I3"求得培养基的理论灭菌时间&

$例%I!%!某发酵罐内装培养基4:$3%在2-2‘下进行分批灭菌&设每毫升培养基中含耐热芽孢杆菌为-V2:5个%2-2‘时的灭菌速度常数为2<8$(%[2&求理论灭菌时间!即灭菌失败几率为:<2R时所需要的灭菌时间"&

解(’:U4:V2:6V-V2:5U8V2:2-!个"

’2U:<::2!个"

!!灭菌时间(3U-<3:3E.K.

’2’2U

-<3:32<8K.

!8V2:25"U-:<34!$(%"

但是在这里没有考虑培养基加热升温对灭菌的贡献%特别是培养基加热到

2::‘以上时%这个作用更为明显&也就是说保温开始时培养基中的活微生物不是’:&另外%降温阶段对灭菌也有一定的贡献%但现在普遍采用迅速降温的措施%时间短%在计算时一般不予以考虑&

在升温阶段%培养基温度不断升高%菌体死亡速度常数也在不断增加%灭菌速度常数与温度的关系为式!4I4"%在计算时%一般取抵抗力较大的芽孢杆菌的E值进行计算%这时的1可以取作2<34V2:36E[2%.?可以取-<844V2:5=0$)K%因此式!4I5"可写为

!!K.EU[24845-H a36<2- !4I6"

利用式!4I6"可求得不同灭菌温度下的速度常数&若欲求得升温阶段!如温度从H2 升至H-"的平均菌死亡速度常数E$%可用下式求得

!!E$ F&

H-

H2ELH

H-GH2!4I7"

47 发酵工程

若培养基加热时间!一般以2::‘至保温的升温时间"3G 已知%E$ 已求得%则升温阶段结束时%培养基中残留菌数!’G"可由下式求得

!!’GU’:

"E$.3G!4I8"

再由下式求得保温所需时间

!!3U-<3:3E.K.

’G’&

!4I9"

$例%I#%!例4I2中%灭菌过程的升温阶段%培养基从2::‘上升至2-2‘%升温阶段结束时%培养基中的芽孢数和保温所需的时间&

解(H2U373O!!H-U394O根据式!4I6"求得373*394O之间若干E值%E[H关系如表4I22所示&

表%"!!!!"#关系

H0O 373 376 379 38- 385 388 392 394

E0E[2 -<35V2:[44<57V2:[42<:3V2:[4-<:9V2:[44<:8V2:[48<24V2:[42<6-V2:[4-<87V2:[4

用图解积分法得

!!&H-

H2ELHF:*2-8!O0E"

E$ F&

H-

H2ELH

H-GH2 F:*2-8394G373F

:*::62!EG2"

’GF ’:"E$.3G F

8J2:2-

":*::62J25J6: F8J2:2-

"5*49 F3*3J2:2:!个"

保温时间

!!3U-<3:3E.K.

’G’&U

-<3:32<8K.

3<3V2:2:

2:[3 U27<3!$(%"

由此可见%若考虑加热升温阶段的灭菌效应%保温时间比例4I2的灭菌时间

-:<34$(%缩短了24<9R%其计算式为!-:<34[27<3"$(%0-:<34$(%U24<9R%所以发酵罐体积越大%其分批灭菌的升温时间越长%升温阶段对灭菌的影响就越大%相应的保温时间就越短&

-<连续灭菌连续灭菌的理论灭菌时间计算仍可采用对数残留定律%如果忽略升温的灭菌

57第四章!发酵工业灭菌

作用%则灭菌保温的时间

!!3U-<3:3E K.@:@&

!4I2:"

式中(@:)单位体积培养基灭菌前的含菌数%个0$@/@&)单位体积培养基灭菌后的含菌数%个0$@&

$例%I$%!若将例4I2中的培养基采用连续灭菌%灭菌温度为232‘%此温度下灭菌速度常数为25$(%[2&求灭菌所需的维持时间&

解(@:U-V2:5!个0$@"

!!@&U 24:V2:6V2:3U-<5V2:

[22!个0$@"

!!3U-<3:325 K.-V2:5

-<5V2:[22U:<25V25<8U-<37!$(%"

可见%灭菌温度升高2:‘后采用连续灭菌则保温时间大大缩短&但在维持罐内的物料会有返混%所以实际灭菌时间常采取理论灭菌时间的3*5倍&

二!发酵设备的灭菌

发酵设备的灭菌包括发酵罐’管道和阀门’空气过滤器’补料系统’消沫剂系统等的灭菌&通常选择:<25*:<- F’的饱和蒸汽%这样既可以较快使设备和管路达到所要求的灭菌温度%又使操作安全&对于大型的发酵设备和较长的管路%可根据具体情况使用压强稍高的蒸汽&另外%灭菌开始时%必须注意把设备和管路中的空气排尽%否则达不到应有的灭菌温度&

发酵罐是发酵工业生产最重要的设备%是生化反应的场所%对无菌要求十分严格&空罐灭菌时%发酵罐与培养基一起灭菌&培养基采用连续灭菌时%发酵罐需在培养基灭菌之前%直接用蒸汽进行空罐灭菌&空消之后立即冷却%先用无菌空气保压%待灭菌的培养基输入罐内后%才可以开冷却系统进行冷却&除发酵罐外%培养基的贮罐也要求洁净无菌&

发酵罐的附属设备有空气过滤器’补料系统’消沫剂系统等&通气发酵罐需通入大量的无菌空气%这就需要空气过滤器过滤除去空气中的微生物&但过滤器本身必须经蒸汽加热灭菌后才能起除菌过滤以提供无菌空气的作用&空气过滤器在发酵罐灭菌之前进行灭菌&排出过滤器中的空气%从过滤器上部通入蒸汽%并从上’下排汽口排汽%保持压力:<274 F’%维持->&灭菌后用空气吹干备用&补料罐的灭菌温度根据料液不同而异%如淀粉料液%2-2‘%保温3:$(%/尿素溶液%

67 发酵工程

2-2‘%保温5$(%&补料管路’消沫剂管路可与补料罐’发酵罐同时进行灭菌%但保温时间为2>&移种管路灭菌一般要求蒸汽压力为:<3*:<45 F’%保温2>&上述各管路在灭菌之前%要进行气密性试验%以防泄漏&

第三节!无菌空气制备

氧气是好氧微生物生长’繁殖以及合成代谢产物所必需的重要原料%工业生产中通常采用空气作为氧气的来源%而空气中含有多种微生物%如果这些微生物随空气进入发酵培养系统%会在适宜的条件下大量繁殖%与生产用微生物竞争性消耗培养基中的营养物质%同时产生各种副产物%干扰或破坏纯培养过程的正常进行%甚至使培养过程彻底失败导致倒罐%造成严重的经济损失&所以%必须将空气中的微生物除去或杀死&空气除菌的方法很多%如过滤除菌’热杀菌’静电除菌’辐射杀菌等%其中介质过滤法常采用%各种除菌方法的除菌效果’设备条件’经济指标各不相同&经冷却的压缩空气带有大量水分或油%在过滤前将空气中的水油除去%才能保持过滤介质的干燥状态%以保证过滤除菌效率&同时%供给发酵罐的无菌空气需具有一定的压力%以维持发酵过程中的罐压力&由此就构成了一个无菌空气的制备系统%这是发酵工程中非常重要的一环&

一!发酵使用的净化空气的标准

空气主要是由0-’,-’+,-’惰性气体’水蒸气以及悬浮在空气中的尘埃等组成的混合物&通常微生物在固体或液体培养基中繁殖后%很多细小而轻的菌体’芽孢或孢子会随水分的蒸发’物料的转移被气流带入空气中或黏附于灰尘上随风飘浮&它们在空气中的含量和种类随地区’高低’季节’空气中尘埃多少和人们活动情况而变化&一般寒冷的北方比暖和’潮湿的南方含菌量少/离地面越高含菌量愈少/农村比工业城市含菌量少&空气中的微生物以细菌和细菌芽孢为主%也有酵母’霉菌’放线菌和噬菌体&据统计一般城市的空气中含菌量为2:3*2:4个0$3&

不同的发酵工业生产中%不同菌种由于生产能力强弱’生长速度快慢’发酵周期长短’产物性质’培养基的营养成分和GP值的差异等%对空气质量有不同的要求%其中%空气的无菌程度是一项关键指标&例如%酵母培养过程%因它的培养基是以糖源为主%能利用无机氮源%有机氮比较少%适宜的GP值较低%在这种条件下%一般细菌较难繁殖%而酵母的繁殖速度较快%在繁殖过程中能抵抗少量的杂菌影响%因而对空气无菌程度的要求不如氨基酸’液体曲’抗生素发酵那么严格&而氨基酸与抗生素发酵因周期长短不同%对无菌空气的要求也不同&总的来说%影响因

77第四章!发酵工业灭菌

素比较复杂%需要根据具体的工艺情况而决定&发酵工业生产中应用的#无菌空气$%是指通过除菌处理使空气中含菌量降到零或极低%从而使污染的可能性降至极小&一般按染菌率为2:R来计算%即2:::次发酵周期所用的无菌空气只允许

2次染菌&对不同的生物发酵生产和同一工厂的不同生产区域!环节"%应有不同的空气

无菌程度的要求&空气无菌程度是用空气洁净度来表示%空气洁净度是指洁净环境中空气含尘!微粒"量多少的程度&含尘浓度高则洁净度低%含尘浓度低洁净度高&空气洁净度的具体高低是用空气洁净度级别来区分的%而这种级别又是用操作时间内空气的计数含尘量!就是单位容积空气中所含某种大小微粒的数量"来表示的%也就是从某一个低的含尘浓度起到不超过另一个高的含尘浓度为止%这一含尘浓度范围定为某一个空气洁净级别&我国参考美国’日本等的标准也提出了空气洁净级别!表4I2-"&

发酵使用的无菌空气除对无菌程度有要求外%还要充分考虑空气的温度’湿度与压力&

表%"!#!环境空气洁度等级

生产区分类 洁净级别0级’每升空气中

%:<5+$尘埃数每升空气中

%5+$尘埃数N

菌落数0个B

控制区 2::::: ’35:: ’-5 ’2:2:::: ’35: ’-<5 ’3

洁净区 2::: ’35 ’:<-5 ’-2:: ’3<5 !: ’2

注(’洁净室空气洁净度等级的检验%应以动态条件下测试的尘粒数为依据&N对于空气洁净度为2::级的洁净室内%5+$尘粒的计算应进行多次采样&当其多次出现时%方可认为该测试数值是可靠的&

B9B$双碟露置:<5>%37‘培养-4>&

二!空气预处理

无菌空气制备的整个过程包括两部分内容(一是对进入空气过滤器的空气进行预处理%达到合适的空气状态!温度’湿度"%二是对空气进行过滤处理%以除去微生物颗粒%满足生物细胞培养需要&空气过滤除菌的工艺过程一般是将吸入的空气先经前过滤%再进空气压缩机%从压缩机出来的空气先冷却至适当的温度%经分离除去油水%再加热至适当的温度%使其相对湿度为5:R*6:R%再经过空气过滤器除菌%得到合乎要求的无菌空气&因此空气的预处理是保证过滤器效率能否正常发挥的重要部分&

空气预处理主要围绕两个目的来进行(一是提高压缩空气的洁净度%降低空气

87 发酵工程

过滤器的负荷/二是去除压缩后空气中所带的油水%以合适的空气湿度和温度进入空气过滤器&

!一"采风塔空气中的微生物通常不单独游离存在%而依附在尘埃和雾滴上&提高压缩前空

气的洁净度的主要措施是提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的前过滤&一般认为%高度每上升2:$%空气中微生物量下降一个数量级%因此%空气吸入口一般都选在比较洁净处%并尽量提高吸入口的高度%以减少收入空气的尘埃含量和微生物含量&在工厂空气吸入口安装位置选择时%应选择在当地的上风口地点%并远离尘埃集中处%高度一般在2:$左右%设计流速8$0E&可建在空压机房的屋顶上&

!二"粗过滤器吸入的空气在进入压缩机前先通过粗过滤器过滤!或前置高效过滤器"%可以

保护空气压缩机%延长空气压缩机的使用寿命%滤去空气中颗粒较大的尘埃%减少进入空气压缩机的灰尘和微生物含量及压缩机的磨损%并减轻主过滤器的负荷%提高除菌空气的质量&对于这种前置过滤器%要求过滤效率高%阻力小%容灰量大%否则会增加压缩机的收入负荷和降低压缩机的排气量&通常采用布袋过滤器’填料过滤器’油浴洗涤和水雾除尘装置等%流速:<2*:<5$0E&

采用布袋过滤结构最简单%只要将滤布缝制成与骨架相同形状的布袋%紧套于焊在进气管的骨架上%并缝紧所有会造成短路的空隙&其过滤效率和阻力损失要视所选用的滤布结构情况和过滤面积而定&布质结实细致%则过滤效率高%但阻力大&最好采用毛质绒布效果较好%现多采用合成纤维滤布&气流速度越大则阻力越大%且过滤效率也低&滤布要定期换洗%以减少阻力损失和提高过滤效率&

填料式粗过滤器一般用油浸铁回丝’玻璃纤维或其他合成纤维等作填料%过滤效果比布袋过滤稍好%阻力损失也较小%但结构较复杂%占地面积也较大%内部填料经常洗换才能保持一定的过滤作用%操作比较麻烦&

油浴洗涤装置是在空气进入装置后要通过油箱中的油层洗涤%空气中的微粒被油黏附而逐渐沉降于油箱底部而被除去%经过油浴的空气因带有油雾%需要经过百叶窗式的圆盘%分离较大粒油雾%再经过滤网分离小颗粒油雾后%由中心管吸入压缩机&这种洗涤器效果比较好%若有分离不彻底的油雾进入压缩机时也无影响%阻力也不大%但耗油量大&

水雾除尘装置是空气从设备底部进入%经上部喷下的水雾洗涤%将空气中的灰尘’微生物微粒黏附沉降%从器底排出&带有微小水雾的洁净空气经上部过滤网过

97第四章!发酵工业灭菌

滤后排出%进入压缩机经洗涤后的空气可除去大部分的微粒和小部分微小粒子%一般对:<5+$粒子的过滤效率为5:R*7:R/对2+$粒子的除去效率为55R*88R/对5+$以上粒子的除去效率为9:R*99R&洗涤室内空气流速不能太大%一般在2*-$0E的范围%否则带出水雾太多&会影响压缩机工作%降低排气量&

!三"空气压缩机为了克服输送过程中过滤介质等阻力%吸入的空气必须经空压机压缩%目前常

用的空压机有涡轮式和往复式两种&空气经压缩后%温度会显著上升%压缩比愈高%温度也愈高&由于空气的压缩过程可看作是绝热过程%故压缩后的空气温度与被压缩后的压强的关系符合压缩多变公式&

!四"空气贮罐空气贮罐的作用是消除压缩机排出空气量的脉动%维持稳定的空气压力%同时

也可以利用重力沉降作用分离部分油雾&大多数是将贮罐紧接着压缩机安装%虽然由于空气温度较高%容器要求稍大%但对设备防腐’冷却器热交换都有好处&贮罐的结构较简单%是一个装有安全阀’压力表的空罐壳体&有些单位在罐内加装冷却蛇管%利用空气冷却器排出的冷却水进行冷却%提高冷却水的利用率/也有在贮罐内加装导筒%使进入贮罐的热空气沿一定路线流过%提高热杀菌效果&

空气压缩机出口温度一般在2-:‘左右%若将此高温压缩空气直接通入空气过滤器%不仅会引起过滤介质的炭化或燃烧%而且还会增大培养装置的降温负荷%给培养过程温度的控制带来困难&同时%高温空气还会增加培养液水分的蒸发%对微生物的生长和生物合成都是不利的%因此要将压缩空气降温/另外%在潮湿地域和季节%空气中含水量较高%为了避免过滤介质受潮而失效%冷却还可以达到降湿的目的&用于空气冷却的设备一般有列管式换热器和翘板式换热器两种&采用列管式换热器进行冷却时%其传热系数大约为2:5=0!$-.E.O"&翘板式换热器则以强制流动的冷空气冷却%其总传热系数可达35:=0!$-.E.O"&

一般中小型工厂采用两级空气冷却器串联来冷却压缩空气&在夏季%第一级冷却器可用循环水来冷却压缩空气%第二级冷却器采用9‘左右的低温水来冷却压缩空气&由于空气被冷却到露点以下会有凝结水析出%故冷却器外壳的下部应设置排除凝结水的接管口&

!五"气液分离器经冷却降温后的空气相对湿度增大%超过其饱和度时!或空气温度冷却至露点

:8 发酵工程

以下时"%就会析出水来&使过滤介质受潮失效%因此压缩后的湿空气要除水&同时%由于空气经压缩机后不可避免地会夹带润滑油%故除水的同时尚需进行除油&在实际操作中%将空气压缩后%经过冷却%会有大量水蒸气及油分凝结下来%经油水分离器分离后再通过过滤器&油水分离器有两类(一类是利用离心力进行沉降的旋风分离器(另一类是利用惯性进行拦截的介质过滤器&旋风分离器是利用气流从切线方向进入容器%在容器内形成旋转运动时产生的离心力来分离较重的微粒&介质过滤器是利用填料的惯性拦截作用%将空气中的水雾和油雾分离出来&填料的成分有焦炭’活性炭’瓷环’金属丝网’塑料丝网等%分离效率随表面积增大而增大&

!六"空气的加热压缩空气冷却到一定温度%分去油水后%空气的相对湿度仍为2::R%若不加

热升温%只要湿度稍有所降低%便会再度析出水分%使过滤介质受潮而降低或丧失过滤效能&

所以必须将冷却除水后的压缩空气加热到一定温度%使相对湿度降低%才能输入过滤器&压缩空气加热温度的选择对保证空气干燥%保证空气过滤器的除菌效率十分关键&一般来讲%降温后的温度与升温后的温度温差在2:*25‘%即能保证相对湿度降低至一定水平%满足过滤器的要求&空气的加热一般采用列管式换热器来实现&

三!空气净化的方法

空气净化就是除去或杀灭空气中的微生物&破坏生物体活性的方法很多%如辐射杀菌’加热杀菌’化学药物杀菌等%都是将有机体蛋白变性而破坏其活力&而静电吸附和介质过滤除菌的方法是把微生物的粒子用分离的方法除去&空气净化的方法有以下几种&

!一"热杀菌热杀菌是有效的’可靠的杀菌方法%但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空

气%以达到杀菌目的%则要消耗大量的能源和增加大量的换热设备%这是十分不经济的&利用空气压缩时放出的热量进行保温杀菌%这就比较经济%见图4I4&空气进口温度若为-2‘%空气的出口温度287*298‘%压力为:<7 F’&可见%若是空气经压缩后温度升高用于干热灭菌是完全可行的%对制备大量无菌空气具有特别的意义&但在实际应用时%对培养装置与空气压缩机的相对位置%连接压缩机与

28第四章!发酵工业灭菌

培养装置之间的管道的灭菌以及管道的长度等问题都必须加以考虑&从压缩机出口到空气贮罐过程进行保温%使空气达到高温后保持一段时间%从而使微生物死亡&为了延长空气的高温时间%最好在贮罐内加装导管筒&一般来说%欲杀死空气中的杂菌%在不同的温度下所需的时间如表4I23所示&

2<压缩机/-<保温层/3<贮罐/4<灭菌后空气

图%"%!热杀菌流程图

表%"!$!杀菌温度与所需时间之间的对应关系

温度0‘ 所需杀菌时间0E 温度0‘ 所需杀菌时间0E

-:: 25<2 3:: -<2-5: 5<2 35: 2<:5

采用热杀菌装置时%还应装空气冷却器%排除冷凝水%以防止在管道设备死角积聚而造成杂菌繁殖&在进入发酵罐前应加装分过滤器以保证安全%但采用这样系统的压缩机能量消耗会相应增大%压缩机耐热性能要增加%它的零部件也要选用耐热材料加工&

!二"辐射杀菌从理论上来说%,射线’-射线’/射线’紫外线’超声波等从理论上都能破坏蛋

白质等生物活性物质%从而起到杀菌作用&辐射灭菌目前仅用于一些表面的灭菌及有限空间内空气的灭菌%对大规模空气的灭菌还不能采用此种方法&

!三"静电除菌静电除菌是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的&悬浮于空

气中的微生物%其孢子大多带有不同的电荷%没有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离成带电微粒%但对于一些直径很小的微粒%它所带的电荷很小%当产生的引力等于或小于气流对微粒的作用力或微粒布朗扩散运动的动量时%则微粒不能被吸附而沉降%所以%静电除尘灭菌对很小的微粒效率较低&

-8 发酵工程

静电除菌效果不是很高%一般在85R*99R之间%但由于它消耗能量小%若使用得当%每处理2:::$3的空气每小时仅耗电:<-*:<8CQ&常用于洁净工作台%洁净工作室所需无菌空气的第一次除尘%配合高效过滤器使用&

!四"过滤除菌过滤除菌法是让含菌空气通过过滤介质以阻截空气中所含微生物%而取得无

菌空气的方法&通过过滤处理的空气可达无菌%并有足够的压力和适宜的温度以供耗氧培养过程之用&该法是目前广泛用来获得大量无菌空气的常规方法&常用的过滤介质有棉花’活性炭或玻璃纤维’有机合成纤维’有机’无机和金属烧结材料等&由于被过滤的微生物粒子很小%一般只有:<5*-+$%而过滤介质的材料一般孔隙直径都大于微粒直径的几倍到几十倍%因此过滤机理比较复杂&同时%由于空气在压缩过程带入的油雾和水蒸气冷凝的水雾影响%使过滤的因素变化更多&过滤除菌按其机制不同而分为绝对过滤和深层过滤&绝对过滤是利用微孔滤膜%其孔隙小于:<5+$%甚至小于:<2+$!一般细菌大小为2+$"%将空气中的细菌除去%主要特点是过滤介质孔隙小于或大大小于被过滤的微粒直径&深层过滤又分为两种(一种是以纤维!棉花’玻璃纤维’尼龙等"或颗粒状!活性炭"介质为过滤层%这种过滤层比较深%其空隙一般大于5:+$%即远大于细菌%因此这种除菌不是真正意义上的过滤作用%而是靠静电’扩散’惯性和阻截等作用将细菌截留在滤层中/另一种是用超细玻璃纤维!纸"’石棉板’烧结金属板’聚乙烯醇’聚四氟乙烯等为介质%这种滤层比较薄%但是孔隙仍大于:<5+$%因此仍属于深层过滤的范畴&

绝对过滤易于控制过滤后空气质量%节约能量和时间%操作简便%它是多年来受到国内外科学工作者注意和研究的问题&它是采用很细小的纤维介质制成%介质空隙小于:<5+$%如纤维素脂微孔滤膜!孔径’:<5+$%厚度:<25+$"’聚四氟乙烯微孔滤膜!孔径:<-+$或:<5+$’孔率8:R"&我国也已研制成功微孔滤膜%有混合纤维素脂微孔滤膜和醋酸纤维素微孔滤膜%后者的热稳定性和化学稳定性均比前者好&孔径为:<45+$的微孔滤膜%对细菌的过滤效果可达2::R%微孔滤膜用于滤除空气中的细菌和尘埃%除有滤除作用外%还有静电吸附作用&在空气过滤之前应将空气中的油’水除去%以提高微孔滤膜的过滤效率和使用寿命&

四!介质过滤除菌的材料及除菌原理

!一"介质过滤除菌的材料过滤介质是过滤除菌的关键%它的好坏不但影响到介质的消耗%过滤过程的动

力消耗’操作劳动强度’维护管理等%而且设备的结构’尺寸还关系到运转过程的可靠

38第四章!发酵工业灭菌

性&过去一直采用棉花纤维或玻璃纤维结合活性炭使用%由于缺点很多%故近年来很多研究者正致力于新过滤介质的研究和开发%并已获得一定成绩&例如%超细玻璃纤维’各种合成纤维’微孔烧结材料和微孔超滤膜等各种新型过滤介质%正在逐渐取代原有的棉花I活性炭过滤介质%而得到开发应用&下面对各种过滤介质做以介绍&

2<棉花棉花是最早使用的过滤介质%棉花随品种的不同%过滤性能有很大的差别%一

般选用细长纤维且疏松的新棉花为过滤介质%同时是未脱脂的棉花!脱脂棉花易于吸水而使体积变小"%压缩后仍有弹性&棉花纤维的直径为26*-2+$%装填时要分层均匀铺放%最后压紧%装填密度以25:*-::C.0$3 为宜&装填均匀是最重要的一点%必须严格做到%否则将会严重影响过滤效果&为了使棉花装填平整%可先将棉花弹成比筒稍大的棉垫后再放入器内&

-<玻璃纤维作为散装充填过滤器的玻璃纤维%一般直径为8*29+$不等%而纤维直径越

小越好%但由于纤维直径越小%其强度越低%很容易断碎而造成堵塞%增大阻力&因此%充填系数不宜太大%一般采用6R*2:R%它的阻力损失一般比棉花小&如果采用硅硼玻璃纤维%则可得到较细直径!:<5+$"的高强度纤维&玻璃纤维的过滤效率随填充密度和填充厚度的增大而提高!表4I24"&玻璃纤维充填的最大缺点是(更换过滤介质时易造成碎末飞扬%使皮肤发痒%甚至出现过敏现象&

表%"!%!玻璃纤维的过滤效率

纤维直径0+$

填充密度

0!C.0$3"填充厚度0B$

过滤效率0R

纤维直径0+$

填充密度

0!C.0$3"填充厚度

B$过滤效率0R

-:<: 7- 5<:8 -- 28<5 --4 2:<26 99<328<5 --4 5<:8 97 28<5 --4 25<-4 99<7

3<活性炭活性炭有非常大的表面积%通过吸附作用捕集微生物&通常采用直径3$$’

长5*2:$$的圆柱状活性炭&因其粒子间空隙很大%故阻力很小%仅为棉花的

202-%但它的过滤效率很低&目前常与棉花联合使用%即在二层棉花中夹一层活性炭%以降低滤层阻力&活性炭的好坏决定于它的强度和表面积%表面积小%则吸附性能差%过滤效率低/强度不足%则很容易破碎&堵塞孔隙%增大气流阻力&它的用量约为整个过滤层的203*20-&

4<超细玻璃纤维纸这种纤维是由无碱玻璃纤维制成%直径仅2*-+$%纤维特别细小%不宜散装

48 发酵工程

充填&而采用造纸的方法做成:<-5*2$$厚的纤维纸&它所形成的网格空隙为

:<5*5+$%比棉花小2:*25倍%故具有较高的过滤效率&超细玻璃纤维纸属于高速过滤介质&在低速过滤时%它的过滤机理以拦截扩散作用机理为主&当气流速度超过临界速度时%属于惯性冲击%气流速度越高%效率越高&生产上操作的气流速度应避开效率最低的临界气速&

超细玻璃纤维滤纸虽然有较高的过滤效率%但由于纤维细短%强度很差%容易受空气冲击而破坏%特别是受潮以后%这样细短的纤维间隙很小%水分在纤维间因毛细管表面力作用%使纤维松散%强度大大下降&为增加强度可采用树脂处理%用树脂处理时要注意所用树脂的浓度%树脂过浓%则会堵塞网格小孔%降低过滤效率和增加空气的阻力损失&一般只用-R*5R的-2-4酚醛树脂的95R酒精溶液进行浸渍’搽抹或喷洒处理%可提高机械强度&防止冲击穿孔&如果同时采用硅酮等疏水剂处理可防湿润%强度更大&采用加厚滤纸可提高强度%同时也可提高过滤效率%但增大了过滤阻力&

目前%国内多数都是多层复合使用超细纤维滤纸%目的是增加强度和进一步提高过滤效果&但实际上过滤效果并无显著提高%虽是多层使用%但滤层间并无重新分布空气的空间%故不可能达到多层过滤的要求&紧密叠合的多层滤纸形成稍厚的超细纤维滤垫%过滤效果不但没有提高%反而大大增加压力损失&

超细纤维滤纸的一个很大的弱点就是抗湿性能差%一旦滤纸受潮%强度和过滤效率就会明显下降&目前已研制成=Y型除菌滤纸%它是在制纸过程中加入适量疏水剂处理%起到抗油’水’蒸汽等作用&这种滤纸还具有坚韧’不怕折叠%抗湿强度高等特点/同时又具有很高的过滤效率和较低的过滤阻力等优点&

5<烧结材料过滤介质烧结材料过滤介质种类很多%有烧结金属!蒙太尔合金’青铜等"’烧结陶瓷’烧

结塑料等&制造时用这些材料微粒末加压成型%使其处于熔点温度下黏结固定%由于只是表面粉末熔融黏结%内部粒子间的间隙仍得以保持%故形成的介质具有微孔通道%能起到微孔过滤的作用&

目前我国生产的蒙乃尔合金粉末烧结板!或烧结管"是由钛锰合金金属粉末烧结而成%具有强度高’寿命长’能耐高温’使用方便等优点&它的过滤性能与孔径大小有关%而孔径又随粉末的粒度及烧结条件而异%一般为5*2:+$!汞压法测定"%过滤效果中等&

6<新型过滤介质随着科学技术的发展和发酵条件的不断提高%目前已研制成功了一些新型的

过滤介质&超滤膜便是其中之一&超滤膜的微孔直径只有:<2*:<45+$%小于菌

58第四章!发酵工业灭菌

体粒子%能有效地将其去除%但还不能阻截病毒’噬菌体等更小的微生物&使用超滤膜%必须同时使用粗过滤器%目的是先把空气中的大粒子固体物除去%减轻超滤膜的负荷和防止大颗粒堵塞滤孔&传统的棉花活性炭’超细玻璃纤维’维尼纶’金属烧结过滤器由于无法保证绝对除菌%且系统阻力大’装拆不便&已逐渐被新一代的微孔滤膜介质所取代&新型过滤介质的高容尘空间引出了#高流!>(.>!K)A"$的概念%改变了以往过滤器单位过滤面积处理量低的状况&过滤介质被制成折叠式大面积滤芯%使过滤器的结构更为合理’装拆方便%从而被生物制药和发酵行业所接受&

表4I25列出了几种传统过滤器的适用条件及性能比较&表4I26列出了新一代微孔滤膜过滤器的适用条件&

表%"!&!传统过滤器的适用条件及性能比较

过滤器类型 适用条件及性能

棉花活性炭 可以反复蒸汽灭菌%旧介质经灭菌后过滤效率降低%装拆劳动强度大%环保条件差&活性炭对油雾的吸附效果较好%故可作为总过滤器以去除油雾’灰尘’管垢和铁锈等

超细玻璃纤维纸

可以蒸汽灭菌%但重复次数有限%装拆不便%装填要求高%可作为终过滤器%但不能保证绝对除菌

维尼纶 无需蒸汽灭菌%靠过滤介质本身的#自净$作用&要求有一定的填充密度和厚度%管路设计有一定要求%介质一旦受潮易失效&可作为总过滤器及微孔滤膜过滤器的预过滤

金属烧结介质 耐高温%可反复蒸汽灭菌%过滤介质空隙在2:*3:+$%过滤阻力小%可作为终过滤器%但无法保证绝对除菌

表%"!’!新一代微孔滤膜过滤器的适用条件及性能比较

滤膜材料 适用条件及性能

硼硅酸纤维 亲水性%无需蒸汽灭菌%95R容尘空间%过滤精度2+$%介质受潮后处理能力和过滤效率下降/适合无油干燥的空压系统%可作为预过滤器%除尘’管垢及铁锈等/过滤介质经折叠后制成滤芯%过滤面积大’阻力小’更换方便’容尘空间大’处理量大

聚偏二氟乙烯 疏水性%要反复蒸汽灭菌%65R容尘空间%过滤精度:<2*:<:2+$/可以作为无菌空气的终端过滤器%过滤介质经折叠后制成滤芯过滤面积大’阻力小’更换方便

聚四氟乙烯 疏水性%可反复蒸汽灭菌%85R容尘空间%过滤精度:<:2+$%可2::R去除微生物/可以作为无菌空气的终端过滤器%无菌槽’罐的呼吸过滤器及发酵罐尾气除菌过滤器/过滤介质经折叠后的滤芯面积大’阻力小’更换方便

68 发酵工程

!二"介质过滤除菌的原理以棉花’玻璃纤维’尼龙等纤维类或者活性炭作为介质填充成一定厚度的过滤

层%或者将玻璃纤维’聚乙烯醇’聚四氟乙烯’金属烧结材料等制成过滤层%其介质间的空隙度大于被滤除的尘埃或微生物&那么悬浮于空气中的微生物菌体何以能被过滤除去呢1 当气流通过滤层时%基于滤层纤维的层层阻碍%迫使空气在流动过程中出现无数次改变气速大小和方向的绕流运动%从而使微生物微粒与滤层纤维间产生撞击’拦截’布朗扩散’重力及静电引力等作用%将其中的尘埃和微生物截留在介质层内%达到过滤除菌的目的&

2<布朗扩散截留作用直径很小的微粒在很慢的气流中能产生不规则的直线运动称为布朗扩散&布

朗扩散的运动距离很短%在较大的气速’较大的纤维间隙中是不起作用的%但在很慢的气流速度和较小的纤维间隙中布朗扩散作用大大增加微粒与纤维的接触滞留

机会&假设微粒扩散运动的距离为K%则离纤维表面距离’K的气流微粒会因为扩散运动而与纤维接触%截留在纤维上&由于布朗扩散截留作用的存在%大大增加了纤维的截留效率&

-<拦截截留作用在一定条件下%空气速度是影响截留速度的重要参数%改变气流的流速就是改

变微粒的运动惯力&通过降低气流速度%可以使惯性截留作用接近于零%此时的气流速度称为临界气流速度&气流速度在临界速度以下%微粒不能因惯性截留于纤维上%截留效率显著下降%但实践证明%随着气流速度的继续下降%纤维对微粒的截留作用又回升%说明有另一种机理在起作用&

因为微生物微粒直径很小%质量很轻%它随气流流动慢慢靠近纤维时%微粒所在主导气流流线受纤维所阻改变流动方向%绕过纤维前进%并在纤维的周边形成一层边界滞留区&滞留区的气流流速更慢%进到滞留区的微粒慢慢靠近和接触纤维而被黏附截留&拦截截留的截留效率与气流的雷诺数和微粒同纤维的直径比有关&

3<惯性撞击截留作用过滤器中的滤层交织着无数的纤维%并形成层层网格%随着纤维直径的减小和

填充密度的增大%所形成的网格也就越细致’紧密%网格的层数也就越多%纤维间的间隙就越小&当含有微生物颗粒的空气通过滤层时%纤维纵横交错%层层叠叠%迫使空气流不断地改变它的运动方向和速度大小&鉴于微生物颗粒的惯性大于空气%因而当空气流遇阻而绕道前进时%微生物颗粒不能及时改变它的运动方向%结果将撞击纤维并被截留于纤维的表面&

惯性撞击截流作用的大小取决于颗粒的动能和纤维的阻力%其中尤以气流的

78第四章!发酵工业灭菌

流速更为重要&惯性力与气流流速成正比%当空气流速过低时惯性撞击截留作用很少%甚至接近于零/当空气的流速增大时%惯性撞击截留作用起主导作用&

4<重力沉降作用重力沉降起到一个稳定的分离作用%当微粒所受的重力大于气流对它的拖带

力时微粒就沉降&就单一的重力沉降情况来看%大颗粒比小颗粒作用显著%对于小颗粒只有气流速度很慢才起作用&一般它是配合拦截截留作用的%即在纤维的边界滞留区内微粒的沉降作用提高了拦截截留的效率&

5<静电吸引作用空气在非导体物质中间进行相对运动时%由于摩擦会产生诱导电荷%特别是纤

维和树脂处理过的纤维更为显著&悬浮在空气中的微生物颗粒大多带有不同的电荷%当菌体所带的电荷与介质所带的电荷相反时%就会发生静电吸引作用&带电的微粒会受带异性电荷的物体吸引而沉降&此外表面吸附也归属于这个范畴%如活性炭的大部分过滤作用是表面吸附的作用&

在过滤除菌中%有时很难分辨上述各种机理各自所做出贡献的大小&随着参数的变化%各种作用之间有着复杂的关系%目前还未能作准确的理论计算&一般认为惯性截留’拦截和布朗运动的作用较大%而重力沉降作用和静电吸引的作用则很小&

五!空气净化的工艺流程

空气净化一般是把吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤%然后进入空气压缩机&从空压机出来的空气!一般压力在2<96V2:5F’以上%温度2-:*25:‘"%先冷却到适当的温度!-:*-5‘"除去油和水%再加热至3:*35‘%最后通过总过滤器和分过滤器除菌&从而获得洁净度’压力’温度和流量都符合要求的无菌空气&具有一定压力的无菌空气可以克服空气在预处理’过滤除菌及有关设备’管道’阀门’过滤介质等的压力损失%并在培养过程中能够维持一定的罐压&因此过滤除菌的流程必须有供气设备)))空气压缩机%对空气提供足够的能量%同时还要具有高效的过滤除菌设备以除去空气中的微生物颗粒&要保持过滤器在比较高的效率下进行过滤%并维持一定的气流速度和不受油’水的干扰%则要有一系列的加热’冷却及分离和除杂设备来保证&空气过滤除菌有多种工艺流程%下面分别介绍几种较典型流程&

!一"空气压缩冷却过滤流程这是一个设备较简单的空气除菌流程%它由压缩机’贮罐’空气冷却器和过滤

器组成%如图4I5所示&它只能适用于那些气候寒冷’相对温度很低的地区&由于空气的温度低%经压缩后它的温度也不会升高很多%特别是空气的相对湿度低%空

88 发酵工程

气中绝对湿度含量很小%虽然空气经压缩并冷却到培养要求的温度%但最后空气的相对湿度还能保持在6:R以下%这就能保证过滤设备的过滤除菌效率%满足微生物培养对无菌空气要求&但是室外温度低到什么程度和空气的相对湿度低到多少才能采用这种流程%需要空气中的相对湿度来确定&

2<粗过滤器/-<压缩机/3<贮罐/4<冷却器/5<总过滤器

图%"&!空气冷却过滤流程图!参考韦革宏等<发酵工程<-::8"

这种流程在使用蜗轮式空气压缩机或无油润滑空压机的情况下效果是好的%但采用普通空气压缩机时%可能会引起油雾污染过滤器%这时应加装丝网分离器先将油雾除去&

!二"高效前置过滤空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程采用了高效率的前置过滤设备%利用压缩机的抽

吸作用%使空气先经中’高效过滤后%再进入空气压缩机%这样就降低了主过滤器的负荷%经高效前置过滤后%空气的无菌程度已经相当高%再经冷却’分离%进入主过滤器过滤%就可获得无菌程度很高的空气&此流程的特点是采用了高效率的前置过滤设备%使空气经多次过滤%因而所得空气的无菌程度很高&图4I6为高效前置过滤除菌的流程示意图&

2<高效前过滤器/-<压缩机/3<贮罐/4<冷却器/5<丝网分离器/6<加热器/7<空气过滤器

图%"’!高效前置过滤空气除菌工艺流程图!参考韦革宏等<发酵工程<-::8"

98第四章!发酵工业灭菌

!三"两级冷却#分离#加热的空气除菌流程两级冷却’加热除菌流程示意图见图4I7&这是一个比较完善的空气除菌流

程&它可以适应各种气候条件%能充分地分离空气中的水分%使空气在低的相对湿度下进入过滤器%提高过滤除菌效率&

2<粗过滤器/-<压缩机/3<贮罐/4%6<冷却器/5<旋风分离器/7<丝网除沫器/8<加热器/9<空气过滤器

图%"(!两级冷却#加热除菌设备流程图!参考李艳等<发酵工程原理及技术<-::8"

这种流程的特点是(两次冷却’两次分离’适当加热&两次冷却’两次分离油水的主要优点是可节约冷却用水%油和水雾分离除去比较完全%保证干过滤&经第一次冷却后%大部分的水’油都已结成较大的雾粒%且雾粒浓度比较大%故适宜用旋风分离器分离&第二级冷却器使空气进一步冷却后析出较小的雾粒%宜采用丝网分离器分离%这类分离器可分离较小直径的雾粒且分离效果高&经两次分离后%空气带的雾沫就较小%两级冷却可以减少油膜污染对传热的影响&

两级冷却’加热除菌流程尤其适用于潮湿地区%其他地区可根据当地的情况%对流程中的设备做适当的增减&

!四"利用热空气加热冷空气的流程图4I8为热空气加热冷空气的流程示意图&利用压缩后的热空气和冷却后的

冷空气进行热交换%使冷空气的温度升高%降低相对湿度&此流程对热能的利用比较合理%热交换器还可兼做贮气罐%但由于气I气换热的传热系数很小%加热面积要足够大才能满足要求&

!五"冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空气除菌流程如图4I9所示&从流程图可以看出%压缩

空气从贮罐出来后分成两部分%一部分进入冷却器%冷却到较低温度%经分离器分离水’油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合%此时混合空气已达到温度

:9 发酵工程

为3:*35‘%相对湿度为5:R*6:R的要求%再进入过滤器过滤&该流程的特点是可省去第二次冷却后的分离设备和空气加热设备%流程比较简单%利用压缩空气来加热析水后的空气%冷却水用量少等&该流程适用于中等含湿地区%但不适合于空气含湿量高的地区&由于外界空气随季节而变化%冷热空气的混合流程需要较高的操作技术&

2<高空采风/-<粗过滤器/3<压缩机/4<热交换器/5<冷却器/6%7<析水器/8<空气总过滤器/9<空气分过滤器

图%")!热空气加热冷空气除菌工艺流程图!参考李艳等<发酵工程原理及技术<-::8"

2<粗过滤器/-<压缩机/3<贮罐/4<冷却器/5<丝网分离器/6<空气过滤器

图%"*!冷热空气直接混合式空气除菌流程

!参考李艳等<发酵工程原理及技术<-::8"

以上几个除菌流程都是根据目前使用的过滤介质的过滤性能%结合环境条件%从提高过滤效率和使用寿命来设计的&

思 考 题

2<试述培养基灭菌的主要方法及基本原理&

-<为什么干热灭菌与湿热灭菌相比温度高’时间长1

29第四章!发酵工业灭菌

3<连消与实消相比有何优缺点1

4<在相同的温度下%微生物的E值越小%说明耐热性强%为什么1

5<影响培养基灭菌的因素有哪些1

6<工业上采用高温瞬时灭菌的理论依据有哪些1

7<固体培养基的灭菌方法有哪些1

8<根据对数残留定律%如何确定培养基的灭菌时间1

9<培养基灭菌过程中如何保护营养成分不受破坏而又达到灭菌的目的1

2:<发酵使用空气净化的标准是什么1

22<列出空气除菌的方法%比较其优缺点%说明为什么发酵工业上采用介质过滤法&

2-<分析空气的过滤除菌机理%并指出影响过滤除菌效率的主要因素%如何提高过滤除菌的效率&

23<设计一空气净化流程%并对其进行分析&

24<某制药厂现有一发酵罐%内装8:&发酵培养基%在2-2‘下进行实消&如果每毫升培养基中含有耐热的芽孢数为-V2:7 个&作2-2‘时灭菌速度常数为

:<:-87E[2&请问灭菌失败概率为:<::2时所需的灭菌时间是多少1

-9 发酵工程

第五章!发酵工业菌种制备

发酵是微生物特有的作用%微生物发酵工程就是利用微生物发酵作用%通过现代工程技术手段来生产有用物质%或者把微生物直接应用于生物反应器的技术%因此微生物菌种是发酵的关键因素和灵魂&一个发酵工厂的成败很大程度上取决于工厂是否有一株!或复合菌系"优质’高产’健壮的菌种&工业微生物是指在发酵工业上已经应用的或具有潜在应用价值的微生物%其范围随科学技术的发展而不断扩展&工业微生物包括细菌’放线菌’酵母菌和霉菌%在某种意义上还包括病毒&对于现代发酵工业来说还包括工程菌&发酵工业以微生物的生命活动为基础%决定发酵工业生产水平的三个要素是(生产菌种的性能’发酵及提纯工艺条件和生产设备%其中优良的菌种是最重要的&发酵工业中使用的微生物菌种最初都来自于自然界%经过分离’纯化和基因改造等行之有效的筛选和育种方法%改善和提高其生产能力而用于大规模生产&

第一节!发酵工业微生物菌种的选育

一!发酵工业对微生物菌种的要求

菌种工作包括不断发掘新菌种%向大自然索取新产品/用传统方法和新的生物技术如基因工程手段构建新菌种/以及围绕着提高产量’改进质量’改革工艺等目的%对现有菌种进行改造&因此一个微生物菌种能否满足工业生产的实际需要%是否有工业生产价值是极为重要的&尽管发酵工业用的菌种多种多样%但能够用于大规模工业生产的微生物菌种则必须满足以下基本要求(!发酵条件如糖浓度’温度’GP值’溶解氧’渗透压等易控制&在常规培养条件下%可迅速生长和发酵%且所需的酶活力高培养条件易于控制/"对诱变剂敏感%可通过诱变达到提高菌种优良性能的目的/#能在廉价原料制备的培养基上迅速生长并生成所需的代谢产物%且产量高/$满足代谢控制的要求/%抗噬菌体和杂菌的能力强/&遗传性状稳定%菌种不易变异退化/’在发酵过程中产生的泡沫要少%这对提高装料系数’提高单罐产量’降低成本有重要意义/(对需要添加的前体物质有耐受能力%并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用/)目的产物最好能分泌到细胞外%以利于产物分

离/0不是病原菌%同时在系统发育上与病原菌无关%不产生任何有害的生物活性物质!包括抗生素’激素和毒素"%以保证安全&具备以上条件的菌株%才能保证发酵产品的产量和质量%这是发酵工业的最大目的和最低要求&

二!发酵工业常用微生物菌种

地球上的微生物资源非常丰富%目前已发现的只占其总数的2R*5R%而在工业生产中被利用的仅有数百种&它们具有不同的形态结构和生理特征%可以分成不同的类群&细菌’放线菌’酵母菌和霉菌等已广泛应用于发酵工业%有的直接利用其菌体细胞%有的则利用其代谢产物或转化机能&由于发酵工程本身的发展以及基因工程等生物技术快速渗入发酵过程%病毒’藻类等其他微生物和基因工程菌也正在逐步变为工业生产菌&以下介绍具有工业价值的几种主要微生物&

!一"细菌细菌!N’B&"#(’"是自然界分布最广’数量最多的一类微生物%属单细胞原核生

物%以典型的二分分裂方式繁殖&细胞生长时%环状/01染色体复制%细胞内的蛋白质等组分同时增加一倍%然后在细胞中部产生一横段间隔%染色体分开%继而间隔分裂形成两个相同的子细胞&如间隔不完全分裂就形成链状细胞&

工业生产常用的细菌有(枯草芽孢杆菌’醋酸杆菌’乳酸杆菌’棒状杆菌’短杆菌等&用于生产淀粉酶制剂’乳酸’醋酸’氨基酸和肌苷酸等&

!二"酵母菌酵母菌!?"’E&"为单细胞真核生物%在自然界中普遍存在%主要分布于含糖较

多的酸性环境中%如水果’蔬菜’花蜜和植物叶子上%以及果园土壤中&石油酵母较多地分布在油田周围的土壤中&酵母菌多为腐生%常以单个细胞存在%以发芽形式进行繁殖%母细胞体积长到一定程度时开始发芽&芽长大的同时母细胞缩小%在母子细胞间形成隔膜%最后形成同样大小的母细胞%如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞%称为假菌丝&在发酵生产旺盛期%常出现假菌丝&

工业生产常用的酵母菌有(啤酒酵母’假丝酵母’类酵母等&分别用于酿酒’制造面包’生产酒精’酶制剂以及生产可食用’药用和饲料用酵母菌体蛋白等&

!三"霉菌霉菌!$)DKL"不是一个分类学上的名词&凡生长在营养基质上形成绒毛状’

网状或絮状菌丝的真菌统称为霉菌&霉菌在自然界分布很广%大量存在于土壤’空

49 发酵工程

气’水和生物体内外等处&它喜欢偏酸性环境%大多数为好氧性%多腐生%少数寄生&霉菌的繁殖能力很强%它以无性孢子和有性孢子进行繁殖%多以无性孢子繁殖为主&其生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支%彼此交错呈网状&菌丝的长度既受遗传性的控制%又受环境的影响%其分支数量取决于环境条件&菌丝或呈分散生长%或呈菌丝团状生长&

工业生产常用的霉菌有(藻状菌纲的根霉’毛霉’犁头霉%子囊菌纲的红曲霉%半知菌类的曲霉’青霉等&它们可用于生产多种酶制剂’抗生素’有机酸及甾体激素等&

!四"放线菌放线菌!’B&(%)$?B"&"E"因菌落呈放线状而得名&它是一个原核生物类群%在

自然界中分布很广%尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中较广&大多腐生%少数寄生&放线菌主要以无性孢子进行繁殖%也可借菌丝片段进行繁殖&后一种繁殖方式见于液体沉没培养中&其生长方式是菌丝末端伸长和分支%彼此交错成网状结构%成为菌丝体&菌丝长度既受遗传性的控制%又与环境相关&在液体深层通风发酵中由于搅拌器的剪应力作用%常常形成短的分支旺盛的菌丝体%或呈分散生长%或呈菌丝团状生长&最大经济价值在于能产生多种抗生素&从微生物中发现的抗生素%有6:R以上是放线菌产生的%如链霉素’红霉素’金霉素’庆大霉素等&

工业生产常用的放线菌主要来自以下几个属(链霉菌属’小单胞菌属和诺卡菌属等&

!五"担子菌所谓担子菌!N’E(L()$?B"&"E"就是人们通常所说的菇类!$DE>#))$"微生物&

担子菌资源的利用正引起人们的重视%如多糖’橡胶物质和抗癌药物的开发&近年来%日本’美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究%发现香菇中2%

-I"I葡萄糖苷酶及两种糖类物质具有抗癌作用&

!六"藻类藻类!’K.’"是自然界分布极广的一类自养微生物资源%许多国家已把它用作

人类保健食品和饲料&培养螺旋藻!9=/:10/8-"%按干重计算其产量为6:&0>$-%而种植大豆产量仅为4&0>$-/从蛋白质产率来看%螺旋藻是大豆的-8倍&培养珊列藻!9.484"4(71("%从蛋白质产率计算%每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的-:*35倍&此外%还可通过藻类将+,-转变为石油%培养单胞藻或其他藻类而获得的石油%可占细胞干重的5R*5:R%合成的油与重油相同%加工后可转变为汽油’煤

59第五章!发酵工业菌种制备

油和其他产品&有的国家已建立培植单胞藻的农场%每年每公顷地%培植的单胞藻按5R干物质为碳水化合物计算%可得6:&石油燃料&此项技术的应用%还可减轻因工业生产而大量排放+,- 造成的温室效应&国外还有从#藻类农场$获取氢能的报道%大量培养藻类%利用其光合放氢来获取氢能&

三!发酵工业微生物菌种的分离与纯化

菌株的分离!E"G’#’&()%"和筛选!E"K"B&()%"一般就是利用自然界采集的样品或相关发酵制品获得性状优良菌株的过程%菌株的分离与筛选过程见图5I2&筛选菌种的具体做法大致分成以下4个步骤(采样’微生物富集’菌株分离和产物鉴定&

图&"!!分离和筛选菌种的一般程序

!一"生物样品的采集

2<从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养’空气和水分%是微生物最集中的地方%细

菌’放线菌’霉菌和酵母菌在土壤中的数量级分别达到2:8%2:7%2:6和2:5%从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株&但由于各种微生物生理特性不同%在土壤中的分布也随着土壤所在地域’土壤条件的不同而有很大的变化&

由于阳光照射%2*5B$的表层土蒸发量大%水分少%且因紫外线的杀菌作用%而微生物数量较少/-5B$以下土层土质紧密%空气稀薄%养分与水分相对缺乏%含菌量也较少&因此%采土样最好的土层是5*-5B$&一般每克土中含菌总数几十

69 发酵工程

万到几十亿个%而且微生物种类丰富%通常霉菌和好氧芽孢杆菌分布于浅土层&从土壤的酸碱度角度讲%偏碱的土壤!GP7<:*7<5"环境%适合于细菌和放线菌

生长%而在偏酸的土壤!GP"7<:"环境下%霉菌和酵母菌生长旺盛&同时微生物数量受季节的影响也较大%可根据不同地域的气候条件%选择春季或秋季采集样品&

采样时除去表层5B$左右的浮土%取5*-5B$处的土样-:.左右%装入事先准备好的无菌袋内扎好&一般应在同一地区%不同位置多处采样%并做好编号%采样后应尽快进行分离%以免微生物死亡&如条件不允许进行快速分离%则可取少许土样撒到做好的选择性培养基试管斜面上%作为临时保存&

-<极端环境条件下采样极端微生物是一类能生长在极端温度’高酸’高碱’高盐或高辐射强度条件下

的微生物&如在寒冷的环境中分离嗜冷菌!:*-:‘"/在盐碱地’碱湖中分离嗜碱菌!GP(8<:"/从温泉和海底火山口分离极端嗜热菌/利用海洋独特的高盐度’高压力’低温及光照条件%分离具备特殊的生理活性的微生物%如日本学者从海洋中分离%并筛选到一株产/01达-9:$.0@的菌株&

3<特殊环境条件下采样每种微生物对营养的需求和生理特性都不一样%因此分布也有差异%可以根据

微生物的不同特性%在相应的环境下采样&如在腐烂的木头上分离以纤维素为碳源的纤维素酶产生菌/在肉类加工厂附近分离蛋白酶和脂肪酶的产生菌/在酒精厂附近分离糖化酶的产生菌/在油田附近的土壤中就容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株&

!二"样品中微生物的富集培养富集!"%#(B>$"%&"培养是将较少的目的微生物%根据其生理特点%利用选择培

养基%使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖%数量增加%以利于分离到所需要的菌株&

2<调整培养基的营养成分进行富集利用微生物代谢类型的不同%在分离目的菌株之前%可在增殖培养基中加入相

应的底物作为唯一碳源或氮源%能分解利用相应底物的目的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖%其他微生物的生长则受到抑制&在相应选择性培养基上生长的微生物并非单一菌株%而是营养类型相同的微生物群落%因此富集选择只是相对的&如要分离水解酶产生菌%可在富集培养基中加入相应底物为唯一碳源%加入含菌样品%对目的微生物以最佳的培养条件!GP值’温度’营养’通气等"进行培养%能分解利用该底物的微生物得以富集&自然界存在着大量废物及污染物%如多环芳烃’

79第五章!发酵工业菌种制备

有机染料和颜料’表面活性剂’农药’酚类和卤代烃等&在分离筛选这类物质的降解微生物时%用该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养%可得到相应的环保菌&如以苯胺作为唯一碳源对样品进行富集培养%待底物完全降解后%再以一定接种量转接到新鲜的含苯胺的富集培养基中%如此连续移接培养数次%同时将苯胺浓度逐步提高%便可得到降解苯胺占优势的菌株培养液%采用稀释涂布法或平板划线法进一步分离%即可得到能降解高浓度苯胺的微生物&

-<控制培养条件进行富集除通过培养基营养成分的选择外%还可通过控制GP值’温度及通气量等条件

进行培养%达到有效的分离目的&如细菌’放线菌的生长繁殖一般要求偏碱性!GP值为7<:*7<5"条件%霉菌和酵母菌要求偏酸性!GP值为4<5*6<:"条件&因此%富集培养基的GP值调节到目的微生物的生长范围有利于目的菌的生长%同时也可排除一部分不需要的菌类&如分离碱性蛋白酶产生菌时%把培养基GP值调到

9*22%可以有效抑制非目的微生物的生长%从而富集碱性蛋白酶产生菌&!2"控制GP 值&微生物在生长繁殖过程中%由于代谢会产生酸性或碱性产

物%GP值会发生变化%因此培养基的GP 值要结合营养成分和培养条件来考虑&一般培养基中碳氮比!+00"越高%培养后越容易产生酸性环境%反之则容易产生碱性环境&无机盐的性质也会影响GP 值变化%!0P4"-Z,4 是生理酸性无机氮源%而0’0,3 是生理碱性无机氮源%为了维持培养基的GP值%一般要添加磷酸盐%如

O-PF,4或OP-F,4%使培养基具有一定的缓冲能力&如果培养液中的酸碱变化很大%磷酸盐的缓冲容量不足以调节GP值变化%则可适当加入+’+,3%以不断中和菌体代谢过程中产生的酸类%使培养基的GP值能保持在恒定的范围内%以利于菌种的生长&如分离乳酸菌的 ^MZ培养基一般加入 OP-F,4%分离醋酸菌的培养基往往加入+’+,3&

!-"控制温度&微生物根据生长温度的不同%可分三大类(第一类是高温微生物%一般最适生长温度为5:*6:‘%在此温度下进行微生物的分离%能抑制一些嗜冷’中性微生物的生长%可以提高分离效率&第二类是中温微生物%一般最适生长温度为-:*4:‘%工业发酵微生物大多数都属于此类&第三类是低温微生物%最适生长温度为25‘或更低&当从样品中进行菌种分离时%置于目的菌体最适温度下培养可在一定程度上抑制另一类微生物的生长&当分离某些特殊产物的微生物时%对温度的选择还需考虑某些内在的关系%如在筛选不饱和脂肪酸产生菌时%由于细胞膜中所含的不饱和脂肪酸含量越高%凝固点越低%细胞在较低温度下越有活力%因此在低于正常温度2:‘时分离效果较好&分离放线菌时%可将样品液在

4:‘条件下预处理-:$(%%有利于孢子的萌发%以达到富集的目的&

89 发酵工程

!3"控制其他培养条件&分离厌氧菌时%除了控制正常的培养条件外%还需准备特殊的培养装置%创造一个有利于厌氧菌的生长环境&筛选极端微生物时%需针对其特殊的生理特性%设计适宜的培养条件%达到富集的目的&

!4"抑制不需要的菌类&除了通过控制营养和培养条件%增加富集微生物的数量以有利于分离外%还可通过加入专一的抑制剂减少非目的微生物的数量%使目的微生物的比例增加&

分离细菌时%在培养基中加入浓度为5:Y0$@制霉菌素%可以抑制霉菌和酵母菌的生长/分离霉菌和酵母菌时%在培养基中加入青霉素’链霉素和四环素各

3:Y0$@%可以抑制细菌和放线菌生长/分离放线菌时%在样品悬浮液中加入数滴

2:R的苯酚或加入青霉素!抑制ca菌"’链霉素!抑制c[菌"各3:*5:Y0$@%加入:<:5R十二烷基磺酸钠或适量的胆盐!抑制ca菌"%以及丙酸钠2:+.0$@!抑制霉菌类"可抑制霉菌和细菌的生长&

除了用加入抗生素的方法抑制非目的微生物外%还可以根据要分离微生物的生理特性%采用一些特殊的方法抑制非目的微生物&如分离芽孢杆菌时%由于芽孢具有耐高温特性%可先将样品加热到8:‘或在5:R乙醇溶液中浸泡2>%杀死不产芽孢的菌种后再进行分离&分离厌氧菌时%可加入少量硫乙醇酸钠作为还原剂%它能使培养基氧化还原电势下降%创造厌氧环境%抑制好氧菌的繁殖&分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时%可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖溶液中处理一段时间%杀死非目的微生物后再进行分离&

!三"分离纯化经过富集培养后的样品%通过进一步的分离纯化%把需要的目的菌株直接从样

品中分离出来%以便进行筛选和鉴定&

2<好氧微生物的分离分离的方法可分为两类(一类较为粗放%只能达到#菌落纯$%如稀释涂布法’划

线分离法等%操作简便有效%工业生产中应用较多/另一类是较细微的单细胞或单孢子分离方法%可达到#菌株纯$或#细胞纯$的水平%需采用专门的仪器设备%复杂的如显微操作装置%简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离&

!2"稀释涂布法&将样品用无菌水进行梯度稀释%取一定量的某一稀释度的悬浮液%涂抹于分离培养基的平板上%经过培养%长出单个菌落%挑取需要的菌落转接到斜面试管中培养&样品的稀释程度应根据样品中的含菌数多少而定&

!-"划线分离法&用接种环取部分样品或菌体%在事先已准备好的培养基平板上划线%当单个菌落长出后%将菌落转接到斜面试管中&在样品含菌量较少或某种

99第五章!发酵工业菌种制备

目的微生物不多的情况下%微生物的纯种分离方法可以采取如下的方式(取一支盛有3*5$@无菌水的试管%另取混匀的样品少许放入其中%充分振荡分散%用灭菌滴管取一滴菌悬液于琼脂平板上涂抹培养%或者用接种环取一环于平板上划线培养&这种方法省略了常规的稀释法%简便易行&

!3"单细胞或单孢子分离法&采用特殊的仪器设备进行单细胞或单孢子的分离%如显微操作仪法’凹玻片法’平皿滤纸法等&用凹玻片进行单细胞或单孢子分离的一般方法为(将纯化的米曲霉孢子悬液稀释为25::B!D0$@%用校正口径的滴管!4::滴0$@"吸取孢子并均匀滴于无菌干燥盖玻片上%将其小心翻转于凹玻片的孔穴上%穴内加一滴已灭菌的培养液%盖玻片和载玻片用凡士林密封&显微镜下观察每个小滴%将只有一个孢子的小滴位置做好记录%恒温培养%挑取单菌落于斜面&

用滤纸进行单细胞或单孢子分离的方法为(取与培养皿内径大小一致的滤纸

3*4层%浸在培养液中%取出放在空皿内%在滤纸上滴几滴甘油以防干燥%盖好皿盖%灭菌&将稀释为25::B!D0$@的孢子悬液用滴管滴在滤纸上%每皿点-:滴左右%恒温培养%每滴约出现2:个菌落%将单菌落移接于斜面上&

-<厌氧菌的分离工业发酵所用菌种为厌氧菌%如用于丙酮I丁醇发酵的梭状芽孢杆菌%白酒增

香用的丁酸菌’己酸菌及用于环境污水处理和水产养殖用的光合菌’反硝化菌’脱氮排硫杆菌等&它们生长于水底层及沉积物中%要从样品中分离这类微生物%需采取厌氧培养法%否则菌体会因接触氧气而死亡&

!2"加还原剂法&在分离培养基内加入还原剂%如半胱氨酸’#型维生素+’硫化钠等%操作时以最快的速度划线分离%然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内!充+,- 或0-"%于适宜温度下培养&

!-"容器厌氧培养法&利用焦性没食子酸和 0’,P互相反应可除去氧气的原理%先将焦性没食子酸放在容器中%把含有厌氧菌样品的培养皿架空放入容器内%然后加入0’,P溶液%立即盖上容器盖子%并用石蜡或凡士林密封%于适宜温度下培养&一般除去2::$@空气需要焦性没食子酸2.或2:R0’,P 溶液2:$@&

!3"平皿厌氧培养法&取无菌培养皿一套%在皿底内倒入分离培养基%凝固后%皿盖的一侧放入焦性没食子酸固体%另一侧放2:R0’,P溶液%使二者不相接触&准备完毕%在凝固的琼脂平板上迅速将含厌氧菌样品进行划线%然后盖上皿盖并密封%摇动平皿使焦性没食子酸固体和0’,P溶液混合%发生化学反应%除去皿内的氧气%于适宜温度下培养&

::2 发酵工程

!四"利用生化反应进行初筛分离培养基根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来

设计%通过观察微生物在选择性培养基上的生长状况或生化反应进行分离筛选%可显著提高菌株分离筛选的效率&

2<透明圈法透明圈法的主要原理为(在平板培养基中加入溶解性较差的底物%使培养基混

浊%能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈%圈的大小可初步反应该菌株利用底物的能力&该法在分离水解酶产生菌时采用较多%如脂肪酶’淀粉酶’蛋白酶’核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈&在分离产有机酸的菌株时%也通常采用透明圈法进行初筛%在选择性培养基中加入碳酸钙%使平板成混浊状%将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养%由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解%形成清晰的透明圈%可以轻易地鉴别出来&分离乳酸产生菌时%由于乳酸是一种较强的有机酸%在培养基中加入的碳酸钙不仅有筛选作用%还有酸中和作用%利于乳酸菌的生长&

-<变色圈法一些不易产生透明圈产物的微生物%可在底物平板中加入指示剂或显色剂%使

微生物能被快速鉴别出来&如在分离谷氨酸产生菌时%可在培养基中加入溴酚蓝酸碱指示剂%其变色范围在GP值为6<-*7<6%当GP值在6<-以下时为黄色%GP值在7<6以上为蓝色&若平板上出现产酸菌%其菌落周围会变成黄色%可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌&筛选解脂微生物时可以吐温为底物%尼罗蓝!0(K"NKD""作为指示剂%根据变色圈大小来判断脂肪酶活性的高低%从而进行有效的筛选&筛选果胶酶产生菌时%用含:<-R果胶为唯一碳源的培养基平板%对含微生物的样品进行分离%待菌落长成后%加入:<-R刚果红溶液染色4>%具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈&分离内肽酶产生菌%可用3I羟基吲哚乙酸酯为底物加入到分离培养基中%产生蛋白酶的菌落可水解3I羟基吲哚乙酸酯为3I羟基吲哚%后者能氧化生成蓝色产物%根据变色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落&

3<生长圈法生长圈法要用到工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株&将待检菌涂布于含

高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养%若某菌株能合成平板所需的营养物%在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈&如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板%在其上涂布含菌样品进行培养%周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌&同样%只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时%

2:2第五章!发酵工业菌种制备

都可采用生长圈法%工具菌用相应的营养缺陷型菌株%由于得到所需营养%凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈&生长圈法通常用于分离筛选氨基酸’核苷酸和维生素的产生菌&

4<抑菌圈法常用于抗生素产生菌的初步分离筛选%此法以抗生素的杀菌能力为衡量效价

的标准%其原理恰好与临床应用的要求相一致%而且此法灵敏度高%需用的检品量较小%是其他方法所不能比的%但此法得到结果比较慢%需经过26*28>培养&工具菌是采用抗生素的敏感菌%如青霉素用金黄色葡萄球菌%链霉素用枯草芽孢杆菌%氯霉素用大肠杆菌%四环素用八叠球菌等作繁殖试验&若被检菌能分泌某些抑制微生物生长的抗生素%便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈%很容易被鉴别出来&在青霉素菌种选育中%还可以加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株&

四!发酵工业微生物菌种的选育

优良菌种的选育为生产提供了各种类型的突变株%大幅度提高了菌种产生有价值代谢产物的水平%还可以改进产品质量%去除不需要的代谢产物或产生新的代谢产物&自然选育’诱变选育’抗噬菌体菌种的选育’杂交育种’原生质体融合技术’基因工程技术等都被用于优良生产菌种的选育&

!一"自然选育不经人工处理%利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育

!%’&D#’KE"K"B&()%"&自然突变由两种原因引起%即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应&所谓多因素低剂量的诱变效应%是指在自然环境中存在着低剂量的宇宙射线’各种短波辐射’低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生的诱变物质等的作用引起的突变&互变异构效应是指4种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构%会引起碱基的错配&

自然突变可能会产生两种截然不同的结果%一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降/另一种是对生产有益的突变&为了保证生产水平的稳定和提高%应经常地进行生产菌种自然选育%以淘汰退化的菌种%选出优良的菌种&

自然选育是一种简单易行的选育方法%可以达到纯化菌种%防止菌种退化%稳定生产%提高产量的目的&但是自然选育的效率低%因此经常与诱变选育交替使用%以提高育种效率&自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液%用稀释法在固体平板上分离单菌落%再分别测定单菌落的生产能力%从中选出高水平菌种&

-:2 发酵工程

!二"诱变选育诱变育种!$D&’."%(BN#""L(%."是利用物理’化学或生物的一种或者多种诱变

因子处理均匀分散的微生物细胞群%使菌体负责遗传作用的/01分子中的碱基对发生变化产生突变体%进而采用简便’快速和高效的筛选方法%将极少数的有益突变株挑选出来%淘汰产量低’性能差的负变异株%从而达到获得优良菌株的目的&这与自然选育比较%由于引进了诱变剂处理而使菌种发生突变的频率和变异的幅度得到了提高%从而使筛选获得优良特性的变异菌株的概率得到了提高&

当前发酵工业中使用的高产菌株%几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株&诱变育种除能提高产量外还可以达到改善产品质量’简化生产工艺’缩短生产周期’合成新的化合物’抵抗不良的培养条件’产生新的生物活性物质等目的&-:世纪4:年代初%美国威斯康星大学/"$"#")博士开始利用]射线诱变青霉素生产菌产黄青霉%使其遗传基因发生突变%获得了高产青霉素的突变株%开创了微生物诱变育种的新纪元&虽然至今已6:多年%由于其方法具有简单’快速和收效显著等特点%故目前仍是被广泛使用的主要育种方法之一&

2<诱变育种的原理诱变育种的理论基础是基因突变%突变主要包括染色体畸变和基因突变两大

类&染色体畸变指的是染色体或/01片段发生缺失’易位’逆位’重复等&基因突变指的是/01中的碱基发生变化即点突变&常用的诱变剂包括物理’化学和生物的三大类%见表5I2&

表&"!!常用的各类诱变剂

物理诱变剂 紫外线’快中子’]射线’-射线’/射线’激光

化学诱变剂 碱基类似物 -I氨基嘌呤’5I溴尿嘧啶’8I鸟嘌呤

与碱基反应的物质 硫酸 二 乙 酯 !/;Z"’甲 基 硫 酸 乙 酯!; Z"’亚硝基胍!0Sc"’亚硝基甲基脲!0^Y"’亚硝基乙基脲!0;Y"’亚硝基!01"’氮芥!0^"’4I硝基喹啉!4I0g,"’乙烯亚胺!;X"’羟胺

/01分子中插入或缺失一个或几个碱基

吖啶类物质’吖啶氮芥衍生物

生物诱变剂 噬菌体’转座子

-<诱变育种的基本方法诱变育种一般包括诱变和筛选两个部分%诱变部分成功的关键包括出发菌株

的选择’诱变剂种类和剂量的选择%以及合理的使用&筛选部分包括初筛和复筛来

3:2第五章!发酵工业菌种制备

测定菌种的生产能力&诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复%直到获得高产菌株&微生物诱变育种的基本程序如图5I-所示&

图&"#!诱变育种操作程序

!2"出发菌株的选择&诱变出发菌株要有一定的目标产物的生产能力&其他生产性能如生长繁殖快’营养要求低’产孢子多且早%对诱变剂敏感%变异幅度大等&必须了解用作诱变的出发菌株的产量’形态’生理等方面的情况&可选择已经过诱变处理的菌株%因为这样的菌株对诱变剂的敏感性会有所提高&

!-"诱变剂的使用方法&诱变的方法有单一诱变剂处理和用两种以上的诱变剂处理菌种的复合诱变剂处理&

!3"诱变剂的剂量选择&对不同的微生物使用的剂量不同%诱变剂的剂量与致死率有关%而致死率又与突变率有一定的关系&因此可用致死率作为诱变剂剂量选择的依据&一般突变率随诱变剂剂量的增加而提高%但达到一定程度以后%再提高剂量反使突变率下降&

!4"突变菌株的筛选&诱变处理后%菌种的性能有可能发生各种各样的变异%如营养变异’抗性变异’代谢变异’形态变异’生长繁殖变异和发酵温度变异等&正向突变的菌株通常为少数%须通过初筛和复筛后%再经过发酵条件的优化研究%确

4:2 发酵工程

定最佳的发酵条件%才能使高产菌株的生产能力充分发挥出来&经诱变后%这些变异的菌种可用各种方法筛选出来&

!营养缺陷型突变菌株的筛选(营养缺陷型突变菌株的诱变育种已广泛地在氨基酸’核苷酸生产中获得应用&在营养缺陷型突变菌株中%生物合成途径中的某一步发生了酶缺陷%合成反应不能完成%末端产物不能积累%因此末端产物的反馈调节作用被解除&只要在培养基中限量加入所要求的末端产物%克服生长障碍%就能使中间产物积累&营养缺陷型突变菌株具有明显的遗传标记%在杂交育种中作为出发菌株%有利于杂交重组的分析%也可以作为基因工程中的受体菌%检出克隆基因的表达&

"抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选(末端产物的反馈调节在生物合成途径中是普遍存在的%除了采用筛选营养缺陷型突变菌株来降低末端产物的浓度外%更加有效的办法是筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株&这两种突变均是由于代谢失调%它们有共同的表型%即在细胞中已经有了大量的末端产物时%仍不断合成这一产物&但其代谢失调的原因不同&其原因或是因为调节基因或操纵基因发生突变%使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因%因此不再起反馈阻遏作用/或是由于编码酶的结构基因发生突变%使变构酶不再具有结合终产物的能力但仍具有催化活性%从而解除了反馈抑制&

通常抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株是通过抗结构类似物突变的方法筛选

出来的&结构类似物与末端产物有相似的结构%能与阻遏蛋白或变构酶结合%阻止产物的合成%引起反馈调节作用%但它们不能代替末端产物参与生物合成%它们的浓度不会降低%因此它们与阻遏蛋白或变构酶结合也是不可逆的&未突变的细胞因代谢受阻%不能合成某种产物而死亡&抗反馈调节突变菌株则即使在结构类似物存在下%仍可合成末端产物形成菌落&为了稳定抗结构类似物突变株%可在培养基中加入适量的结构类似物或抗生素%防止回复突变&

另外也可从营养缺陷型的回复突变菌株获得抗反馈突变株&营养缺陷型突变株是因为对反馈调节作用敏感的酶钝化或缺失等原因所致%发生回复突变后%虽然酶的催化活性恢复了%但酶的结构发生了改变%对反馈调节作用不敏感%因此可过量积累末端代谢产物&

#组成型突变株的筛选(在酶制剂的发酵生产中%常采用在发酵过程中分批限量加入诱导物的方法%提高诱导酶的活性&为解除对诱导物的依赖%可通过诱变改变菌种的遗传特性%筛选组成型突变株&突变发生在调节基因或操纵基因%都可获得组成型突变株&筛选的方法是设计某种有利于组成型菌株生长%并限制诱导型菌株生长的培养条件%造成组成型菌株生长的优势或能以适当的分辨两类菌落的

5:2第五章!发酵工业菌种制备

方法%选出组成型突变菌株&以"I半乳糖苷酶为例%将诱变处理后的菌种培养在含有抑制物邻硝基I"I#I岩

藻糖苷和乳糖的培养液中&在这种培养液中%"I半乳糖苷酶的合成被抑制%因此诱导型菌株不能利用乳糖%则不能生长&而组成型菌株能够合成"I半乳糖苷酶%利用乳糖生长%使组成型菌株被富集&

交替培养法是将诱导型菌株经诱变处理后%先在含诱导剂如乳糖的培养液中培养%由于组成型菌株不需要诱导物就能合成"I半乳糖苷酶%利用乳糖%因此它们会先于诱导型开始生长%在一段时间内%它们的菌数会增加很快&当诱导型在诱导物的诱导下合成"I半乳糖苷酶%开始利用乳糖生长时%就将细菌全部转入葡萄糖培养基中/在葡萄糖培养基中两类细菌同样生长繁殖%但是组成型菌株仍能够合成

"I半乳糖苷酶%而诱导型菌株的"I半乳糖苷酶合成停止%并且酶活力则逐渐丧失&这时再将全部细菌转入乳糖培养基%组成型菌株又获得一次优势生长&如此反复多次后%组成型菌株的数量大大超过诱导型菌株%然后再用平板培养基分离出组成型菌株的单菌落&

通过显色反应也可在平板上识别组成型菌株&其方法是在不含诱导物的平板上进行培养%由于组成型菌株能产生酶%培养后加入适当的底物反应&常采用经酶解后有颜色变化的底物%以便快速检出组成型菌落&如用邻硝基苯半乳糖苷!,0Fc"来筛选"I半乳糖苷酶组成型突变株%刚果红可使纤维素酶水解纤维素露出的还原基团被染上色%而用于筛选纤维素酶组成型突变株等&

$抗性突变株的筛选(这包括对抗生素’金属离子’温度’噬菌体等的抗性!或敏感"突变株的筛选%这些突变型常用来提高某些代谢产物的产量&

1<抗生素抗性突变(各种抗生素对微生物代谢的抑制机制各不相同%利用这些不同的机制改变微生物的代谢%可使某些产物过量积累&如解烃棒杆菌!@*+;":5.-:250-(31("%产生的棒杆菌素是氯霉素的类似物%抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆菌素要高出3倍&

衣霉素可改变细胞的分泌能力%有助于胞内物质分泌到胞外%原因为它可以抑制细胞膜糖蛋白的合成&筛选枯草芽孢杆菌的衣霉素抗性突变株%使!I淀粉酶的产量比亲株提高了5倍&蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的"I淀粉酶产量提高了7倍%这主要是因为利福平可抑制芽孢的形成%使芽孢形成的时间延迟%有利于"I淀粉酶的分泌&

J<抗噬菌体菌株的选育(有研究表明%细菌对噬菌体的抗性是基因突变的结果%这种抗性可以发生在接触噬菌体以前%与噬菌体的存在与否无关&抗噬菌体菌株的筛选可采用自然选育和诱变选育两种方法&自发突变是以噬菌体为筛子%在

6:2 发酵工程

不经任何诱变的敏感菌株中筛选抗性菌株%但抗性突变的频率很低&为了提高效率%可先进行诱变处理%再用高浓度的噬菌体平板筛选抗性菌株&噬菌体感染的筛选过程也可以反复多次%使敏感菌株裂解%从中筛选出抗性菌株&

+<条件抗性突变(条件抗性突变也称为条件致死突变%其中温度敏感突变常可提高产物的产量&如适于在中温条件下!如37‘"生长的细菌%经诱变后获得的温度敏感突变只能在低于37‘温度下生长&这主要是因某一酶蛋白结构改变后%在高温条件下丧失了活力&若此酶是某蛋白质’核苷酸合成途径中所需的酶%该突变株在高温下的表型就是营养缺陷型&谷氨酸产生菌)))乳糖发酵短杆菌--56经诱变后获得的温度敏感突变%在3:‘条件下培养能正常生长%4:‘温度下死亡%能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸%而野生型菌的谷氨酸合成却受生物素的反馈抑制&

/<敏感突变(柠檬酸经顺乌头酸酶催化%转化为异柠檬酸&生产上为了提高柠檬酸的产量%必须抑制顺乌头酸酶活性%防止异柠檬酸的产生&氟乙酸可抑制顺乌头酸酶活性%通过诱变处理造成顺乌头酸酶结构基因的突变%有可能造成酶活力下降%那么此菌株必然对氟乙酸更加敏感%即不足以抑制野生菌顺乌头酸酶活力的某一氟乙酸浓度%会对突变型产生抑制作用&如解脂假丝酵母X_:243用亚硝基胍诱变处理%获得的突变株Z--对氟乙酸表现出极大的敏感性%其顺乌头酸酶酶活力仅为野生菌株的202::%产柠檬酸与异柠檬酸的比例为97T3%大大提高了柠檬酸的产量&

!三"杂交育种生产上%长期使用诱变剂处理%会使菌种的生活能力逐渐下降%如生长周期延

长%孢子量减 少%代 谢 减 慢%产 量 增 加 缓 慢%因 此%有 必 要 利 用 杂 交 育 种!>?N#(LN#""L(%."的方法%提高菌种的生产能力&

杂交育种的目的是将不同菌株的遗传物质进行交换’重组%使不同菌株的优良性状集中在重组体中%克服长期诱变引起的生活力下降等缺陷&通过杂交还可以扩大变异范围%改变产品的产量和质量%甚至创造出新品种&由于多数微生物尚未发现有性世代%因此%直接亲本菌株应具有适当的遗传标记%如颜色’营养要求!即营养缺陷标记"或抗药性等&

2<杂交育种的优点!2"通过具有不同遗传性状菌株的杂交%使遗传物质进行交换和重新组合%改

变亲株的遗传物质基础%扩大变异范围%使两亲株的优良性状集中于重组体内%获得新品种&

7:2第五章!发酵工业菌种制备

!-"通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体%不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降%代谢缓慢等缺陷%也可以提高对诱变剂的敏感性%降低对诱变剂的#疲劳$效应&

!3"通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律%丰富并促进遗传学理论的发展&

-<杂交育种的基本程序杂交育种的一般程序!图5I3"(选择原始亲本$诱变筛选直接亲本$直接亲

本之间亲和力鉴定$杂交$分离到基本培养基或选择性培养基$筛选重组体$重组体分析鉴定&

图&"$!微生物杂交程序

3<杂交育种的方法大部分发酵工业中具有重要经济价值的微生物是准性生殖方式杂交重组&原

核微生物杂交仅转移部分基因%然后形成部分结合子%最终实现染色体交换和基因重组&丝状真核微生物通过接合’染色体交换%然后分离形成重组体&常规杂交主要包括接合’转化’转导’溶原转换和转染等技术%它们的特点见表5I-&

表&"#!微生物常规杂交形式

微生物类别 杂交方式 供体与受体细胞关系 参与交换的遗传物质

原核微生物 接合 体细胞间暂时沟通 部分染色体杂合

转化 细胞不接触%吸收游离/01片段 个别或少数基因杂合

转导 细胞间不接触%质粒’噬菌体介导 个别或少数基因杂合

真核生物 有性生殖 生殖细胞融合或接合 整套染色体高频率重组

准性生殖 体细胞接合 整套染色体高频率重组

!四"原生质体融合原生质体融合!G#)&)GK’E&!DE()%"技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法&

首先是在动植物细胞融合研究的基础上发展起来的%然后才应用于真菌’细菌和放

8:2 发酵工程

线菌&由于这一技术可以打破种属间的界限%提高重组频率%扩大重组幅度%而备受关注&

2<原生质体融合的优越性原生质体融合的方法是首先用酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁%在高渗环

境中释放出原生质%将它们混合%在助融剂或电场作用下%使它们互相凝集%发生细胞融合%实现遗传重组&原生质体融合技术优点如下(!受接合型或致育型的限制小%两亲株没有供体和受体之分%有利于不同种属微生物的杂交&"重组频率高于其他杂交方法&有报道%放线菌原生质体融合频率达2:[-*2:[2%丝状真菌达

2:[3*2:[-%细菌和酵母也可达2:[6*2:[5&#遗传物质的传递更加充分’完善%既有核配又有质配&原核微生物可以有两个以上完整基因组融合的机会&放线菌还能形成短暂的或拟双倍体%真菌中也能形成暂时的或稳定的双倍体&$可以采用温度’药物’紫外线等处理纯化亲株的一方或双方%然后使其融合%筛选再生重组子菌落%提高筛选效率&%用微生物的原生质体进行诱变%可明显提高诱变频率&

-<原生质体融合方法原生质体融合技术的一般程序包括原生质体的制备%原生质体的融合%原生质

体的再生和融合子的筛选等步骤&!2"原生质体制备&使用各种酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁%使其细胞壁

全部消化或部分破裂%释放出原生质体%为防止原生质体内部渗透压过高而破裂%必须将原生质体释放到高渗溶液中&由于各种微生物细胞壁的组成不同%须采用不同的原生质体制备方法&

!-"原生质体融合和再生&由两个出发菌株制备好的原生质体可以通过化学因子或电场诱导的方法进行融合&化学因子诱导多采用聚乙二醇!F;c"4:::和

6:::作为融合剂%并加入+’-a和 .-a等阳离子&电融合过程是原生质体在电场中极化成偶极子%并沿电力线方向排列成串/再加直流脉冲击穿原生质体膜%导致原生质体发生融合&融合后的原生质体具有生物活性%但由于缺少细胞壁%不是正常的细胞%不能在普通培养基上生长&所以要涂布在高渗培养基上令其再生%可以增加高渗培养基的渗透压或添加蔗糖来提高再生率&

!3"融合子的检出&融合子是在选择性培养基上检出的%即通过两个遗传标记互补确定的&如利用营养缺陷型互补%在基本培养基上识别融合子&当亲株没有或很少标记的情况下%可利用灭活的原生质体!单亲株或双亲株灭活均可"融合%筛选有生物活性的重组子&此外可以利用荧光染色%将两个亲株用不同的荧光色素染色并融合后%在落射荧光装置的立体显微镜下观察融合子/如在一个个体上观察到双亲的两种荧光色素%即为融合子&

9:2第五章!发酵工业菌种制备

通过上述方法产生的融合子如果产生了杂合双倍体或单倍重组子%其遗传性状比较稳定&但也可能产生的融合子是一种短暂的融合%会再次分离成亲本类型&所以还要再进行多次筛选%找到稳定的融合子&

!五"基因工程育种基因工程!."%"&(B"%.(%""#(%."或称体外重组/01技术’遗传工程%是以分子

遗传学的理论为基础%综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术&它是现代生物技术的一个重要组成方面%是-:世纪7:年代以来生命科学发展的最前沿&利用基因工程能够使任何生物的/01插入到某一细胞质复制因子中%进而引入寄主细胞进行成功表达&因而%在遗传学上开辟了一条崭新的研究/01序列和功能的关系及基因表达调控机制的渠道%在发酵工业提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力&本部分仅对体外重组/01技术作一简要的基础性介绍%具体内容可参考相关专著&

基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质/01分子提取出来%在离体条件下进行#切割$%获得代表某一性状的目的基因%把该目的基因与作为载体的/01分子连接起来%然后导入某一受体细胞中%让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达%从而获得目的产物&由于该受体细胞即包含了原有的一整套遗传信息%同时也含有外来基因的遗传信息%是一个#杂交体$%因此它是一个自然演化中根本不存在的全新物种&

重组/01技术一般包括四步%即目标/01片段的获得’与载体/01分子的连接’重组/01分子引入宿主细胞及从中选出含有所需重组/01分子的宿主细胞&作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑&

2<基因的提取

/01的提取通常包括去垢剂!如Z/Z"溶解细胞%用酚和蛋白酶去除蛋白质%核糖核酸酶去除M01%以及乙醇沉淀等步骤&但从总体/01中分离特异的目的基因%则是相当困难的%主要有物理分离法’互补/01分离法和#鸟枪$法等&

-</01分子的切割与连接

/01分子的切割是由限制性核酸内切酶来实现的&限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离的%可分为三类&在分子克隆中应用的主要是1类限制性核酸内切酶%其相对分子质量较小%在/01上有各种不同的识别顺序%被称为分子手术刀&它不仅对切点邻近的两个核苷酸有严格要求%而且对较远的核苷酸顺序也有严格要求&限制酶的识别顺序通常为4*6个核苷酸%这些位点的核苷酸都作

:22 发酵工程

旋转对称排列&/01片段的连接主要通过限制酶产生的黏性末端’末端转移酶合成的同聚物接尾以及合成的人工接头等%利用/01连接酶来实现&大肠杆菌的

/01连接酶和S4噬菌体感染大肠杆菌产生的S4/01连接酶%都能修复互补黏性末端之间的单链缺口&S4/01连接酶还能连接平末端的双链/01分子或连接上合成的人工接头等&

3<载体能够克隆外源/01 片段并能在大肠杆菌中繁殖的载体有4种类型(质粒

!GK’E$(LE"’噬菌体2’黏粒!B)E$(LE"和单链噬菌体 23等&这4类载体大小’结构以及生物特性各不相同%但具有以下的共同点(!能在大肠杆菌中自主复制%在共价连接了外源/01片段后仍能自主复制%即载体本身就是一个单独的复制子/

"对某些限制酶来说只有一个切口%并在酶作用后不影响其自主繁殖能力/#从细菌核酸中分离和纯化很容易/$在宿主中能以多拷贝形式存在%有利于插入的外源基因的表达%能在宿主中稳定地遗传&

4<引入宿主细胞外源/01片段与载体连接形成的重组体必须进入宿主细胞才能进一步

增殖和表达&以质粒为载体的重组/01以转化的方式进入宿主细胞/以噬菌体为载体的重组/01则以转染的方式进入宿主细胞/经体外包裹进噬菌体外壳的噬菌体载体重组子或柯斯质粒%则以转导的方式进入宿主细胞&

5<重组体的选择和鉴定从转化’转染或转导的受体细胞群体中选择被研究的重组体%一般分两步(第

一步%根据载体的遗传标记等选择出含有重组分子的转化细胞&第二步%进一步根据外源/01!目标基因"的遗传特性进行鉴定&鉴定转化细胞的方法主要有(遗传学方法’免疫化学方法和核酸杂交方法等&

6<外源基因的表达外源基因引入受体后%能否很好地表达%表达所形成的外源蛋白能否分泌或到

达催化反应的场所等%是关系到能否工业化应用的问题&影响外源基因表达的因素主要表现在以下几个方面(转录水平上%启动子和受体细胞中M01聚合酶的统一/翻译水平上%$M01的核糖体结合部位与受体细胞核糖体的统一/外源基因插入方向对表达的影响/转录后修饰和翻译后修饰等&其中主要集中在转录’翻译及修饰三方面%任一步的失效均造成表达失败&

随着重组/01技术的发展%将高等生物的基因克隆到大肠杆菌中%由大肠杆菌发酵生产人胰岛素’人生长激素和干扰素等高附加值药物产品已工业化生产&同时%在微生物发酵生产的其他产品中%重组/01技术对产量的提高及性状的改

222第五章!发酵工业菌种制备

良等也得到了广泛的研究和应用&

第二节!发酵工业微生物菌种保藏

一!菌种保藏的目的

由于微生物已广泛应用于工业’农业’医学’林业’环保等方面%因此菌种的供应问题显得十分重要&菌种质量的好坏%直接影响生产效果&虽然在选育种工作中做了大量的工作%获得了优良性状%甚至利用基因工程手段构建了具有能生产昂贵产物的菌种&但是%由于微生物具有较易产生变异的特性%因此在实验室或生产过程中%菌种仍会不断发生变异’退化’变质%甚至污染杂菌&很显然%菌种保藏的目的%一方面使之不至于死亡绝种’不污染杂菌%另一方面要尽量使菌种在保藏中保持优良的性状%并使菌种的存活率高’变异率低%以利于生产’研究’交换和使用&

菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料%特别是利用微生物进行有关生产如抗生素’氨基酸’酿造等工业%更离不开菌种&所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分&在国际上一些工业发达的国家都设有相应的菌种保藏机构%广泛收集实验室和生产菌种’菌株!包括病毒株%甚至动’植物细胞株和质粒等"这些重要生物资源&

在发酵工业中%选育出具有良好性状的生产菌种是十分不容易的%如何利用优良的微生物菌种保藏技术%使菌种经长期保藏后既要存活%同时又要使高产突变株不改变表型和基因型%特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物的高产能力%这对于发酵工业是极为重要&

二!菌种保藏的原理

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点%人为创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低%以减少其变异&一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态%干燥和低温%使菌种处于休眠状态%抑制其繁殖能力&一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变%同时还需考虑到方法本身的简便和经济%以便生产上能推广使用&

三!菌种保藏的方法

微生物菌种保藏技术很多%常用的方法有(蒸馏水悬浮或斜面传代保藏’干燥

-22 发酵工程

载体保藏或冷冻干燥保藏’超低温或在液氮中冷冻保藏等方法&

!一"蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法%只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中%将容器封

好口%于2:‘保藏即可达到目的&好气性细菌和酵母等可用此法保存&

!二"斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上’液体培养基中或

穿刺培养%然后在低温条件下保存&它可用于实验室中各类微生物的保藏%此法简单易行%且不需任何特殊的设备&但此方法易发生培养基干枯’菌体自溶’基因突变’菌种退化’菌株污染等不良现象&因此要求最好在基本培养基上传代%目的是能淘汰突变株%同时%转接菌量应保持较低水平&斜面培养物应在密闭容器中于

5‘ 保藏%以防止培养基脱水并降低代谢活性&此方法一般保存时间为3*6个月%如放线菌于4*6‘保存%每3个月移接一次/酵母菌于4*6‘保存%每4*6个月移接一次/霉菌于4*6‘保存%每6个月移接一次&

!三"干燥载体保藏本方法是将菌种接种于适当的载体上%如河沙’土壤’硅胶’滤纸及麸皮等%以

保藏菌种&以沙土保藏用得较多%制备方法为(将河沙经-4目过筛后用2:R*-:R盐酸浸泡3*4>%以除去其中所含的有机物%用水漂洗至中性%烘干%然后装高度约2B$的河沙于小试管中%2-2‘间歇灭菌3次&用无菌吸管将孢子悬液滴入沙粒小管中%经真空干燥8>%于常温或低温下保藏均可%保存期为2*2:年&土壤法以土壤代替沙粒%不需酸洗%经风干’粉碎%然后同法过筛’灭菌即可&此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏&

一般细菌芽孢常用砂管保藏%霉菌的孢子多用麸皮管保藏&

!四"矿物油中浸没保藏矿物油中浸没保藏法是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中

于室温下或冰箱中保藏%此方法简便有效%可用于丝状真菌/酵母’细菌和放线菌的保藏&特别对难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效&操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长%然后注入经26:‘干热灭菌2*->%或湿热灭菌后2-:‘烘去水分的矿物油%矿物油的用量以高出培养物2B$为宜%并以橡皮塞代替棉塞封口%这样可使菌种保藏时间延

322第五章!发酵工业菌种制备

长至2*-年&以液体石蜡作为保藏方法时%应对需保藏的菌株预先做试验%因为某些菌株如酵母’霉菌’细菌等能利用石蜡为碳源%还有些菌株对液体石蜡保藏敏感&为了预防不测%一般保藏菌株-*3年应做一次存活试验&

!五"冷冻保藏冷冻保藏是指将菌种于[-:‘以下的温度保藏%冷冻保藏为微生物菌种保藏

非常有效的方法&通过冷冻%使微生物代谢活动停止&一般而言%冷冻温度愈低%效果愈好&为了保藏的结果更加令人满意%通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂/同时还要认真掌握好冷冻速度和解冻速度&冷冻保藏的缺点是培养物运输较困难&

2<普通冷冻保藏技术将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上%待生长适度后%将试管或瓶口用橡胶

塞严格封好%于冰箱的冷藏室中贮藏%或于温度范围在[-:*[5‘的普通冰箱中保存&用此方法可以维持若干微生物的活力2*-年&应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏&这一方法虽简便易行&但不适宜多数微生物菌种的长期保藏&

-<超低温冷冻保藏技术要求长期保藏的微生物菌种%一般都应在[6:‘以下的超低温冷藏柜中进行

保藏&超低温冷冻保藏的一般方法是(先离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞%再用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞%然后加入等体积的-:R甘油或

2:R二甲亚砜冷冻保护剂%混匀后分装入冷冻指管或安瓿管中%于[7:‘超低温冰箱中保藏&超低温冰箱的冷冻速度一般控制在2*-‘0$(%&若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响&

3<液氮冷冻保藏技术近年来%大量有特殊意义和特征的高等动’植物细胞能够在液氮中长期保藏%

并发现在液氮中保藏的菌种的存活率远比其他保藏方法高且回复突变的发生率极

低&液氮保藏已成为工业微生物菌种保藏的最好方法&具体方法是(把细胞悬浮于一定的分散剂中或是把在琼脂培养基上培养好的菌种直接进行液体冷冻%然后移至液氮![296‘"或其蒸气相中![256‘"保藏&进行液氮冷冻保藏时应严格控制制冷速度&液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤是先制备冷冻保藏菌种的细胞悬液%分装:<5*2$@入玻璃安瓿管或液氮冷藏专用塑料瓶%玻璃安瓿管用酒精喷灯封口/然后以2<-‘0$(%的制冷速度降温%直到温度达到细胞冻结点!通常为

[3:‘"&待细胞冻结后%将制冷速度降为2‘0$(%%直到温度达到[5:‘%将安

422 发酵工程

瓿管迅速移入液氮罐中于液相![296‘"或气相![256‘"中保存&如果无控速冷冻机%则一般可用如下方法代替(将安瓿管或液氮瓶置于[7:‘冰箱中冷冻4>%然后迅速移入液氮罐中保存&在液氮冷冻保藏中%最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油%最终使用浓度一般为甘油2:R’二甲亚砜5R&所使用的甘油一般用高压蒸汽灭菌%而二甲亚砜最好为过滤灭菌&

!六"真空冻干保藏真空冷冻干燥的基本方法是先将菌种培养到最大稳定期后%一般培养放线菌

和丝状真菌约需7*2:L%培养细菌约需-4*-8>%培养酵母约需3L&然后混悬于含有保护剂的溶液中%保护剂常选用脱脂乳’蔗糖’动物血清’谷氨酸钠等%取:<2*:<-$@菌悬液置于安瓿管中冷冻%再于减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华至2R*5R%使培养物干燥&最后将管口熔封%保存在常温下或冰箱中&此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一%大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏2:年之久而不丧失活力&而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏%便于运输&但操作过程复杂%并要求一定的设备条件&

一般实验室可采用现成的真空冷冻干燥机%也可自制分支管或冻干装置%如图

5I4所示&

2<真空压力表/-<分支管/3<安瓿管/4<冰浴/5<阀门/6<接真空泵/7<冷凝器/8<冰浴

图&"%!简易冷冻干燥装置!参考罗大珍等<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

!七"寄主保藏由于目前不少微生物还不能进行人工培养%如病毒’立克次氏体’螺旋体等%要

保存这些微生物菌种%则必须利用其寄主保存&常见的有寄主传代培养保藏法’寄主液氨保藏法和冷冻干燥保藏法等&

522第五章!发酵工业菌种制备

!八"基因工程菌的保藏随着基因工程的不断发展%越来越多的基因工程菌需要得到合理的保藏%由于

它们的载体质粒等所携带的外源/01片段的遗传性状不太稳定’且其外源质粒复制子很容易丢失&另外%对于宿主细胞质粒基因通常为生长非必需%一般情况下当细胞丢失这些质粒时%生长速度会加快&而由质粒编码的抗生素抗性基因在富集含此类质粒的细胞群体时极为有用&当培养基中加入抗生素时%抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压&而且在运用基因工程菌进行发酵时%抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调&由此看来%基因工程菌最好应保藏在含低浓度选择剂的培养基中&

思 考 题

2<工业用微生物的要求有哪些1 试举例说明微生物在工业中的应用&

-<常用工业微生物的种类有哪些1 每种列举出三个典型代表%并说明其主要的发酵产品&

3<工业生产中使用的微生物为什么会发生衰退1 菌种衰退表现在哪些方面1

4<防止菌种衰退的措施有哪些1

5<简述发酵工业中分离和筛选菌种的一般程序&

6<简述发酵工业中微生物菌种选育的方法及特点&

7<简要说明诱变育种的操作步骤&

8<试比较诱变育种技术’原生质体融合技术’/01重组技术三种育种方法的优缺点&

9<试述微生物菌种保藏的目的和原理&

2:<试述微生物菌种保藏的方法’操作步骤及其使用范围&

622 发酵工程

第六章!发酵工业的放大

发酵过程放大是将实验室研究成果转化为生产力的关键环节&虽然在不同规模的发酵罐中%所用微生物的生物反应基本特性是相同的%但随着规模的扩大%尽管采用相同的菌种’培养基和工艺%人们仍观察到大量的随发酵规模的扩大%发酵生产水平下降的例子&放大的过程中因发酵罐中混合’气)液)固相间的物质传递及热量传递等的差异’细胞受到的剪切差异等%微生物的环境与小型发酵罐中产生差异%造成代谢的改变而得到不同的发酵结果&放大不是简单的发酵罐规模的扩大%还包括种子的扩大培养&人们对于发酵过程放大的规律掌握尚不充分%PD$G>#"?曾经指出%发酵过程的放大与其说是一门科学不如说是一项技巧&研究和掌握发酵过程放大的规律%也是发酵工程面临的一个重要课题&

第一节!发酵工业种子的扩大培养

现代发酵工业生产的规模越来越大%发酵罐的容积从几十立方米发展到几百立方米&如果要使小小微生物在几个小时内%完成如此巨大的发酵任务%就必须具备数量巨大的微生物细胞&菌种扩大培养的目的就是要为发酵工业提供适宜微生物生长的特定的物理和化学环境%使其迅速大量繁殖%为生产提供相当数量的代谢旺盛的微生物菌种&这是由于它与发酵时间的长短和接种量的大小有关%接种量越大%发酵时间就越短&所以将数量较多的成熟菌体加入到发酵罐中%就会有利于缩短发酵周期%提高发酵罐的利用率%并且也有利于减少杂菌污染的机会&因此菌种扩大培养的任务%不但要得到纯而壮的培养物%而且还要获得活力旺盛的’接种数量足够的培养物&

一!种子扩大培养的概念

种子扩大培养是指将保存在沙土管’冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后%再经过摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程&该纯种培养物称为种子&

二!发酵工业对种子的要求

菌种的扩大培养是发酵生产的关键步骤%因此%作为发酵工业生产用的种子必须满足以下条件(

!2"菌种细胞的生长活力强%移种至发酵罐后能迅速生长%迟缓期短&!-"生理性状稳定&!3"菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求&!4"无杂菌和噬菌体的污染&!5"保持稳定的生产能力&

三!种子扩大培养的任务

当每只发酵罐的容积和发酵液数量增大%要保持发酵时间一定%则罐内所需微生物菌种的数量也必须增加&菌种扩大培养的任务就是要为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子&因为发酵时间的长短和接种量的大小有直接关系%接种量大%发酵时间则短&将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中%就有利于缩短发酵时间%提高发酵罐利用率%并且也有利于减少染菌的机会&因此%种子的扩大培养过程%不但要得到纯而壮的培养菌%而且要获得活力旺盛的接种量足够的培养物&对于不同产品的发酵过程来说%必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数&

四!种子的制备过程

在发酵生产过程中%种子制备的过程大致可分为两个阶段!图6I2"(实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段&

2<沙土孢子/-<冷冻干燥孢子/3<斜面孢子/4<摇瓶液体培养/5<茄子瓶斜面培养/6<固体培养基培养/7%8<种子罐培养/9<发酵罐

图’"!!种子扩大培养流程图

822 发酵工程

!一"实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用孢子的制备和液体种子制备两种方式&对于产孢子能力强的及孢子发芽’生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培

养孢子%孢子可直接作为种子罐的种子%这样操作简便%不易污染杂菌&对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种%可以用液体培养法&

2<孢子的制备!2"细菌孢子的制备&细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方&

培养温度一般为37‘&培养时间一般为2*-L%产芽孢的细菌培养则需要5*2:L&!-"霉菌孢子的制备&霉菌孢子的培养一般以大米’小米’玉米’麸皮’麦粒等

天然农产品为培养基&培养温度一般为-5*-8‘&培养时间一般为4*24L&!3"放线菌孢子的制备&放线菌孢子培养一般采用琼脂斜面培养基%培养基中

含有一些适合产孢子的营养成分%如麸皮’豌豆浸汁’蛋白胨和一些无机盐等&培养温度一般为-8‘&培养时间为5*24L&

-<液体种子制备!2"好氧培养&对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种%如产链霉素的灰色

链霉菌!9*>:/(41("和产卡那霉素的卡那链霉菌!9*E-8-71.43/.1("可以用摇瓶液体培养法&将孢子接入含液体培养基的摇瓶中%于摇瓶机上恒温振荡培养%获得菌丝体%作为种子&其过程为(试管$三角瓶$摇床$种子罐&

!-"厌氧培养&对于酵母菌!啤酒’葡萄酒’清酒等"%其种子的制备过程为(试管$三角瓶$卡氏罐$种子罐&

例如%生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或 ^hFc培养基!培养基配方(39R麦芽浸出物%3.酵母浸出物%5.蛋白胨%2:.葡萄糖和-:.琼脂于2@水中"的斜面上%于4‘冰箱内保藏&每年移种3*4次&啤酒酵母菌种放大流程见图6I-&

!二"生产车间种子制备实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养%种子罐的培养基虽因

不同菌种而异%但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖’玉米浆’磷酸盐等&如果是需氧菌%同时还需供给定够的无菌空气%并不断搅拌%使菌!丝"体在培养液中均匀分布%获得相同的培养条件&

2<种子罐的作用主要是使孢子发芽&生长繁殖成菌!丝"体%接入发酵罐能迅速生长%达到一定

的菌体量%以利于产物的合成&

922第六章!发酵工业的放大

图’"#!啤酒酵母放大流程图

-<种子罐级数的确定种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数%主要取决于两方面(!菌种

生长特性’孢子发芽及菌体繁殖速度/"所采用发酵罐的容积&细菌生长快%种子用量比例少%级数也较少%如谷氨酸等氨基酸类产品以及部

分酶制剂类产品可用-级发酵%即(茄子瓶$种子罐$发酵罐&霉菌生长较慢%如青霉菌%可用3级发酵%即(孢子悬浮液$2级种子罐!-7‘%

4:>孢子发芽%产生菌丝"$-级种子罐!-7‘%2:*-4>%菌体迅速繁殖%粗壮菌丝体"$发酵罐&

放线菌的细胞生长繁殖缓慢%如抗生素类产品%一般采用3级或4级种子扩大培养&

酵母生长比细菌慢%比霉菌和放线菌快%通常用3级种子&如啤酒酵母的扩大培养!图6I-"%扩大倍数一般第2级到第-级为8*2:倍%第-级到第3级为4*6倍&

3<确定种子罐级数需注意的问题!2"种子级数越少越好%可简化工艺和控制%减少染菌机会&!-"种子级数太少%接种量小%发酵时间延长%降低发酵罐的生产率%增加染菌机会&!3"虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定&但也与所选用工艺条件

有关%如改变种子罐的培养条件%加速了孢子发芽及菌体的繁殖%也可相应地减少种子罐的级数&

五!种子质量的控制

!一"影响孢子质量的因素及控制影响孢子质量的因素通常有(培养基’培养条件’培养时间和冷藏时间等&

:-2 发酵工程

2<培养基生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象%其主要原因是培养用原材料质

量波动&例如%在四环素’土霉素生产中%配制产孢子斜面培养基用的麸皮%因小麦产地’品种’加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同&蛋白胨加工原料不同对孢子也有不同影响%如鱼胨或骨胨&另外%原材料中无机离子含量不同也有很大影响%如微量元素 .-a’+D-a’J’-a能刺激孢子的形成&磷含量太多或太少也会影响孢子的质量&

水质的影响(地区不同’季节变化和水源污染%均可造成水质波动%影响种子质量&菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落%氮源品种越多%出现的菌落类型也越多%不利于生产的稳定&

解决措施(!2"培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用&!-"严格控制灭菌后培养基的质量&!3"斜面培养基使用前%需在适当温度下放置一定时间&!4"供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源%作为选种或分离用的培养基

刚采用较复杂的有机氮源&

-<培养条件!2"温度&温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响%如土霉素生产菌种在

高于37‘培养时%孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢%氨基氮回升提前%菌丝过早自溶%效价降低等现象&一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培养温度&

!-"湿度&制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量也有较大的影响&例如%土霉素生产菌种龟裂链霉菌%孢子制备时发现(在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快%在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好%而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状%孢子稀少&在气温高含湿度大的地区%斜面孢子长得慢%主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成&从表6I2中看出%相对湿度在4:R*45R时孢子数量最多%且孢子颜色均匀%质量较好&

表’"!!不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响

相对湿度0R 斜面外观 活孢子计数0!亿0支"

26<5*29 上部稀薄’下部稠%略黄 2<--5*36 上部薄’中部均匀发白 -<34:*45 一片白%孢子丰富%稍皱 5<7

3<培养时间和冷藏时间!2"培养时间&一般来说%衰老的孢子不如年轻的孢子%因为衰老的孢子已在

2-2第六章!发酵工业的放大

逐步进入发芽阶段%核物质趋于分化状态&过于衰老的孢子会导致生产能力的下降&

解决措施(孢子培养的时间应该控制在孢子量多’孢子成熟’发酵产量正常的阶段终止培养&

!-"冷藏时间&斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关%如土霉素生产菌种孢子斜面培养4L左右即于4‘冰箱保存%发现冷藏7*8L菌体细胞开始自溶&而培养5L以后冷藏%-:L未发现自溶&冷藏时间对孢子的生产能力也有影响&例如%在链霉素生产中%斜面孢子在6‘冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低28R%冷藏3个月后降低35R&

4<接种量接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例&接种量大小影响

到培养基中孢子的数量%进而影响菌体的生理状况&

!二"影响种子质量的因素及控制生产过程中影响种子质量的因素通常有(孢子的质量’培养基’培养条件’种

龄’接种量&

2<培养基种子培养基要满足以下要求(!2"营养成分适合种子培养的需要&!-"选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基&!3"营养上要易于被菌体直接吸收和利用&!4"营养成分要适当丰富和完全%氮源和维生素含量要高&!5"营养成分要尽可能与发酵培养基相近&

-<培养条件!2"温度&种子培养应选择最适温度&!-"通气量&在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外%还要有

足够的通气量提高种子质量&例如%青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内%它们的发酵单位可相差2倍&但也有例外%如土霉素生产菌%一级种子罐的通气量小对发酵有利&

3<种龄种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间&通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期%菌体量还未达到最大值时的

培养时间较为合适&时间太长%菌种趋于老化%生产能力下降%菌体自溶/种龄太

--2 发酵工程

短%造成发酵前期生长缓慢&不同菌种或同一菌种工艺条件不同%种龄是不一样的%一般需经过多种实验来

确定%如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶%2->最好!图6I3"&

4<接种量接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度%采用较大的接种

量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间%使产物的形成提前到来%并可减少杂菌的生长机会&但接种量过大或者过小%均会影响发酵&过大会引起溶氧不足%影响产物合成%而且会过多移入代谢废物%也不经济/过小会延长培养时间%降低发酵罐的生产率!图6I4"&通常接种量%细菌2R*5R%酵母菌5R*2:R%霉菌

7R*25R%有时-:R*-5R&

!

图’"$!种龄与碱性蛋白酶活力之间的关系

图’"%!接种量对碱性蛋白酶产生的影响

!三"种子质量的控制措施种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力&因此%首

先必须保证生产菌种的稳定性%其次是提供种子培养的适宜环境%保证无杂菌侵入%以获得优良种子&因此%在生产过程中通常进行以下两项检查&

2<菌种稳定性的检查生产中所用的菌种必须保持稳定的生产能力%不能有变异种&尽管变异的可

能性很小%但不能完全排除这一危险&所以%定期检查和挑选稳定菌株是必不可少的一项工作&方法是(将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中%逐级稀释%然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养%长出菌落%选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养%检测出生产率高的菌种备用&这一分离方法适用于所有的保藏菌种%并且一年左右必须做一次&

3-2第六章!发酵工业的放大

-<无杂菌检查在种子制备过程中%每移种一次都需要进行杂菌检查&一般的方法是(显微镜

观察%或平板培养试验%即将种子液涂在平板培养皿上划线培养%观察有无异常菌落%定时检查%防止漏检&此外%也可对种子液的生化特性进行分析%如取样测其营养消耗速度’GP值变化’溶氧利用情况’色泽’气味是否异常等&

!四"种子质量标准

2<细胞或菌体菌丝形态’菌丝浓度和培养液外观!色素’颗粒等"&单细胞(菌体健壮’菌形一致’均匀整齐%有的还要求有一定的排列或形态/霉菌’放线菌(菌丝粗壮’对某些染料着色力强’生长旺盛’菌丝分枝情况和内

含物情况好&

-<生化指标种子液的糖’氮’磷的含量和GP值变化&

3<产物生成量在抗生素发酵中%产物生成量是考察种子质量的重要指标%因为种子液中产物

生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度&

4<酶活力种子液中某种酶的活力%与目的产物的产量有一定关系&

第二节!发酵工业设备的逐级放大

由实验室小型设备到试验工厂小规模设备的试验发酵%再转为大规模设备的工业发酵生产%此过程称为发酵的逐级放大&通俗地将逐级放大称为小试!小型试验"’中试!中间试验"和大试!大规模工业性试验"三个阶段&各阶段不是设备的简单放大%必须付出辛勤的劳动和大量的工作%调节温度’GP值’溶解氧’细胞生长’产物形成等发酵参数%使适宜于放大的设备%每个阶段都有预期的目标和要求%对于研究开发新发酵产品都是不可缺少和同等重要的%而且密切相关%相辅相成%循环往复%不断逐级放大%提高发酵产品的效率%精益求精&

发酵的逐级放大%几乎是发酵工业新产品或改良产品或工艺改造的必由之路%但现代生物技术的产品有的产量是以公斤级’克单位%甚至更小的单位计算%而具有很高的商业价值和能满足市场需要%这类产品从研究开发到生产%虽然也要经过逐级放大%经历的过程和试验的项目甚至更长和更多%但小试’中试和大试各阶段

4-2 发酵工程

所采用的设备’仪器的差异不是很大%有的在实验室内就能完成放大的全过程%进行商业性生产%取得高额利润&值得强调的是%一个新产品的开发成功%是非常艰难的%例如微生物新药%从小试到大试%成为产品上市%大约需要2:年时间%国外耗资约2亿美元&而且在逐步放大期间%因工艺或临床试验等原因被淘汰的还占多数&

发酵罐是生物技术开发中的关键性设备%发酵罐的放大是发酵工程的一个重要问题%无论从工程角度上还是从学术上都有重要意义&

从理论上%生物发酵过程和生物发酵罐的开发设计由三步构成(!2"在较宽的培养条件!如培养基的浓度组成’GP值’溶氧速率和溶氧浓度’

搅拌剪切强度等"下对所使用的生物菌株进行试验%掌握细胞生长动力学和产物合成动力学的特性&

!-"根据上述试验结果%确定该生物菌株发酵的最佳培养基配方和培养条件&!3"对有关的质量传递’热量传递’动量传递等微观恒算方程进行求解%导出能

表达反应器内的环境条件和主要操作变量!搅拌转速’通风量’搅拌功率’基质流加速率等"之间的关系模型&然后%应用此数学模型%计算优化条件下主要操作变量的取值%确定发酵罐的形式和参数&

遗憾的是%上述理论发酵罐的设计过程至今无法遵循&主要原因是生物发酵过程的复杂性%能充分描述反应过程的动力学方程十分复杂%某些有关中间反应方程和相关的酶至今仍未明了%因此要求求解生物发酵的有关微分方程十分困难或不可能&同时反应要求的最佳条件与操作参变量的取值有矛盾%如单位体积搅拌功率与传质和溶氧有关%但若搅拌剪切作用过高对生物细胞有损伤&

一!发酵工业放大的原则

为使小规模实验得到的工艺条件能在大规模发酵工艺中得到很好实现%必须遵循在放大过程中使菌体在大型设备和小型设备中所处的环境条件包括化学因素

!基质浓度’前体浓度等"和物理因素!温度’黏度’功率消耗’剪切力’溶氧浓度等"完全相同这一原则%这样才能保证不同发酵规模的产物生产能力和效率相同&

影响发酵的物理’化学因素中有些因素可以通过人为的控制来保持恒定%如基质浓度’前体浓度’发酵温度’GP值等%但有些因素如溶解氧’剪切力’功率消耗’通气量等与设备规模的大小关系很大%且随着设备规模的变化而发生不同程度的变化&再者环境条件完全相同%有时也不能保证微生物的生理活性完全相同%这一问题一时还很难解决%因为微生物的生化代谢还受很多生物因素!如变异问题"的影响%无法用简单的物理’化学因素来消除&至今为止%还没有一个全面有效而正

5-2第六章!发酵工业的放大

确的发酵工艺的放大关联式&在发酵工业实际生产实践中%一般的做法是选择对发酵影响比较敏感的参数作为发酵工艺和设备放大的依据&对于需氧发酵来说%主要采用液相体积氧传质系数,@!或单位体积输入功率)0L 来作为发酵工艺和设备放大的依据&因为这两个参数都直接或间接与氧由气泡传递到液体的速度有关&

二!发酵工业的放大

实际生产时%通常使用小试小发酵罐来确定恰当的培养基和培养条件%根据以往的经验尝试进行&发酵罐的放大%就是要使大型发酵罐的性能与小型发酵罐接近%使大型发酵罐的生产效率与小型发酵罐相似&发酵罐的放大方法从目前的情况来看%主要有经验放大法’因次分析法’数学模拟法等&

经验放大法是依据对已有发酵罐的操作经验所建立起来的一些规律而进行放

大的方法&这也是当今最常用的放大法&据不完全调查结果%目前生物发酵工厂所用的好氧发酵罐全部是采用经验放大法%不同准则所占比例如表6I-所示&

表’"#!通气发酵罐放大准则

放大准则 所占比例0R 放大准则 所占比例0R

维持):0L 不变 3: 维持搅拌器叶端线速度不变 -:维持,@!不变 3: 维持溶氧浓度不变 -:

一般说来%发酵罐维持高径比为-T2或3T2&如果高径比维持不变%那么放大过程中表面积与体积比例将会显著减小&对于供氧及溶解的+,-移出来说%与喷射通气贡献相比%这种表面积与体积比的变化会降低表面通气的相对贡献&对于传统的细菌发酵%表面通气并不重要%但对于剪切敏感的培养!如动物细胞"%这可能就很重要了%因为搅拌和喷射通气均受到限制&

在细菌和真菌发酵过程中%更为重要的是壁生长&如果细胞黏附到壁表面%而且如果这样的黏附细胞已经改变了代谢!如由于质量传递限制"%那么由小发酵罐获得的数据可能不能可靠地预测大发酵罐的情况!见例6I2"&

$例’I!%!间歇发酵后%拆卸打开系统%大约有75R!质量分数"细胞悬浮在液体中!-@"而-5R的细胞以厚膜的形式!大约:<3B$"在反应器器壁和内件上&放射性示踪剂检验表明%5:R的目标产物!内"每部分细胞都相关&在-@规模的反应器中生产能力是-.产品0@&如果两个反应器的高径比均为-T2%那么-::::@规模的反应器生产能力是多少1

解(两个罐几何相似%所以可计算两个罐的直径’表面积和体积(

6-2 发酵工程

!!LU2043#-.$U2043#-.-#U20-3#3

!!9U3#.$U3#.-#U-3#-

对于-@反应器(

!!#U2:<8B$!!9U738B$-

!!LU-:::B$3

对于-::::@反应器(

!!#U-33<5B$!!9U34-6::B$-

!!LU-V2:7B$3

在实验室规模!-@"%由附着在表面的细胞所生产的产物量为(对于738B$- 的表面积%-.0@V-@V20-U-.对于-::::@规模的反应器%由附着在表面上生长的细胞所生产的产物量为(

!!34-6::B$-0738B$-V-.U9-8.

-@体系产物的总量是(

!!-.0@V-@U4.

-::::@体系产物的总量是(

!!9-8.a!-.0@V20-V-::::@"U-:9-8.

如果没有壁面生长%-::::@的罐可产生4::::.产品&因而%如果存在壁面%则放大后将严重影响大规模系统的生产能力&

或许更为重要的是%可以表明%即使维持几何形状相似%在大发酵罐中的物理条件也决不会在小发酵罐中得到精确的复制&在表6I3描述的情况中%搅拌罐的直径增加5倍%由于维持高径比恒定%罐的体积则增加2-5倍&表6I3包含4种类型(基于恒定的功率输入!):0L"的放大’容器内恒定的液体循环速度!单位体积叶轮的泵送速度%I0L"’恒定的桨尖剪切力!’#("’恒定的常雷诺数!’#-($0%"&注意() )’3#5(%L )#3(%I )’#3(%)0L )’3#-(%I0L )’&因此%固定了’ 和

#(%则固定了表6I3中所有的量&由于这些量对’ 和#(有不同的依赖关系%因此规模的变化必定导致细胞经历的物理环境变化&当这些变化改变了反应器中化学物质的分布时%或者它们破坏或损伤了细胞时%规模不同的培养代谢响应也会不同&在一些情况下%即使不存在明显的细胞损伤或裂解%细胞也会通过改变生理功

7-2第六章!发酵工业的放大

能响应于机械应力的适度变化&结果%依据不同的放大规则!)0L 为常数意味着

,SM不变/C4为常数意味着流型几何相似/’ 为常数给出恒定的混合时间’桨尖速率不变%使得剪切力恒定"%会得到不同的结果&

表’"$!放大参数的相互依赖关系

!参考麦克尔<生物过程工程(基本概念<-::8"

放大判断 表示方法小发酵罐

8:@生产发酵罐%2::::T2

):0L 恒定 ’ 恒定 ’.#(恒定 C4恒定能量输入 ): 2<: 2-5 32-5 -5 :<-能量输入0体积 ):0L 2<: 2<: -5 :<- :<::26搅拌转速 ’ 2<: :<34 2<: :<- :<:4叶轮直径 #( 2<: 5<: 5<: 5<: 5<:叶轮的泵送速度 I 2<: 4-<5 2-5 -5 5<:叶轮 的 泵 送 速率0体积 I0L 2<: :<34 2<: :<- :<:4

最大剪切速率 ’.#( 2<: 2<7 5<: 2<: :<-雷诺数 ’#-($0% 2<: 8<5 -5<: 5<: 2<:

这些放大问题都与传递过程有关&特别是%混合和反应的相对时间比例对发酵罐的非均匀性是非常重要的&在进行放大时%我们可能将在小规模的微观动力学!细胞反应"控制的系统响应转变到在大规模传递限制控制的系统响应&当控制区域发生变化时%用小规模的实验结果来预测大规模的性能就变得不可靠了&

一种预测可能的反应器限制条件的方法是使用转化和传递过程的特征时间常

数&表6I4定义了一些重要的时间常数及这些时间常数在-:$3 发酵罐中生产葡

萄糖酸的应用&

表’"%!一些时间常数!方程"

!参考O)EE"%<J()&"B>%)K).?’%LJ()G#)B"EE;%.(%""#(%.<2985"

运输过程 方程 运输过程 方程

流动 !0L 或者L0I 转化过程

扩散 !-0# 生长 20%氧传递 20,@! 化学反应 @0:热量传递 L4@G0M< 底物消耗 @E0:$’e!@E*,E"

混合 3$U4L0!2<5’#3"%搅拌反应器

,E0:$’e!@E+,E"

热量产生 $@G.CH0:.$

8-2 发酵工程

与主要过程相比%时间常数较小的过程呈现出基本平衡状态&例如%如果

20,@!+3)-转化!3)-转化是消耗,- 的时间常数"%那么发酵液被氧饱和%因为供氧比转化快得多&另一方面%如果氧的消耗与氧的供应数量级相同!例如%20,@!,3)-转化"%那么溶氧浓度可能非常低%正如表6I5和图6I5所示&由此所得的溶氧实验测定表明%反应器中氧的浓度发生显著变化%有一些为零值&这种不均匀性表明细胞将周期性地通过厌氧区域&因为许多细胞具有适应从好氧变化到厌氧的调控线路%这些线路可以不断地改变细胞的代谢&

表’"&!时间常数!#+>$ 发酵罐"!参考O)EE"%<J()&"B>%)K).?’%LJ()G#)B"EE;%.(%""#(%.<2985"

传递现象 时间常数0E 传递现象 时间常数0E氧传递 5<5!%)%B)’K<"*22<-!B)’K<!" 转化过程 26液体循环 2-<3 氧消耗%零级 :<7气体停留 -:<6 一级 5<5V2:4

气泡的氧传递 -9:!%)%B)’K<"*593!B)’K<!" 底物消耗%生长 2<-V2:4

热量传递 33:*65: 热产生 35:

!B)’K<表示聚结的气泡&

传统的放大完全靠经验%而且仅在放大过程中控制区域没有变化的情况下才有意义%特别是如果系统仅由反应控制或仅由运输控制的情况&常用的放大准则是维持恒定的功率与体积比率’恒定的,@!’恒定的桨尖速率’混合时间与雷诺数的组合%以及维持恒定的底物或产物水平!通常是溶氧浓度"&每一个准则都有成功和不成功的实例&牛顿型发酵液的结果要好于非牛顿型发酵液&

不管使用这些准则中的哪一个导致失败%其原因都与放大过程控制区域的变化有关&没有经验准则能充分地考虑这些情况&在预测发酵罐中的流体分布’混合时间和气体分散的模型方面%还有清楚地预测由于局部环境的变化而产生的细胞响应模型方面%都取得了一些进展&如果这些模型能够整合%它们可以从根本上为放大提供更加合理的基础&随着改进的超级计算机的出现%可以满足这样复杂的模型对计算的要求&例6I-中给出了计算搅拌罐混合时间的一种方法&

$例’I#%!当发酵罐放大后%混合时间通常会增加&混合时间395$ 定义为一种化合物的浓度经局部扰动后%恢复到平衡值的95R所需要的时间&混合时间是通过阶跃添加电解质溶液的实验而确定的&可以在离开注入点的不同位点连续测量电导&

一个生产用发酵罐通常有多组搅拌桨&有效的模型方法是将大罐的内含物分成几个混合分室%其中每一个分室都是完全混合的&如图6I6所示%一个简单模型就是考虑每个叶轮与一个分室相关联&在此例题中%我们定义$ 为分室之间的总质量传递系数&可以用瞬态质量平衡和实验数据来估计$ 的值&

9-2第六章!发酵工业的放大

图’"&!#+>$ 生产发酵罐中所测量的氧浓度!圆圈中的数字是模型估计值"!参考 O)EE"%<J()&"B>%)K).?’%LJ()G#)B"EE;%.(%""#(%.<2985"

./是第/个分室的浓度/2<空气出口/-<补料进口/3<分室2/4<分室-/5<分室3/6<空气进口

图’"’!例#的简单混合模型示意图!参考Z>DKL"# @%O’#.(_著<陈涛%赵学明译<

生物过程工程(基本概念<-::8"

:32 发酵工程

已经确定2:@容器$ 为:<43E[2%而2::::@容器 $ 为:<:75E[2&对于

?*.50/发酵%间歇补料发酵中葡萄糖补料速率维持在一个常数%相对较低的葡萄糖浓度可以防止形成有毒代谢物!例如有毒代谢物将限制细胞的最终浓度"&假设所希望达到的葡萄糖浓度为-5$.0@% )%)L动力学可近似为速率常数大约是

:<:5E[2的一级反应&假设细胞浓度变化缓慢&假定葡萄糖补料经充分浓缩%反应器中的总液体体积为常数&此外%还假定N!单位反应器体积葡萄糖的质量加料速率"与特征混合液间’反应时间相比变化缓慢&当使用一个理想的传感器!测量中没有误差或滞后"以保持中部分室的设置点浓度为-5$.0@%试比较小罐和大罐中葡萄糖浓度的变化&如果传感器放在上部分室而不是中部分室%考虑会有什么样的响应1

解(注意到N和E2是紧密相关的&随着细胞生长%E2 增加%这改变了对葡萄糖!N"的需求&因为N比混合的特征时间常数的变化慢得多%所以我们假定系统处于准稳态&

根据图6I5(

!!.2U -aE2$[$

$aE! "2 N3E2a!E-20$"

!662"

!!.-U N3E2a!E-20$"

!66-"

!!.3U $$aE2

. N3E2a!E-20$"

!6I3"

式中(.()第/个分室的葡萄糖浓度/E2)一级反应常数&上述方程的解是(

!!.2U -aE2$[$

$aE! "2 N3E2a!E-20$"

!664"

!!.-U N3E2a!E-20$"

!665"

!!.3U $$aE2

. N3E2a!E-20$"

!6I6"

如果探针放在中部分室%且控制系统完善%那么.-U-5$.0@&经式!6I5"%可计算得出(对小罐%NU3<9$.0!@.E"/对大罐%NU4<6$.0@&.2 和.3 的值可以通过式!6I4"’式!6I5"和式!6I6"得到&对传感器放在上部分室的第二种情况%可重复上述计算过程&

结果总结如下(

232第六章!发酵工业的放大

1<传感器放在中部分室

12<小罐!2:@"/NU3<9$.0!@.E"

!!.2U3:<5$.0@/.-U-5$.0@/.3U--<4$.0@

1-<大罐!2::::@"/NU4<6$.0!@.E"

!!.2U52<7$.0@/.-U-5$.0@/.3U25$.0@

J<探针放在上部分室

J2<小罐!2:@"/NU3<-$.0!@.E"

!!.2U-5$.0@/.-U-:<5$.0@/.3U28<4$.0@

J-<大罐!2::::@"/NU-<-$.0!@.E"

!!.2U-5$.0@/.-U2-<2$.0@/.3U7<3$.0@

这些结果说明大罐中混合时间改变对于营养消耗速率!N"和浓度梯度影响的重要性&应该清楚%在混合不好的容器中传感器的布置对于反应器中的反应会有显著的影响&

经验表明%发酵罐体积:<2*2::$3%混合时间和发酵罐体积之间的关系可以用如下方程式表达(

!!3$UHC.L:<3 !6I7"

式中(3$)混合时间/L)容器体积/常数HC)搅拌桨类型’位置及容器设计的函数&式!6I7"假设多层MDE>&)%叶轮%而且是基于实际操作条件下不同大小的容器的数据&

图’"(!对于通气和搅拌发酵罐的实际操作边界!参考麦克尔<生物过程工程(基本概念<-::8"

总之%目前实际进行的放大还是一种经验性的’不严谨的技术&只要要求在不同规模下几何相似%就不能做到微环境条件与规模无关&模型法及规模缩小法对于改进放大是很

有潜力的方法%但是这些方法还没有得到充分发展&

对于一个通气及搅拌发酵罐%其实际操作边界的性质如图6I7所示&边界的确切位置取决于发酵及系统

-32 发酵工程

放大或缩小时引起的变化&边界是模糊的%而不是清晰的&虽然如此%在生物过程中必须重视这些约束的存在&

思 考 题

2<什么是种子的扩大培养1 种子扩大培养的任务是什么1

-<简述种子扩大培养的目的和意义&

3<发酵工业对种子的要求有哪些1

4<在菌种的扩大培养中%应注意哪些事项1

5<简述种子制备的方式及其过程&

6<影响孢子质量的因素有哪些1

7<影响种子质量的因素有哪些1 如何控制种子质量1

8<简述发酵罐放大的重要意义&

9<从理论上%生物发酵过程和生物发酵罐的开发设计由哪三步构成1

2:<试述发酵工业放大的原则&

22<简述发酵罐逐级放大的方法&

2-<将处理量为:<9-2$3’罐内径为:<57$’液面高度2<24$’两只涡轮直径为:<--8$’搅拌转速337#0$(%的发酵罐放大2::倍%请估算放大后的发酵罐的直径’液面高度’搅拌器直径和转速&

332第六章!发酵工业的放大

第七章!微生物发酵机制

由于微生物的种类’遗传性状和环境条件不同%微生物所能积累的产物不同%主要有微生物菌体’微生物酶和代谢产物%微生物的代谢产物很多%如酒精’丙酮’丁醇’有机酸’氨基酸’核苷酸’蛋白质’抗生素’维生素’脂肪’多糖等&这些产物中有些是某种微生物在一定的环境条件下所生成的%如酒精和乳酸&也有许多产物是生理正常的微生物不能过量积累的%必须是具有特异的生理特征的微生物才能积累&因此%微生物发酵机制是指微生物通过其代谢活动%利用基质合成人们所需要的产物的内在规律&人为地改变微生物的代谢调控机制%使有用中间代谢产物过量积累%这种发酵称为代谢控制发酵&微生物发酵机制的研究内容是微生物的生理代谢规律%就是生物合成各种代谢产物的途径和代谢调节机制%环境因素对代谢方向的影响以及改变微生物代谢方向的措施&

第一节!糖’醇’有机酸发酵的代谢控制

一!葡萄糖的分解代谢

绝大多数微生物都能利用葡萄糖作为能源和碳源&因此%葡萄糖的分解代谢’能量转化规律%具有生物学意义&葡萄糖经过2%6I二磷酸果糖生成3I磷酸甘油醛%3I磷酸甘油醛再降解生成丙酮酸并产生1SF的代谢过程称为糖酵解&葡萄糖降解分为两个阶段(第一个阶段是从葡萄糖降解至丙酮酸&第二阶段是从丙酮酸再进一步代谢%在缺氧条件下%细胞进行无氧酵解!即无氧呼吸"%仅获得有限的能量以维持生命活动%丙酮酸继续进行代谢可产生酒精’乳酸等厌氧代谢产品/在有氧条件下%细胞进行有氧代谢生成丙酮酸后%进入S+1循环%其发酵产品有柠檬酸’氨基酸及其他有机酸和氨基酸等&

!一"葡萄糖降解至丙酮酸的途径!图(I!"

2<; F";$NL"%I "?"#>)!IF’#%’E#途径

; F途径又称糖酵解途径或双磷酸己糖降解途径%是大多数微生物共有的一条

图("!!葡萄糖分解代谢及发酵途径!参考罗大珍<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

532第七章!微生物发酵机制

基本代谢途径%在微生物细胞的细胞质中进行&该途径共有十步反应%分两个阶段%前三步是六碳糖’耗能阶段/后七步是三碳糖’产能阶段&

; F途径的特征酶是_/F醛缩酶!2%6I二磷酸果糖醛缩酶"%限速因子调节酶是磷酸果糖激酶&葡萄糖在这条途径中只被部分氧化%产能低%是专性厌氧微生物获得能量的唯一途径%只在2%3I/Fc1!2%3I二磷酸甘油酸"转变成3IFc1!3I磷酸甘油酸"和F;F!磷酸烯醇式丙酮酸"转变成Fh!丙酮酸"的反应中通过底物水平磷酸化生成1SF&

该条途径的生理功能除了提供 1SF’还原力 01/P- 外%主要供应三碳中间代谢产物%如(c1F!三磷酸甘油醛"和Fh是 ; F途径’P F途径’;/途径三条代谢途径交叉枢纽的关键中间产物/F;F在糖的补偿途径+,-回补中占有重要位置/Fc1供嘌呤类物质的生物合成//P1F!磷酸二羟丙酮"接受c1F脱下的氢而生成3I磷酸甘油%后者转化为甘油%再与脂肪酸缩合生成细胞膜的重要成分磷脂&

; F途径提供了2-个关键中间代谢产物的半数%即 cI2IF!2I磷酸葡萄糖"’

/P1F’c1F’F;F和Fh&总反应式为(厌氧条件

!!+6P2-,6a-01/aa-1/Fa-F($-+P-+,+,,Pa-01/P-a-1SFa-P-,

有氧条件!由; FaS+1获得"

!!+6P2-,6a6,-a38!36"1/Fa38!36"F($6+,-a6P-,a38!36"1SF

-<P F">"e)E"$)%)G>)EG>’&"#途径

P F途径又称单磷酸己糖支路或磷酸戊糖循环&也分两个阶段(第一阶段是由葡萄糖磷酸化形成6I磷酸葡萄糖!cI6IF"%再经脱氢’脱羧降解成五碳糖的阶段/阶段是磷酸戊糖分子通过本途径特征酶)))转酮酶和转醛酶催化进行的五碳糖的循环%重新合成六碳糖阶段&在这里磷酸戊糖分子本身不被消耗%相当于三羧酸循环中的再生底物,11!草酰乙酸"&

从6分子cI6IF开始%经脱氢’脱羧%产生6分子+,- 和提供生物合成所需的

2-个分子01/FP-%同时生成6个磷酸戊糖分子!6I磷酸葡萄糖酸6IFc先氧化’脱羧生成5I磷酸核糖MDI5IF%由MDI5IF转化为5I磷酸核糖MI5IF和5I磷酸木酮糖]DI5IF"%MI5IF和]DI5IF经转酮酶和转醛酶等作用%生成一系列+7!7I磷酸景天庚酮糖ZDI7IF"’+4!4I磷酸赤藓糖;I4IF"和+3!3I磷酸甘油醛c1F"化合物&由

6分子cI6IF最后生成4分子6I磷酸果糖!_I6IF"和-分子3I磷酸甘油醛&这-分子3I磷酸甘油醛最后转变为2分子6I磷酸果糖&6I磷酸果糖经异构化%生成6I磷

632 发酵工程

酸葡萄糖&结果由6个6I磷酸葡萄糖分子开始%最后回收5个6I磷酸果糖%另2个

6I磷酸葡萄糖分子生成6分子+,-和6分子 P-,&

P F途径的特征酶是转酮I转醛酶系&该途径的限速因子调节酶是cI6IF脱氢酶和6I磷酸葡萄糖酸!6IFc"脱氢酶%全部酶系在细胞质中&P F途径的生理功能主要是提供大量01/FP-和各种不同碳原子骨架的磷酸糖%如MI5IF为核苷酸’核酸及01/Fa’_1/!_ 0"’+)1等辅酶合成提供原料/MDI5IF为化能自养微生物固定+,- 时受体MDI/F!2%5I二磷酸核酮糖"合成的前体/;I4IF为芳香族氨基酸生物合成的前体&P F途径的MI5IF和;I4IF是2-个关键中间代谢产物中的两个产物&; F途径和 P F途径往往同时存在于一种微生物中%两者在代谢中所占比例也随环境条件变化而不同%如大肠杆菌有-03的葡萄糖经; F途径降解/酵母菌有405的葡萄糖按 ; F途径降解/产黄青霉; F途径和 P F途径各占20-&总反应式为(

不完全氧化

!!+6P2-,6a01/aa3P-,a601/Faa1/FaF($!!3+,-a+P3+,+,,Pa01/P-a601/FP-a21SF

完全氧化

!!+6P2-,6a6,-a351/Fa35F($6+,-a6P-,a351SF

!!!由2-01/FP-完全氧化获得"

3<;/";%&%"#I/)DL)#)!#途径

;/途径又称-I酮I3I脱氧I6I磷酸葡萄糖酸!O/Fc"裂解途径%简称O/Fc途径&该途径的特征酶为-I酮I3I脱氧I6I磷酸葡萄糖酸醛缩酶!简称 O/Fc醛缩酶"%分两个阶段%前段由; F途径和 P F途径相同的酶己糖激酶’cI6IF脱氢酶催化%葡萄糖磷酸化和脱氢!形成2分子01/FP-"%生成6IFc%然后%由6IFc脱水酶将6IFc水解成O/Fc%再经O/Fc醛缩酶催化%2分子O/Fc直接裂解为丙酮酸和3I磷酸甘油醛&

这样2分子葡萄糖只经过4步反应就生成-分子丙酮酸&2分子丙酮酸由

O/Fc直接裂解产生/另2分子丙酮酸由3I磷酸甘油醛进入; F途径转化而来&厌氧发酵时%只有进入 ; F途径的2分子3I磷酸甘油醛脱氢’脱水生成-分子

1SF%除去葡萄糖激活时消耗的2分子1SF%净得2分子1SF&较; F途径产能低&有氧条件下%;/途径生成的01/FP-和01/P-%将电子转移给末端电子受体,- 产生37分子 1SF&;/途径只存在于少数缺乏完整; F途径的细菌

732第七章!微生物发酵机制

中&总反应式为(厌氧条件

!!+6P2-,6a01/aa01/Faa1/FaF($!!-+P3+,+,,Pa01/P-a01/FP-a21SF

有氧条件

!!+6P2-,6a6,-a371/Fa37F($6+,-aP-,a371SF!1SF由2个01/FP-和2个01/P-及丙酮酸’3I磷酸甘油醛完全氧化获得"

4<FO"G>)EG>)C"&)K’E"G’&>A’?#途径

FO途径又称磷酸酮解酶途径&没有 ; F’P F’;/途径的细菌通过FO途径分解葡萄糖&FO途径又分磷酸戊糖酮解酶途径和磷酸己糖酮解酶途径&此二途径必须在厌氧条件下进行&

!2"磷酸戊糖酮解酶途径&简称FFO途径%又称 P F变异途径&该途径从葡萄糖到]DI5IF%均与 P F途径相同%]DI5IF在该途径关键酶磷酸戊糖酮解酶作用下裂解为乙酰磷酸和3I磷酸甘油醛&乙酰磷酸可进一步反应生成乙醇%3I磷酸甘油醛经丙酮酸转化为乳酸&短乳杆菌和肠膜状明串珠菌的异型乳酸发酵就是通过这条途径实现的&

!-"磷酸己糖酮解酶途径&简称FPO途径%又称; F变异途径&该途径从葡萄糖到_I6IF%均与; F途径相同%_I6IF在该途径关键酶磷酸己糖酮解酶作用下裂解为乙酰磷酸和;I4IF/另2分子_I6IF与;I4IF反应按 P F逆转途径生成

-分子磷酸戊糖!]DI5IF和MI5IF"%]DI5IF异构化为MI5IF%MI5IF在磷酸戊糖酮解酶催化下再裂解成乙酰磷酸和3I磷酸甘油醛&两歧双歧杆菌!&/A/"52-.34:/172/A/"17"的异型乳酸发酵就是按此途径实现的&

5<葡萄糖直接氧化途径上述4条途径都是葡萄糖先磷酸化后才逐步被降解的&有些微生物如酵母属

!9-..+-:57;.4("’假单胞菌属!)(41"5758-("’气杆菌属!<4:52-.34:"和醋杆菌属!<4352-.34:"的某些菌%它们没有己糖激酶%但有葡萄糖氧化酶%便直接将葡萄糖先氧化成葡萄糖酸%再磷酸化生成6I磷酸葡萄糖酸%假单胞菌中的6I磷酸葡萄糖酸经6IFc脱水酶转化为O/Fc%按;/途径进一步降解/气杆菌属和醋杆菌属以及另一些假单胞菌中的6I磷酸葡萄糖酸经6IFc脱氢酶转化为5I磷酸核酮糖%进入

P F途径降解&

832 发酵工程

!二"丙酮酸的代谢!图(I#"

图("#!葡萄糖有氧代谢途径!参考罗大珍<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

932第七章!微生物发酵机制

上文所述5条途径为葡萄糖降解至丙酮酸的第一阶段&葡萄糖降解过程中生成的01/!F"P- 需重新被氧化生成01/!F"a%才能继续循环使用以承担氢载体的功能&01/!F"P-的去向在有氧和无氧条件下是不同的&在好氧微生物中%丙酮酸先被氧化脱羧生成乙酰+)1%再经三羧酸循环或乙醛酸循环彻底氧化生成

+,- 和P-,/同时反应生成的01/!F"P-转移给末端最终电子受体,-分子&但在厌氧或兼性厌氧微生物中%厌氧时01/!F"P- 的受氢体或是氧以外的外源氧化物%或是含不饱和碳氢键的有机物!代谢的中间产物"形成各种类型的发酵&

2<三羧酸循环"&#(B’#N)e?K(B’B(LB?BK"$S+1循环#

2分子葡萄糖通过 ; F途径产生-分子丙酮酸%同时产生-分子 1SF和-分子01/P-/在丙酮酸脱氢酶催化下丙酮酸氧化脱羧’脱氢并与+)1结合生成-分子乙酰+)1和-分子01/P-/生成的乙酰+)1与草酰乙酸!简称,11"在关键酶柠檬酸合成酶!简称+Z"催化下缩合成柠檬酸进入 S+1循环&在 S+1环中%乙酰+)1是原始底物%草酰乙酸是再生底物&只要乙酰+)1供应充足%草酰乙酸就能经S+1环不断再生&S+1环中的另一个特征酶是异柠檬酸脱氢酶!简称X+/"%位于S+1环与/+1环!乙醛酸循环"的分支点%催化异柠檬酸脱氢生成草酰琥珀酸&从图7I-可知%S+1环由六碳’五碳’四碳化合物组成%经历两次加水脱氢%两次碳链裂解氧化脱羧%一次底物水平磷酸化&这样由2分子葡萄糖降解成-分子丙酮酸%经两次循环完全氧化生成6分子+,-&从-分子丙酮酸进入

S+1环完全氧化%上述过程脱氢形成6分子01/P-’-分子01/FP- 和-分子

_1/P-&有氧时将 Pa最终交给分子,- 生成 P-,%电子通过电子传递链进行电子传递氧化磷酸化%每2分子01/!F"P-经电子传递氧化磷酸化产生3分子

1SF/每2分子_1/P- 经电子传递氧化磷酸化产生-分子 1SF%加上2分子

cSF转化为2分子1SF%也是3分子1SF&由此%-分子丙酮酸进入S+1循环完全氧化生成3:分子1SF&与; F途径获得-分子1SF及-分子01/P-经电子传递氧化磷酸化获得的6分子1SF一起%总共38!36"分子1SF&除糖降解的产物丙酮酸外%大多数脂肪酸和氨基酸的降解%最后都将转化为乙酰+)1进入

S+1循环%彻底降解为+,- 和 P-,&因此%S+1循环又常被称为专门降解乙酰基的途径&在细菌’放线菌等原核微生物中%此过程在细胞质中进行%而在酵母菌和霉菌等真核微生物中%S+1循环在线粒体中进行&

S+1循环的生理功能不只是产能%还是物质代谢的枢纽&它在糖’蛋白质和脂类代谢中起桥梁作用%又为合成代谢提供重要的中间产物%2-种关键中间代谢产物在S+1环中占了4种&如草酰乙酸和!I酮戊二酸是天冬氨酸和谷氨酸的碳架原料/乙酰+)1是脂肪酸合成的原料/琥珀酸是合成卟啉’细胞色素和叶绿素的前

:42 发酵工程

体&另外%S+1循环还为人类提供了各种有机酸%如柠檬酸’苹果酸和延胡索酸等&由于氨基酸和嘌呤’嘧啶等化合物生物合成要消耗草酰乙酸和!I酮戊二酸等

S+1循环的中间代谢产物%若不及时补充%就会影响S+1循环正常运转%微生物可通过4种途径以回补四碳化合物草酰乙酸和苹果酸&即(/+1循环/丙酮酸和

1SF通过丙酮酸羧化酶催化固定+,- 丙酮酸和01/FP- 通过苹果酸酶催化固

定+,-/磷酸烯醇式丙酮酸在F;F羧化酶催化下固定+,-&+,-固定反应在延胡索酸’琥珀酸’谷氨酸发酵中起重要作用&厌氧微生物和有些兼性厌氧微生物缺乏

S+1循环中的第三个关键酶!I酮戊二酸脱氢酶%可进行不完整的S+1循环来获得所需的S+1循环中间产物&

-<乙醛酸循环"L(B’#N)e?K(B’B(LB?BK"$/+1循环#乙醛酸循环又称二羧酸循环或S+1循环支路&/+1循环的两个关键酶是异

柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶&先在异柠檬酸裂解酶催化下异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸%再在苹果酸合成酶作用下将乙醛酸和乙酰+)1合成苹果酸&在这里

/+1环原始底物是乙醛酸%/+1环再生底物是乙酰+)1&/+1循环的生理功能是使微生物可在乙酸为唯一的碳源基质上生长/又可弥补S+1环中四碳化合物之不足/同时%在脂肪酸转化为糖的过程中起齿轮作用&/+1循环总反应式为

!!-V乙酸a-01/a$苹果酸a-01/P-

!!乙酰+)1a乙醛酸a-01/a$苹果酸a-01/P-

二!厌氧发酵机制

上述葡萄糖厌氧分解的4条途径中都产生还原力01/!F"P- 若不及时使之

氧化再生%葡萄糖分解产能代谢将会终止&厌氧时%微生物就以葡萄糖分解过程中形成的各种代谢中间产物来接受01/!F"P- 脱下的氢!或电子"%这样%就产生了各种各样的发酵产物&微生物发酵常以它们的终产物来命名%如乙醇发酵’甘油发酵’乳酸发酵’丙酮I丁醇发酵等&

!一"乙醇发酵和甘油发酵乙醇发酵有酵母型乙醇发酵和细菌型乙醇发酵两类%工业上生产酒精和酿酒

一般采用酵母型乙醇发酵&甘油发酵也早已大规模工业化生产%有重要经济意义&

2<酵母型乙醇发酵"又称酵母菌的第一型发酵#酿酒酵母和少数细菌进行酵母型乙醇发酵&在厌氧’GP3<5*4<5条件下%通

过; F途径将每分子葡萄糖分解为-分子丙酮酸%丙酮酸在丙酮酸脱羧酶催化

242第七章!微生物发酵机制

下脱羧生成乙醛/再以乙醛为受氢体%在醇脱氢酶催化下%接受; F途径中3I磷酸甘油醛脱下的01/P-的氢生成-分子乙醇’-分子+,- 并净得-分子1SF&总反应式为

!!+6P2-,6a-1/Fa-F($-+P3+P-,Pa-+,-a-1SF

-<甘油发酵"又称酵母菌的第二型发酵#酿酒酵母在厌氧和培养基中有3R亚硫酸氢钠时%丙酮酸脱羧生成的乙醛和

亚硫酸氢钠起加成反应%生成难溶的亚硫酸氢钠加成物)))磺化羟乙醛/乙醛不能作为正常受氢体%则以磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体%先形成3I磷酸甘油%再进一步水解去磷酸生成甘油&总反应式为

!!+6P2-,6a0’PZ,3$ +P,P

+P---

,P

+P---

,P

a+P3)+ ,Pa+,.. -

--P

,Z,---

0’

由上式看出%每分子葡萄糖只产生2分子甘油%而不产生 1SF&为维持菌体生长所需的能量%必须控制添加亚硫酸氢钠在亚适量!3R"的水平%保证有一部分葡萄糖进行乙醇发酵以供能&

3<乙酸!乙醇!甘油发酵"又称酵母菌的第三型发酵#酿酒酵母在厌氧’GP(7<5条件下%乙醛也不能作为正常的受氢体%于是-分

子乙醛之间互相氧化I还原发生歧化反应%生成2分子乙酸和2分子乙醇&此时%

01/P- 受氢体仍不足%磷酸二羟丙酮亦作为受氢体接受3I磷酸甘油醛脱下的氢生成!I磷酸甘油%再水解生成甘油&故发酵产物为乙酸’乙醇’甘油和+,-%发酵也不产生能量&总反应式为

!!-+6P2-,6$-+P-,P+P,P+P-,Pa+P3+P-,Pa+P3+,,Pa-+,-

4<细菌型乙醇发酵少数细菌如运动发酵单胞菌!O;758-(752/0/("和厌氧发酵单胞菌!O;756

75-(8-8-4:52/-"等能通过;/途径进行细菌型乙醇发酵&2分子3I磷酸甘油醛经; F途径转化为2分子丙酮酸’-分子1SF和2分子01/P-&然后丙酮酸脱羧生成乙醛%再转化为乙醇&虽然2分子葡萄糖通过;/途径生成-分子乙醇’-分子+,-%但只净产生2分子 1SF!扣除发酵开始激活葡萄糖时用去的2分子

1SF"&在这里%氧化时获得的 01/P- 和 01/FP- 全部用于乙醛还原生成乙

-42 发酵工程

醇%01/!F"P- 产生与消耗完全平衡&总反应式为

!!+6P2-,6a1/FaF($-+P3+P-,Pa-+,-a1SFaP-,

肠杆菌!?834:52-.34:-"利用 ; F途径进行乙醇发酵&

!二"乳酸发酵!图("!"乳酸是细菌工业发酵最常见的终产物&细菌可经三种不同的代谢途径产生乳

酸&由葡萄糖发酵形成乳酸有两种类型%即同型乳酸发酵!>)$)K’B&(B!"#$"%&’&()%"和异型乳酸发酵!>"&"#)K’B&(B!"#$"%&’&()%"两类&两者的发酵菌种不同%发酵机制也不同&

2<同型乳酸发酵同型乳酸发酵是指由葡萄糖经; F途径分解为丙酮酸后%丙酮酸在乳酸脱

氢酶作用下直接作为01/P-的受氢体被还原成乳酸&2分子葡萄糖产生-分子乳酸’-分子1SF%但不产生+,-%; F途径葡萄糖发酵得到的产物只有乳酸%因此称同型乳酸发酵&乳杆菌属!!-.352-./001("和链球菌属!93:4=35...1("的多数细菌进行同型乳酸发酵&乳酸脱氢酶是乳酸发酵的关键酶%其活性受_/F和

.-a调控%当培养基中葡萄糖限量时%菌体细胞内_/F浓度低%乳酸形成少/当培养基中氮源限量时%菌体细胞内_/F浓度高%乳酸积累&总反应式为

!!+6P2-,6a-1/Fa-F($-+P3+P,P+,,Pa-1SF

-<异型乳酸发酵异型乳酸发酵是指发酵终产物中除了乳酸外%还有乙醇或乙酸和+,-它是以

磷酸酮解酶途径!FFO途径"为基础的&2分子葡萄糖发酵产生2分子乳酸’2分子乙醇和2分子1SF!由3I磷酸甘油醛至丙酮酸产生-分子1SF%扣除发酵开始激活葡萄糖时用去的2分子1SF"&产能低%相当于同型乳酸发酵的一半&总反应式为

!!+6P2-,6a1/FaF($+P3+P,P+,,Pa+P3+P-,Pa+,-a1SF

双歧杆菌经FPO途径!又称 ; F变异途径或双歧途径"进行异型乳酸发酵&如图7I2所示%-分子葡萄糖经双歧途径分解为-分子乳酸’3分子乙酸和5分子

1SF!由3I磷酸甘油醛和乙酰磷酸转变为乳酸和乙酸产生7分子1SF%扣除发酵开始激活-分子葡萄糖时用去的-分子1SF"&其产能水平高于上述两种乳酸发酵&总反应式为

!!+6P2-,6a-<51/Fa-<5F($+P3+P,P+,,Pa2<5+P3+,,Pa-<51SF

342第七章!微生物发酵机制

!三"丁酸型发酵!图(I$"

图("$!丁酸发酵和丙酮"丁醇#异丙醇发酵途径!参考罗大珍<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

442 发酵工程

一些专性厌氧细菌如梭菌属!@05(34:/17"’丁酸弧菌属!&13;:/B/2:/5"’梭杆菌属!N1(52-.34:/17"’真杆菌属!?12-.34:/17"的细菌能进行丁酸型发酵&依发酵产物不同%分丁酸发酵’丙酮I丁醇发酵等&其中丙酮I丁醇发酵业已大规模连续发酵生产%具重要经济意义&

2<丁酸发酵丙酮酸I铁氧还蛋白氧化还原酶和氢酶联合作用下%丙酮酸转变为乙酰+)1’

+,- 和P-%乙酰+)1再经一系列反应生成丁酸&在丁酸发酵过程中%每2分子葡萄糖分解产生2分子丁酸’-分子+,-’-分子 P-和3分子1SF&总反应式为

!!+6P2-,6a31/Fa3F($+P3+P-+P-+,,Pa-+,-a-P-a31SF

-<丙酮I丁醇发酵丙酮I丁醇发酵途径中%每-分子葡萄糖分解可产生2分子丙酮’2分子丁醇’4

分子 P- 和5分子+,-%并产生4分子1SF供细菌生长之需!若丙酮继续还原仍可生成异丙醇"&总反应式为

!!-+6P2-,6a41/Fa4F($+P3+P-+P-+P-,Pa+P3+,+P3a5+,-a4P-a41SF

工业发酵采用的丙酮I丁醇梭菌%因有淀粉酶%可先将淀粉质原料水解为葡萄糖%葡萄糖经 ; F途径降解为丙酮酸%再由丙酮酸生成乙酰+)1%进一步合成丙酮和丁醇&

!四"丙酸发酵!图(I%"许多厌氧细菌能发酵葡萄糖或乳酸生成丙酸’乙酸和+,-&有两种代谢途径

可以进行丙酸发酵%即琥珀酸I丙酸途径和丙烯酸途径&随石油短缺%合成法制取丙酸将逐步被发酵法取代&

2<琥珀酸I丙酸途径大多数丙酸细菌中葡萄糖经; F途径降解成-分子丙酮酸%由图7I4看出%

从丙酮酸生成丙酸是一个循环反应&2分子葡萄糖经琥珀酸I丙酸途径至少产生-分子1SF&

-<丙烯酸途径只少数丙酸细菌中存在丙烯酸途径&葡萄糖经; F途径降解生成丙酮酸

后%大部分丙酮酸通过还原生成乳酸%这也是一个循环反应&2分子葡萄糖经丙烯酸途径至少产生3分子1SF&

542第七章!微生物发酵机制

图("%!丙酸发酵途径!丙酸细菌"

!五"甲烷发酵机制甲烷发酵也叫沼气发酵&甲烷发酵过程的非产甲烷菌!%)%I$"%&>’%)."%E"

和产甲烷细菌!$"%&>’%)."%E"均叫沼气菌!N().’EG#)LDB(%.N’B&"#(’"&非产甲烷菌又称为产酸菌!’B(L)."%E"%包括(水解发酵细菌群!>?L#)K?&(BI!"#$"%&’&(*"N’BI

&"#(’"’产氢产乙酸菌群!P-IG#)LDB(%.’B"&)."%E"和同型产乙酸菌群!>)$)I’B"&)I

."%E"&2979年 ^<F<J#?’%&将甲烷菌分成三类(第一类包括甲烷杆菌属!P43+-6852-.34:/17"和甲烷短杆菌属!P43+-852:4B/2-.34:"在内的甲烷杆菌目 ! "&>’I%)N’B&"#(’K"E"/第二类包括甲烷球菌属!P43+-85.5..1("在内的甲烷球菌目!"&>I’%)B)BB’K"E"/第三类为甲烷微菌目! "&>’%)$(B#)N(’K"E"%分为两科%第一科包括甲烷微菌属!P43+-857/.:52/17"’产甲烷菌属!P43+-85>48/17"%甲烷螺菌属

642 发酵工程

!P43+-85(=/:/0017"排列顺序上都很相似%它们都具有嗜盐性%而且比典型的细菌耐温和耐酸&所以有人将甲烷菌和嗜盐菌’嗜热菌’嗜酸菌等一起分类属于古细菌&甲烷菌与真细菌的一个主要区别在于它能抵抗破坏真细菌细胞壁的抗生素的作用&甲烷发酵是由许多厌氧细菌同时进行的产酸和产气的复合发酵&厌氧消化过程的非产甲烷菌和产甲烷菌的生理特性有较大的差异%对环境条件的要求迥异%如表7I2所示&

表("!!产酸菌和产甲烷菌的特性参数

参数 产甲烷菌 产酸菌

对GP值的敏感性 敏感%最佳GP值为6<8*7<-不太敏感%最佳GP 值为5<5*7<:

氧化还原电位;> "[35:$\!中温"%"[56:$\!高温"

"[25:*-::$\

对温度的敏感性 最佳温度(3:*38‘%5:*55‘ 最佳温度(-:*35‘

甲烷发酵机制是厌氧菌将糖类’脂肪’蛋白质等复杂的有机物最终分解成甲烷和+,-&有机物的甲烷发酵不是由单一的甲烷产生菌所能完成的%甲烷发酵至少由三个阶段组成%第一阶段是有机聚合物水解生成单体化合物%进而分解成各种脂肪酸’+,- 和 P-/第二阶段是各类脂肪酸进行分解%生成乙酸’+,- 和 P-/第三阶段是由乙酸和+,- 及P-反应生成甲烷&甲烷发酵的三个阶段是相互依赖和连续进行的%并保持动态平衡&如果平衡遭到破坏%沼气发酵就受到影响%甚至停止&甲烷发酵过程如图7I5所示&

图("&!甲烷发酵过程示意图

742第七章!微生物发酵机制

甲烷发酵的前两个阶段统称为产酸阶段%产酸阶段也叫液化阶段%参与这一阶段发酵的产酸细菌大部分是兼性厌氧细菌%如梭菌属!@05(3:/"/17"%芽孢杆菌属!&-./001("%葡萄球菌属!93-=+05.5.1("%变形菌属!N:53./("%杆菌属!&-.34:/17"等&只有少量的原生动物’霉菌和酵母参与这一反应&发酵液中这一类非甲烷产生菌的数量大体上与甲烷产生菌相等%达2:6*2:8 个0$@&第三阶段的产气过程称为甲烷发酵%与这一过程有关的细菌总称为甲烷菌&甲烷菌是严格厌养菌%不产孢子&采用新的厌氧培养技术%可以分离得到-:种以上的甲烷产生菌&

复杂的有机物受到各类微生物的作用%生成简单的可溶性有机物%可溶性有机物经产酸菌的代谢生成 P-’乙酸和其他脂肪酸!3*5碳"&丙酸等3*5个碳的脂肪酸不能直接被甲烷菌转化生成甲烷%而先要有一种专性质子还原菌或醋酸菌将它们转化为醋酸和氢%甲烷菌再将 P-’P+,[3 !生成碳酸盐"或醋酸转化为甲烷!+P4"%并产生1SF&生成碳酸盐在溶液中和碳酸相平衡%后者与溶解态的+,-相平衡%液相+,- 又与气相+,- 相平衡&最终的产物是生物气体!+P4a+,-"&两者比例与基质’细菌分解途径’GP值和发酵液的缓冲能力有关%+P4 占的比例为5:R*9:R&

三!好氧发酵机制

传统的发酵工业如酿酒’制醋’乳酸和丙酮I丁醇发酵%最初都是由厌氧发酵开始的&但微生物中许多代谢产物的积累%如某些有机酸’氨基酸’核酸类物质’抗生素以及许多生理活性物质等都属于好氧发酵类型&

!一"葡萄糖直接氧化生成的有机酸!图(I’"葡萄糖直接氧化生成的有机酸有葡萄糖酸’5I酮葡萄糖酸’-I酮葡萄糖酸’阿

拉伯抗坏血酸’曲酸&

2<葡萄糖酸发酵葡糖杆菌属!@01.5852-.34:"’假单胞菌属!)(41"5758-("和曲霉属!<(=4:>/06

01("一些种在葡萄糖氧化酶催化下几乎定量地将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸&工业发酵常采用的菌种是黑曲霉&发酵液的GP值对产量有显著影响%为了及时中和发酵过程生成的有机酸%在以转桶式发酵罐生产时%培养基中需添加+’+,3%同时加入硼酸盐以抑制生成的葡萄糖酸钙沉淀/在通气搅拌发酵罐进行连续发酵生产时%需连续添加0’,P以维持发酵液的GP值&葡萄糖酸的钙盐和铁盐用于医药/葡萄糖酸的钠盐可作防垢剂/中间产物葡萄糖酸I&I内酯因缓慢释放+,-%可作发酵粉&

842 发酵工程

图("’!由葡萄糖直接氢化和经?5@循环合成有机酸的途径

942第七章!微生物发酵机制

由葡萄糖通过脱氢反应直接氧化先合成葡萄糖酸%再脱氢生成的有机酸还有5I酮葡萄糖酸!为酒石酸和维生素+生产的原料"’-I酮葡萄糖酸和阿拉伯抗坏血酸&

-<曲酸发酵由葡萄糖通过脱氢反应直接氧化合成有机酸还有曲酸的过程称为曲酸发酵&

在生产上%曲酸发酵采用米曲霉’溜曲霉!<(=*3-7-://"’黄曲霉等&生产上也采用通气搅拌发酵罐%由葡萄糖发酵生产曲酸收率达5:R以上&葡糖杆菌属的某些成员可由果糖生成微量曲酸&曲酸可作为杀霉剂和杀虫剂原料&

!二"经?5@循环而生成有机酸!图("’"经S+1循环而生成的有机酸有柠檬酸’异柠檬酸’别异柠檬酸’反丁烯二酸’苹

果酸’琥珀酸’丙酮酸’!I酮戊二酸’衣康酸等&仅简介柠檬酸和苹果酸发酵机制&2<柠檬酸发酵柠檬酸是S+1循环中的一种重要中间产物%正常情况下并不积累&黑曲霉

是目前生产上主要使用的菌种&黑曲霉的生长与柠檬酸过量合成明显分为两个时期(前期主要是菌丝体生长期%; F和P F途径比率为-T2%此时几乎没有柠檬酸积累/后期菌丝体生长停止%若条件适宜%柠檬酸大量合成和积累%; F和

P F途径比率为4T2&柠檬酸积累机制(!2"控制 %-a含量%抑制蛋白质合成%造成胞内0Pa4 浓度升高和代谢转向侧系

呼吸链!呼吸活性强%但不产1SF"%解除1SF对F_O的反馈调节%使; F途径畅通/!-"控制_"-a含量%使乌头酸酶活性低%阻止柠檬酸转化/!3"由丙酮酸羧化酶!组成酶"催化不断合成草酰乙酸%并继续转化成柠檬酸%

柠檬酸又会抑制异柠檬酸脱氢酶%进一步促进柠檬酸的积累&生产上2::.葡萄糖可获得75*87.柠檬酸&

-<苹果酸发酵苹果酸是S+1循环中的一个成员%一般不大量积累&黄曲霉’寄生曲霉和米

曲霉等是由葡萄糖发酵生产苹果酸的菌种&合成途径可能有(!乙醛酸循环合成苹果酸%2分子葡萄糖生成2分子苹果酸%理论转化率74<4R/"丙酮酸羧化合成草酰乙酸%再通过发酵液中添加+’+,3 转化为苹果酸%2分子葡萄糖生成-分子苹果酸%理论产率248<8R/乙醛酸循环和丙酮酸羧化合成苹果酸%苹果酸不参加循环%-分子葡萄糖生成3分子苹果酸%理论产率226<6R&

四!糖分解代谢中的调节

微生物为保证高效和经济地利用能量和养料%对为细胞提供能源和碳源的根

:52 发酵工程

本途径!糖分解代谢"有一套极精细的调节系统%主要有分解代谢产物阻遏’能荷与代谢调节和巴斯德效应&

!一"分解代谢产物阻遏!A/./1B6-.232932;;-B8"微生物在含有能分解的两种底物!如葡萄糖和乳糖或氨和硝酸盐"的培养基中

生长时%首先分解快速利用的碳源’氮源!如葡萄糖或氨"%而不分解慢速利用的碳源’氮源底物!如乳糖或硝酸盐"&这是因为快速利用的碳源’氮源分解代谢产物阻遏了慢速利用的碳源’氮源分解酶合成的结果&由于葡萄糖常对其他底物的有关酶合成有阻遏作用%又称葡萄糖效应!.KDB)E""!!"B&"&分解代谢产物阻遏在微生物生长上的表现为#二次生长$现象&微生物先利用第一种快速被利用的基质生长%待快速被利用的基质耗尽后%分解代谢产物阻遏才被解除%再利用第二种基质生长&

分解代谢产物阻遏机制!图7I7"(是两种效应物和两种调节蛋白共同调节的结果&第一种效应物K!乳糖"和阻遏蛋白2!M基因编码阻遏物"/第二种效应物-!醋酸杆菌属"和调节蛋白-!+MF蛋白%分解代谢产物活化蛋白或B1 F受体蛋白"&当细胞中B1 F浓度高时%B1 F与+MF结合引起+MF构象变化%形成一种有活性的B1 FI+MF复合物%与启动基因!F"一个位点结合/效应物2!乳糖"存在时%效应物2与调节蛋白2结合%使调节蛋白2变构%离开操纵基因!,"/M01聚合酶与启动基因!F"另一位点结合%开始结构基因转录和翻译&B1 F浓度低时%

图("(!葡萄糖分解代谢产物阻遏和A@CD作用

252第七章!微生物发酵机制

调节蛋白-!+MF"单独存在%不与启动基因结合&实际上是B1 F参与微生物的分解代谢酶的诱导合成的调节&B1 F由腺苷酸环化酶合成%由磷酸二酯酶分解%由B1 F透过酶运出胞外&葡萄糖分解代谢产物有抑制腺苷酸环化酶活力和促进磷酸二酯酶活力和B1 F透过酶活力的作用!即葡萄糖分解产物可使胞内

B1 F浓度下降和使胞内B1 F向胞外排出"&当培养液中有葡萄糖时%细胞内

B1 F水平低/反之%当葡萄糖被利用后%细胞内B1 F水平上升%引起+MF变构%形成有活性的B1 FI+MF复合物%从而启动转录&另外%B1 FI+MF复合物可以同时与几个操纵子上的启动基因结合%从而影响许多操纵子&所以%B1 FI+MF复合物可诱导一系列酶的合成&说明分解阻遏是发生在转录水平上的调节&

生产上有时常使用一些慢速利用的碳’氮源来避免使用快速利用的碳’氮源而引起分解代谢产物阻遏&如青霉素发酵中常利用乳糖代替部分葡萄糖以提高青霉素产量/采用嗜热脂肪芽孢杆菌!&-./001((34-:53+4:75=+/01("生产淀粉酶时%用甘油代替果糖以提高淀粉酶产量&如培养基中必须添加易引起分解阻遏的物质时%可采用分批添加或连续流加方式&

!二"能荷与代谢调节糖分解代谢途径中的一些酶除受末端产物或分解代谢产物调节外%由于1SF

可以视为糖分解代谢的末端产物%也可通过控制细胞的产能代谢!细胞能荷大小"来控制代谢物的流向&细胞内 1SF含量多少代表能荷高低%在产能反应的调节中%1SF过量时1SF反馈抑制产能反应中的酶!1SF合成酶系"/当1SF分解为

1/F或1 F%同时将能量转移给其他物质进行合成反应时%1SF的反馈抑制被解除%则1/F或1 F又激活产能反应的酶!1SF利用酶系"%恢复1SF的合成&通过改变1SF’1/F’1 F三者比例来调节代谢活动%称为能荷调节&受能荷调节的酶%其活性与能荷的关系如图7I8所示&

!三"巴斯德效应!D/;.2:32002A."由于葡萄糖在有氧呼吸中获得的能量远比无氧呼吸和发酵时获得的多得多%

所以%兼性厌氧微生物!如工业生产中常用的酿酒酵母或大肠杆菌"在有氧条件下%就会终止厌氧发酵而转向有氧呼吸&这种呼吸抑制发酵的现象称为巴斯德效应&因为巴斯德在研究酵母菌的乙醇发酵时%首先发现在有氧时酵母菌细胞进行呼吸作用%同时乙醇产量显著下降%糖的消耗速率减慢&这种呼吸抑制发酵的作用%几乎在所有兼性微生物中都存在&

-52 发酵工程

!a"激活/!["抑制

图(")!细胞能荷状态对糖代谢的影响

巴斯德效应的本质是能荷与代谢调节的结果%如图7I9所示&酵母菌通过

; F途径进行葡萄糖的乙醇发酵&; F途径中己糖激酶!PO"’磷酸果糖激酶!_I6IF激酶"和丙酮酸激酶!FO"是该途径的三个关键酶&这些酶的活性不仅受多种代谢产物的影响!柠檬酸和异柠檬酸抑制_I6IF激酶活性"%而且受到能荷调控&通过调节酶的活性而影响; F途径的正常运转&

巴斯德效应的机制为(!2",- 供应充足时%葡萄糖经; F途径产生的丙酮酸进入线粒体%经S+1

循环产生大量1SF%高能荷时1SF抑制_I6IF激酶’丙酮酸激酶’丙酮酸脱氢酶’柠檬酸合成酶’异柠檬酸脱氢酶等的活性&

!-",- 供应充足时%1/F和无机磷!F("进入线粒体%降低了对_I6IF激酶和己糖激酶的激活作用&由于_I6IF激酶活性降低%造成6I磷酸果糖积累%6I磷酸果糖

352第七章!微生物发酵机制

图("*!糖酵解途径与有氧呼吸途径的调节

异构逆转生成6I磷酸葡萄糖%但己糖激酶!PO"受6I磷酸葡萄糖!cI6IF"的反馈抑制%为此葡萄糖消耗速率减慢&

!3",- 供应充足时%大量的01/P- 经电子传递链进行氧化磷酸化生成大量

1SF%从而导致乙醛还原生成乙醇所需的01/P-减少%所以乙醇产量显著下降&

综上所述%由于,-供应充足时%_I6IF激酶’丙酮酸激酶等酶的活性降低%从而影响了微生物细胞对葡萄糖的分解利用以及 ; F途径发酵产物乙醇的生成%造成所谓呼吸抑制发酵的现象&

第二节!氨基酸发酵的代谢控制

一!氨基酸的生物合成

微生物生长所需要的氨基酸可以直接从培养基中吸收%或通过转氨基作用合

452 发酵工程

成其他的氨基酸(

!!谷氨酸a丙酮酸$!I酮戊二酸a丙氨酸

!!谷氨酸a草酰乙酸$!I酮戊二酸a天冬氨酸

这类反应是由氨基转移酶催化完成的&微生物经氨化作用或经固氮作用生成的氨可以通过特定的反应来吸收%生成

新的氨基酸(

微生物除了能通过上述反应合成新的氨基酸外%还可以从糖分解代谢过程中产生的中间体碳架物质通过一系列生物化学反应合成机体生长所需要的各种氨基

酸&按前体不同可以将-:种氨基酸生物合成方式分成6组(!2"3I磷酸甘油醛(丝氨酸’半胱氨酸’甘氨酸&!-"4I磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸(色氨酸’酪氨酸’苯丙氨酸&!3"丙酮酸(丙氨酸’缬氨酸’亮氨酸&!4"!I酮戊二酸(谷氨酸’谷氨酰胺’脯氨酸’精氨酸’赖氨酸!存在于细菌

中"&!5"草酰乙酸(天冬氨酸’天冬酰胺’甲硫氨酸’苏氨酸’异亮氨酸’赖氨酸!存在

于细菌中"&!6"5I磷酸核酮糖a1SF(组氨酸&这些氨基酸生物合成的大概过程分别概括如图7I2:所示&

二!氨基酸发酵机制

下面仅以谷氨酸’天冬氨酸族’赖氨酸’分支链氨基酸及鸟氨酸’瓜氨酸和精氨酸发酵机制为代表阐述&

!一"谷氨酸的发酵途径谷氨酸的生物合成途径就是经过糖酵解途径!; F"和单磷酸己糖途径!P F"

552第七章!微生物发酵机制

图("!+!氨基酸生物合成的大概过程

生成丙酮酸&一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰+)1/另一方面经+,-固定作用生成草酰乙酸/两者合并成柠檬酸进入三羧酸循环&由三羧酸循环的中间产物!I酮戊二酸%在谷氨酸脱氢酶催化下%还原氨基化合成谷氨酸&图7I22为谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成示意图%可见%谷氨酸的生物合成包括; F’P F’S+1循环’乙醛酸循环!/+1"和+,- 固定作用等&根据这一合成途径%由葡萄糖生成谷氨酸的总反应式为(

!!+6P2-,6a0P3a-03,-$+5P9,40a+,-a3P-,

谷氨酸发酵是氮素同化发酵&氨的导入是氨基酸发酵最基本的过程&从谷氨酸生物合成途径可知%氨的导入有三种方式(一是糖代谢中间体!I酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸/二是由天冬氨酸或丙酮酸通过氨基转移作用将氨基转给!I酮戊二酸生成/三是谷氨酸合成酶途径&但是谷氨酸产生菌中天冬氨酸酶和丙酮酸脱氢酶活力很低%转氨途径并不重要&

在谷氨酸发酵中%糖代谢除受生物素控制外%也受0Pa4 的影响&使用生物素

缺乏菌%在 0Pa4 存在时%葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸/当

0Pa4 不存在时%糖的消耗速度很慢%生成物是!I酮戊二酸’丙酮酸’醋酸和琥珀

酸&研究结果证明%在0Pa4 存在下%葡萄糖消耗和氧吸收量比约是2%但0Pa

4 不

652 发酵工程

图("!!!谷氨酸棒杆菌的谷氨酸生物合成示意图

存在时%比值一开始就为-%而且两种情况的呼吸商!Mg"也不同&但是%在生物素充足菌中%0Pa

4 几乎不影响糖代谢&

!二"天冬氨酸族氨基酸生物合成途径微生物的天冬氨酸族氨基酸生物合成途径是295:年以后逐渐被阐明的&它

是葡萄糖经糖酵解途径生成丙酮酸%丙酮酸经+,-固定和氧化脱羧后进入三羧酸循环%生成草酰乙酸/再经氨基化反应生成天冬氨酸/天冬氨酸在天冬氨酸激酶作用下分解成天冬氨酸"I半醛/然后分成两路%一方面在二氢吡啶二羧酸!//F"合成酶等一系列酶催化下生成赖氨酸%另一方面在高丝氨酸激酶等酶催化下生成苏氨酸/苏氨酸又在苏氨酸脱氢酶催化下生成异亮氨酸!图7I2-"&

752第七章!微生物发酵机制

2<天冬氨酸激酶/-<天冬氨酸I"I半醛脱氢酶/3<高丝氨酸脱氢酶/4<琥珀酰高丝氨酸合成酶/5<胱硫醚合成酶/6<胱硫醚酶/7<蛋氨酸合成酶/8<高丝氨酸激酶/9<苏氨酸合成酶/

2:<苏氨酸脱氢酶/22<乙酰羟酸合成酶/2-<二羟基酸还原异构酶/23<二羟基酸脱氢酶/27<0I琥珀酰I’I酮I!I氨基庚二酸合成酶/

28<琥珀酰二氨基庚二酸转移酶/29<琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶/-:<二氨基庚二酸差向异构酶/-2<二氨基庚二酸脱羧酶

图("!#!细菌的赖氨酸生物合成途径

!三"酵母和霉菌的赖氨酸生物合成途径酵母和霉菌合成赖氨酸是!I氨基己二酸途径%如图7I23所示&采用酵母的赖氨酸直接发酵法%目前尚未达到工业化生产程度%只不过开发利

用了一部分赖氨酸含量高的饲料酵母&这里主要存在两个原因%一个是酵母菌膜的通透性问题还没有解决/另一个是还没有发现像细菌中谷氨酸产生菌那样%在代谢活性方面有许多特征的菌株&有学者曾报道%在产朊球拟酵母!H5:105=(/(13/60/("和酿酒酵母的培养液中添加赖氨酸的前体物!I氨基己二酸和!I酮己二酸时%这些前体物有5:R*7:R转化为赖氨酸%这一含量为菌体重量的26R*-:R&为了添加前体物质使酵母积累赖氨酸%必须进行变异株的诱变&对酵母来说%由于赖氨

852 发酵工程

2<同型乳氨酸合成酶/-<同型乌头酸水解酶/3<同型异柠檬酸脱氢酶/4<!I氨基己二酸转氨酶/5<!I氨基己二酸还原酶/6<!I氨基己二酸转氨酶/7<!I氨基己二酸半醛I谷氨酸还原酶/

8<酵母氨酸脱氢酶

图("!$!酵母#霉菌赖氨酸生物合成途径

酸生物合成体系中没有分支途径%也就不存在由这个体系中其他代谢产物来进行的控制&因此%想要依靠像细菌那样的营养缺陷型变异株来进行赖氨酸生产是不可能的%这样必须取得在遗传上没有调节控制的调节突变株&

!四"分支链氨基酸发酵机制分支链氨基酸包括异亮氨酸’亮氨酸’缬氨酸%由于这些氨基酸的分子中都具

有甲基侧链形成的分支结构%故称为分支链氨基酸&经过用粗糙链孢霉’大肠杆菌等的营养缺陷型突变株%及用放射性同位素标记

的前体进行研究的结果%确定了亮氨酸’异亮氨酸和缬氨酸的生物合成途径&异亮氨酸的合成是以苏氨酸为前体%由苏氨酸脱氨酶和其后4种酶催化合成&缬氨酸是从丙酮酸开始%由乙酰乳酸合成酶’二羟基酸还原异构酶’二羟基酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶等4种酶催化合成%这4种酶与催化异亮氨酸合成的4种酶是相同的&亮氨酸是从缬氨酸生物合成的前体物!I酮基异戊酸开始分支%由!I异丙基苹果酸合成酶及其后三种酶催化合成&催化三种氨基酸生物合成的最后一步反应的酶是同一种酶%即分支链氨基酸转氨酶&可见%三种氨基酸的生物合成是相互影响的&

952第七章!微生物发酵机制

!五"鸟氨酸#瓜氨酸和精氨酸的发酵机制鸟氨酸’瓜氨酸和精氨酸是精氨酸系氨基酸%它们的生物合成是以谷氨酸为前

体物%由谷氨酸逐次合成鸟氨酸’瓜氨酸和精氨酸%从而组成以精氨酸为最终产物的不分支的代谢途径&在整个合成途径中由8个酶催化反应%其中第一步和第五步反应%由于微生物种类不同而异&5型途径的第一步由谷氨酸生成0I乙酰谷氨酸是由0I乙酰谷氨酸合成酶催化%第五步由0I乙酰鸟氨酸生成鸟氨酸是由0I乙酰鸟氨酸酶催化/而1型途径的第一步由谷氨酸生成乙酰谷氨酸%及由0I乙酰鸟氨酸生成鸟氨酸是由 0I乙酰谷氨酸I乙酰鸟氨酸乙酰基转移酶的共轭反应催化&大肠杆菌’枯草杆菌’埃希氏杆菌等微生物由5型途径合成精氨酸%而棒杆菌’假单胞菌’酵母’放线菌等由1型途径合成精氨酸%谷氨酸产生菌也属于1型&

精氨酸也可发生分解生成鸟氨酸并放出尿素%使精氨酸与鸟氨酸相衔接%形成循环%称为鸟氨酸环或尿素环&在微生物中%也存在分解精氨酸生成鸟氨酸及瓜氨酸的酶!精氨酸酶或精氨酸脱亚氨基酶等"&

第三节!抗生素发酵的代谢调控

抗生素是生物生命活动过程中产生的一种次级代谢产物或其人工衍生物%它们可以很低的浓度抑制或影响其他种生物的生命活动&与生物生存有关的’涉及产能代谢!分解代谢和耗能代谢"’合成代谢的代谢类型称为初级代谢(某些生物为了避免在初级代谢过程中积累某种或某些中间产物对机体的毒害作用而产生的一

类有利于生存的代谢类型称为次级代谢&次级代谢产物根据其作用可分为抗生素’激素’生物碱’毒素’色素’维生素等&微生物!尤其放线菌"是抗生素的主要产生菌%在生长的一定时期!一般是对数生长末期或稳定期"以初级代谢产物为前体%合成次级代谢产物&

一!次级代谢产物生物合成的主要途径

根据次级代谢产物的合成途径%次级代谢产物主要分为5种类型!图7I24"&

!一"与糖代谢有关的类型直接由葡萄糖合成的抗生素I链霉素和大环内酯类抗生素中的糖苷等/经

莽草酸途径中预苯酸合成芳香族抗生素I氯霉素和新生霉素等/由磷酸戊糖合成的抗生素I狭霉素’嘌呤霉素’抗溃疡的间型霉素’杀稻瘟菌素Z及多氧霉素等&

:62 发酵工程

图("!%!初级代谢的主要途径及与次级代谢关系

!二"与脂肪酸代谢有关的类型由丙二酸单酰+)1’乙酰+)1合成的聚酮!G)K?C"&(L""或"I多酮次甲基链!"I

262第七章!微生物发酵机制

G)K?C"&)$"&>?K"%""后进一步生成的次级代谢产物)))四环素族!聚乙酸型聚酮"’利福霉素族!脂肪桥"’大环内酯族红霉素!7个丙酸单位构成"’多烯族抗生素’放线菌酮!聚九酮"’灰黄霉素!聚七酮"和橘霉素等&

!三"与萜烯和甾体化合物有关的类型主要由霉菌产生%如由3个异戊烯单位聚合而成的烟曲霉素’4个异戊烯单位

聚合而成的赤霉素’6个异戊烯单位聚合而成的梭链孢酸’8个异戊烯单位聚合而成的"I胡萝卜素等&

!四"与?5@循环有关的类型一类是由S+1循环中间产物进一步合成的次级产物%如由!I酮戊二酸还原

生成的戊烯酸和由乌头酸生成的衣康酸/另一类是由S+1循环的中间产物与从乙酸生成的有机酸缩合而成的次级代谢产物%如担子菌产生的松蕈酸!!I十六烷基柠檬酸"就是由十八烷酸的!I亚甲基与草酰乙酸羰基缩合而成&

!五"与氨基酸有关的类型由一个氨基酸形成的次级代谢产物%如放线菌产生的环丝氨酸’氮丝氨酸%担

子菌由色氨酸合成的口蘑氨酸’鹅膏蕈氨酸等/由两个氨基酸形成的曲霉酸’支霉菌素和由半胱氨酸与缬氨酸缩合而形成的6I氨基青霉烷酸等/由三个以上氨基酸缩合而成的次级代谢产物%如细菌产生的杆菌肽’短杆菌肽Z’多黏菌素%链霉菌产生的放线菌素等&

从前面介绍的次级代谢产物类型也可看出%初级代谢是次级代谢的基础%初级代谢为次级代谢提供前体’能量和还原力%而次级代谢则是初级代谢在一定条件下的继续和发展&另外%初级代谢产物合成和次级代谢产物合成中往往也有共同的关键中间代谢物&

二!抗生素发酵调控机制

次级代谢和初级代谢调节在某些方面是相同的%实际上也是酶的调节%即酶活性的激活和抑制’酶合成的诱导和阻遏等&但是%初级代谢产物是次级代谢的前体%所以初级代谢对次级代谢调节的作用更大&研究微生物的代谢调节机制%可从/01水平研究酶合成的调节机制和从酶化学观点研究酶活性的调节机制两方面着手&对微生物来说%细胞的通透性与代谢调节的关系也是很密切的&因此%微生物的代谢调节机制可分为(!受/01控制的酶合成调节机制%包括

-62 发酵工程

酶的诱导和酶的阻遏!有终产物的阻遏和分解产物的阻遏"/"酶活性的调节机制%包括终产物的抑制或活化%利用辅酶的酶活调节’酶原的活化和潜在酶的活化/#细胞膜透性的调节&现就影响抗生素形成的主要代谢调节机制略述如下&

!一"诱导调节细胞产生的酶通常分为组成酶和诱导酶&组成酶是菌体生长繁殖所必需的

酶系%它的产生一般不受培养基成分的影响/诱导酶是仅当培养基中含有一定量的诱导物!一般为酶的底物或底物类似物"时才能形成%以适应底物的特殊需要&底物诱导可能控制单个酶的形成%也可能控制一组酶%这是由于加入的小分子诱导物能够与控制酶产生的调节基因所产生的阻遏蛋白发生特异性结合%使阻遏蛋白失去原有的构型%因而失去了原有的调节功能%使诱导酶的结构基因得以解除阻遏%开始转录而产生酶&在抗生素生物合成过程中%参与次级代谢的酶%有些是诱导酶%需要有诱导物存在才能形成&如把甘露糖链霉素变为链霉素和甘露糖的甘露糖链霉素酶%需要有!I甲基甘露糖苷’甘露聚糖等诱导物的作用&在顶芽孢菌的头孢菌素+生物合成中%甲硫氨酸具有促进抗生素生产的作用&

!二"反馈调节反馈调节包括反馈阻遏和反馈抑制%前者是作用于基因水平%控制酶的合成

量%是终产物抑制生物合成途径中的一种或多种酶形成的调节过程/后者是作用于分子水平%控制酶的活性%是合成途径的终产物抑制该过程中第一步酶的活性作用&两者作用方式各异%功能也有所不同%目的都是防止产生过量的物质%保证快速有效地适应变换了的外界环境%对生长有利&在抗生素的生物合成途径中%一方面抗生素本身的积累就能起反馈调节作用/另一方面初级代谢产物的形成受到反馈调节%也必然影响抗生素的合成&如缬氨酸是合成青霉素的前体%其生物合成受到反馈调节%必然对青霉素合成的次级代谢产生影响&

!三"碳#氮及其分解代谢产物的调节碳分解代谢产物调节指能迅速被利用的碳源!葡萄糖"或其分解代谢产物%对

其他代谢中的酶!包括分解酶和合成酶"的调节&分为分解产物阻遏和抑制两种&葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源%但对青霉素’头孢菌素’卡那霉素’新霉素’

362第七章!微生物发酵机制

丝裂霉素等都有明显降低产量的作用&在初级代谢中%氮分解代谢产物调节是指迅速利用的氮源!氨"抑制作用于含

底物酶!蛋白酶’硝酸盐还原酶’酰胺酶’脲酶’组氨酸酶"的合成&在次级代谢中%其阻遏作用也确实存在&在抗生素生产中使用黄豆饼粉就是由于它缓慢分解成有阻遏作用的氨基酸和氨%防止或减弱氮分解代谢产物阻遏作用&

营养物的吸收与代谢产物分泌都受到膜透性的调控&如上所述%控制膜透性可提高氨基酸发酵产量&青霉素发酵中也发现硫化物输入能力大%硫源供应充足%就会促进半胱氨酸合成%青霉素产量就提高&新霉素产生菌突变株加入油酸钠或

0’+K%改变细胞膜中脂肪酸的组成%谷氨酸积累增加%可促进新霉素前体新霉胺和去氧新霉胺合成%新霉素产量提高&

!四"细胞膜透性的调节外界物质的吸收或代谢产物的分泌都需经细胞膜的运输%如发生障碍%则胞内

合成代谢物不能分泌出来%影响发酵产物收获%或胞外营养物不能进入脑内%也影响产物合成%使产量下降&如在青霉素发酵中%生产菌细胞膜输入硫化物能力的大小影响青霉素发酵单位的高低&如果输入硫化物能力增大%硫供应充足%合成青霉素的量就增多&

!五"磷酸盐的调节磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分%还是调节抗生素生物合成的

重要因素&其机制按效应剂来说有直接作用%即磷酸盐自身影响抗生素合成%间接作用即磷酸盐调节胞内其他效应剂!如1SF’腺苷酸能量负荷和B1 F"%进而影响抗生素合成&已发现过量磷酸盐对四环素’氨基糖苷类和多烯大环内酯类等3-种抗生素的合成产生阻抑作用&

!六"产生菌细胞生长调节许多抗生素产生菌发酵过程存在着两个明显不同的生理阶段%即菌体快速生

长阶段和次级代谢产物合成阶段&许多重要的抗生素只在次级代谢产物合成阶段产生%如链霉素’青霉素’红霉素’金霉素’新霉素’放线菌素’卡那霉素’嘌呤霉素和杆菌肽等&抗生素发酵有两个生理阶段%其主要原因一是快速利用碳’氮源分解产物阻遏作用造成的%阻遏作用解除%碳’氮源耗尽%抗生素才开始产生/二是快速利用碳’氮源分解产物对次级代谢产物合成酶的阻遏%一旦解除阻遏%这些酶便被激活或合成&

462 发酵工程

总之%抗生素发酵的菌体生长期和次级代谢产物合成期两个生理阶段所要求的环境条件是不同的%这不仅因两个生理阶段所需的酶系不同%如何使抗生素合成关键酶的基因从阻遏状态迅速转入脱阻遏状态1 如何使发酵过程的生长期缩短%并迅速转入抗生素的生产期1 还有待于就分解代谢产物对抗生素合成关键酶阻遏机制的深入研究%以便从分子水平上设计育种方案%延长发酵的生产期%提高抗生素产量&

三!常见抗生素的生物合成机制

2<青霉素和头孢菌素的生物合成机制青霉素!G"%(B(KK(%"是青霉菌属!)48/./00/17"分泌的胞外抗生素%其化学结构

由两部分组成%即带酰基的侧链和6I氨基青霉烷酸!6I1F1"即青霉素的母核&头孢菌素+也是由两部分组成%即!I氨基己二酸侧链和7I氨基头孢霉烷酸!!I7I1+1"母核&它们都有相同的"I内酰胺环%并且在生物合成过程中具有同一的中间体%!I氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸/所不同的是组成青霉素母核的另一个环是噻唑环%头孢菌素的另一个环是双氢噻唑环&青霉素 c生物合成的化学计量式如下(

!!2<5葡萄糖a-0P3aP-Z,4a-01/P-aF11a51SF$青霉素c

头孢菌素+在异青霉素0以前的阶段和青霉素的生物合成完全一样&此后%经头孢菌素霉产生的异构酶的作用%将异青霉素0转化为青霉素0%再由扩环酶!脱乙酰氧头孢菌素+合成酶"催化扩环生成脱乙酰头孢菌素+%最后通过羟化和转乙酰基反应得到头孢菌素+&扩环和羟化是头孢菌素+生物合成中的关键反应和限速反应阶段&

青霉素c和头孢菌素+的生物合成与调控过程如图7I25所示&

-<大环内酯类抗生素的生物合成机制大环内酯类抗生素是以一个大环内酯!也称糖苷配基"为母核%通过糖苷键与

糖分子连接的一类有机化合物&依据结构分为大环内酯抗生素和多烯大环内酯抗生素&

红霉素!"#?&>#)$?B(%"是大环内酯类抗生素之一%是295-年从红链霉菌!93:4=357;.4(4:;3+:41("中获得的&红霉素分子结构由红霉内酯环’红霉糖和红霉糖胺3个亚单位构成的十四元大环内酯抗生素&在红霉素生物合成途径中最早合成的中间体是6I红霉内酯J%它是通过与脂肪酸合成过程类似的聚酮体途径合成的&使用24+和23+标志的前体试验%证实了红霉素内酯的缩合过程&2个 丙 酰

562第七章!微生物发酵机制

图("!&!青霉素E和头孢菌素5的生物合成与调控

+)1与6个甲基丙二酰+)1通过丙酸盐头部!)+,,P"至中部!+-"的共价键相连接缩合而形成&其生物合成途径见图7I26&

图("!’!红霉素生物合成途径

3<链霉素的生物合成机制链霉素!E&#"G&)$?B(%"为Q’CE$’%等人于2944年首先从灰色链霉菌!93:4=6

662 发酵工程

357;.4(>:/(41("的培养液中分离出来%是由链霉胍!E&#"G&(L(%""’链霉糖!E&#"G&)IN()E’$(%""和0I甲基I!I氨基葡萄糖组成的三糖&链霉素属于氨基糖苷类抗生素%分子中的3个亚单位的碳架直接来源于#I葡萄糖%胍基碳原子来自#I葡萄糖的降解产物&

!2"链霉胍的生物合成&从链霉素的分子结构可知%链霉胍部分是由-个胍基和环己六醇组成的&利用同位素试验证明环己六醇是由#I葡萄糖经过6I磷酸酯环化成环己六醇I2I磷酸酯%再经脱磷酸生成肌环己六醇%肌环己六醇经过氧化作用’氨基化作用’磷酸化作用’胍化作用和去磷酸化作用生成链霉胍&链霉胍的胍基来自精氨酸%精氨酸来自鸟氨酸循环&

!-"链霉糖的生物合成&链霉糖是由葡萄糖生物合成%葡萄糖2%-%3和6位碳提供了链霉糖2%-%3和5位碳&由葡萄糖转变成链霉糖是经过分子中碳I碳重排%并涉及脱氧胸腺核苷5iI-FI!LS/FI葡萄糖"%它被转化为4I酮I4%6I二脱氧I#I葡萄糖%最后转化为二氢链霉糖和鼠李糖&

!3"0I甲基I!I氨基葡萄糖的生物合成&利用不同位置的带有24+标记的

#Ic试验证明了0I甲基氨基葡萄糖的各个碳来自#I葡萄糖相对的碳原子%并且

#I氨基葡萄糖I2I24+&+也可以进入0I甲基I!I氨基葡萄糖的相应部分%用同位素证明了其甲基来自蛋氨酸&

所生成的!I链霉糖和0I甲基I!I氨基葡萄糖分别从它们的核苷二磷酸衍生物输送至链霉胍的6I磷酸%接着输送到,I-I!I链霉糖!2I4"I链霉胍I6I磷酸%形成链霉素I6I磷酸%经过脱磷酸作用生成链霉素&

4<氯霉素的生物合成机制氯霉素!B>K)#’$G>"%(B)K"是在2947年从放线菌委内瑞拉链霉菌!93:4=6

357-;.4(B484D140-"中分离出来的&现在使用的是化学合成产品%氯霉素分子中含有对位硝基苯基团’丙二醇及二氯乙酰胺基&氯霉素分子中存在着两个不对称碳原子%所以有4个光学异构体%其中只有左旋异构体具有抗菌能力&氯霉素生物合成途径如图7I27所示&氯霉素合成途径第一个酶为芳基胺合成酶&当氯霉素达2::$.0@时%对芳基胺合成酶有阻遏和抑制作用&

四!抗生素生物合成途径的遗传控制

初级代谢产物!如-:种氨基酸’8种核苷酸%以及由它们聚合而成的蛋白质和核酸等"的性质与类型在各类生物中是相同的或基本相同的%其生物合成途径也基本相同或相似&但是%次级代谢产物的合成%仅存在于个别菌种之中&次级代谢产物虽然也都是从少数几种初级代谢过程产生的中间产物衍生而来%但分类地位相

762第七章!微生物发酵机制

图("!(!氯霉素的生物合成与控制

同或不同的菌株%所产生的各种抗生素生物合成途径却大不一样&初级代谢分解与合成酶的基因位于染色体上%次级代谢产物合成酶的基因或位于染色体上或部分位于质粒上&已报道%有几十种抗生素的生物合成受到质粒控制%大致分为4类(质粒上载有合成抗生素的结构基因’调节基因’质粒控制抗生素的分泌基因’质粒编码抗生素的耐性基因%研究抗生素生物合成途径的遗传控制%进行抗生素产生菌的遗传育种%将为提高抗生素产量’获得新型抗生素开辟新的途径&

思 考 题

2<糖酵解!; F"途径有何意义和特点1

-<酒精发酵过程中为什么会产生甘油1

3<比较酵母菌的酒精发酵和细菌的酒精发酵之异同&

4<比较同型乳酸发酵与异型乳酸发酵的异同&

5<说明丙酮I丁醇发酵’己酸发酵和甲烷发酵的机理及应用&

6<在柠檬酸发酵过程中应该如何控制%使之大量积累1

7<请说明己酸发酵的原理&

8<为什么说谷氨酸及其他氨基酸发酵是代谢控制发酵1 生产中该怎样

862 发酵工程

控制1

9<说明初级代谢和次级代谢的关系及次级代谢产物的特征&

2:<抗生素产生菌的主要代谢调节有哪几种方式1 说明各类抗生素的生物合成机制&

962第七章!微生物发酵机制

第八章!发酵动力学

发酵动力学是生化反应工程的基础内容之一%研究发酵过程中菌的生长速率’培养基的消耗速率和产品形成速率的相互作用和随时间变化的规律&通过发酵动力学的研究%可进一步了解微生物的生理特征%菌体生长和产物形成的合适条件%以及各种发酵参数之间的关系&它为发酵过程的控制’小罐试验数据的放大以及从分批发酵过渡到半连续发酵和连续发酵提供了理论基础%也为发酵过程的工艺控制’发酵罐的设计放大和用计算机对发酵过程的控制创造条件&

在发酵中同时存在着菌体生长和产物形成两个过程%它们都需要消耗培养基中的基质%因此有各自的动力学表达式%但它们之间是有相互联系的%都是以菌体生长动力学为基础的&所谓菌体生长动力学是以研究菌体浓度’限制性基质!培养基中含量最少的基质%其他组分都是过量的"浓度’抑制剂浓度’温度和GP值等对菌体生长速率的影响为内容的&本章重点研究微生物发酵过程中菌体生长’基质消耗’产物生成的动态平衡及其内在规律&通过此研究进行最佳发酵生产工艺条件的控制&另外%设计合理的发酵过程%也必须以发酵动力学模型作为依据%发酵动力学研究还为工厂的试验比拟放大%为分批发酵过渡到连续发酵提供理论依据&

第一节!发酵过程动力学描述

一!发酵动力学分类

为了获得发酵过程变化的第一手资料%首先%要尽可能寻找能反映过程变化的理论参数/其次%将各种参数变化和现象与发酵代谢规律联系起来%找出他们之间的相互关系和变化/第三%建立各种数学模型以描述各参数随时间变化的关系/第四%通过计算机的在线控制%反复验证各种模型的可行性与适用范围&

表8I2为各种发酵动力学分类表&

表)"!!发酵动力学

分类依据及类型 判断因素 举!例

根据产物生成与基质消耗的关系

5产物生成直接与基质!糖类"消耗有关

酒精发酵’葡萄糖发酵’乳酸发酵’酵母培养

1产物生成与基质!糖类"消耗间接有关

柠檬酸发酵’衣康酸’谷氨酸’赖氨酸’丙酮’丁醇等的发酵

6产物生成与基质!糖类"消耗无关

青霉素’链霉素’糖化酶’核黄素等的发酵

根据生长有否偶联

偶联型 产物生成速率与菌体生长速率有紧密联系

酒精发酵

混合型 产物生成速率与菌体生长速率只有部分联系

乳酸发酵

非偶联型 产物生成速率与菌体生长速率无紧密联系

抗生素发酵

根据反应进程

简单型 营养成分以固定的化学量转化为产物%无中间物积累

黑曲霉葡萄糖酸发酵’阴沟产气杆菌的生长

并联型 营养成分以不定的化学量转化为一种以上的产物%且产物生成速率随营养成分含量而异%也无中间物积累

黏红酵母的生长

串联型 形成产物前积累一定程度的中间物的反应

极毛杆菌的葡萄糖酸发酵

分段型 营养成分在转化为产物前全转变为中间物或以优先顺序选择性的转化为产物反应过程有两个简单反应段组成

大肠杆菌的两段生长%弱氧化醋酸杆菌的5I酮基葡萄糖酸发酵

复合型 大多数的发酵过程是一个复杂的联合反应

青霉素发酵

发酵动力学可根据菌体生长与产物形成的关联关系%产物形成与基质消耗的关系%以及反应的进程等三种分类方式进行分类&

!一"根据菌体生长与产物形成是否偶联进行分类

2<偶联型产物生成速率与菌体生长速率有紧密关系%发酵产物通常是分解代谢的直接

产物&

272第八章!发酵动力学

!!L.!F"L3 UQF0]

L.!]"L3 UQF0]+.!]"!或!IFUQF0]+ !8I2"

式中(QF0])是以菌体细胞为基准的产物得率系数%.0.细胞/.!F")产物浓度%

.0@/.!]")菌体浓度%.0@/+)比生长速率%>[2/IF)产物比生成速率%>[2/

L.!)"L3

)产物生成速率%.0!@.>"/L.!]"L3

)菌体生长速率%.0!@.>"&

-<非偶联型在菌体生长和发酵产物无关联的发酵模式中%菌体生长时%无产物形成%但菌

体停止生长后%则有大量产物积累%发酵产物的生成速率只与菌体积累量有关&产物合成发生在菌体停止生长之后!即产生于次级生长"%故习惯上把这类与生长无关联的产物称为次级代谢产物%但不是所有次级代谢产物一定是与生长无关联的&非偶联型发酵的生成速率只与已有的菌体量有关%而产物比生成速率为一常数%与比生长速率设有直接关系&因此%其产率和浓度高低取决于菌体生长期结束时的生物量&产物形成与菌体浓度的关系如下(

!!L.!F"L3 U".!]" !8I-"

式中(")非生长偶联的比生成系数%.0!.细胞.>"&

3<混合型菌体生长与产物生成相关!如乳酸’柠檬酸’谷氨酸等的发酵"%发酵产物生成

速率可由下式描述(

!!L.!F"L3 U!L.

!]"L3 a".!]"U!%.!]"a".!]" !8I3"

或!!!IFU!%a"式中(!)与生长偶联的产物生成系数%.0./")非生长偶联的产物比生成系数%.0!..>"&

该复合模型的形成是将常数!’"作为变数%它们在分批生长的4个时期分别具有特定的数值&

!二"根据产物形成与基质消耗的关系分类

2<类型5产物的形成直接与基质!糖类"的消耗有关%这是一种产物合成与利用糖类有

化学计量关系的发酵%糖类提供了生长所需的能量&糖耗速率与产物合成速率的

-72 发酵工程

变化是平行的%如利用酵母菌的酒精发酵和酵母菌的好氧生长&这种形式也叫做有生长联系的培养&

-<类型1产物的形成间接与基质!糖类"的消耗有关%即微生物生长和产物合成是分开

的%糖既满足菌体生长所需的能量%又作为产物合成的碳源&但在发酵过程中有两个时期对糖的利用最为迅速%一个是最高生长时期%另一个是产物合成的最高时期&

3<类型6产物的形成显然与基质!糖类"的消耗无关%如抗生素发酵&即产物是微生物

的次级代谢产物%其特征是产物合成与利用碳源无准量关系%产物合成在菌体生长停止才开始&此种培养也叫做无生长联系的培养&

图)"!!比生长速率#产物比生长速率及基质比消耗速率的定义

图8I2示意一个典型的分批发酵过程%其产物不是菌体本身&图的纵坐标分别为菌体浓度.!]"%产物浓度.!F"及底物浓度.!Z"/横坐标是发酵时间3&在时间3U32 时的生长速率%产物比生成速率和底物比消耗速率都明确地表示在图上&

由图可知%各比速率是分批发酵过程时间3的函数%与对数生长期相一致%即(

!!+U2.!]"

L.!]"L3 ULK%.

!]"L3

!8I4"

!三"根据反应形式分类亭道孚!/"(%L"#!"#"根据反应形式提出5种发酵动力学的类型&

2<简单反应型营养成分以固定的化学量转化为产物%没有中间物积聚&又可分为有生长偶

联和无生长偶联两类&

-<并行反应型营养成分以不定的化学量转化为产物%在反应过程中产生一种以上的产物%而

372第八章!发酵动力学

且这些产物的生成速率随营养成分的浓度而异%同时没有中间物积聚&

3<串联反应型是指在形成产物之前积累一定程度的中间物的反应&

4<分段反应型其营养成分在转化为产物之前全部转变为中间物&或营养成分以优先顺序选

择性地转化为产物&反应过程是由两个简单反应段组成%这两段反应是由酶诱导调节&

5<复合型大多数发酵过程是一个联合反应%它们的联合可能相当复杂&青霉素发酵

过程就是这种反应&菌种的生长曲线是一个特殊的两段型&青霉素的生产曲线也呈现一个两段型的特征并滞后于生长曲线&一个中间产物的积聚是在糖分消失和青霉素出现之间的某处&这也是青霉素发酵过程中添加糖的一个理由&

二!工业发酵分类

发酵过程根据生产菌种和发酵条件的要求分为好氧发酵和厌氧发酵&好氧发酵有液体表面培养发酵’在多孔或颗粒状固体培养基表面发酵和通氧式液体深层发酵&厌氧发酵采用不通氧的深层发酵&液体深层培养是在有一定径高比的圆柱形发酵罐内完成的%根据其操作方法可分为以下几种&

!一"分批发酵法!1/.AF023>28./.-B8"分批发酵法是采用单罐深层分批发酵法&每一个分批发酵过程都经历接种’

生长繁殖’菌体衰老进而结束发酵%分离产物&这一过程在某些培养液的条件支配下%微生物经历着由生到死的一系列变化阶段%在各个变化的进程中都受到菌体本身特性的制约%也受到周围环境的影响&只有正确认识和掌握这一系列变化过程%才有利于控制发酵生产&

分批发酵的特点(基质一次性装入罐内%在适宜条件下接种进行反应%经过一定时间后%将全部反应物取出/微生物所处的环境是不断变化的%可进行少量多品种的发酵生产%如果发生染菌能够很容易终止操作%当运转条件发生变化或需要生产新产品时%易改变处理对策%对原料组成要求较粗放等&

!二"补料分批发酵法!02G"1/.AF023>28./.-B8"补料分批发酵法又称半连续发酵或半连续培养%是指在分批培养过程中%间歇

472 发酵工程

或连续地补加新鲜培养基&先将一定量基质装入罐内%在适宜条件下接种使反应开始&反应过程中%将限制性基质送入反应器%以将罐内限制性基质浓度控制在一定范围&反应终止将全部反应物取出&

与传统分批发酵相比%其优点是(使发酵系统中维持很低的基质浓度%可以除去快速利用碳源的阻遏效应%并维持适当的菌体浓度%使不致加剧供氧的矛盾/避免培养基积累有毒代谢物&广泛应用于抗生素’氨基酸’酶制剂’核苷酸’有机酸及高聚物等的生产&

!三"连续发酵法!AB8.-8:B:;023>28./.-B8"连续发酵过程是当微生物培养到对数生长期时%在发酵罐中一方面以一定速

度连续不断地流加新鲜液体培养基%另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出%使发酵罐中微生物的生长和代谢活动始终保持旺盛的稳定状态%而

GP值’温度’营养成分的浓度’溶解氧等都保持一定%并从系统外部予以调整%使菌体维持在恒定生长速率下进行连续生长和发酵%这样就大大提高了发酵的生长效率和设备利用率&

连续发酵的优点如下(!提供了微生物在恒定状态下高速生长的环境%便于进行微生物的代谢’生理’生长和遗传特性的研究/"在工业生产上可减少分批发酵中的清洗’装料’消毒’接种’放罐等的操作时间%提高生产效率/#中间及最终产物的生产稳定%由于系统化而产生综合效果/$产物质量比较稳定/%可以作为分析微生物的生理’生态及反应机制的有效手段&

连续发酵的缺点如下几点(!在长时间的培养过程中%微生物菌种容易发生变异%发酵过程容易染菌/"新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合%影响培养基和营养物质的利用/#必须和整个作业的其他工序连续一致/$收率及产物浓度比分批法稍低/%有可能被杂菌污染及变异/各因素对生物反应的影响和动力学关系不能充分解释&

连续发酵的类型见表8I-&连续发酵又分为开放式连续发酵和封闭式连续发酵&

表)"#!连续发酵类型

类型开放式!菌体取出" 封闭式!菌体不取出"

单罐 双罐 单罐 双罐

均匀混合

非循环 搅拌发酵罐 搅拌罐!串联" 透析膜培养

循环 搅拌发酵罐!菌体部分重复使用"

搅拌罐串联!菌体部分重复使用"

搅拌发酵罐!菌体2::R重复使用"

搅拌发酵罐串联!菌体2::R重复使用"

572第八章!发酵动力学

!!续表8I-

类型开放式!菌体取出" 封闭式!菌体不取出"

单罐 双罐 单罐 双罐

非均匀混合

非循环 管道发酵罐塔式发酵罐

塔式发酵罐装有隔板的管道发酵器!卧式’立式"

塔式发酵罐!菌体2::R重复使用"

塔式发酵罐 !菌体2::R重复使用"

循环 管道发酵器塔式发酵罐!菌体部分重复使用"

塔式发酵罐装有隔板的管道发酵器!菌体部分重复使用"

管道发酵罐!菌体2::R重复使用"

塔式发酵罐装有隔板的管道发酵器!菌体2::R重复使用"

2<开放式连续发酵在开放式连续发酵系统中%菌体随着发酵液而一起流出%菌体流出的速度等于

新菌体生成速度&因此在这种情况下%可使菌体浓度处于某种稳定状态&另外%最后流出的发酵液如部分返回!反馈"发酵罐进行重复使用%则该装置叫做循环系统%发酵液不重复使用的装置叫做不循环系统&

!2"单罐均匀混合连续发酵&培养液以一定的流速不断地流加到带有机械搅拌装置的发酵罐中%与罐内发酵液充分混合%同时带有菌体和产物的发酵液又以同样流速连续流出&如果用一个装置将流出的发酵液中部分细胞返回发酵罐%就构成循环系统&图8I-为单罐连续发酵系统示意图&

2<发酵罐/-<分离器/3<培养基流入

图)"#!单罐连续发酵系统

!-"多罐均匀混合连续发酵&将若干搅拌发酵罐串联起来%就构成多罐均匀混合发酵装置&

新鲜培养液不断流入第一只发酵罐%发酵液以同样流速依次流入下一只发酵

672 发酵工程

罐%在最后一只发酵罐中流出&多级连续发酵可以在每个罐中控制不同的环境条件以满足微生物生长各阶段的不同需要%并能使培养液中的营养成分得到较充分的利用%最后流出的发酵液中菌体和产物的浓度较高%所以是最经济的连续发酵法&

!3"管道非均匀混合连续发酵&管道的形式有多种%如直线形’Z形’蛇形管等&培养液和来自于种子罐的种子不断流入管道发酵器内%使微生物在其中生长’繁殖和积累代谢产物&这种连续发酵的方法主要用于厌氧发酵&如在管道中用隔板加以分隔%每一个分隔等于一台发酵罐%就相当于多罐串联的连续发酵&图8I3为该系统示意图&

2<培养液/-<种子罐/3<普通发酵罐/4<发酵液

图)"$!普通连续发酵

2<种子罐/-<空气进口/3<培养液进口/4<发酵液出口

图)"%!气液并流型塔式连续发酵装置

!4"塔式非均匀混合连续发酵&塔式发酵罐有两种(一种是用多孔板将其分隔成若干室%每个室等于一台发酵罐%这样一台多孔板塔式发酵罐就相当于一组多级串联的连续

发酵装置/另一种是在罐内装设填充物%使菌体在上面生长%这种形式仍然属于单罐式&图8I4是一种气液并流型连续发酵装置%培养液和空气从塔底部并流进入%在用多孔板分隔的多段发酵室中培养后由塔顶流出&

-<封闭式连续发酵在封闭式连续发酵系统中%运用某种方

法使菌体一直保持在培养器内%并使其数量不断增加&这种条件下%某些限制因素在培养器中发生变化%最后大部分菌体死亡&因此在这种系统中%不可能维持稳定状态&封闭式连续发酵装置可以用开放

772第八章!发酵动力学

式发酵设备加以改装%只要使部分菌体重新循环&另一种方法是采用间隔物或填充物置于设备内%使菌体在上面生长%发酵液流出时不携带细胞或所携带细胞极少&

透析膜连续发酵法是一种新方法%它是采用一种具有微孔的有机膜将发酵设备分隔%这种膜只能通过发酵产物%而不能通过菌体细胞&这样%将培养液连续流加到发酵设备的具有菌体的间隔中%微生物的代谢产物就通过透析膜连续不断地从另一间隔流出&在一些发酵过程中%当发酵液中代谢产物积累到一定程度时就会抑制它的继续积累%而采用透析膜发酵的方法可使代谢产物不断透析出去%发酵液中留下不多%因而可以提高产品得率&

三!发酵动力学描述量化指标

!一"菌体生长速率发酵过程动力学描述采用群体生物量的变化来表示&在液体培养基中的群

体生长%其生长速率即单位体积!或面积"’单位时间里微生物群体生长的菌体量&在表面上的群体生长%其生长速率以单位表面积来表示&菌体量一般指其干重&

生长微生物群体存在细胞大小的分布%单细胞的生长速率与细胞的大小直接相关%因此也存在生长速率分布&以下讨论的微生物生长速率指具有这种分布的群体平均值&群体的繁殖速率是群体的各个新单体的生长速率&

比生长速率是菌体浓度除菌体的生长速率和菌体浓度除菌体的繁殖速率&在平衡条件下%比生长速率%的定义式为(

!!%U2.!]"

L.!]"L3

或B]UL.!]"L3 U%.!]" !8I5"

式中(3)时间%>/B])菌体生长速率%.0!@.>"&菌体生长速率B] 与微生物的浓度.!]"成正比&比生长速率%除受细胞自身

遗传信息支配外%还受环境因素的影响&

!二"基质消耗速率以菌体得率系数为媒介%可确定基质消耗速率与菌体生长速率的关系&基质

的消耗速率BZ可表示为(

!![BZUB]Q]0Z

!8I6"

872 发酵工程

式中(Q]0Z)菌体得率系数又称细胞得率系数%.0$)@&基质的消耗速率常以单位菌体表示%称为基质的比消耗速率%以B表示(

!!BUBZ.!]"

!8I7"

当以氮源’无机盐’维生素等为基质时%由于这些成分只能构成菌体的组成成分%不能成为能源%Q]0Z近似一定%所以上式能够成立&但当基质既是能源又是碳源时%就应考虑维持能量&

!![BZU2QcB]a7..!]" !8I8"

!!碳源总消耗速率U用于生长的消耗速率a用于维持代谢的消耗速率

式中(7)基质维持代谢系数%$)K0!..>"/[BZ)碳源总消耗速率%$)K0!@.>"/

B])菌体生长速率%.0!@.>"/Qc)菌体得率系数!对细胞生长所消耗的基质而言"%.0$)K&

两边同除以.!]"%则

!![BU2Qc%a7 !8I9"

式!8I9"作为连接B和%的关联式%可以看作是含有两个参数的线性模型&B对%的依赖关系可一般简化为(

!![BU.!%" !8I2:"

式!8I2:"也间接表明了B对环境的依赖关系&

!三"代谢产物的生成速率代谢产物有分泌于培养液中的%也有保留在细胞内的%因此讨论生成速率的数

学模式有必要区分这两种情况&与生长速率和基质消耗速率相同%当以体积为基准时%称为代谢产物的生成

速率%记为BF/当以单位质量为基准时%称为产物的比生成速率%记为I%相关式为(

!!IUBF.!]"

!8I22"

+,- 不是目的代谢产物%但是%在微生物反应中是一定会产生的&+,- 的I

972第八章!发酵动力学

值%常表示为IB)-&好氧微生物反应中IB)-相对于氧的消耗%又称为呼吸商!CI"

!!CIU..!+,-"[..!,-"U

BB)-[B)-

UIB)-[I)-

!8I2-"

一般I是%的函数%考虑到生长偶联与非生长偶联两种情况I与%的关系可写成(

!!"IU<a&%

另外%作为一般形式%可认为是二次方程%即(

!!IU<a&%a@%- !8I23"

式中(<’&’@)常数&某些酶的生产和氨基酸的合成属于这种类型&

第二节!分批培养动力学

一!分批培养中微生物的生长曲线

分批培养是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后%接入少量的微生物菌种进行培养%使微生物生长繁殖%在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法&该方法在发酵开始时%将微生物菌种接入已灭菌的新鲜培养基中%在微生物最适宜的培养条件下进行培养%在整个培养过程中%除氧气的供给’发酵尾气的排出’消泡剂的添加和控制GP值需要加入酸或碱外%整个培

图)"&!分批培养过程中典型的细菌生长曲线

养系统与外界没有其他物质的交换&分批培养过程中随着培养基中营养物质的不断

减少%微生物生长的环境条件也随之不断变化%因此%微生物分批培养是一种非稳态的培养方法&

在分批培养过程中%随着微生物生长和繁殖%细胞量’底物’代谢产物的浓度等均不断发生变化&微生物的生长可分为4个阶段(停滞期!’"’对数生长期!N"’稳定期!B"和衰亡期!L"%见图8I5&各时期细胞成分的变化见图8I6&分批培养过程中各

个生长阶段的细菌细胞特征见表8I3&

:82 发酵工程

’<停滞期/N<对数生长期/B<稳定期/L<衰亡期

图)"’!不同生长阶段细胞成分的变化曲线

表)"$!细胞在分批培养过程中各个阶段的细胞特征

生长阶段 细 胞 特 征

停滞期 适应新环境的过程%细胞个体增大%合成新的酶及细胞物质%细胞数量很少增加%微生物对不良环境的抵抗力降低&当接种的是饥饿或老龄的微生物细胞%或新鲜培养基营养不丰富时%停滞期将延长&

对数生长期 细胞活力很强%生长速率达到最大值且保持稳定%生长速率大小取决于培养基的营养和环境

稳定期 随着营养物质的消耗和产物的积累%微生物的生长速率下降%并等于死亡速率%系统中活菌的数量基本稳定

衰亡期 在稳定期开始以后的不同时期内%由于自溶酶的作用或有害物质的影响%使细胞破裂死亡

2<停滞期停滞期是微生物细胞适应新环境的过程&在该过程中%系统的微生物细胞数

量并没有增加%处于一个相对的停止生长状态&但细胞内却在诱导产生新的营养物质运输系统%可能有一些基本的辅助因子会扩散到细胞外%同时参加初级代谢的酶类再调节状态以适应新的环境&

接种物的生理状态是迟滞期长短的关键&如果接种物处于对数期%很可能不

282第八章!发酵动力学

存在迟滞期%而立即生长&如果所用的接种物已经停止生长%那么%就需要更长的时间%以适应新环境&此外%接种物的浓度对迟滞期长短也有影响&

-<对数生长期处于对数生长期的微生物细胞的生长速度大大加快%单位时间内细胞的数量

或质量的增加维持恒定%并达到最大值&如在半对数纸上用细胞数目或细胞质量的对数值对培养时间作图%将可得到一条直线%该直线的斜率就等于%&

在对数生长期%随着时间的推移%培养基中的成分不断发生变化%但此期间%细胞的生长速率基本维持恒定%其生长速率可用数学方程式表示(

!!L.!]"L3 U%.!]" !8I24"

式中(.!]")细胞浓度%.0@/3)培养时间%>/%)细胞的比生长速率%@0>&如果当3U:时%细胞的浓度为.:!]"%上式积分后就为(

!!K%U.!]".)!]"U%

.3 !8I25"

微生物的生长有时也可用#倍增时间$!3L"表示%定义为微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间%即(

!!3LUK%-%U:<693%

!8I26"

微生物细胞比生长速率和倍增时间因受遗传特性及生长条件的控制%有很大的差异&应当指出%并不是所有微生物的生长速度都符合上述方程&微生物的比生长速率和倍增时间见表8I4&

表)"%!微生物的比生长速率和倍增时间

微生物 碳!源 比生长速率0!@0>" 倍增时间0$(%

大肠杆菌 复合物 2<- 35葡萄糖a无机盐 -<-8 25醋酸a无机盐 3<5- 2-琥珀酸a无机盐 :<24 3::

中型假丝酵母 葡萄糖a维生素a无机盐 :<35 2-:葡萄糖a无机盐 2<-3 34+6P24a维生素a无机盐 :<23 3-:

地衣芽孢杆菌 葡萄糖a水解酪蛋白 2<- 35葡萄糖a无机盐 :<69 6:谷氨酸a无机盐 :<35 2-:

-82 发酵工程

3<稳定期在微生物的培养过程中%随着培养基中营养物质的积累或释放%微生物的生

长速率也就随之下降%直至停滞生长&当所有微生物细胞分裂或细胞增加的速率与死亡的速率相当时%微生物的数量就达到平衡%微生物的生长也就进入了稳定期&在微生物生长的稳定期%细胞的质量基本维持稳定%但活细胞的数量可能下降&

由于细胞的自溶作用%一些新的营养物质%诸如细胞内的一些糖类’蛋白质等被释放出来%又作为细胞的营养物质%从而使存活的细胞继续缓慢地生长%出现通常所称的二次或隐性生长&

4<衰亡期当发酵过程处于衰亡期时%微生物细胞内所储存的能量已经基本耗尽%细胞开

始在自身所含的酶的作用下死亡&需要注意的是%微生物细胞生长的停滞期’对数生长期’稳定期和衰亡期的时

间长短取决于微生物的种类和所用的培养基&

二!微生物分批培养的生长动力学

分批培养过程中%虽然培养基中的营养物质随时间的变化而变化%但通常在特定条件下%其比生长速率往往是恒定的&从-:世纪4:年代以来%人们提出了许多描述微生物生长过程中比生长速率和营养物质浓度之间关系的方程%其中%294-年% )%)L提出了在特定温度’GP 值’营养物类型’营养物浓度等条件下%微生物细胞的比生长速率与限制性营养物的浓度之间存在如下的关系式(

!!%U %$.!Z"

,Za.!Z"!8I27"

式中(%$)微生物的最大比生长速率%@0>/.!Z")限制性营养物质的浓度%.0@/

,Z)饱和常数%$.0@&

,Z的物理意义为当比生长速率为最大比生长速率的一半时%限制性营养物质的浓度%它的大小表示了微生物对营养物质的吸收亲和力大小&,Z越大%表示微生物对营养物质的吸收亲和力越小/反之就越大&

对于微生物来说%,Z 值是很小的%一般为:<2*2-:$.0@ 或:<:2*3<:$$)K0@%这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力&

一些微生物的,Z值见表8I5&

382第八章!发酵动力学

表)"&!某些微生物的$H值

微生物 基质 ,Z值0!$.0@"

产气肠道细菌 葡萄糖 2<:大肠杆菌 葡萄糖 -<:*4<:啤酒酵母 葡萄糖 -5<:多形汗逊酵母 核糖 3<:多形汗逊酵母 甲醇 2-:产期肠道细菌 氮 :<2产期肠道细菌 镁 :<6产期肠道细菌 硫酸盐 3<:

微生物生长的最大比生长速率%$ 在工业生产上有条件的不同而不同%通常为:<:9*:<640>&一般来说%细菌的%$ 大于真菌&就同一细菌而言%培养温度升高%%$ 增大/营养物质的改变%%$ 也要发生变化&

图)"(!比生长速率与基质之间关系

通常容易被微生物利用的营养物

质%其%$ 较大/随着营养物质碳链的逐渐加长%%$ 则逐渐变小&习惯上式!8I26"称为莫诺德! )%)L"方程&

微生物的比生长速率与基质消耗

之间关系见图8I7&图8I7中线段-表示营养物质浓度

很低%即以.!Z"+,Z 时%微生物的比生长速率与营养物质的关系为线性关系%此时%)%)L方程可写为(

!!%U%$

,Z.!Z" !8I28"

线段2为适合 )%)L方程段/线段.表示营养物质浓度很高%即以.!Z"*,E时%微生物的比生长速率与营养物质的关系&正常情况下%%,%$%但这也正是由于营养物质或代谢产物导致抑制作用的区域%目前尚没有相应的理论方程描述此区域的情况%但有时可按下式表达(

!!%U %$,2,2a.!Z"

!8I29"

式中(,2)抑制常数&

482 发酵工程

因此%实践上%为了避免发生营养物质的抑制作用%分批培养应在高营养物质浓度下开始进行&

)%)L方程纯粹是基于经验得出的&在纯培养情况下%只有当微生物细胞生长受一种限制性营养物质制约时% )%)L方程才与实验数据相一致&而当培养基中存在多种营养物质时% )%)L方程必须加以修改%写成下式才能与实验数据相符合&

!!%F%$,2.2!Z",2R.2!Z"R

,-.-!Z",-R.-!Z"R

2R ,/./!Z",/R./!Z3 4". 2

//F2,3 4/

!8I-:"

如果所有营养物质都过量时%U%$%此时细胞处于对数生长期%生长速率达到最大值&微生物生长的动力学方程见表8I6&

表)"’!微生物生长的动力学方程

提出者 动力学方程 时间

)%)L %U%$Z

,ZaZ 294-年

S"(EE("# %U%$ 2["[90,! "E 2936年

)E"# %U%$Zj

,ZaZj 2958年

+)%&)(E 2959年

藤本 %U%$Z

,Z.]aZ 2963年

三!分批培养时基质的消耗速率

在发酵培养过程中%培养基中的营养物质被细胞利用%生成细胞和代谢产物%我们常用得率系数描述微生物生长过程的特征%即生成的细胞或产物与消耗的营养物质之间的关系&在实际生产中%最常用的是细胞得率系数!Q]0Z"和产物得率系数!QF0Z"%其含义为(

细胞得率系数!Q]0Z"(消耗2.营养物质生成的细胞的质量%单位为克&产物得率系数!QF0Z"(消耗2.营养物质生成的产物的质量%单位为克&可通过测定一定时间内细胞和产物的生成量以及营养物质的消耗量来进行计

算%获得表观得率系数&

582第八章!发酵动力学

!!Q]0ZU.!]"[.:!]".:!Z"[.!Z"U

..!]"

..!Z"

!!QF0ZU.!F"[):.:!Z"[.!Z"U

..!F"

..!Z"

!!Q]0,U.!]"[.:!]".:!,"[.!,"U

..!]"

..!,"

发酵培养基中基质的减少是由于细胞和产物的形成&即(

!![L.!Z"L3 U%.

!]"Q]0Z

!8I-2"

!!L.!F"L3 UQF0].L.

!]"L3

!8I--"

如果限制性的基质是碳源%消耗掉的碳源中一部分形成细胞物质%一部分形成产物%一部分产物维持生命活动%即有(

!![L.!Z"L3 U%.

!]"Qc

a7.!]"a2QFa2 !8I-3"

式中(Qc)菌体得率系数%.0./7)维持常数/QF)产物得率系数%.0.&

Q]0Z’QF0Z分别是对基质总消耗而言的&Qc 和QF是分别对用于生长和产物形

成所消耗的基质而言的%如果用比速率来表示基质的消耗和产物的形成%则有(

!!BU[ 2.!]"

.L.!Z"L3

!8I-4"

!!IFU 2.!]"

.L.!F"L3

!8I-5"

式中(B)基质比消耗速率%$)K0!.菌体.>"/IF)产物比生成速率%$)K0!.菌体.>"&

根据比生长速率的关系式和基质消耗速率的关系式可得到下列关系(

!!BU %Q]0Z!8I-6"

根据式!8I--"和式!7I-5"可得到下式(

!! 2Q]0Z

U2Qca7%

!8I-7"

若产物可忽略则%式!8I-6"可写成下式(

682 发酵工程

!! 2Q]0Z

U2Qca7%

!8I-8"

由于Qc’7很难直接测定%只要得出细胞在不同比生长速率下的Q]0Z%可根据式!8I-7"用图解法求Qc’7的值%从而可得到基质消耗的速率&

四!分批培养中产物的生成速率

在微生物的分批培养中%产物的生成与微生物细胞生长关系的动力学模式有三种%图8I8表示营养物质以化学计量关系转化为单一产物!F"’产物生成速率与细胞生长速率的关系&

图)")!微生物细胞的分批培养中细胞生长与产物生成的动力学模式

2<产物形成与细胞生长相关在该模式中%产物的生成速率与比生长速率的关系可表示为(

!!L.!F"L3 U%QF0Z !8I-9"

-<产物生成与细胞生长无关联

!!L.!F"L3 U".!]" !8I3:"

3<产物生成与细胞生长有关联和无关联的复合模式这时%产物生成与细胞生长的关系可表示为(

!!L.!F"L3 U!L.

!]"L3 a".!]" !8I32"

782第八章!发酵动力学

五!分批培养过程的生产率

在评价发酵过程的成本’效率时%应利用生产率!)"这个概念&发酵过程中的生产率可定义为(

!!生产率!)"U产物浓度!.0@"发酵时间!>"

!.0>.@"

生产率是个综合指标%在讨论分批培养时%必须考虑所有的因素&在计算时间时%不仅包括发酵时间%还应包括放罐’清洗’装料和消毒时间以及停滞期所消耗时间&图8I9表示整个发酵过程中所经历的时间的典型分析%并显示出了平均生产率和最大生产率&

图)"*!分批培养的生产率

发酵总时间为(

!!3U2%$K%.2

!]".:!]"a3Ba3!a32

!8I3-"

式中(3B)放罐清洗时间/3!)装料消毒时间/32)停滞时间/.:!]")细胞初始浓度/.2!]")细胞最终浓度&

如令3@U3Ba3!a32%平均生产率)可表示为(

!!)U.2!]"[.:!]"2%$K%.2

!]".:!]"a32

!8I33"

882 发酵工程

第三节!连续发酵动力学

连续培养是以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基%同时以相同的速度流出培养液%从而使培养系统内培养液的量维持恒定%使微生物细胞能在近似恒定状态下生长&连续培养也称连续发酵&

在连续培养过程中%微生物细胞所处的环境条件%如营养物质的浓度’产物的浓度’GP值以及微生物细胞浓度’比生长速率等可以自始至终基本保持不变%甚至还可以根据需要来调节微生物细胞的生长速率&因此%连续培养的最大特点是微生物细胞的生长速率’产物的代谢均处于恒定状态%可达到稳定’高速培养微生物细胞或产生大量的代谢产物的目的&

一!单罐连续培养的动力学

!一"细胞的物料平衡为了描述恒定状态下恒化器的特性%必须求出细胞和限制性营养物质的浓

度与培养基流速之间的关系方程&对发酵反应器来说%细胞的物料平衡可表示为(

!!流入的细胞[流出的细胞a生长的细胞[死去的细胞U积累的细胞

!!N.:!]"L [NL.

!]"a%.!]"[E.!]"UL.!]"L3

!8I34"

式中(.:!]")流入发酵罐的细胞浓度%.0@/.!]")流出发酵罐的细胞浓度%.0@/

N)培养基的流速%@0>/L)发酵罐内液体的体积%@/%)比生长速率%@0>/E)比死亡速率%@0>/3)时间%>&

对普通单级恒化器而言%.:!]"U:%在多数连续培养中%*E%所以方程可简化为(

!![NL.!]"a%.!]"U

L.!]"L3

!8I35"

定义稀释率#UN0L%单位为>[2&在恒定状态时%L3U:%所以

!!%UNL

!8I36"

即在恒定状态时%比生长速率等于稀释率(

982第八章!发酵动力学

!!%U# !8I37"

这就表明%在一定范围内%认为调节培养基的流加速率%可以使细胞按所希望的比生长速率来生长&

!二"限制性营养物质的物料平衡对生物反应器!发酵罐"而言%营养物的物料平衡可表示为(

!!流入的营养物质[流出的营养物质[生长消耗的营养物质[

!!维持生命需要的营养物质[形成产物消耗的营养物U积累的营养物

即(

!!NL.:!Z"[NL.

!Z"[%.!]"Q]0Z

[7.!]"[IF.!]"

QF0ZUL.

!Z"L3

!8I38"

式中(.:!Z")流入发酵罐的营养物浓度%.0@/.!Z")流出发酵罐的营养物浓度%

.0@/Q]0Z)细胞得率系数/IG)产物的比生成速率%.产物0!.细胞.>"/QF0Z)产物得率系数&

在一般情况下%7.!]"+%.!]"0Q]0Z而形成产物很少%可忽略不计&在恒定状

态下%L.!Z"L3 U:%式!8I38"为(

!!#3.:!Z"[.!Z"4U%.!]"Q]0Z

!8I39"

因为%U#%所以(

!!.!]"UQ]0Z3.!Z"[.:!Z"4 !8I4:"

!三"细胞浓度与稀释率的关系为了使细胞浓度’营养物的浓度与稀释率发生关系%需要利用 )%)L方程&

当 )%)L方程应用于连续培养时%则变为(

!!#U#B.!Z",Za.!Z"U

%$.!Z",Za.!Z"

!8I42"

式中(#B)临界稀释率%即在恒化器中可能达到的最大稀释率&除极少数外%#B相当于分批培养中的%$%由式!8I42"可得到(

:92 发酵工程

!!SUQ]0Z.:!Z"[ #,Z%$[3 4# !8I4-"

式!8I42"和式!8I4-"分别表示了以.!Z"和.!]"对培养基流速!也就是#"的依赖关系&当流速低时%# 小时%营养物全部被细胞利用%.!Z"$:%细胞浓度

.!]"U.:!Z"Q]0Z&如果#增加%开始.!]"呈线性慢慢下降%然后%当#U#BU%$ 时%

.!]"下降到:&开始时.!Z"随#的增加而缓慢增加&当#U%$ 时%.!Z"$.:!Z"&在方程!8I4-"中%当.!]"U:时%达到#清洗点$%即有(

!!#U %$.:!Z"

,Za.:!Z"!8I43"

因为( .:!Z",Za.:!Z"U2

%所以#U%$&

当#在%$ 以上时%不可能达到恒定状态&如果# 只稍稍低于%$%那么整个系统对外界环境变化是非常敏感的&随着# 的微小变化%.!]"将产生巨大的变化&图8I2:表示稀释率对.!Z"’.!]"’3L!倍增时间"和细胞产率的影响&

图)"!+!稀释率对营养物质浓度&%!H"’#细胞浓度&%!I"’#倍增时间!&G"和细胞生成速率&’A!I"’的影响

!四"连续培养生产率与分批培养生产率的比较在工业生产中%连续培养主要用于生产微生物菌体&连续培养的生产率可表

示为(

!!)U#B!]" !8I44"

292第八章!发酵动力学

将方程!8I4-"代入方程!8I44"得到(

!!)U#Q]0Z.:!Z"[ #,Z%$[3 4# !8I45"

为求出最大生产率所需要的稀释率%可求方程!8I45"的一阶导数并使其为零来计算&由此得到(

!!#$U%$ 2[,Z

,Za.:!Z槡3 4" !8I46"

将方程!8I46"代入方程!8I4-"得到(

!!.$!]"UQ]0Z 3.:!Z"a,Z4[ ,Z3.:!Z"a,Z槡5 64 !8I47"

由此得到连续培养生产率和分批培养生产率之比为(

!!)B)NU

#$.$!]")N U

%$Q]0Z,Za.:!Z".:!Z槡 " [ ,Z

.:!Z槡3 4"-

.$!]"[.:!]"2%$K%.$

!]".:!]"a32

!8I48"

因为.:!Z"*,Z%所以,Za.:!Z".:!Z" ,2%

,Z.:!Z",:

%方程!8I48"可以简化为(

!!)B)NU

K%.$!]"

.:!]"a%$32

.$!]"[.:!]"Q]0Z !8I49"

由此可见(%$ 越大%连续培养生产率比与分批培养生产率之比越大%采用连续培养越有利(如%$ 过小%则不宜采用连续培养&

二!带有细胞再循环的单级恒化器

在单级恒化器的培养过程中%若将流出液用离心机分离%将流出液中的微生物细胞再部分地回加到发酵罐内%形成再循环系统%这样可以增加系统的稳定性%而且可使恒化器内细胞的浓度增加%.2!]"’.-!]"分别代表从发酵罐和离心机流出的细胞浓度%N和N2分别代表充入发酵罐的培养基流速和流出离心机的流速&如果引入再循环比率!和浓缩因子@两个参数%再采取与前述类似的方法可推导出%在恒化器状态下(

!!%U!2a![!@"#

-92 发酵工程

!!.!]"UQ]0Z3.:!Z"[.!Z"4

2a![!@!8I5:"

由此可见%当存在细胞再循环时%%不再等于#%因为@(2%所以2a![!@永远小于2%则%永远大于#&这就表明%在带有细胞再循环的单级恒化器中%有可能达到很高的稀释率%而细胞没有被#清洗$的危险&同样%在恒定状态下细胞浓度

比不带有再循环的恒化器大一个因子 22a![!@

&

将式!8I5:"代入 )%)L方程%则(

!!.!Z"U,Z++$[+

U,Z #!2a![!@"+$[#!2a![!+"

!8I52"

!!.2!]"UQ]0Z

2a![!@.:!Z"[,Z#

!2a![!@"+$#!2a![!@"

!8I5-"

式!8I52"和式!8I5-"是在带有循环的单级恒化器中基质浓度与细胞浓度的表达式%说明该系统有利于增加细胞浓度&

三!多级连续培养

图8I22显示一种简单的多级连续培养&图中N为由第一个发酵罐流出的培养液的流速!单位为@0>"%L2 和L- 分别为第一和第二个发酵罐的体积!单位为

@"%Ni是补加到第二个发酵罐的新鲜培养基的流速!单位为@0>"%N-UNaNT%

.:!Z"’.:i!Z"分别为加到第一和第二个发酵罐内限制性营养物浓度%.2!Z"和.-!Z"分别为剩余限制性营养物的浓度%.2!]"和.-!]"分别为第一和第二个发酵罐内细胞浓度&采用与前述类似的方法%可以推导出在恒定状态下%两级串联恒化器中每个发酵罐内物料平衡的结果&

图)"!!!多级连续培养示意图

392第八章!发酵动力学

表)"(!恒定状态下两级串联恒化器中每个发酵罐内的物料平衡

发酵罐 细胞物料平衡 限制性营养物料平衡

第一个发酵罐 %2U#- .2!]"UQ]0Z3.:!Z"[.2!Z"4

第二个发酵罐!不补加新鲜培养基" %-U#- 2[

.2!]"

.-!]3 4" .-!]"U#-%-Q]0Z .2!Z"[.-!Z3 4"

第二个发酵罐!补加新鲜培养基" %-U#-[

N2.2!]"L-.-!]" .-!]"U

Q]0Z

%-N2L-.2

!Z"aNTL-9T[#-.-!Z3 4"

由上表可见%在第二个发酵罐内%%- 不等于#-%如果不向第二个发酵罐补加新鲜培养基%则第二个发酵罐的净生长速率就会很小/如果向第二个发酵罐内补加新鲜培养基%不仅可以促进细胞的生长%而且可以使# 选定在比%$ 更大的数值&

第四节!补料分批发酵动力学

补料分批发酵指在分批培养过程中%间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法%又称半连续培养或半连续发酵%是介于分批培养过程与连续培养过程之间的一种过渡培养方式&

目前%该方法在发酵工业上普遍用于氨基酸’抗生素’维生素’酶制剂’单细胞蛋白’有机酸及有机溶剂等的生产过程中&

一!补料分批发酵的类型

补料分批发酵类型很多%比较混乱%尚未有统一的分类方法&!2"按补料方式可分为连续补料’不连续补料’多周期补料/!-"按每次补料的流速可分为快速补料’恒速补料’指数速度补料’变速补料/!3"按反应器中发酵液的体积可分为变体积’恒体积/!4"按反应器的数目分为单级’多级/!5"按补料培养基组成分为单一组分补料’多组分补料&发酵过程中不同的补料方法对细胞密度’生长速率及生产率均有影响&表8I8

为补料方法对细胞密度’生长速率及生产率的影响&图8I2-为微生物补料分批发酵类型及其操作过程&

492 发酵工程

表)")!补料方法对细胞密度#生长速率及生产率的影响

微生物 培养基搅拌通气

补料方式细胞浓度0!.0@"

比生长速率0!20>"

生产率03.0!@.>"4

大肠杆菌 完全培养基 ,- 补加葡萄糖%提高最低溶氧浓度

-6 :<46 -<3

大肠杆菌 完全培养基 ,- 改变加入蔗糖的量%控制最低溶氧浓度

4- :<36 4<7

大肠杆菌 完全培养基 ,- 按比例加入葡萄糖和铵盐%控制GP值

35 :<-3 3<9

大肠杆菌 完全培养基 ,- 按比例加入葡萄糖和铵盐%控制GP值%低温维持最低溶氧浓度大于2:R

47 :<58 3<6

大肠杆菌 完全培养基 ,- 补加碳源%维持恒定的浓度/以适当比例加入盐和铵盐%控制GP值

238 :<55 5<8

大肠杆菌 完全培养基 空气 以恒定的速度!不导致,- 的供应受到限制"补加碳源

43 :<38 :<8

大肠杆菌 完全培养基 空气 补加碳源%限制细胞生长%避免乙酸产生

65 :<2*:<24 2<3

大肠杆菌 完全培养基 空气 补加碳源%控制细胞生长

8: :<-*2<3 6<-

N<流速/L<发酵液体积/.!Z"<限制性营养物质的浓度/!指数速率补料培养/"恒速补料培养/#变速补料培养/

图)"!#!微生物补料分批发酵类型及其操作过程!参考韩德权等<发酵工程<-::8"

592第八章!发酵动力学

补料分批培养是介于分批培养和连续培养之间的一种微生物培养方式%它兼有两种培养方式的优点%并在某种程度上克服了它们所存在的缺点&

与分批培养方式比较%补料分批培养的优点如下(!可以解除培养过程中的底物抑制’产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应/"对于耗氧过程%可以避免在分批培养过程中因一次性投糖过多造成的细胞大且生长’耗氧过多以至通风搅拌设备不能配套的状况/#在某种程度上可减少微生物细胞的生成量’提高目的产物的转化率/$微生物细胞可以被控制在一系列连续的过滤态阶段%可用作控制细胞质量的手段%以提高发芽孢子的比例/%可作为理论研究的手段%为自动控制和最优化控制提供实验基础&

与连续培养方式比较%补料分批培养的优点如下(!不需要严格的无菌条件/

"不会产生微生物菌老化和变异/#最终产物浓度较高%有利于产物的分离/$使用范围广&

二!补料分批培养的动力学

!一"单一补料分批培养单一补料分批培养的特点是补料一直到培养液达到额定值为止%培养过程中

不取出培养液&在单一补料分批培养过程中%假定.:!Z"为开始时培养基中限制性营养物质的浓度%N为培养基的流速%L 为培养基的体积%N0L 为稀释率%用#表示%刚接种时培养液中的微生物细胞浓度.:!]"%那么%在某一瞬间培养液中微生物细胞浓度以.!]"可表示为(

!!.!]"U.:!]"aQ]0Z3.:!]"[.!Z"4 !8I53"

由式可知%当.!Z"U:时%微生物细胞的最终浓度为.$’e!]"%假如.$’e!]"*.:!]"%则(

!!.$’e!]"UQ]0Z.:!Z" !8I54"

如果在.!]"U.:!]"时%开始以恒定的速率补加培养基%这时%稀释率# 小于

%$%发酵过程中随着补料的进行%所有限制性营养物质都很快被消耗&此时(

!!N.:!Z",%.i!]"Q]0Z

!8I55"

式中(N)补料的培养基流速%@0>/.i!]")培养液中微生物细胞总量%.%.T!]"U.!]"L/L)时间3时培养基的体积%@&

式!8I55"可以看出补加的营养物质与细胞消耗掉的营养物质相等%因此L.!Z"L3 U:&

692 发酵工程

随着时间的延长%培养液中微生物细胞的量.T!]"增加%但细胞的浓度却保持不

变%即L.!]"L3 U:%因而%0#&这种

L.!]"L3 U:%L.

!Z"L3 U:%%0# 时微生物细胞的培

养状态%就称为#准恒定状态$%同样有(

!!.!Z",#,Z%$[#

.T!]"U.:i!]"aN.Q]0Z..:!Z".3 !8I56"

式中(.:i!]")开始补料时的总微生物细胞量%.&

!二"重复补料分批培养重复补料分批培养是在培养过程中%每间隔一定的时间%取出一定体积的培养

液%同时又在同一时间间隔内加入相等体积的培养基%如此反复进行的培养方式&采用这种培养方式%培养液体积’稀释率’比生长速率以及其他与代谢有关的参数都将发生周期性变化&表8I9是连续补料和分批补料发酵的比较&

表)"*!连续补料和分批补料发酵的比较

项目 连续流加法 分批流加法 项目 连续流加法 分批流加法

批数 4 4 发酵时间0> -3<: -7加糖总量0. 29:k3 289k4 最终谷氨酸的浓度 95<- 9:<8残糖0!.0@" -3<3 -4<6 糖转化率0!.0." :<5:4 :<479

思 考 题

2<研究发酵动力学有何意义1

-<阐述菌体生长速率’基质消耗速率’产物生成速率及意义&

3<发酵动力学如何分类及各自优缺点是什么1

4<比较不同发酵方法的优缺点&

5<简述微生物生长代谢过程中的质量平衡和能量平衡的意义及计算&

6<简述发酵反应过程中的各种得率系数及意义&

7<简述比生长速率’基质比消耗速率’产物比生成速率的意义&

8<分析分批培养中产物比生成速率的表达式%说明在生产过程中如何提高产品的产率&

9<简述生物反应动力学研究的意义&

2:<简述分批发酵动力学! )%)L"方程及意义&

22<试比较分批培养’补料分批培养和连续培养的优缺点&

792第八章!发酵动力学

第九章!发酵工艺的控制

第一节!培养基基质对发酵的影响及调控

营养基质是指供微生物生长及产物合成的原料%也称为底物%主要包括碳源’氮源’无机盐’微量元素和生长调节物质等&在发酵过程中%营养基质是生产菌种代谢的基础%既关系到菌种的生长情况%又关系到代谢产物的形成&不同的菌种以及同一种菌种在不同的条件下对营养基质的种类和浓度都有不同的要求&在分批发酵过程中%若培养基过于丰富%会使菌体生长过盛%发酵液黏度增大%影响传质和传热状况%影响溶氧%还使细胞不得不花费许多能量来维持其生存环境%即用于非生产的能量增高%最终不利于代谢产物的合成&若培养基浓度过低%会使菌体营养不足%影响菌体生长和产物的合成%使设备利用率降低&所以在发酵过程中选择合适的营养基质和控制适宜的营养基质浓度是提高产物产量的重要方法&下面分别讨论碳源’氮源’磷酸盐等主要因素对发酵过程的影响和控制&

一!碳源的种类和浓度对发酵过程的影响及控制

碳源是构成菌体成分的重要元素%又是产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料%同时又是化能异养型微生物的能量来源&碳源主要有单糖中的己糖!以葡萄糖为主"%寡糖中的蔗糖’麦芽糖’棉籽糖%多糖中的淀粉’糖蜜’纤维素’半纤维素’甲壳质和果胶质等&其中%淀粉是大多数微生物都能利用的碳源%如通过培养基优化实验%确定了淀粉为阿维菌素的最适合碳源物质&但也有一些例外%如谷氨酸产生菌不能利用淀粉%只能利用葡萄糖’果糖’蔗糖和麦芽糖等&此外%除了上述糖类外%油脂’有机酸和低碳醇也是工业发酵中常用的碳源&例如%93:4=5356B4:3/./00/17ZOI-发酵生产谷氨酰胺转氨酶的最佳碳源是-R甘油混加适量橄榄油&

!一"碳源的种类对发酵的影响及控制碳源的种类对发酵的影响主要取决于其性质%即快速利用的碳源还是缓慢利

用的碳源&快速利用的碳源!如葡萄糖"能较快地参与微生物的代谢’合成菌体’产

生能量%并产生分解产物!如丙酮酸等"%对菌体生长有利%但有的分解代谢产物对产物的合成会产生阻遏作用/缓慢利用的碳源多数为聚合物!如淀粉"%不能被微生物直接吸收利用%需要微生物分泌胞外酶将聚合物分解成小分子物质%因此被菌体利用缓慢%有利于延长代谢产物的合成时间%特别是延长抗生素的分泌期&许多微生物药物的发酵就是采用这种方法以获得较高的产量%如乳糖’蔗糖’麦芽糖及半乳糖分别是青霉素’头孢菌素+’核黄素及生物碱发酵的最适碳源&因此%选择合适的碳源对提高代谢产物的产量非常重要&

图*"!!糖对青霉素生物合成的影响

在对青霉素发酵的早期研究中%人们就认识到了碳源的重要性&在快速利用的碳源葡萄糖培养基中%菌体生长良好%但合成的青霉素却很少/而在缓慢利用的碳源乳糖培养基中%菌体生长缓慢%青霉素的产量却有明显的提高&它们的代谢变化如图

9I2所示&同样的例子还有葡萄糖完全阻遏嗜热

脂肪芽孢杆菌产生的胞外生物素)))同效维生素的合成&因此%控制使用有阻遏作用的碳源是非常重要的&但并不是所有的快速利用碳源都对产物的合成有阻遏作

用&例如%使用93:4=35.5..1(D554=/"47/6.1(P-3发酵产生透明质酸&在工业发酵中%培养基中常采用快速利用和缓慢利用的混合碳源%就是根据这个原理来控制菌体生长和产物合成的&以葡萄糖作为碳源%透明质酸产量最高%其后依次是蔗糖和麦芽糖%而果糖’木糖’半乳糖等利用情况不佳&葡萄糖是红霉素生物合成的劣质碳源%但发酵初期较高浓度的葡萄糖有利于菌丝体的萌发’生长和大量繁殖&所以%采用葡萄糖和淀粉二者优化配比可提高红霉素的产量&

!二"碳源的浓度对发酵的影响及控制碳源的浓度对于菌体生长和产物的合成有着明显的影响%如培养基中碳源含

量超5R%细菌的生长会因细胞脱水而开始下降&酵母或霉菌可耐受更高的葡萄糖浓度%达-::.0@%这是由于它们对水的依赖性较低&并且%在某一浓度下碳源

992第九章!发酵工艺的控制

会阻遏一个或更多的负责产物合成的酶%这称之为碳分解代谢物阻遏&碳源浓度的优化控制%通常采用经验法和发酵动力学法%即在发酵过程中采用中间补料的方法进行控制&在实际生产中%要根据不同的代谢类型来确定补糖时间’补糖量’补糖方式等&而发酵动力学法要根据菌体的比生长速率’糖比消耗速率及产物的比生产速率等动力学参数来控制&

头孢菌素+生物合成途径中的两个关键酶)))去乙氧头孢菌素+合成酶对碳分解代谢阻遏物很敏感&葡萄糖阻遏头孢菌素+生物合成中的&!!I氨基己二酰"I半胱氨酰I缬氨酸合成酶&避免分解代谢物阻遏的一种办法是使补入碳源的速率等于其消耗的速率%另一种办法是使用非阻遏性碳源%如除葡萄糖以外的其他单糖’寡糖’多糖或油等&

碳源浓度对产物形成的影响以酵母的+#’N&#""效应为典型例子%即酵母生长在高糖浓度下%即使溶氧充足%它还会进行厌氧发酵%从葡萄糖产生乙醇%如图9I-所示&

图*"#!酵母培养基中的53/1.322效应(糖浓度对乙醇比生产率#比生长速率和细胞得率的影响

!参考韦革宏等<发酵工程<-::8"

当葡萄糖浓度大于:<25.0@时便产生乙醇&为了阻止乙醇的生成%需控制生长速率和葡萄糖浓度&在这种情况下采用补料分批或连续培养可以避免+#’N&#""

::- 发酵工程

效应的出现&培养基中糖浓度对谷氨酸发酵有密切关系&在一定范围内%谷氨酸产量随糖

浓度的增加而增加%但糖浓度过高%由于渗透压增大%对菌体的生长和发酵不利&国内谷氨酸发酵的糖浓度为2:R*23R%产酸为4R*5<5R&国外一般采用保持低浓度的流加糖发酵&

在使用93:4=35.5..1(D554=/"47/.1(P-3发酵产生透明质酸的试验中发现初糖浓度对菌种的生产性能有很大的影响%即初糖浓度高对菌体的生长和透明质酸形成产生抑制%而发酵过程中产生的乳酸同样会抑制菌体生长和透明质酸形成/而初糖浓度较低时%透明质酸产率系数降低%发酵时间延长%生产强度偏低&综合考虑透明质酸的产量’产率系数’生产强度%分批发酵生产透明质酸采用5:.0@左右的初糖浓度较为适宜&

在利用重组毕赤酵母高密度发酵生产水蛭素的研究中发现%甲醇一方面作为碳源构成细胞骨架%使细胞生长/另一方面又作为能源物质用于菌体生长’维持外源蛋白的表达&提高碳源浓度可有效地增加产物表达的量%但甲醇浓度的提高会抑制细胞生长甚至导致细胞死亡&因此%利用甲醇传感器控制甲醇的流加量%同时以限制性速度混合流加甘油%可获得较高的水蛭素产量&

二!氮源的种类和浓度对发酵的影响及控制

氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素%所以在发酵过程中%调节氮的种类和浓度对菌体生长和产物合成有着至关重要的作用&

!一"氮源的种类对发酵的影响及控制

2<氮源的种类根据氮的来源可分为无机氮和有机氮&发酵工业中常用的无机氮包括硝酸

盐’铵盐’氨水等/有机氮包括豆饼粉’花生饼粉a玉米浆’蛋白胨’酵母粉’酒糟’尿素等&和碳源一样%也可以把氮源分为可快速利用氮源和缓慢利用氮源&前者包括氨基!或铵"态氮的氨基酸!或硫酸铵等"和玉米浆等/后者包括黄豆饼粉’花生饼粉’棉籽饼粉等蛋白质&

-<不同种类氮源对发酵的影响及控制可快速利用氮源容易被菌体所利用%有利于菌体生长%但对某些代谢产物的合

成%特别是对某些抗生素的合成产生调节作用而影响产量&例如%链霉菌的竹桃霉素发酵中%采用促进菌体生长的铵盐浓度%能刺激菌丝生长%但抗生素的产量反而减少&铵盐对柱晶白霉素’螺旋霉素同样产生类似的调节作用&缓慢利用氮源对

2:-第九章!发酵工艺的控制

延长次级代谢产物的分泌期’提高产物的产量是有好处的&但一次性的投入也容易促进菌体生长和养分过早耗尽%导致菌体过早衰老而自溶%从而缩短产物的分泌期&考虑到上述原因%发酵培养基一般选用含有快速和缓慢利用的混合氮源&例如%氨基酸发酵用铵盐!硫酸铵或醋酸铵"和麸皮水解液’玉米浆作为氮源/链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉作为氮源/红霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉作为碳源%其中借助吸附缓释原理%将无机氮储存在一个库中缓慢释放%即培养基中无机氮源浓度高时将其纳入库中%菌丝生长需要时又可自动流加进来%以此来调节氮的利用&

氮源种类对发酵过程的影响除体现在其是快速利用氮源或缓慢利用氮源外%还有一些特殊的作用&例如%赖氨酸生产中%培养基中甲硫氨酸和苏氨酸的存在可提高赖氨酸的产量%但由于纯氨基酸价格昂贵%生产中常用黄豆水解液来代替&谷氨酸生产中%使用尿素作为氮源%尿素可发生氨基化%从而提高谷氨酸的产量&在使用93:4=35.5..1(D554=/"47/.1(P-3发酵产生透明质酸的试验中%由于酵母粉中含有大量的生长因子%用酵母粉作为氮源%菌体生长良好%透明质酸的产量也最高&但使用H5:105=(/(>0-2:-3- QZPIXF2-发酵产生丙酮酸时%同样使用酵母粉作为氮源%当酵母粉浓度增加时%虽然细胞干重不断增加但丙酮酸产量却迅速下降&

有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外%有的还是产物的前体%如缬氨酸’半胱氨酸和!I氨基己二酸是合成青霉素和头孢菌素的主要前体&无机氮源一般比有机氮源吸收利用快%但无机氮源的迅速利用常会引起GP值的变化&例如%

!!!0P4"-Z,4$-0P3aP-Z,4!!0’0,3a4P-$0P3a-P-,a0’,P

反应中产生的0P3被菌体利用后%培养基中就留下了酸性或碱性物质%从而改变了培养基的GP 值&因此%在使用中一定要注意GP 值的变化并随时进行调整&

!二"氨源的浓度对发酵的影响及控制与碳源相似%氮源的浓度过高%会导致细胞脱水死亡%且影响传质/浓度过低%

菌体营养不足%影响产物的合成&不同产物的发酵中%所需的氮的浓度也不同&例如%谷氨酸发酵需要的氮源比一般的发酵多得多&一般的发酵工业碳氮比为

2::T!:<-*-<:"%谷氨酸发酵的碳氮比为2::T!25*-:"%当碳氮比为2::T22以上%才开始积累谷氨酸&在谷氨酸发酵中%用于合成菌体的氮仅占总耗用氮的

-:- 发酵工程

3R*6R%而3:R*8:R用于合成谷氨酸&在实际生产中%采用尿素或氨水作为氮源时%由于一部分用于调节GP值%一些分解而逸出%往往实际用量很大&当培养基中糖浓度为2-<5R%总尿素用量为3R时%含碳量为5R%含氮量为2<4R%此时碳氮比为2::T-8&氨浓度对谷氨酸的产率也有影响&在菌体生长阶段%如

0Pa4 过量%会抑制菌体生长/在谷氨酸合成阶段%如 0Pa

4 不足%!I酮戊二酸不能还原氨基化%而积累!I酮戊二酸%如0Pa

4 过量%使谷氨酸转化为谷氨酰胺%都会影响谷氨酸的产量&在使用93:4=35.5..1(D554=/"47/.1(P-3发酵产生透明质酸的试验中%当酵母粉的浓度为-:.0@时%透明质酸的含量’细胞干重’细胞产率均达到最大值%残糖最低&例如%继续提高酵母粉浓度%残糖升高%细胞干重和透明质酸都逐渐下降&又如%使用H5:105=(/(>0-2:-3- QZPIXF2-发酵产生丙酮酸%使用蛋白胨作为氮源%当蛋白胨浓度为25.0@较为适宜%若高于此值%虽细胞干重增加%但丙酮酸的产量却下降&在利用S-83+5758-(.-7=4(3:/(I99:-菌株生产黄原胶的研究中发现%随着发酵培养基中总碳氮比的增加%产胶率呈明显的上升趋势%总碳氮比为2:T2时%产胶率仅为2<8:R左右%但当总碳氮比为-5T2时%产胶率提高到3<64R&随着碳氮比的继续增大%产胶率逐渐维持在3<4R左右的水平&

此外%为了调节菌体生长和防止菌体衰老自溶%除了基础培养基中的氮源外%有时还需要补加氮源来控制浓度&生产上常用的方法有(第一%补加有机氮源%根据微生物的代谢情况%添加某些具有调节生长代谢的有机氮源%如酵母粉’玉米浆’尿素等&例如%青霉素发酵中%后期出现糖利用缓慢’菌体浓度变稀’菌丝展不开%

GP值下降的现象%补加尿素水溶液就可改变这种状况并提高产量&第二%补加无机氮源%工业中常用的方法是补加氨水或硫酸铵%其中氨水既可作为无机氮源%又可调节GP值&在抗生素的发酵工业中%补加氨水可提高产量%如果与其他条件配合%有些抗生素的发酵单位可提高5:R&如在红霉素的发酵生产中加入氨调节

GP值%并且可作为无机氮源%能提高红霉素的产率和有效组分的比例&

三!磷酸盐浓度的影响及控制

磷是构成蛋白质’核酸和 1SF的必要元素%是微生物生长繁殖所必需的成分%也是合成代谢产物所必需的营养物质&在发酵过程中%微生物从培养基中摄取的磷一般以磷酸盐的形式存在&因此%在发酵工业中%磷酸盐的浓度对菌体的生长和产物的合成有一定的影响&微生物生长良好时%所允许的磷酸盐浓度为:<3-*3::$$)K0@%但次级代谢产物合成良好时所允许的磷酸盐最高平均浓度仅为

2$$)K0@&当提高到2:$$)K0@时%可明显抑制其合成&菌体生长所允许的浓度和次级代谢产物合成所允许的浓度相差悬殊&因此%控制磷酸盐浓度对微生物次

3:-第九章!发酵工艺的控制

级代谢产物发酵的意义非常大&例如%杆菌肽发酵中无机磷酸盐的浓度应控制在

:<2*2$$)K0@%这时可以合成杆菌肽%不受其影响&但是%如果浓度高于2$$)K0@%则杆菌肽合成明显受到抑制&但也有一些产物要求磷酸盐浓度高些%如黑曲霉0MIM@33:菌种生产!I淀粉酶%若加入:<-R磷酸二氢钾则活力可比低磷酸盐提高3倍&还有报道用地衣芽孢杆菌生产!I淀粉酶时%添加超过菌体生长所需的磷酸盐浓度%则能显著增加!I淀粉酶的产量&

在磷酸盐浓度的控制方面%通常是在基础培养基中采用适当的浓度给予控制&高浓度磷酸盐对许多抗生素&如链霉素’新霉素’四环素’土霉素’金霉素’万古霉素等的合成具有阻遏和抑制作用%磷酸盐浓度太低时%菌体生长不够%也不利于抗生素合成&因此%常采用生长亚适量!对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量"的磷酸盐浓度&磷酸盐最适浓度取决于菌种特性’培养条件’培养基组成和原料来源等因素%并结合具体条件和使用的原材料进行实验来确定&培养基中的磷含量还可能因配制方法和灭菌条件不同而有所变化%在使用时应特别小心&在发酵过程中%若发现代谢缓慢’耗糖低的情况%可适量地补充磷酸盐%如在西所米星发酵中%高浓度磷酸盐会提高发酵液中淀粉水解酶活力和丙酮酸浓度’降低碱性磷酸酯酶活力%对西所米星合成产生抑制&所以%西所米星发酵生产中采用分段控制发酵液中的磷酸盐浓度%在菌体生长期控制在3<24$$)K0@以内%在产物合成期应控制:<2$$)K0@以下&

总之%控制基质的种类及其各成分的浓度是决定发酵是否成功的基础%必须根据生产菌的特性和产物合成的要求进行深入细致的实验研究%以取得最满意的效果&

第二节!溶解氧对发酵的影响及控制

一!微生物对氧的需求

!一"微生物的临界氧浓度微生物的耗氧速率受发酵液中氧的浓度的影响%各种微生物对发酵液中溶氧

浓度有一个最低要求%这一溶氧浓度叫做临界氧浓度%以.临界表示&目前%最常用的测定溶氧的方法是基于极谱原理的电流型测氧覆膜电极法%即在发酵罐中安装溶氧电极进行溶氧的测定&在临界氧浓度以下微生物的临界氧浓度一般为

:<::3*:<:5$$)K0@&不同种类的微生物需氧量不同%一般为-5*2::$$)K,-0!@.>"%但也有个别菌很高&

4:- 发酵工程

同一种微生物的需氧量%随菌龄和培养条件不同而异&菌体生长和形成代谢产物时的耗氧量也不同&一般幼龄菌生长旺盛%其呼吸强度大%但是种子培养阶段由于菌体浓度低%总的耗氧量也较低/晚龄菌的呼吸强度弱%但是%在发酵阶段%由于菌体浓度高%耗氧量大&培养基丰富的耗氧量也大&

氧是一种难溶气体%在-5‘’2<:2V2:5 F’下%氧在纯水中的溶解度为

2<-6$$)K0@&表9I2为氧在水’盐或酸溶液中的溶解度&空气中的氧在水中的溶解度为:<-5$$)K0@左右&在相同条件下%培养基中含有大量的有机物和无机盐%由于盐析等作用造成氧在培养基中的溶解度更低%约为:<-2$$)K0@&在好氧深层培养中%氧气的供应往往是发酵过程能否成功的重要限制因素之一&如果外界不能及时地供给氧%这些溶解氧只能维持微生物菌体25*-:E的正常呼吸%随之就会被耗尽%微生物的呼吸就会受到抑制&在发酵过程中%微生物只能利用溶解状态下的氧&因此%就必须采取强化供氧&在实验室和小规模发酵培养过程中%氧的供给可以通过摇瓶机的往复运动或偏心旋转运动对摇瓶中的微生物供氧&对大规模生产的深层发酵罐供氧采用通风方式通入无菌空气%为了提高供氧效率%还必须控制搅拌速率&通风和搅拌的目的就是提供微生物生长和代谢所需要的氧%并使微生物在培养液中处于悬浮状态以及提高代谢产物的传递速度&

表*"!!氧在水#盐或酸溶液中的溶解度

温度0‘在水中的溶解度0!$$)K0@"

在-5‘溶液中溶解度0!$$)K0@"

溶液浓度 盐液 硫酸 氯化钠

: -<28 : 2<-6 2<-6 2<-62: 2<7:25 2<54 :<5 2<-2 2<-2 2<:7-: 2<38-5 2<-6 2<: 2<26 2<2- :<893: 2<2635 2<:9 -<: 2<2- 2<:- :<724: 2<:3

!二"供氧与微生物呼吸及代谢产物的关系好气性微生物的生长发育和产物的合成都需要消耗氧气%它们只有在氧分子

存在的情况下才能完成生物氧化作用%因此%供氧对需氧微生物必不可少&好氧微生物的氧化酶系存在于细胞内原生质中%因此%微生物只能利用溶解于液体中的氧&发酵液中溶解氧的多少%一般以溶解氧系数值表示&由于各种好氧微生物所

5:-第九章!发酵工艺的控制

含的氧化酶体系!如过氧化氢酶’细胞色素氧化酶’黄素脱氢酶’多酚氧化酶等"的种类和数量不同%在不同环境条件下%各种需氧微生物的吸氧量或呼吸程度不同&

微生物的吸氧量常用呼吸强度和耗氧速率来表示&呼吸强度(指单位重量干菌体在单位时间内所吸取的氧量%以I,-表示%单位

为3$$)K,-0!.干菌体.>"4&耗氧速率(指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量%以:表示%单位为

3$$)K,-0!@.>"4&呼吸强度可以表示微生物的相对需氧量%但是%当培养液中有固体成分存在%

对测定有困难%这时可用耗氧速率来表示&微生物在发酵过程中的耗氧速率取决于微生物的呼吸强度和单位体积液体的菌体浓度&

二!氧在溶液中的传递

!一"氧的传递途径与传质阻力在大规模发酵生产中%通常采用深层培养方式%氧的提供是给培养中的微生物

通入无菌空气来进行&微生物细胞分散在培养液中%只能利用溶解氧&氧从空气的气泡传递到微生物细胞内要克服一系列传递阻力&氧的传递途径是气相中的氧溶解在发酵液中%再传递到细胞内的呼吸酶位置上而被利用&这一系列传递过程分为供氧和耗氧两方面&

供氧(指空气中氧气从空气泡里通过气膜’气液界面和液膜扩散到液体主流中&

耗氧(指氧分子自液体主流通过液膜’菌丝丛’细胞膜扩散到细胞内&这种传氧对那些细胞浓度很高’细胞的生长受到液体中氧限制的体系尤为重要&氧传递过程中要克服的阻力有(!从气相主体到气液界面的气膜传递阻力

20Ec%与空气情况有关/"气液界面的传递阻力20E2%与空气情况有关%只有具备高能量的氧分子才能透到液相中去%而其余的则返回气相/#从气液界面通过液膜的传递阻力20E@%与发酵液的成分和浓度有关/$液相主体的传递阻力20EXJ%与发酵液的成分和浓度有关%通常不作为重要阻力%因在液体主流中氧的浓度是假定不变的%但只有在适当搅拌的情况下才这样/%细胞或细胞团表面的传递阻力20EX+%与微生物的种类’生理特性状态有关%但细菌和酵母的细胞不存在这种阻力%对于菌丝这种阻力是最为突出的/&固液界面的传递阻力20EXZ%与微生物的生理特性有关/’细胞团内的传递阻力20E1/(细胞壁的阻力K0EQ/)反应阻力20EM%是指氧分子与细胞内呼吸酶系反应时的阻力%与微生物的种类’生理特性有关&

由于氧是难溶气体%所以在供氧方面液膜是一个控制过程%即20E@ 是较为显

6:- 发酵工程

著的%使气泡和液体充分混合而产生湍流可以减少这方面的阻力&细胞内反应阻力20EM 可随下列因素中任一种而产生(!一些生理条件如温度’GP值等不适于酶的反应/"培养基成分与其相应的酶的作用失活/#一些代谢物的积累或其不能及时从反应处移去&

图9I3是氧从气泡到细胞的传递过程示意图&

2*4%供氧方面的氧传递阻力/5*9%好氧方面的阻力

图*"$!氧从气泡到细菌的传递过程示意图

这些阻力的相对大小取决于流体力学特性’温度’细胞的活性和浓度’液体的组成’界面特性以及其他因素&由图可以看出这些阻力中2*4项是供氧方面的氧传递阻力%5*9项是耗氧方面的阻力&而氧从空气泡到细胞的总传递阻力是以上各项的总和(

!!2E&U2Eca

2E2a

2E@a

2EXJa

2EX+a

2EXZa

2E1a

2EQa

2EM

这9项阻力不是等量齐观的%而是有主次之分%当细胞以游离状态存在于液体中时%阻力消失%而当细胞吸附在气液界面上时%则阻力4’5’6’7消失&

!二"气体溶解过程的双膜理论氧首先由气相扩散到气液两相接触界面%再进入液相%界面的一侧是气膜%另

一侧是液膜%氧从气相扩散到液相必须穿过这两层膜&氧从空气主流扩散到气液界面的推动力是空气中氧的分压力与界面处氧分压

之差%即=[=(%氧穿过界面溶于液体%继续扩散到液体中的推动力是界面处氧的浓度与液体中氧浓度之差%即.([.@&

7:-第九章!发酵工艺的控制

与两个推动力相对应的阻力是气膜阻力20Ec 和液膜阻力20E@&单位接触界面氧的传递速率为(

!!’1U推动力阻力 U=[=(20Ec U

.@[.(20E@

!9I2"

式中(’1)位接触界面的氧传递速率%C$)K,-0!$3.>"/=%=()气相中与气液界面处氧分压% F’/.@%.()液相中与气液界面处氧的浓度%C$)K0$3/E@)液膜传质系数%C$)K0!$-.>.C$)K0$3"或$0>&

双膜理论的气液接触界面附近氧分压与浓度的变化见图9I4&

图*"%!双膜的理论气液接触

通常情况下%不可能测定界面处的氧分压和氧浓度&为了计算方便%并不单独使用Ec 或E@%而改用总传质系数和总推动力%在稳定状态时(

!!’1U,c!=[=#"U,@!.#[.@" !9I-"

式中(,c)以氧分压差为总推动力的总传质系数%C$)K0!$-.>. F’"/,@)以氧浓度差为总推动力的总传质系数%$0>/=#)与液相中氧浓度.相平衡的氧的分压% F’/.#)与气相中氧分压=达平衡氧的溶解度%C$)K0$3&

根据 P"%#?!亨利"定律(与溶解浓度达到平衡的气体分压与该气体被溶解的分子分数成正比%即(

!!=U$.#

=#U$.@=(U$.

12

3(

!9I3"

8:- 发酵工程

式中($)亨利常数%它表示气体溶解于液体的难易程度&根据式!9I-"(

!!,cU ’1

=[=#

!!2,cU=[=

#

’1U=[=(’1

a=([=#

’1U=[=(’1

a$!.([.@"’1

又根据!9I2"(

!!2EcU=[=(’1

%!2E@U.([.@’1

所以%

!!2,cU2Eca

$E@

!9I4"

!!2,@U 2$Eca

2E@

!9I5"

对于易溶气体%如氨溶于水%$ 值甚小%式!9I4"右边第二项可略%则,cUEc%说明这一溶解过程的主要阻力是气膜阻力&对于难溶气体%如氧溶于水%$ 值甚大%式!9I5"右边第一项K0$Ec 可以略去%则,@UE@%说明这一过程液膜阻力是主要因素&

三!影响氧传递速率的主要因素

根据氧传递速率方程(

!!,SMU,@!!.#[.@" !9I6"

凡是影响氧传递推动力!.#[.@"’气液比表面积和氧传递常数的因素都会影响氧传递速率&

!一"溶液的性质对氧溶解度的影响氧是一种难溶气体%在-5‘和2<:2V2:5 F’时%纯水中氧的溶解度是

2<-6$)K0$3%由于空气中氧的体积分数是:<-2%因此与空气平衡的水相中氧浓度为:<-65$)K0$3&

氧在水中的溶解度随温度的升高而降低!表9I-"%在2<:2V2:5F’和温度在

4*33‘的范围内%与空气平衡的纯水中%氧的浓度也可由以下经验式来计算(

!!.#QU 24<63a32<6

!9I7"

9:-第九章!发酵工艺的控制

式中(.#Q)与空气平衡的水中氧浓度%$)K0$3/3)温度%‘&

表*"#!纯氧在不同温度水中的溶解度!!J+!K!+&D/"

温度0‘ 溶解度0!$)K0$3" 温度0‘ 溶解度0!$)K0$3"

: -<28 -5 2<-62: 2<7: 3: 2<2625 2<54 35 2<:9-: 2<38 4: 2<:3

氧在酸溶液中的溶解度与酸的种类及浓度有关%如表9I3所示&

表*"$!#&=和!J+!K!+&D/下纯氧在不同酸溶液中的溶解度

溶液浓度0!C$)K0$3"溶解度0!$)K0$3"

盐酸 硫酸

:<: 2<-6 2<-6:<5: 2<-2 2<-22<: 2<26 2<2-2<5 2<2- 2<:-

在电解质溶液中%由于发生盐析作用%使氧的溶解度降低&氧在电解质溶液中可由Z"B>"%)*公式计算(

!!K..#Q.#"U,@; !9I8"

图*"&!氧的溶解度与盐浓度的关系

式中(.#" )氧在电解质溶液中的溶解度%

$)K0$3/.;)电解质溶液的浓度%C$)K0$3/

,)Z"B>"%)*常数&该常数随气体种类’电解质种类和温度的变化而变化&

图9I5示出了氧在几种盐溶液中的溶解度与盐浓度的关系&

如果是几种电解质的混合溶液%此时氧的溶解度则可根据溶液的离子强度

计算(

!!K..#Q

.#"F/

/+/U/ !9I9"

式中(+/)第/种离子的常数%$30C$)K/

U/)第/种离子的常数%C$)K0$3&离子的

:2- 发酵工程

离子强度%C$)K0$3&在非电解质溶液中%氧的溶解度一般随溶质浓度的增加而下降%其规律和电解

质溶液相似(

!!K..#Q.#% U,.]

!9I2:"

式中(.#% )氧在非电解质溶液中的溶解度%$)K0$3/.0)非电解质或有机物浓度%

C.0$3&若培养基中同时含有电解质和非电解质%氧的溶解度则可用下式计算(

!!K..#Q

.#$ F//+/U/R/VK..#Q.#8V

!9I22"

式中(.#$)氧在混合溶液中的溶解度%$)K0$3&要提高氧在溶液中的溶解度的方法有多种%其中最简单的方法是增加罐压&

但是要注意的是增加罐压虽然提高了氧的分压%从而增加了氧的溶解度%但其他气体成分!如+,-"的分压也相应增加%且由于+,- 的溶解度比氧大得多%因此不利于液相中+,- 的排出%而影响了细胞的生长和产物的代谢%所以增加罐压是有一定限度的&

另一种方法是增加空气中氧的含量%进行富氧通气操作&即通过深冷分离法’吸附分离法及膜分离法制得富氧空气%然后通入发酵液&目前由于这三种分离方法的成本都较高%富氧通气还处于研究阶段&

!二"气I液比表面积对氧溶解度的影响根据氧传递速率方程式!9I6"%氧的传递速率与气I液比表面积成正比&因此

凡是能影响气I液比表面积的因素均能影响氧在溶液中的溶解度&气I液比表面积的大小取决于截留在发酵液中的气体体积及气泡的大小&截

留在发酵液中的气体越多%气泡的直径越小%那么气泡的比表面积就越大%即气I液比表面积与气体的截留率成正比%而与气泡平均直径成反比&对于带有机械搅拌的发酵罐%气泡的平均直径与单位体积液体消耗的通气搅拌功率’液体的物理性质有关&

搅拌对比表面积的影响较大%因为搅拌一方面可使气泡在液体中产生复杂的运动%延长停留时间%增大气体的截留率/另一方面搅拌的剪切作用又使气泡粉碎%减少气泡的直径&而表面张力的作用则阻止气泡的变化和粉碎%具有使比表面积下降的作用&增大通气量可增加空气的截留率%使比表面积增大&但通气量增大

22-第九章!发酵工艺的控制

到一定程度%如不改变搅拌速度%则会降低搅拌功率%甚至发生空气#过载$现象%导致气泡的凝聚形成大气泡&

!三"影响氧传递系数的因素

2<搅拌搅拌转速对,@!值具有很大的影响%对于带有机械搅拌的通风发酵罐%搅拌

是以下述方式促进氧的传递(!搅拌能把大的空气泡分散成细小的气泡%防止小气泡的凝聚%增加了氧与液体的接触面积/"搅拌使发酵液作涡流运动%延长了气泡在发酵液中的停留时间/#搅拌使菌体分散%避免结团%有利于固液传递中的接触面积的增加%使推动力均一%同时也减少了菌体表面液膜的厚度%有利于氧的传递/

$搅拌使发酵液产生湍流而降低气0液接触界面的液膜厚度%减小氧传递过程的阻力%因而增大了,@!值&

带有机械搅拌的通风发酵罐其搅拌器与氧传递速率常数,@!的关系可用式

9I2-来表示(

!!,@!UE ).! "L:<95

L:<65Z !9I2-"

式中().)通气时搅拌器的轴功率%Q/L)发酵罐中发酵液的体积%$3/LE)空气的线速度%$0E/E)常数&

从式!9I2-"可知,@!几乎与单位体积中的搅拌轴功率成正比&但这种关系取决于发酵罐的大小%).0L 的指数随发酵设备大小而变化!表9I4"&

表*"%!(7))指数发酵设备规模的关系

规模 ).0L 的指数

实验室规模 :<95中试规模 :<67生产规模 :<5:

-<空气线速度空气线速度较小时%氧传递系数,@!是随通风量的增加而增大的%当增加通

风量时%空气的线速度也就相应地增大%从而增加了溶氧%氧传递系数,@!相应地也增大&空气线速度增大到一定程度%如不改变搅拌速度%则会降低搅拌功率%甚至发生#过载$现象%会使搅拌桨叶不能打散空气%气流形成大气泡在轴的周围逸出%使搅拌效率和溶氧速率都大大降低%使,@!降低&图9I6是表观空气速度与氧传递系数,@!的关系&

-2- 发酵工程

图*"’!表观空气速度与氧传递系数$L!的关系

3<空气分布管在通风发酵中%除了用搅拌将空气分散成小气

泡外还可用空气分布管来分散空气&空气分布管的型式’喷口直径及管口与罐底距离的相对位置对氧溶解速率有较大的影响&当通风量较小时%喷口的直径越小%气泡的直径也就越小%相应地溶氧系数也就越大&而当通风量超过一定值后%气泡的直径与通风量有关%与喷口的直径无关&

4<发酵液性质在发酵过程中%由于微生物的生命活动%分解并

利用培养液中的基质%大量繁殖菌体%积累代谢产物等都引起培养液的性质的改变%特别是黏度’表面张力’离子浓度’密度’扩散系数等%从而影响到气泡的大小’气泡的稳定性%进而对传氧系数,@!带来很大的影响&此外%发酵液黏度的改变还会影响到液体的湍流性以及界面或液膜阻力%从而影响到传氧系数,@!&当发酵液浓度增大时%黏度也增大%传氧系数,@!就降低&发酵液中泡沫的大量形成会使菌体与泡沫形成稳定的乳浊液%影响到传氧系数&

5<表面活性剂培养液中消泡用的油脂等具有亲水端和疏水端的表面活性物质分布在气液界

面%增大了传递的阻力%使传氧系数,@!等发生变化%图9I7为表面活性剂月桂基磺酸钠浓度对传氧系数,@!’,@ 和"J的影响&

图*"(!表面活性剂浓度对传氧系数$L!#$L 和*M 的影响

32-第九章!发酵工艺的控制

图*")!溶液中电解质浓度对$L!的影响

6<离子强度发酵液中含有多种盐类%离子强

度为:<-*:<5$)K0@&,@!随着离子强度的增大而增大&搅拌和通气消耗的功率越大%则,@!随离子强度增大的幅度越大%有时,@!可高达纯水中的5*6倍&在盐溶液中%气泡细小且难以聚合成大气泡&而且气体滞留量有增大的趋势&图9I8表示电解质溶液的浓度对,@,的影响&

7<菌体浓度许多研究表明%菌体的存在对氧

传递是不利的&研究表明%发酵液中菌体浓度的增加%会使,@!变小&

四!溶解氧的控制

溶氧是需氧发酵控制最重要的参数之一&由于氧在水’发酵液中的溶解度都很小%因此%需要不断通风和搅拌%才能满足不同发酵过程对氧的需求&

2<发酵过程中溶氧的规律正常条件下%每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律&在谷氨酸和红

霉素发酵前期%产生菌大量繁殖%需氧量不断增大%此时的需氧量超过供氧量%使溶氧浓度明显下降%出现一个低峰%同时产生菌的摄氧率出现一个高峰%发酵液的菌浓度也不断上升%开始出现一个高峰&黏度一般在这个时期也会出现一个高峰阶段&这都说明产生菌正处于对数生长期&过了生长阶段需氧量有所减少%溶氧经过一段时间的平稳阶段!如谷氨酸发酵"或随之上升!如抗生素发酵"后%就开始形成产物%溶氧也不断上升&谷氨酸发酵的溶氧低峰在6*-:>%而抗生素的溶氧低峰在2:*7:>%低峰出现的时间和低峰溶氧随菌种’工艺条件和设备供氧能力的不同而异&发酵中后期%对于分批发酵来说%溶氧变化比较小&因为菌体已繁殖到一定浓度%进入静止期%呼吸强度变化也不大%如不补加基质%发酵液的摄氧率变化也不大%供氧能力仍保持不变%溶氧变化也不大&当外界进行补料!包括碳源’前体’消沫剂"时%溶氧发生改变%其变化大小和持续时间的长短随补料时的菌龄’补入物质的种类和剂量不同而不同&如补加糖后%发酵液的摄氧率增加%引起溶氧下降%经过一段时间后又逐步回升/继续补糖%溶氧下降%甚至降至临界氧以下%成为生产

42- 发酵工程

上的限制因素&在生产后期%由于菌体衰老&呼吸强度减弱%溶氧也会逐渐上升%一旦菌体自溶%溶氧更会明显上升&

-<发酵过程中溶氧的异常在发酵过程中%有时会出现溶氧明显上升或下降的异常变化%常见的是溶氧下

降&造成异常变化的原因有两个方面(耗氧或供氧发生异常或发生障碍&据已有资料报道%引起溶氧异常下降可能有下列原因(!污染了好气性杂菌%大量的溶氧被耗掉%可能在短时间内!一般-*5>内"使溶氧接近到零%并长时间不回升/"菌体代谢发生异常现象%需氧量增加%使溶氧下降/#某些设备或工艺控制发生故障或变化%如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢%影响供氧能力%使溶氧降低%如消泡剂因自动加油器失灵或人为加入量过多%也会引起溶氧迅速下降&其他影响供氧的工艺操作%如停止搅拌’罐排气封闭等%都会使溶氧发生异常变化&引起溶氧异常升高的原因%在供氧条件没有发生变化的情况下%主要是耗氧出现改变%如菌体代谢出现异常%耗氧能力下降%使溶氧上升%直到菌体破裂后%完全失去呼吸能力%溶氧就直线上升&

因此%从发酵液中溶氧浓度的变化%就可以了解微生物生长代谢是否正常%工艺控制是否合理%设备供氧能力是否充足等问题%查出发酵不正常的原因%控制好发酵生产&

3<溶氧对菌体生长和产物影响溶氧的大小对菌体生长和产物合成以及产量都会产生不同的影响%如谷氨酸

发酵%供氧不足时%谷氨酸积累就会明显降低%产生大量乳酸和琥珀酸&又如薛氏丙酸菌发酵生产维生素J2-中%维生素J2-的组成部分咕啉醇酰胺!J因子"的生物合成前期的两种主要酶会受到氧的阻遏%限制氧的供给才能积累大量的J因子%J因子又在供氧的条件下才能转变成维生素J2-%因而采用厌氧和供氧相结合的方法有利于维生素J2-的合成&据实验研究%当溶氧下降到45R时%就从好气培养转为厌气培养%酶的活力可提高6倍%这说明控制溶氧的重要性&对抗生素发酵来说%氧的供给更为重要%如金霉素发酵%在生长期中短时间停止通风%就可能影响菌体在生产期的糖代谢途径%由P F途径转向 ; F途径%使金霉素合成的产量减少&金霉素+6 上的氧还直接来源于溶解氧%所以%溶氧对菌体代谢和产物合成都有影响&

不同种类的微生物需氧量不同%一般为-5*2::$$)K0!@.>"&同一种微生物的需氧量%随菌龄和培养条件的不同而异&菌体生长和产物合成时的耗氧量也往往不同%一般幼龄菌生长旺盛%其呼吸强度大%但是种子培养阶段由于菌体浓度低%总的耗氧量也比较低/但在发酵阶段%由于菌体浓度高%耗氧量大&晚龄菌的呼

52-第九章!发酵工艺的控制

吸强度则较弱&据报道%黑曲霉生长的最大耗氧速率为5:*55$$)K0!@.>"%而在后期产!I淀粉酶时的最大耗氧速率为-:$$)K0!@.>"/谷氨酸生产菌在种子培养7>的耗氧速率为23$$)K0!@.>"%发酵23>的耗氧速率为5:$$)K0!@.>"%发酵28>的耗氧速率为52$$)K0!@.>"&为避免发酵过程供氧不足%需要考查每一种发酵产物的临界氧浓度和最适氧浓度%并使发酵过程保持在最适浓度&最适溶氧浓度的大小与菌体和产物合成代谢的特性有关&

属于初级代谢产物的氨基酸发酵%其需氧量的大小与氨基酸的合成途径密切相关!图9I9"&根据发酵需氧要求不同可分为三类(

图*"*!氨基酸的相对产量与氧满足度程度之间的相关性

第一类包括谷氨酸’谷氨酰胺’精氨酸和脯氨酸等谷氨酸系氨基酸发酵%它们在菌体呼吸充足的条件下%产量最大&如果供氧不足%氨基酸合成就会受到强烈抑制%大量积累乳酸和琥珀酸/第二类包括异亮氨酸’赖氨酸’苏氨酸和天冬氨酸%即天冬氨酸系氨基酸发酵%供氧充足可达到最高产量%但供氧受限%产量受到的影响并不明显/第三类包括亮氨酸’缬氨酸和苯丙氨酸发酵%仅在供氧受限’细胞呼吸受到抑制时%才能获得最大的氨基酸产量%如果供氧充足%产物形成反而受到抑制&氨基酸生物合成途径的不同引起需氧不同%因为不同代谢途径产生不同数量的 01/!F"P%则进行氧化所需溶氧量也就不同&第一类氨基酸是经过乙醛酸循环和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统两个途径形成

的%产生的 01/P量最多%因 01/P 氧化反应的需氧量也最多%因此供氧越多%合成氨基酸越顺利/第二类氨基酸的合成途径是产生 01/P 的乙醛酸循环或消耗 01/P的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系统%产生的 01/P量不多%因而

62- 发酵工程

与供氧量关系不明显/第三类氨基酸的合成%并不经 S+1循环%01/P 产量很少%过量供氧反而起抑制作用&由此可知%供氧大小与产物的合成途径密切相关&

五!提高溶解氧的措施

提高溶解氧的措施需要从影响氧溶解和传递的因素来考虑&由上述内容可知%工业发酵中通常采用搅拌’控制培养基浓度’控制空气流速’改善发酵罐的结构等方面提高溶氧&

2<搅拌是提高溶氧的重要措施在赤霉素发酵中溶氧水平对产物合成有很大的影响&通常在发酵25*5:>

之间溶氧下降到2:R空气饱和度以下&此后如补料不匹配%使溶氧长期处于较低水平%导致赤霉素的发酵单位停滞不前&为此%将搅拌转速从255#0$(%提高到

28:#0$(%%结果使氧的传质提高%有利于产物合成&值得注意的是%溶氧开始回升的时间因搅拌加快而提前-4>%赤霉素生物合成的启动也提前2L%到258>发酵单位已超过对照放罐的水平&搅拌加快后很少遇到因溶氧不足而#发酸$和发酵单位不升的现象&

-<改善发酵液的黏度能有效地提高传质据报道泰乐菌素的发酵生产%在气升式生物反应器中%通过改变培养基成分%

降低黏度%提高了溶氧%从而使泰乐菌素的发酵单位增加-<5倍&

3<在培养基方面限制养分的供给以降低菌的生长速率%也可限制菌对氧的大量消耗%从而提高

溶氧水平&这看来有些#消极$%但从总的经济效益来看%在设备供氧不理想的情况下%控制菌量使发酵液的溶氧值不低于临界溶氧值%从而提高菌的生产能力%也能达到高产目标&

此外%还可从控制空气流速’改善发酵罐的结构等方面提高溶氧&

第三节!温度对发酵的影响及控制

在影响微生物生长繁殖的各种物理因素中%温度的作用最重要&由于微生物的生长繁殖和产物的合成都是在各种酶的催化下进行的%而温度却是保证酶活性的重要条件%因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境&温度对发酵的影响是多方面的%对微生物细胞的生长和代谢’产物生成的影响是各种因素综合表现的结果&

72-第九章!发酵工艺的控制

一!温度对微生物细胞生长的影响

大多数微生物适宜在-:*4:‘的温度范围内生长&嗜冷菌在温度低于-:‘下生长速率最大%嗜中温菌在3:*35‘生长%嗜热菌在5:‘以上生长&在最适宜的温度范围内%微生物的生长速率可以达到最大%当温度超过最适生长温度%生长速率随温度增加而迅速下降&

温度对细胞生长的影响下仅表现为对表面的作用%而且因热平衡的关系%热可以传递到细胞内%对微生物细胞内部的所有结构物质都有作用&微生物的生命活动可以看作是相互连续进行酶反应的过程%任何反应又都与温度有关&

高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或凝固%同时破坏微生物细胞内的酶活性%从而杀死微生物%温度越高%微生物的死亡就越快&

微生物对低温的抵抗力一般比对高温的强&原因是微生物体积小%在其细胞内不能形成冰结晶体%因此不能破坏细胞内的原生质%但低温能抑制微生物的生长&

各种微生物在一定条件下都有一个最适的生长温度范围%在此温度范围内%微生物生长繁殖最快&微生物的种类不同%所具有的酶系及其性质不同%生长所要求的温度也不同&即使同一种微生物%由于培养条件不同%其最适的温度也有所不同&

温度和微生物生长的关系%一方面%在细胞最适生长温度范围内%微生物的生长速度随温度的升高而增加%通常在生物学范围内温度每升高2:‘%微生物的生长速度就加快2倍%因此发酵温度越高%培养的周期就越短/另一方面%处于不同生长阶段的微生物对温度的反应不同%处于4个不同生长时期的微生物对环境的敏感程度不同&处于停滞期的微生物对环境十分敏感%将其置于最适温度范围内%可以缩短该时期%并促使孢子萌发&在最适温度范围内提高对数生长期的培养温度%既有利于菌体的生长%又避免热作用的破坏&处于生长后期的菌体%其生长速度一般来说主要取决于氧%而不是温度&

二!温度对发酵代谢产物的影响

温度对发酵的影响体现在影响发酵动力学特性’改变菌体代谢产物的合成方向’影响微生物的代谢调节机制’影响发酵液的理化性质和产物的生物合成&

在一定的温度范围内%随着温度的升高酶反应速率增加%温度越高酶反应的速度就越大%微生物细胞的生长代谢加快%产物生成提前&但酶本身很容易因热的作用而失去活性%温度升高酶的失活也越快%表现出微生物细胞容易衰老%使发酵周

82- 发酵工程

期缩短%从而影响发酵过程的最终产物产量&温度能够改变菌体代谢产物的合成方向&例如%在四环素的发酵过程中%生产

菌株金色链霉菌同时也能产生金霉素%当温度低于3:‘时%生产菌株金色链霉菌合成金霉素的能力较强%随着温度的升高%合成四环素的能力也逐渐增强%当温度提高到35‘时则只合成四环素%而金霉素的合成几乎处于停止状态&

温度对多组分次级代谢产物的组分比例产生影响&如黄曲霉产生的多组分黄曲霉毒素%在-:‘’-5‘和3:‘%发酵所产生的黄曲霉毒素!’!K’&)e(%"c2 与J2比例分别为3T2%2T-%2T2&

温度还能影响微生物的代谢机制&例如在氨基酸生物合成途径中的终产物对第一个合成酶的反馈抑制作用%在-:‘时比37‘时终产物对第二个合成酶的抑制作用更敏感&

温度可以通过改变培养液的物理性质而间接影响发酵的进程&如发酵液的黏度’基质和氧在发酵液中的溶解和传递速率’某些基质的分解和吸收速率等%都受到温度变化的影响%进而影响发酵动力学特性和产物合成&

有时%同一微生物细胞的细胞生长和代谢产物积累的最适温度不同&例如%青霉素产生菌的生长最适温度为3:‘%而产生青霉素的最适温度为-5‘/黑曲霉的最适生长温度为37‘%而产生糖化酶和柠檬酸的最适温度都是3-*34‘/谷氨酸产生菌的最适生长温度为3:*3-‘%而代谢产生谷氨酸的最适温度却为34*37‘&对于此种发酵类型%必须根据要求在发酵过程中适时调整培养温度&

三!发酵热及其计算和测定

!一"发酵热发酵过程中%随着微生物菌种对培养基的利用和机械搅拌作用将产生一定的

热量%同时%发酵罐的罐壁散热和部分蒸发也会带走一些热量%总之%发酵过程中产生的热量%叫做发酵热&发酵热包括生物热’搅拌热’蒸发热和辐射热等%是引起发酵过程中温度变化的原因&

2<生物热生物热!I生物"是微生物生长繁殖过程中产生的热量%是由培养基中的碳水化

合物’脂肪和蛋白质等被微生物分解成+,-’P-,和其他物质时释放出来的&释放出的能量一部分用来合成高能化合物%供微生物合成和代谢活动的需要%另一部分用来合成代谢产物%其余的以热的形式散发出来%导致发酵热温度的升高&

在发酵过程中%生物热的产生有很强的时间性%即在微生物生长的不同时期菌体的呼吸作用和发酵作用强度不同所产生的热量也不同&在菌体处于对数生长期

92-第九章!发酵工艺的控制

时%繁殖旺盛%呼吸作用剧烈%细胞数量也多%产生的热量多&

-<搅拌热机械搅拌通气发酵罐%由于机械带动发酵液作机械运动%造成液体之间’液体

与搅拌器和液体与罐壁之间的摩擦而产生搅拌热!I搅拌"&

!!I搅拌U!)0L"36:2 !9I23"

式中()0L)通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率%CQ0$3/36:2)机械能转变为热能的热功当量%C=0!CQ.>"&

3<蒸发热空气进入发酵罐后与发酵液广泛接触%引起发酵液水分的蒸发%被空气和蒸发

水分带走的热量叫做蒸发热!I蒸发"或汽化热&

!!I蒸发UW!U出[U进" !9I24"

式中(W)空气的重量流量%C.干空气0>/U出’U进)发酵罐排气’进气的热焓%C=0C.干空气&

4<辐射热因发酵罐液体温度与罐外周围环境温度不同%发酵液中有一部分热通过罐体

向大气辐射称为辐射热!I辐射"&辐射热的大小决定于罐内温度与外界温度的差值大小&

发酵过程中的上述热量%产热的因素是生物热!I生物"和搅拌热!I搅拌"%散热因素有蒸发热!I蒸发"和辐射热!I辐射"&产生的热能减去散失的热能%所得的净热量就是发酵热!I发酵"%该发酵热是使得发酵温度变化的主要原因&

!!I发酵UI生物aI搅拌aI蒸发aI辐射 !9I25"

发酵热是随时间变化的%要维持一定的发酵温度%必须采取保温措施%在夹套内通冷却水控制温度&

!二"发酵热的测定和计算!2"通过测量一定时间内冷却水的流量和冷却水进’出口温度%用下式计算发

酵热&

!!I发酵UW.!3-[32"0L !9I26"

式中(W)冷却水流量%@0>/.)水的比热容%C=0!C..+"/32’3-)发酵罐进’出口的冷却水温度%L)发酵液体积%$3&

:-- 发酵工程

!-"通过发酵罐的温度自动控制装置%先使罐温达到恒定%再关闭自动装置%测量温度随时间上升的速率%按下式计算发酵热&

酵罐的罐壁散热和水分蒸发也会带走一些热量%总之%发酵过程中产生的热量%叫做发酵热&发酵热包括生物热’搅拌热’蒸发热和辐射热等%是引起发酵过程中温度变化的原因&

!!I发酵U!P2.2aP-.-"9 !9I27"

式中(P2)发酵液的质量%C./P-)发酵罐的质量%C./.2)发酵液的比热%C=0!C..+"/.-)发酵罐材料的比热%C=0!C..+"/9)温度上升速率%‘0>&

!3"根据化合物的燃烧热值计算发酵过程中生物热的近似值&根据 P"EE定律%热效应决定于系统的初态和终态%而与变化的途径无关%反

应的热效应等于产物的生成热总和减去作用物生成热总和&也可以用燃烧热来计算热效应%特别是对于有机化合物%燃烧热可直接测定%而采用燃烧热来计算更适合&反应的热效应等于作用物的燃烧热总和减去生成物的燃烧热总和&可用下式计算(

!!.$ F/!.$"作用物 G/!.$"产物 !9I28"

四!最适温度的控制

最适发酵温度是既适合菌体生长%又适合代谢产物合成的温度&但有时最适生长温度不同于最适生产温度&一般来说%接种后应适当提高培养温度%以利于孢子的萌发或加快微生物的生长’繁殖%而且此时发酵的温度大多数是下降的/待发酵液的温度表现为上升时%发酵液的温度应控制在微生物的最适生长温度/到主发酵旺盛阶段%温度的控制可比最适生长温度低些%即控制在微生物代谢产物合成的最适温度/到发酵后期%温度出现下降的趋势%直至发酵成熟即可放罐&

在发酵过程中%如果微生物能够承受高一些的温度进行生长繁殖%对生产非常有利%既可减少杂菌污染的机会又可减少夏季培养所需的降温辅助设备&因此培育耐高温的微生物很有意义&

最适发酵温度随着菌种’培养基成分’培养条件和菌体生长阶段不同而改变&因此它是一种相对的概念%是在一定的条件下测得的结果&不同的微生物和不同的培养条件以及不同的酶反应和不同的生长阶段%最适温度也应有所不同&生产上为了使发酵的温度控制在一定范围%常在发酵设备上装有热交换设备%如采用夹套’排管或蛇管等进行降温或加热&

2--第九章!发酵工艺的控制

在实际发酵过程中%往往不能在整个发酵周期内仅选择一个最适培养温度%因为最适于微生物细胞生长的温度不一定最适合于发酵产物的生成/反之%最合适于发酵产物生成的温度亦往往不是微生物细胞生长的最适温度&此时%究竟选择哪一个温度进行发酵为宜%则要看当时微生物生长和生物合成这一对矛盾中哪一个为主要方面&

发酵温度的选择还与培养基成分和浓度有关&当使用较稀或较容易利用的培养基时%提高温度往往会使营养物质过早耗尽%从而导致微生物细胞过早自溶%使生产的产量降低&

发酵温度的选择还要参考其他的发酵条件灵活掌握&如在通气条件较差的情况下%最合适的发酵温度也可能比正常良好通气条件下要低一些&这时由于在较低温度下%氧的溶解度相应要大些%同时微生物的生长速度也比较小%从而弥补了因通气不足而造成的代谢异常&

第四节!GP值对发酵的影响及控制

发酵过程中培养液的GP 值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标%是重要的发酵参数&因此%在发酵过程中必须及时检测并加以控制%使之处于对生产最有利的最佳状态&

一!9<值对发酵过程的影响

微生物发酵有各自的最适生长GP值和最适生产GP值&这两种GP值范围对发酵控制来说都是很重要的参数&GP值对发酵过程的菌体生长和产物形成的影响主要体现在以下几个方面(

!2"影响酶的活性%以致影响菌体的生长和产物的合成&菌体生长和产物合成都是酶反应的结果%在不适宜的GP值下%微生物的某些

酶的活性受到抑制%从而影响菌体的生长和产物的合成&有时GP值不同甚至菌体的代谢途径会随之发生改变%如酵母菌在GP4<5*5<:时发酵产物主要是酒精%但在GP8<:时产物不仅有酒精%还有醋酸和甘油&

!-"影响菌体细胞结构的变化和细胞形态的变化%因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成&

如GP值影响菌体细胞膜的电荷状况%引起膜透性发生改变&+)KK%(.等人发现产黄青霉的细胞壁的厚度就随GP值的增加而减小&其菌丝直径在GP6<:时为-*3+$%GPU4时为-*28+$%并呈膨胀酵母状%GP值下降后%菌丝形态又会

--- 发酵工程

恢复正常&!3"影响基质和中间代谢产物的解离%从而影响微生物对这些物质的利用&!4"还对发酵液或代谢产物产生物理化学的影响%其中要特别注意的是对产物

稳定性的影响&如在"I内酯胺抗生素沙纳霉素的发酵中%考察GP值对产物生物合成的影响

时%发现GP值在6<7*7<5之间%抗生素的产量相近%高于或低于这个范围%合成就受到抑制%在这个GP值范围内%沙纳霉素的稳定性未受到严重影响%半衰期也无大的变化%但GP(7<5时%稳定性下降%半衰期缩短%发酵单位也下降&这可能就是发酵单位下降与产物的稳定性有关&青霉素在碱性条件下发酵单位低%也与青霉素的稳定性有关&

控制一定的GP值%不仅是保证微生物生长的主要条件之一%而且是防止杂菌感染的一个措施&维持最适GP值已成为发酵生产成败的关键因素之一&

二!发酵过程中9<值的变化及影响因素

发酵过程中由于菌种在一定温度及通气条件下对培养基中碳源’氮源等的利用%随着有机酸或氨基酸的积累%会使GP值产生一定的变化&GP值变化的幅度取决于所用的菌种’培养基的成分和培养条件&在产生菌的代谢过程中%菌本身具有一定的调整周围GP值的能力%从而构建最适GP值的环境&如以生产利福霉素Z\的地中海诺卡菌进行发酵研究%采用GP值为6<:’6<8’7<5三个出发值%结果发现GP值在6<8’7<5时%最终发酵GP值都达到7<5左右%菌丝生长和发酵单位都达到正常水平/但GP值为6<:时%发酵中期GP 值仅达4<5%菌体浓度仅为

-:R%发酵单位为零&这说明菌体仅有一定的自调节能力&一般在正常情况下%菌体生长阶段GP值有上升或下降的趋势!相对于接种后

起始GP值而言"&如利福霉素J发酵起始GP值为中性%但生长初期由于菌体产生的蛋白酶水解培养基中蛋白胨而生成铵离子%使GP值上升为碱性&接着%随着菌体量的增多和铵离子的利用%以及葡萄糖利用过程中产生的有机酸的积累%使

GP值下降到酸性!GP6<5"%此时有利于菌的生长&在生长阶段%GP值趋于稳定%维持在最适产物合成的范围!GP7<:*7<5"&到菌体自溶阶段%随着基质的耗尽%菌体蛋白酶的活跃%培养基中氨基酸增加%使GP值又上升%此时菌丝趋于自溶而代谢活动停止&

外界环境发生较大变化时%GP 值将会不断波动&凡是导致酸性物质生成或释放%碱性物质的消耗都会引起发酵液的GP值下降/反之%凡是造成碱性物质的生成或释放%酸性物质的利用将使GP值上升&此外%引起发酵液中GP值下降的

3--第九章!发酵工艺的控制

因素还有(!2"培养基中碳’氮比例不当%碳源过多%特别是葡萄糖过量或者中间补糖过

多%加之溶解氧不足%致使有机酸大量积累而GP值下跌&!-"消泡剂!油"加量过多&!3"生理酸性物质的存在%氨被利用%GP值下降&引起发酵液GP值上升的因素有(!2"培养基中碳0氮比例不当%氮源过多%氨基氮释放%使GP值上升&!-"生理碱性物质存在&!3"中间补料中氨水或尿素等碱性物质的加量过多%使GP值上升&

GP值的变化会引起各种酶活力的改变%影响菌对基质的利用速度和细胞的结构%以致影响菌体的生长和产物的合成&GP值还会影响菌体细胞膜电荷状况%引起膜的渗透性改变%因而影响菌体对营养的吸收和代谢产物的形成等&

因此%确定发酵过程中的最佳GP值及采取有效控制措施是保证或提高产量的重要环节&

三!发酵过程中9<值的确定和控制

在产生菌的代谢过程中%菌本身具有一定的调节周围GP值的能力&曾以产生利福霉素Z\的地中海诺卡氏菌进行发酵研究%采用GP6<:’6<8’7<5三个出发值%结果发现GP值在6<8’7<5时%最终发酵GP值都达到7<5左右%菌丝生长和发酵单位都达到正常水平%但GP值为6<:时%发酵中期GP值只达4<5%菌浓仅为

-:R%发酵单位为零&这说明菌体仅有一定的自调能力&大多数微生物生长适应

GP值跨度为3*4个单位%其最佳生长GP值跨度在:<5*2个单位&发酵的GP值随菌种和产品不同而不同&由于发酵是多酶复合反应系统%各

酶的最适GP值也不相同%因此%同一菌种%生长最适GP值可能与产物合成的最适GP值是不一样的&如初级代谢产物丙酮I丁醇的梭状芽孢杆菌发酵%GP值在中性时%菌种生长良好%但产物产量很低%实际发酵的最适GP值为5*6&次级代谢产物抗生素的发酵更是如此%链霉素产生菌生长的最适GP值为6<-*7<:%而合成链霉素的最适GP值为6<8*7<3&因此%应该按发酵过程的不同阶段分别控制不同的GP值范围%使产物的产量达到最大&

最适GP值是根据实验结果来确定的&将发酵培养基调节成不同的出发GP值%进行发酵%在发酵过程中%定时测定和调节GP值%以分别维持出发GP值%或者利用缓冲液来配制培养基以维持之%定时观察菌体的生长情况%以菌体生长达到最高值的GP值为菌体生长的最适GP值&以同样的方法%可测得产物合成的最

4-- 发酵工程

适GP值&但同一产品的最适GP值还与所用的菌种’培养基组成和培养条件有关&如合成青霉素的最适GP值%先后报道有7<-*7<5’7<:左右和6<5*6<6等不同数值%产生这样的差异%可能是所用的菌株’培养基组成和发酵工艺不同引起的&

在确定最适发酵GP值时%还要考虑培养温度的影响%若温度提高或降低%最适GP值也可能发生变动&

在实际生产中%调节GP值的方法应根据具体情况加以选用&如调节培养基的原始GP值/加入缓冲剂/使盐类和碳源的配比平衡/在发酵过程中加入弱酸或弱碱/合理控制发酵条件%尤其是调节通气量/进行补料控制等&

发酵生产中调节GP值的主要方法有&

!一"添加碳酸钙法采用生理酸性铵盐作为氮源时%由于0Pa

4 被菌体利用后%剩下的酸根引起发酵液GP值下降%在培养基中加入碳酸钙%就能调节GP值&但碳酸钙用量过大%在操作上容易引起染菌&

!二"氨水流加法在发酵过程中根据GP 值的变化流加氨水调节GP 值%且作为氮源供给

0Pa4 &氨水价格便宜%来源容易&但氨水作用快%对发酵液的GP值波动影响大%

应采用少量多次流加%以避免造成GP值过高%抑制菌体生长%或GP值过低%0Pa4

不足等现象&具体流加方法应根据菌种特性’长菌情况’耗糖情况等决定%一般控制GP7<:*8<:%最好能够采用自动控制连续流加方法&

!三"尿素流加法以尿素作为氮源进行流加调节GP值%由于GP值变化有一定规律性%易于操

作控制&由于通风’搅拌和菌体尿酶作用使尿素分解放氨%使GP值上升/氨和培养基成分被菌体利用并形成有机酸等中间代谢产物%使GP值降低%这时就需要及时流加尿素%以调节GP值和补充氮源&

当流加尿素后%尿素被菌体脲酶分解放出氨使GP值上升%氨被菌体利用和形成代谢产物使GP值下降%再次进行流加%反复进行维持一定的GP值&

流加尿素时%除主要根据GP值的变化外%还应考虑菌体生长’耗糖’发酵的不同阶段来采取少量多次流加%维持GP值稍低些%以利长菌&当长菌快%耗糖快%流加量可适当多些%GP值可略高些%发酵后期有利于发酵产物的形成&

5--第九章!发酵工艺的控制

第五节!+,-浓度对发酵的影响及控制

+,- 是微生物的代谢产物%也是合成反应所需的基质&+,- 对微生物生长和发酵具有刺激作用%它是细胞代谢和微生物发酵的可用指标%有人把细胞量和尾气

+,- 的生成相关联%作为手段通过碳元素平衡来估算细胞的生长速率和细胞量&溶解在发酵液中的 +,- 对氨基酸’抗生素等产品的发酵具有抑制或刺激

作用&

一!5N#对菌体生长和产物形成的影响

+,- 对微生物生长有直接作用%微生物代谢产生的+,-浓度高于:<92$)K0@时%糖类的代谢和微生物的呼吸速率将下降&F#(&和 ’%B&’%&曾报道过%通过恒化器培养%并自动控制GP值和溶解氧浓度%检测到生产过程中+,- 的抑制作用&

+,- 的分压达到:<:8V2:5F’时%会降低4:R青霉素的合成&酒精发酵液中溶解的+,- 浓度为2<6V2:[-$)K0@时%会严重抑制酵母的生长&当微生物生长受到抑制时%也会阻碍基质的异化和1SF的生成量%并进一步影响产物的合成&

有研究表明%在充分供氧的条件下%细胞的呼吸速率和细胞的最大需氧量相等时%如果培养液中+,-的浓度达到:<:5V2:5F’以上时%组氨酸的产率将降低&而+,- 的浓度超过:<23V2:5F’时%发酵产生的精氨酸产率急剧下降&

+,-会影响菌体的形态&以产黄青霉菌为例%当+,- 分压为:<:2V2:5F’时%菌丝主要呈丝状/当+,- 分压为:<:-V2:5*:<:3V2:5F’%菌丝主要呈膨胀’粗短状/当+,- 分压为:<:8V2:5F’时%则出现球状或酵母状%致使青霉素合成受阻&

用3::@中试发酵罐进行氨基糖苷类抗生素紫苏霉素!E(E)$(B(%"发酵%在空气进口处通以2R+,-%发现微生物菌丝增长速率降低%对基质的代谢减慢%紫苏霉素的产量比对照样降低33R&当+,-的含量超过3R时%则不产生紫苏霉素&

+,- 和P+,[3 都会影响细胞膜的结构%它们分别作用于细胞膜的不同位点&溶解于培养液中的+,- 主要作用于细胞膜的脂肪酸核心部位%而 P+,[3 则影响磷脂’亲水头部带电荷表面及细胞膜表面上的蛋白质&当细胞膜的脂质相中+,-浓度达到临界值时%使细胞膜的流动性及表面电荷密度发生变化%这将导致许多基质的膜运输受阻%影响了细胞膜的运输效率%使细胞处于#麻醉$状态%细胞生长受到抑制%形态发生了改变&

在大规模发酵过程中+,-的作用是非常突出的问题%很难进行估算和优化&

6-- 发酵工程

发酵罐中+,- 的分压是液体深度的函数%2:$深的发酵罐在2<:2V2:5F’气压下进行操作%底部+,-分压是顶部的-倍&发酵过程中为了排除+,- 的影响%必须考虑+,- 在培养液中的溶解度’温度和通气状况&

二!5N#浓度的测定

分析排出气体!即尾气"中+,- 的含量%记录培养基体积及通气量的变化%用

计算机计算+,- 的积累量%与合成培养基菌体的干重比较%得出对数生长期菌体生长速率与+,- 释放率成正比!一般空气进口,- 占-:<85R’+,- 占:<:3R’惰性气体79<2-R"&

如果连续测得尾气中,-和+,-浓度%即可计算出整个发酵过程中+,- 的释放率!@?C"&

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L@惰进.@+,-出2[@,-出a@+,-出

[@+,-3 4进 X !9I29"

式中(I+,-)比+,- 释放率%$)K+,-0!.菌.>"/S)菌体干重%.0@/N进)进气流量%$)K0>/@惰进’@+,-进)分别为进气中惰性气体’+,- 的体积分数/@+,-出’@,-出)分别为尾气中+,-’,-的体积分数/L)发酵液的体积%@/A)系数%AU-730-73a3进V=进/3进)进气温度%‘/=进)进气绝对压强%F’&

测定排气+,- 的浓度变化%采用控制流加基质的方法来实现对菌体的生长速率和菌体量的控制&

三!5N#浓度的控制

+,- 在发酵液中的浓度变化受到许多因素的影响%如菌体的呼吸强度’发酵

液流变学特性’通气搅拌程度和外界压力大小等&在大发酵罐发酵中%设备规模大小也对+,- 浓度有很大影响%由于+,-的溶解度随压力增加而增大%大发酵罐中的发酵液的静压可达2<:2V2:5F’以上%又处在正压发酵%致使罐底部压强可达

2<5V2:5F’%因此+,-浓度增大%通气搅拌如不变%+,- 就不易排出%在罐底形成碳酸&进而影响菌体的呼吸和产物的合成&在发酵过程中%如遇到泡沫上升而引起#逃液$时%采用增加罐压的方法来消泡%会增加+,- 的溶解度%对菌体生长是不利的&

+,- 浓度的控制应根据它对发酵的影响而定&如果+,- 对产物合成有抑制作用%则应设法降低其浓度/若有促进作用%则应提高其浓度&通气和搅拌速率的大小%不但能调节发酵液中的溶解氧%还能调节+,- 的溶解度%在发酵罐中不断通

7--第九章!发酵工艺的控制

入空气%既可保持溶解氧在临界点以上%可随废气排出所产生的+,-%使之低于能产生抑制作用的浓度&通气搅拌也是控制+,-浓度的一种有效方法%降低通气量和搅拌速率%有利于增加+,- 在发酵液中的浓度%反之就会减小+,- 浓度&+,-形成的碳酸%还可用碱来中和%但不能用+’+,3&罐压的调节也影响+,-的浓度&对菌体代谢和其他参数也产生影响&

+,- 的产生与补料工艺控制密切相关%如在青霉素发酵中%补糖会增加排气中+,- 的浓度和降低培养液的GP值&因此排气中+,-%浓度变化速率常被用来控制发酵中补糖速率&

第六节!泡沫对发酵的影响及控制

发酵过程中因为通气搅拌’发酵液中产生的+,-%以及蛋白质和代谢物等稳定泡沫的表面活性剂的存在而导致发酵产生很多泡沫&泡沫往往会给发酵带来不利的影响&因此%发酵过程中必须了解泡沫的消长规律并加以控制&

一!发酵过程中泡沫的形成及变化

好氧性发酵过程中泡沫的形成是有一定规律的&泡沫的多少一方面与通风’搅拌的剧烈程度有关%搅拌所引起的泡沫比通风来得大/另一方面与培养基所用原材料的性质有关&蛋白质原料%如蛋白胨’玉米浆’黄豆粉’酵母粉等是主要的起泡因素&随原料品种’产地’加工条件而不同/还与配比及培养基浓度和黏度有关&糊精含量多也引起泡沫的形成&葡萄糖等糖类本身起泡能力很差%但在丰富培养基中浓度较高的糖类增加了培养基的黏度%从而有利于泡沫的稳定性&通常培养基的配方含蛋白质多’浓度高’黏度大%更容易起泡%泡沫多而持久稳定&而胶体物质多%黏度大的培养基更容易产生泡沫%如糖蜜原料发泡能力特别强%泡沫多而持久稳定&水解糖水解不完全时%糊精含量多%也容易引起泡沫产生&

发酵过程中%泡沫的形成有一定的规律性&发酵中起泡的方式被认为有5种(

!整个发酵过程中%泡沫保持恒定的水平/"发酵早期%起泡后稳定地下降%以后保持恒定/#发酵前期%泡沫稍微降低后又开始回升/$发酵开始起泡能力低%以后上升/%以上类型的综合方式&这些方式的出现与基质的种类’通气搅拌强度和灭菌条件等因素有关%其中基质中的有机氮源!如黄豆饼粉等"是起泡的主要因素&

培养基的灭菌方法和操作条件均会影响培养基成分的变化而影响发酵时泡沫

8-- 发酵工程

产生&由此可见%发酵过程中泡沫的形成和稳定性与培养基的性质有着密切的关系&

此外%发酵过程中污染杂菌而使发酵液黏度增加%也会产生大量泡沫&

二!泡沫对发酵的影响

在发酵过程中%因微生物的代谢活动处在运动变化中%因此培养基的性质也发生相应变化%也影响到泡沫的形成和消长&例如%霉菌在发酵过程中的代谢活动所引起培养液的液体表面性质变化也直接影响泡沫的消长&发酵初期%由于培养基浓度大’黏度高’养料丰富%因而泡沫的稳定性与高的表面黏度和低的表面张力有关&随着发酵进行%表面黏度下降和表面张力上升%泡沫寿命逐渐缩短%这说明霉菌在代谢过程中在各种细胞外酶%如蛋白酶’淀粉酶等作用下%把造成泡沫稳定的物质如蛋白质等逐步降解利用%结果发酵液黏度降低%泡沫减少&另外%由于菌的繁殖%尤其是细菌本身具有稳定泡沫的作用%在发酵最旺盛时泡沫形成比较多%在发酵后期菌体自溶导致发酵液中可溶性蛋白质增加%又有利于泡沫的产生&此外%当发酵过程感染杂菌或噬菌体时%泡沫也会异常增多&

泡沫的大量存在会给发酵带来许多负作用&主要表现在(!降低了发酵罐的装料系数%一般需氧发酵中%发酵罐装料系数为:<6*:<7%余下的空间用于容纳泡沫&"泡沫过多时%造成大量逃液%发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会和产物损失&#严重时通气搅拌也无法进行%菌体呼吸受到阻碍%导致代谢异常或菌体自溶&所以控制泡沫乃是保证正常发酵的基本条件&

三!泡沫的消除

发酵工业消除泡沫常用的方法有化学消泡法和机械消泡法%以下分别叙述&

!一"化学消泡法化学消泡法是一种使用化学消泡剂消除泡沫的方法%优点是化学消泡剂来源

广泛%消泡效果好%作用迅速可靠%尤其是合成消泡剂效率高’用量少’不需改造现有设备%不仅适用于大规模发酵生产%同时也适用于小规模发酵试验%添加某种测试装置后容易实现自动控制等&

2<化学消泡的机理当化学消泡剂加入起泡体系中%由于消泡剂本身的表面张力比较低!相对于发

泡体系而言"%当消泡剂接触到气泡膜表面时%使气泡膜局部的表面张力降低%力的平衡受到破坏%此外%被周围表面张力较大的膜所牵引%因而气泡破裂%产生气泡合

9--第九章!发酵工艺的控制

并%最后导致泡沫破裂&但是%当泡沫的表面层存在极性的表面活性物质而形成双电层时%可以加一种具有相反电荷的表面活性剂%降低液膜的弹性!机械强度"%或加入某些具有强极性的物质与起泡剂争夺液膜上的空间%并使液膜的机械强度降低%从而促使泡沫破裂&当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时%可加入某些分子内聚力较弱的物质%以降低液膜的表面黏度%从而促使液膜的液体流失而使泡沫破裂&通常一种好的化学消泡剂应同时具有降低液膜的机械强度和表面黏度的双重性能&

-<消泡剂的特点及发酵工业常用的消泡剂种类根据消泡原理和发酵液的性质和要求%消泡剂必须具有以下特点(!2"消泡剂必须是表面活性剂%且具有较低的表面张力%消泡作用迅速%效

率高&!-"消泡剂在气I液界面有足够大的散布系数%才能迅速发挥其消泡活性%这就

要求消泡剂有一定的亲水性&!3"消泡剂在水中的溶解度较小%以保持其持久的消泡或抑泡性能%并防止形

成新的泡沫&!4"对微生物和发酵过程无毒%对人’畜无害%不被微生物同化%对菌体的生长

和代谢无影响%对产物提取和产品质量无影响&!5"不干扰溶解氧’GP值等测定仪表使用%不影响氧的传递&!6"消泡剂来源方便%价格便宜%不会在使用和运输中引起任何危害&!7"能耐受高温灭菌&发酵工业常用的消泡剂主要有天然油脂类%高碳醇’脂肪酸和酯类%聚醚类%硅

酮类!聚硅油"等4类%以天然油脂类和聚醚类最为常用&天然油脂类中有豆油’玉米油’棉籽油’菜子油和猪油&油不仅用作消泡剂%还

可作为碳源和发酵控制的手段%它们的消泡能力和对产物合成影响也不相同&如对于土霉素发酵%用豆油和玉米油效果较好%而亚麻油则会产生不良作用&油脂的质量也会影响消泡效果%碘价或酸价高的油%消泡能力差并产生不良影响&油脂越新鲜%所含的抗氧化剂越多%形成过氧化物的机会少%酸也低%消泡能力越强%副作用也小&

聚醚类消泡剂是氧化丙烯或氧化丙烯和环氧乙烷与甘油聚合而成的聚合物&氧化丙烯与甘油聚合为聚氧丙烯甘油!cF"/氧化丙烯’环氧乙烷与甘油聚合为聚氧乙烯氧丙烯甘油!cF;"%又称泡敌%消泡能力相当于豆油的2:*8:倍&

3<消泡剂的应用和增效作用消泡剂加入发酵罐内能否及时起作用主要决定于该消泡剂的性能和扩散能

:3- 发酵工程

力&增加消泡剂散布可通过机械搅拌分散%也可借助某种载体或分散剂物质%使消泡剂更易于分布&

!2"消泡剂加载体增效&载体一般为惰性液体%消泡剂能溶于载体或分散于载体中%如聚氧烯甘油用豆油为载体!消泡剂T油U2T2<5"%增效作用非常明显&

!-"消泡剂并用增效&取各种消泡剂的优点进行互补%达到增效%如 cFTcF;UKTK混合用于青霉素发酵%结果比单独使用cF时效力增加-倍&

!3"消泡剂乳化增效&如cF用吐温I8:为乳化剂在庆大霉素和谷氨酸发酵中效力提高2*-倍&

生产中%消泡的效果与消泡剂种类’性质’分子质量大小’消泡剂的亲水性’亲油性等因素相关%还与其使用方法’使用浓度和温度有很大关系&

!二"机械消泡机械消泡是一种物理作用%靠机械强烈振动%压力的变化%促使气泡破裂%或借

机械力将排出气体中的液体加以分离回收&优点是不用在发酵液中加入其他物质%节省原料!消泡剂"%减少由于加入消泡剂所引起的污染机会&缺点在于它不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素&

理想的机械消泡装置必须满足的条件有(动力小’结构简单’坚固耐用’容易清扫和杀菌’维修和保养费用低等&

机械消泡的方法%一种是在发酵罐内将泡沫消除/另一种是将泡沫引出发酵罐外%泡沫消除后%液体再返回发酵罐内&

罐内消泡有耙式消泡桨’旋转圆板式’气流吸入式’流体吹入式’冲击反射板式’碟式及超声波的机械消泡等类型/罐外消泡有旋转叶片式’喷雾式’离心力式及转向板式的机械消泡等类型&

2<罐内消泡各种罐内消泡装置有如下几种&耙式消泡桨的机械消泡%见图9I2:%耙式消

泡桨装于发酵罐内搅拌轴上%齿面略高于液面%当产生少量泡沫时耙齿随时将泡沫

图*"!+!耙式消泡桨

打碎/旋转圆板式的机械消泡%见图9I22%圆板旋转同时将槽内发酵液注入圆板中央部分%通过离心力将破碎成微小泡沫的微粒散向槽壁%以达到消泡的目的/流体吹入式消泡%见图9I2-%把空气及空气与培养液吹入培养槽中形成泡沫层来进行

消泡的方法/气体吹入管内吸引消泡%见图9I23%将发酵罐形成的气泡群吸引到气体吹入管%利用

23-第九章!发酵工艺的控制

吹入气体流速/冲击反射板消泡%见图9I24%把气体吹入液面上部%然后通过在液面上部设置的冲击板冲击反射%吹回到液面%将液面上产生的泡沫击碎的方法/超声波消泡%即将空气在2<5*3<: F’下2*-@0E的速度由喷嘴喷入共振室而达到破泡的目的/碟片式消泡器的机械消泡是将消泡器装于发酵罐顶%碟片位于罐顶的空间内%当其高速旋转时%进入碟片间的空气中的气泡被打碎同时将液滴甩出%返回发酵液中%被分离后的气体由空心轴经排气口排出&

2<马达/-<旋转圆板/3<槽内液/4<发酵槽/5<供液泵

图*"!!!旋转圆板型消泡装置

2%8<供液管/-%9<供气管/3<排气管/4<泡沫/5<排液管/6%2:<培养槽/7<空气吹入管

图*"!#!液体吹入式消泡

-3- 发酵工程

2<培养槽/-<无菌空气/3<空气吹入管/4<增速喷头/5<吸入管

图*"!$!吸引消泡

K<喷嘴/-<气体/3<小孔/4<冲击板/5<气泡/6<培养槽/7<空气

图*"!%!冲击反射板式消泡

-<罐外消泡各种罐外消泡装置如下&旋转叶片罐外消泡%见图9I25%将泡沫引出罐外%利

用旋转叶片产生的冲击力和剪切力进行消泡%消泡后%液体再回流至发酵罐内/喷雾消泡%即将水及培养液等液体通过适当喷雾器喷出来达到消泡的目的%这是一种利用冲击力’压缩力及剪切力的消泡方法%这种消泡方法广泛应用于废水处理工程/离心力消泡%见图9I26和图9I27%将泡沫注入用网眼及筛目较大的筛子做成的筐中%通过旋转产生的离心力将泡沫分散%从而达到消泡的方法/旋风分离器消泡%见图9I28%利用带舌盘的旋风分离器的脱泡器进行消泡的方法/转向板消泡%见图

9I29%即在这种装置中泡沫以3:*9:$0E的速度由喷头喷向转向板使泡沫破碎%分离液用泵送回槽内%而气体则排出消泡器外&

2%3<马达/-<旋转叶/4<搅拌叶片

图*"!&!旋转叶片罐外消泡

33-第九章!发酵工艺的控制

2<马达/-<旋转器/3<泡沫

图*"!’!旋转筐消泡2<马达/-<旋转原板/3<泡沫

图*"!(!旋转圆板消泡

K<培养槽/-<培养液/3<泡沫/4%6%8<排气管/5<旋风分离器破泡液/7<旋风分离器/9<脱泡器/2:<舌盘/22%23<供气管/2-<环流液管

图*"!)!旋风分离器消泡

2<泵/-<缓冲液/3<排气/4<喷头

图*"!*!转向板式消泡装置

43- 发酵工程

第七节!补料对发酵的影响及控制

补料是指在发酵过程中一次或多次补充营养物质%以促进发酵微生物的生长’繁殖%提高发酵产量的工艺方法&采用补料发酵的生产工艺称为补料工艺&分批发酵常因配方中的糖量过多造成细胞生长过旺%而造成供氧不足&解决这个问题可在发酵过程中进行补料&补料的作用是及时供给产生菌合成产物的需要&

一!补料的内容

补料是指在发酵过程中补充某些营养物质以维持菌体的生理代谢活动和合成

的需要&因此%补料的内容大致可分为以下4个方面&!2"补充微生物所需要的能源和碳源%如在发酵液中添加葡萄糖’饴糖’液化淀

粉&作为消泡剂的天然油脂%同时也起了补充碳源的作用&!-"补充菌体所需要的氮源%如在发酵过程中添加蛋白胨’豆饼粉’花生饼’玉米

浆’酵母粉和尿素等有机氮源&有的发酵品种还采用通入氨气或添加氨水&以上这些氮源%由于它本身和代谢后的酸碱度也可用于控制发酵的合适的GP值范围&

!3"加入某些微生物生长或合成需要的微量元素或无机盐%如磷酸盐’硫酸盐’氯化钴等&

!4"对于产诱导酶的微生物%在补料中适当加入该酶的作用底物%是提高酶产量的重要措施&

二!补料的原则

菌体的生理调节活动和生物合成%除了决定于本身的遗传特性外%还决定于外界的环境条件%其中一个重要的条件就是培养基的组成和浓度&若在菌体的生长阶段%有过于丰富的碳源和氮源以及适合的生长条件%就会使菌体向着大量菌丝繁殖方向发展%使得养料主要消耗在菌丝生长上/而在生物合成阶段养料便不足以维持正常生理代谢和合成的需要%导致菌丝过早地自溶%使生物合成阶段缩短&

在现代化大规模发酵工业生产中%中间补料的数量为基础料量的2*3倍&如果将所补加的全部料量合并在基础培养基内%势必造成菌体代谢的紊乱而失去控制%或者因为培养基浓度过高%影响细胞膜内的渗透压而无法生长&

补料的原则在于根据发酵微生物的品种及特征%特别是根据生产菌种的生长规律’代谢规律’代谢产物的生物合成途径%结合生产上的实践经验%通过中间补料工艺%采用各种措施%对发酵进行调节’控制%使发酵在中后期有足够但不多的养

53-第九章!发酵工艺的控制

料%以维持发酵微生物代谢活动的正常进行%并大量持久地合成发酵产物%提高发酵生产的总产量&

三!补料的控制

补料的方式有连续流加’非连续流加和多周期流加&每次流加又可分为快速流加’恒速流加’指数速率流加和变速流加&从补料的培养基成分来区分%又可分为单一组分补料和多组分补料等&

工业生产中%主要对糖’氮源及无机盐进行中间补料工艺优化&

!一"补糖的控制在确定补料的内容后%选择适当的时机是相当重要的&补糖过早%有可能刺激

菌丝的生长%加速糖的利用%在相同耗糖情况下%发酵单位偏低&以四环素发酵中间补加葡萄糖为例%图9I-:表示在3个不同时间加糖的效果&

5<加糖时间适当/1<加糖时间过晚/6<加糖时间过早

图*"#+!加糖时间对四环素发酵单位的影响

第5种补料时机适当!在接种后45>后加"%发酵96>单位在2::::+.0$@以上/第1种加糖时间过晚!接种后6->开始加"/第6种加糖时间过早!接种后

-:>后加"%其发酵96>的单位与不加糖的对照组相近%为6:::+.0$@左右%并没有显示补糖的优越性&

补糖的时机不能单纯以培养时间作为依据%还要根据基础培养基中碳源种类’用量和消耗速度’前期发酵条件’菌种特性和种子质量等因素判断&因此%根据代谢变化%如残糖含量’GP值或菌丝形态来考虑%比较切合实际&

63- 发酵工程

补糖的方法一般都以间歇定时加入为主%但近年来也开始注意用定时连续滴加的方式补进所需要的养料&连续滴加比分批加入控制效果更好%这可以避免一次大量加入而引起菌体的代谢受到环境突然改变的影响&有时会出现一次补料过多%十几个小时不增加单位的现象%这可能是由于环境的突然变化%对菌体来说需要一个更新适应的过程&

在确定补糖开始时间后%补糖的方法和控制指标也有讲究&一般在加糖后开始的阶段%如能维持较高浓度的还原糖含量%对生物合成有利/但高浓度还原糖含量不宜维持过久%否则会导致菌丝大量繁殖%影响单位增加&还原糖维持的水平因具体情况而略有差别%似乎维持在:<8R*2<5R较为适合&如在最适的补加葡萄糖的条件下%能正确控制菌丝量的增加’糖的消耗与发酵单位增长三者之间的关系%就可比采用丰富培养基时获得更长的生物合成期&

!二"补充氮源及无机盐通氨是某些发酵生产外补料工艺的有效措施%它主要起着补充菌体的无机氮

源和调节GP值的作用&加入氨时应细流%注意泡沫的情况&避免一次加入量过多%造成局部过碱&也可以将氨水管道接到空气分管内%借气流带入%可迅速与培养液混合均匀&

有些工厂添加某些具有调节生长代谢作用的物料%如磷酸盐’尿素’硝酸盐’硫酸钠’酵母粉或玉米浆等&如果遇到生长迟缓’耗糖低时%可以补加适量的磷酸盐%以促进糖的作用&又如%土霉素发酵不正常时%菌丝展不开%呈葫芦状%糖不消耗%这时添加尿素水溶液有一定好处&

补料发酵工艺灵活多样%不同微生物或同种微生物不同培养条件时%控制方法也有差异&不能照搬套用%需要根据具体情况%并通过实验确定最适宜的中间补料控制方法&

补料中应该注意%补加的料液要配比合适%过浓会影响到消毒及料液的输送%而过稀则料液的体积增大%会导致发酵单位稀释’液面上升’加油量增加等&在补料过程中应注意无菌操作和控制&

第八节!染菌对发酵的影响及控制

工业发酵稳定生产的关键之一是在整个发酵过程中维持纯种培养%避免杂菌污染&发酵过程中污染杂菌的现象称为染菌&发酵工业自从采用纯种培养技术以后%产率有了很大的提高%然而发酵过程中染菌的问题至今仍是现代发酵工业的严

73-第九章!发酵工艺的控制

重威胁%染菌仍是发酵工业的致命伤&工业发酵过程中%杂菌的污染轻者影响产率’产物提取率和产品质量%重者导致#倒罐$%浪费大量的原材料%造成严重的经济损失&因此%必须采取有力措施%严格执行发酵操作程序和预防染菌措施%密切监测染菌情况%并随时控制&

一!染菌对发酵的影响

!一"染菌对不同发酵过程的影响由于各种发酵的菌种’培养基’发酵条件’发酵周期以及产物性质等不同%杂菌

污染对其造成的危害程度也不同&谷氨酸发酵的菌种为细菌%噬菌体污染对谷氨酸发酵的威胁最大%往往导致成批次连续污染%造成倒罐%使生产紊乱达数月之久&抗生素的发酵最怕污染杂菌%但对于不同的抗生素发酵%造成危害程度较大的微生物类型是不同的&如青霉素发酵污染细短产气杆菌后造成的危害较大%由于它们能产生青霉素酶%因此无论染菌是发生在发酵前’中’后期%都会使发酵液中的青霉素迅速被破坏&其他抗生素如链霉素发酵最怕污染细短杆菌’假单胞杆菌和产气杆菌%四环素最怕污染双球菌’芽孢杆菌’荚膜杆菌等&柠檬酸等有机酸的发酵主要是预防发酵前染菌%尤其是预防发生青霉菌污染%发酵进入中后期后%发酵液的

GP值比较低%杂菌生长困难%不太会发生染菌&肌苷’肌苷酸发酵的生产菌种是多种营养缺陷型微生物%生长能力差%所需的培养基营养丰富%因此容易受到杂菌的污染%特别是芽孢杆菌污染对其生产造成的危害较大&

虽然各种发酵发生染菌的特点不同%但不管是哪种发酵%染菌都会造成培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解%生成有毒的代谢产物抑制生产菌的代谢%严重影响产品得率%使发酵产品产量大大降低&

!二"不同时间发生染菌对发酵的影响因为发酵一般都有种子扩大培养期’发酵前期’发酵中期’发酵后期4个阶段%

在不同发酵阶段染菌对发酵产生的影响有很大区别&

2<种子培养期染菌种子制备是生产关键%同时种子是否带菌也是影响发酵无菌的重要环节&一

旦种子发生污染%往往会造成多个发酵罐染菌%给生产带来巨大损失&而种子培养基都具有营养丰富的特点%比较容易染菌%因此应当严格控制种子污染%发现种子受污染时%要采取灭菌措施后弃去&

-<发酵前期染菌微生物菌体在发酵前期主要是处于生长’繁殖阶段%此阶段代谢的产物很少%

83- 发酵工程

容易发生染菌&染菌后的杂菌将迅速繁殖%消耗掉大量营养物质%严重干扰生产菌的正常生长’繁殖%严重时导致生产菌长不起来%产物合成基本停滞&

3<发酵中期染菌发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗%严重干扰生产菌的代

谢%影响产物的生成&有的发酵过程%染菌后杂菌大量繁殖%产生酸性物质使GP值下降%产生有毒代谢产物%糖’氧等的消耗加速%生产菌大量死亡自溶%致使发酵液发黏%发臭%产生大量的泡沫%代谢产物的积累减少或停止/还有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏&就目前情况看%发酵中期染菌一般较难挽救%危害性较大&

4<发酵后期染菌在发酵后期%培养基中的营养物质已接近耗尽%发酵的产物也已积累较多%如

果染菌量不太多%对发酵影响相对来说就小一些%可继续进行发酵&但对于某些发酵过程来说%例如肌苷酸’谷氨酸’赖氨酸等发酵%后期染菌也会影响产物的产量’提取和产品的质量&

!三"染菌程度对发酵的影响染菌程度愈严重%进入发酵罐的杂菌数量越多%对发酵的危害当然就越大&当

生产菌在发酵过程已大量繁殖%在发酵液中已经占据优势地位%污染极少量的杂菌%对发酵不会带来太大的影响&这也是此种染菌常常被忽视的原因&由于没有采取有效措施%往往造成染菌数量在以后批次里越来越多%染菌发生时间越来越提前%最终导致大规模染菌&

二!发酵染菌后的异常现象

发酵染菌后的异常现象是指由于发酵染菌导致发酵过程中的某些物理参数’化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变&通过对这些参数变化的分析%我们可以及时发现染菌并查明原因%加以解决&

!一"种子培养染菌后的异常现象种子培养过程中发生染菌对发酵生产的危害尤其严重%它常常导致发酵成批

染菌和连续染菌%造成倒罐%致使生产紊乱%甚至短期停产&种子培养染菌的异常现象主要有以下几个方面&

2<菌体浓度异常菌体浓度异常的情况分为两种%一种是菌体浓度逐渐降低%另一种是菌体浓度

迅速增高&前者一般是由于感染烈性噬菌体导致培养液中可检测到菌体越来越

93-第九章!发酵工艺的控制

少%而后者大多是由于感染了杂菌%杂菌的大量生长造成培养液中菌体浓度迅速增加&

-<理化指标异常种子培养过程中发生染菌后%由于生产菌的生长繁殖受到抑制%而非生产菌的

微生物却大量繁殖生长%这必定会导致一些宏观的理化指标发生异常变化&例如在氨基酸发酵或某些抗生素发酵的种子培养过程中感染某些杂菌%杂菌大量繁殖产生酸性物质使培养液中的GP值下降很快%大量生物热的产生将使温度迅速上升&

3<代谢异常代谢异常表现在糖’氨基氮等变化不正常&例如感染噬菌体一般都会出现糖

耗’耗氨缓慢或不耗糖%不耗氨的情况&

!二"发酵染菌后的异常现象发酵染菌后的异常现象在不同种类的发酵过程所表现的形式虽然不尽相同%

但均表现出菌体浓度异常’代谢异常’GP值的异常变化’发酵过程中泡沫的异常增多’发酵液颜色的异常变化’代谢产物含量的异常下跌’发酵周期的异常延长’发酵液的甜度异常增加等现象&

2<菌体浓度异常发酵生产过程中菌体或菌丝浓度的变化是按其固有的规律进行的&但是如果

发酵染菌将会导致发酵液中菌体浓度偏离原有规律%出现异常现象&无论是在发酵的前期’中期’后期染菌均会导致菌体浓度的异常变化%但具体变化的形式和染菌的具体情况有关&一般感染烈性噬菌体会造成菌体大量裂解和自溶%出现菌体浓度异常下降的情况/而感染杂菌则会因为杂菌的大量繁殖导致菌体浓度会异常上升&如果感染温和性噬菌体则比较难以识别%此种噬菌体常隐伏在生产菌体内%使之繁殖缓慢%并减少了菌体的裂解和自溶%发酵中常常表现为菌体繁殖速度和代谢速度缓慢&

-<GP值过高或过低

GP值变化是所有代谢反应的综合反映%在发酵的各个时期都有一定规律%

GP值的异常变化就意味着发酵的异常&发酵中如果感染烈性噬菌体%由于菌体的裂解自溶%释放大量氨’氮%GP值将会上升/如果感染杂菌%它产生的酸性物质使培养液中的GP值下降&

3<溶解氧及+,-水平异常任何发酵过程都要求一定的溶解氧水平%而且在不同的发酵阶段其溶解氧的

水平也是不同的&如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化%一般就是发酵染菌发生的表现&在正常的发酵过程中%发酵初期菌体处于适应期%耗氧量比较

:4- 发酵工程

少%溶解氧基本不变/菌体进入对数生长期后%耗氧量增加%溶解氧浓度下降很快%并且维持在一定的水平%虽然操作条件的变化会使溶解氧有所波动%但变化不大/到了发酵后期%菌体衰老%耗氧量减少%溶解氧又再度上升&而发生染菌后%由于生产菌的呼吸作用受抑制%或者由于杂菌的呼吸作用不断加强%溶解氧浓度很快上升或下降&

由于污染的微生物不同%产生溶解氧异常的现象是不同的&当发酵污染的是好氧性微生物时%溶解氧的变化是在较短时间内下降%甚至接近于零%且在长时间内不能回升/当发酵污染的是非好氧性微生物或噬菌体时%生产菌生长被抑制%使耗氧量减少%溶解氧升高&尤其是污染噬菌体后%溶解氧的变化往往比菌体浓度更灵敏%能更好地预见污染的发生&

发酵过程的工艺确定后%排出的气体中+,-含量应当呈现出规律性变化&但染菌后%培养基中糖的消耗发生变化%引起排气中+,- 含量的异常变化&如杂菌污染时%糖耗加快%+,- 含量增加/噬菌体污染时%糖耗减慢%+,- 含量减少&因此%可根据+,- 含量的异常变化来判断是否染菌&

4<泡沫过多在发酵过程中%尤其是耗氧发酵中产生泡沫是很正常的现象&但是如果泡沫

过多产生则是不正常的&导致泡沫过量产生的原因很多%其中染菌特别是污染噬菌体是原因之一%因为噬菌体暴发使菌体死亡’自溶%发酵液中的可溶性蛋白质等胶体物质迅速增加导致泡沫过多&

5<代谢异常在发酵过程中菌体对培养基中碳源’氮源的利用及产物的合成都呈现出一定

的规律&发酵染菌会破坏这种规律&发酵污染杂菌后碳源和氮源的消耗会异常加快%但产物合成速度却下降/而污染噬菌体后碳源’氮源消耗都会下降%甚至不消耗%产物合成速度大大下降&

三!杂菌污染的途径及控制

!一"种子带菌及防治由于种子染菌的危害非常大%因此对种子染菌的检查和染菌的防治是非常重

要的%关系到发酵生产的成败&种子染菌主要发生在以下几个环节中&

2<菌种在培养过程或保藏过程中受到污染虽然菌种保藏和种子扩大培养过程大部分是在无菌环境良好的菌种室内进

行%但仍然会有带有杂菌的空气进入而导致染菌&在种子罐种子培养过程中也会因为操作失误’设备渗漏等原因造成种子被污染&因此%为了防止污染%应做好菌种室和种子罐车间内外的环境消毒工作%降低周围环境中的杂菌浓度&应交替使

24-第九章!发酵工艺的控制

用各种灭菌手段进行处理%如对于菌种室可交替使用紫外线’甲醛’双氧水’石炭酸或高锰酸钾等灭菌&对于种子罐车间可采用甲醛’石炭酸’漂白粉等进行灭菌&种子保藏时%种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度%且有一定的长度%保存温度尽量保持相对稳定%不宜有太大变化&对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查%确保任何一级种子均未受杂菌感染后才能使用&对种子罐等种子培养设备应定期检查%防止设备渗漏引起染菌&

-<培养基和培养设备灭菌不彻底对各级种子培养基’器具’种子罐应进行严格的灭菌处理&在利用灭菌锅进行

灭菌和种子罐实罐灭菌时%要先完全排除内部的空气%以免造成假压%使灭菌的温度达不到要求%造成灭菌不彻底而使种子染菌&为此%在实罐灭菌升温时%应打开排气阀及有关连接管的边阀’压力表接管边阀等%使蒸汽通过%达到彻底灭菌&

3<种子转移和接种过程染菌在种子转移和接种过程中%种子培养物有可能直接暴露在空气中%所以在此过

程中发生染菌的几率是比较高的&为了防止在此环节中发生污染%对无菌间和种子车间的环境要进行严格消毒/接种操作时用的衣帽及用具也要彻底灭菌/接种操作应按操作规程严格执行%避免操作失误引起染菌/在制备种子时对砂土管’斜面’三角瓶及摇瓶均严格进行管理%防止杂菌的进入而受到污染&

!二"空气带菌及防治空气净化系统失效或减效%是引起大面积染菌的主要原因之一&要杜绝无菌

空气带菌%就必须从空气的净化工艺和设备的设计’过滤介质的选用和装填’过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统&如使用往复式空压机时%压缩空气中带有大量油滴%在气候潮湿的情况下过滤介质容易被油水沾湿而失效&要解决这个问题%要采用无油润滑措施%安装高效率的降温’除水装置%保持过滤介质的干燥状态%防止空气冷却器漏水%防止冷却水进入空气系统%并对空气在进入总过滤器之前升温%使相对湿度下降%然后进入总过滤器除菌&

要选用除菌效率高的过滤介质/过滤介质的装填不均会使空气走短路%所以要保证一定的介质充填密度/在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路/在使用膜过滤器时%要防止老化管道中掉下的铁屑击穿过滤器金属膜%造成空气短路引起染菌/避免过滤介质烤焦或着火/当突然停止进空气时%要防止发酵液倒流入空气过滤器%在操作过程中要防止空气压力的剧变和流速的急增&

要加强生产环境的卫生管理%减少生产环境中空气的含菌量%正确选择采气口%如提高采气口的位置或前置粗过滤器&加强空气压缩前的预处理%如提高空压

-4- 发酵工程

机进口空气的洁净度&空气净化系统要制定严格的管理制度%定期检查灭菌%定期更换介质%在使用

过程中要经常排放油水%在多雨或潮湿季节%更要加强管理&安装合理的空气过滤器%防止过滤器失效&

!三"培养基和设备灭菌不彻底导致的染菌及防治首先%培养基灭菌不彻底与原料本身的特性有关&一般来说%越稀薄的培养基

越容易灭菌彻底%而淀粉质原料在升温过快或混合不均匀时容易结块%使团块中心部位#夹生$%蒸汽不易进入将杂菌杀死%但在发酵过程中这些团块会散开%而造成染菌&因此%淀粉质培养基在升温前先要搅拌混合均匀%并加入一定量的淀粉酶进行液化&有大颗粒存在时应先过筛除去%再行灭菌&另外%培养基灭菌不彻底也与灭菌条件有关&例如培养基连续灭菌时%蒸汽压力不稳定%培养基未达到灭菌温度%导致灭菌不彻底而污染&

造成设备灭菌不彻底主要是与设备’管道存在#死角$有关&由于操作’设备结构’安装或人为造成的屏障等原因%引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位%从而不能达到彻底灭菌的要求&常见的设备’管道死角有以下几个方面&

!2"发酵罐内的部件及其支撑件%包括拉手扶梯’搅拌轴拉杆’联轴器’冷却盘管’挡板’空气分布管及其支撑件’温度计套焊接处等周围容易积集污垢%形成死角&例如机械搅拌发酵罐内的环形空气分布管%由于靠近空气进口处气流速度大而远离进口处气流速度小%空气过滤器中的活性炭或培养基中的某些物质常常堵塞远离进口处的气孔%易产生死角而染菌&加强清洗并定期铲除污垢%可以消除这些死角&

!-"发酵罐制作不当造成的死角&如不锈钢衬里焊接质量不好%导致不锈钢与碳钢之间有空气%在灭菌时%由于三者膨胀系数不同%使不锈钢鼓起或破裂%造成#死角$&采用全不锈钢或复合钢可有效解决此问题&

!3"罐底部堆积培养基中的固性物%形成硬块%包藏脏物%使灭菌不彻底&通过加强清洗消除积垢’适当降低搅拌桨位置减少罐底堆积物可有效解决&此外%发酵罐封头上的人孔’排风管接口’灯孔’视镜口’进料管口’压力表接口等是造成死角的潜在位置&

!4"管道安装不当也会形成死角&例如法兰与管子焊接不好’密封面不平会形成死角/某些须在发酵过程中或培养基灭菌后才进行灭菌的管道安装不当也会形成死角等等&因此%在进行法兰的加工’焊接和安装时%应做到使各衔接处管道畅通’光滑’密封好’垫片的内径与法兰内径匹配’安装时对准中心%甚至尽可能减少

34-第九章!发酵工艺的控制

或取消连接法兰等措施%以避免和减少管道出现#死角$&

!四"操作失误和设备渗漏导致的染菌及防治如前所述%在实罐灭菌时%由于操作不合理%未将罐内的空气完全排除%造成

#假压$%罐内温度达不到灭菌的要求%导致灭菌不彻底而染菌&所以%在灭菌升温时%要打开排气阀门使蒸汽驱除罐内冷空气&在培养基灭菌和设备实消过程中%灭菌温度及时间必须达到要求%如果操作时不能达到要求%就会造成培养基或设备灭菌不彻底&好氧发酵过程中很容易产生泡沫%泡沫严重时发生#逃液$%造成染菌&因此%要严防泡沫冒顶%控制装料系数%必要时添加消泡剂防止泡沫的大量产生&此外%发酵时要正压操作%避免罐内负压导致外界空气进入罐内引起染菌&

发酵罐及物料灭菌等附属设备%多数是铁制的%经常受到高温’高压和酸碱腐蚀的作用%极易出现穿孔’变形而造成渗漏&如铁制冷却加热盘管’空气分布管使用久了就容易穿孔&由于它们长期受到搅拌和通气作用的影响而磨损%受到低

GP值发酵液的腐蚀作用%其焊缝处还受到温度冷热变化的作用%所以盘管和空气分布管是非常容易发生渗漏的部件&为了避免这种情况发生%应采用优质的材料%并经常进行检查&冷却加热盘管的微小渗漏不易被发现%可以采用向管道内压入碱性水%并用浸湿酚酞指示剂的白布擦拭管道上可疑处的方法来检验%如有渗漏时白布会显红色&

设备的表面或焊缝处如有砂眼%由于腐蚀逐渐加深%最终导致穿孔/接种管道使用频繁%也容易腐蚀穿孔/生产上使用的阀门不能完全满足发酵工程的工艺要求%易造成渗漏%应采用加工精度高’材料好的阀门避免此类渗漏的发生&

!五"噬菌体的污染及防治噬菌体主要污染利用细菌或放线菌进行的发酵生产%如氨基酸’淀粉酶’抗生

素’丙酮’丁醇等生产都不同程度遭受噬菌体的损害&发酵一旦感染噬菌体%往往在几小时内菌体全部死亡%产物合成停止%并造成倒罐%甚至连续倒罐&这不但给生产造成巨大损失%而且使生产紊乱%甚至生产全部停顿&即使轻度的噬菌体污染%也使正常生产受到困扰%导致产率下降%成本提高%对企业效益影响很大&多年来%国内外都很重视对噬菌体的防治工作%并采取了一系列防治措施%使噬菌体污染得到基本控制%污染程度也逐步减轻%但是尚未达到#根治$&所以%对噬菌体的防治仍然是发酵工业普遍关注的问题&

噬菌体是一种病毒%直径:<2+$%具有非常专一的寄生性&它在自然界中分布很广%在土壤’污水’腐烂的有机物和大气中均有存在&凡是有寄主细胞的地方%

44- 发酵工程

一般都生存有它们的噬菌体%发酵车间’提取车间及其周围更有机会积累噬菌体&发酵生产所污染的噬菌体又可分为烈性噬菌体!*(#DK"%&G>’.""和温和噬菌体!&"$G"#’&"G>’.""&烈性噬菌体侵染细胞后%增殖很快%在较短时间内使细胞裂解&生产中遇到的多数为烈性噬菌体&温和噬菌体感染细胞后%可能增殖暴发%释放子代噬菌体/也可能把其/01和寄主的遗传物质紧密结合在一起%随细胞繁殖%在子代细胞中代代相传%不断延续&

2<噬菌体污染的条件和途径造成噬菌体污染必须具有三个条件(环境中有噬菌体存在’有活菌体存在’有

使噬菌体与活菌体接触的机会和适宜的条件&感染噬菌体的最初发源点就是在自然界中广泛存在的溶源性菌株!K?E)."%(B

E&#’(%"%由于部分溶源性细胞诱发成温和噬菌体%再经过变异就可能成为烈性噬菌体%导致生产菌株感染&

噬菌体也可脱离寄主在环境中长期存在%在非常干燥的状态下能存活5个月%并在适宜的条件下侵染生产菌&此外%一个更主要的原因是人们常常随意进行活菌体排放%使生产环境中存在的噬菌体有了寄主而不断增殖%结果环境中的噬菌体密度增高而形成污染源&虽然有时使用了抗性菌株%但还是会继续发生噬菌体的污染&这是因为噬菌体寄主范围发生了变异%变异后的噬菌体能侵入抗性菌株%这种情况在实际生产中常会遇到&可见%环境污染是发酵污染噬菌体的主要根源&

由于噬菌体体积小%可在空气中传播%几乎可以潜入发酵生产的各个环节&空气过滤系统侵入噬菌体%种子!包括一级种子’二级种子"带进噬菌体或种子本身是溶源性菌株%培养基灭菌不彻底%都会造成多罐连续污染%是造成噬菌体大规模污染的主要途径&发酵罐及其辅助管道有死角’穿孔’渗漏%接种操作失误等是造成单灌污染的主要途径&补料!氮源’碳源’前体’消泡剂等"过程侵入噬菌体%泡沫过多等是造成后期感染的主要途径&

-<发酵污染噬菌体后的症状发酵感染噬菌体后%一般会出现以下症状(短时间内大量菌体死亡自溶%只剩

下少量残留的菌体碎片%检测可发现菌体浓度很低/GP值逐渐上升%温度停止上升然后逐渐下降%排出+,-%量急剧下降/代谢异常%耗糖’耗氨缓慢或停止%产物合成停止/发酵液产生大量泡沫%颜色发红’发灰%有时发酵液呈现黏胶状%可拔丝/二级种子和发酵对营养要求增大%但培养时间仍然延长/镜检时可发现菌体数量显著减少%缺乏正常的排列%找不到完整菌体/用双层平板检测会出现噬菌斑&

上述情况主要是对一些烈性噬菌体而言%对于温和噬菌体则不适用&温和噬菌体感染的外观症状比较温和&在生产中只是表现为菌体代谢缓慢’糖耗氨耗缓

54-第九章!发酵工艺的控制

慢’产物合成量较少’发酵周期长%与其他原因造成的发酵异常难以区分&即便采用双层平板检验%也不会出现明显的噬菌斑&因此%它的存在不宜判断%但是为以后噬菌体的大规模暴发埋下了隐患&对温和噬菌体的防治%我们只能加强环境卫生的管理%以防为主&

3<噬菌体的防治措施至今为止%防治噬菌体的最有效方法是以净化环境为中心的综合防治法&这是

一项系统工程%涉及培养基灭菌’种子培养’空气净化系统’环境消毒’设备管道’车间布局及职工工作责任心等诸多方面%要分段严格检查把关%才能根治噬菌体的危害&

具体要求有以下几条(!2"净化生产环境%消灭污染源&噬菌体的增殖需要有大量活菌体存在%只要

控制环境中活菌体的数量%净化环境%消灭噬菌体增殖的基础就可有效降低噬菌体污染率&具体应做到(严格控制活菌体排放%包括取样液’发酵尾气’发酵废液都要经过灭菌处理后方能排放/彻底搞好全厂卫生%加强环境消毒和环境监测/车间应合理布局%种子室和发酵车间分开%最好设在与发酵罐完全隔离约有较长距离的地方/铺设水泥地面和道路并搞好厂区绿化%扩大绿化覆盖面积%防止尘土飞扬%减少噬菌体传播机会&

!-"改进提高对空气的净化能力&通过空气传播是噬菌体污染的重要途径%改进提高对空气的净化能力%消灭进入发酵罐’种子罐空气中的噬菌体是防止污染的有效方法&具体应做到(高空取氧%空压机吸风口应在3:$以上高处/采用空气加热净化工艺%空气加热到25:‘可完全杀死噬菌体/控制空气流速%避免因空气线速度过大’油水过多使空气过滤器失去净化效果/改进空气净化装置%采用高效的过滤介质%如玻璃纤维’聚乙烯醇!F\1"’硼硅酸纤维等&

!3"保证各级种子不带噬菌体&种子污染噬菌体往往造成发酵大规模污染噬菌体%因此防止种子污染是十分重要的&具体应做到(定期分纯菌种/分纯的优良菌种可用真空冷冻干燥法保存/对菌种定期进行诱发处理%及时发现溶源性菌株/严格种子室管理制度%减少种子室与外界的接触/加强对各级种子噬菌体的检测&

!4"改进设备装置%消灭死角&要全面消除由于设备管道设计或安装不合理%或者设备腐蚀渗漏所造成的死角&发酵工厂的管路配置的原则是使罐体和有关管路都可用蒸汽进行灭菌%即保证蒸汽能够达到所有需要灭菌的部位&尽量简化管道%不必要的管道坚决取消%但也要避免将一些管路汇集到一条总的管路上%造成使用中相互串通’相互干扰%一只罐染菌导致其他发酵罐的连锁染菌&采用单独的排气’排水和排污管可有效防止染菌的发生&

!5"防止操作失误&包括防止发酵负压操作’严格执行消毒制度等&

64- 发酵工程

!六"染菌的挽救与处理

2<杂菌污染后的挽救与处理!2"发酵前期染菌的处理&在发酵前期发现污染杂菌后%应终止发酵%将培养

基重新进行灭菌处理&若培养基中的碳’氮源等营养物质损失不多%灭菌后可直接入种子进行发酵/若染菌已造成较大危害%培养基中的碳’氮源等消耗较多%则应补充新鲜的培养基%重新进行灭菌处理%再接种进行发酵&

!-"发酵中后期染菌处理&发酵中后期染菌%可以加入适当的杀菌剂或抗生素或正常的发酵液%以抑制杂菌的生长&也可采取降低培养温度’降低通风量’停止搅拌’少量补糖等措施进行处理&对于发酵后期产物已积累到一定浓度%可提前放罐&

!3"染菌后对设备的处理&染菌后的发酵罐在重新使用前%必须在放罐后进行彻底清洗%并加热至2-:‘以上3:$(%后才能使用&也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡2->以上等方法进行处理&

-<噬菌体污染后的挽救和处理发酵污染噬菌体时间不同%采取的挽救方法也有所不同&一般说来%感染越

早%危害越大/挽救越早%效果越好&所以经检查判断确认是污染了噬菌体%应尽快采取措施&

!2"发酵前期污染噬菌体的挽救&可采用放罐重消法’轮换菌种法’低温重消重接种法’并罐法等&

!放罐重消法(适用于连消工艺&发现噬菌体后%立即放罐%调低GP值!可用盐酸%不能用磷酸"%补加20-正常量的玉米浆和203正常量的水解糖%不补加氮源%重新灭菌%接入-R的种子%继续发酵&凡感染噬菌体%物料经过的管道设备均应洗刷干净并消毒处理&

"轮换菌种法(立即停止搅拌%小通风%降低GP 值%然后接大不同类型的种子%补充203正常量生物素和磷盐’镁盐!灭菌后"&

#低温重消重接种法(升温到8:‘保温2:$(%灭菌&因噬菌体不耐热%加热可杀死发酵液内的噬菌体%通蒸汽杀死发酵罐空间部分及管道’阀门’仪表的噬菌体&冷却后%如GP值过高%停止搅拌%小通风%降低GP值%接入-倍的原菌种%至

GP值正常后开始搅拌&

$并罐法(利用噬菌体只能在处于生长繁殖的细胞中增殖的特点&当发现发酵初期染噬菌体时%可采用不消毒并罐法%即将正常发酵26*28>的发酵液%以等体积和染噬菌体的发酵液混合后分别发酵%利用其活力旺盛的菌体’不灭菌’不补种%便可发酵&但要肯定进入罐的发酵液没有染菌%否则两罐都付之东流%所以采用此法需要慎重&

74-第九章!发酵工艺的控制

!-"发酵后期感染噬菌体的处理&后期感染噬菌体一般对产酸影响不大%只要调节风量%控制尿素流加量和次数%或提早放罐!经灭菌"即可%不需要采取特殊措施%但放罐前须灭菌处理&

发酵感染噬菌体%不管采用哪种挽救方法%其结果多数是不理想的&有时尽管本罐次挽救了%但对以后的罐次却带来不利影响&因此%当发酵污染噬菌体后%应积极采取综合治理措施&通常的做法是(

!污染了噬菌体的发酵液%必须加热煮沸后才能放罐&

"除了对污染料液进行灭菌外%对各种检测样也要集中消毒&另外%对提炼放出的滤渣也要集中处理%进行消毒&

#更换生产菌种%因为噬菌体的专一寄生性强%换用抗噬菌体菌株或其他性状菌株后%原噬菌体即不起作用&

$生产设备要进行彻底清理检查和灭菌&

%全面普查和清理生产环境中的噬菌体%可采用漂白粉’新洁尔灭’甲醛等消毒剂喷洒四周环境&必要时要短期停产%以便全面断绝噬菌体繁殖基础%停产期间以生产环境不再发现噬菌体为准%时间2*4周不等&

第九节!计算机对发酵过程的控制及参数检测

一!计算机控制

!一"概述传统发酵工业的工艺管理和控制多数采用人工操作的方式%严重地影响和制

约了工艺水平和管理水平的提高&并导致生产不稳定’发酵转化率低’能耗大’高成本等问题的产生&-:世纪6:年代以来%计算机控制技术开始应用于发酵工业生产%不仅解决了上述存在的问题而且还能减轻工人的劳动强度%获得最大的经济效益%因此极大地推进了发酵工业的革新和发展&并且%随着大型计算机造价的降低和微型计算机使用的普及%生物传感器技术的发展%发酵动力学模型研究的完善%使得越来越多的发酵工业过程和产品采用计算机控制技术&目前已广泛应用于抗生素’啤酒’谷氨酸及酶制剂等众多与工农业’医药生产密切相关的产品的发酵生产&

计算机在发酵过程中主要有以下三个功能(

2<过程数据的存储此项任务由数据获得系统完成%即顺序地扫描传感器的信号%将其数据条件

化%过滤后以一种有序并易找到的方式存储&这也是计算机最简单的任务%只要在

84- 发酵工程

发酵罐上安装适当的仪表与计算机相连%即可连续记录发酵罐的多个参数&

-<过程数据的分析由数据分析系统完成%即从测得的数据采用规则系统提取所需信息%求得间接

!衍生"参数%可反映出发酵的状态和性质%分析好的信号可以通过过程管理控制器打印’输入数据库或显示&

3<过程控制由计算机程序来完成%即计算机的信号被送至泵’阀门或经由接口的开关等执

行元件%对发酵过程进行控制&通常控制器需完成按事态发展或超出控制回路设定点的控制’过程灭菌’投料’放罐阀门的有序控制和常规的反应器环境变量的闭环控制三项任务&

!二"计算机控制系统及其功能

2<计算机控制系统的组成计算机发酵过程控制系统是由计算机控制系统和被控对象组成&系统组成如

图9I-2所示&其中计算机控制系统由控制硬件和操作软件组成&控制硬件包括计算机主机’常规外部设备’过程输入输出通道’测量便送仪表’调节阀或执行机构及允许操作台等部分%这几个部分通过主机的系统总线和接口电路相互连接%主要完成数据的采集’输送及信号的输出%还可完成数据显示’电传打字或报警等功能/而计算机控制系统的操作软件部分则主要提供人和机器的职能交换及数据的处

理’传输工作&被控对象包括发酵罐’发酵液和发酵的菌种或细胞%由计算机控制系统进行控制%实现发酵过程的最优化控制%从而使得企业获得最大的经济效益&

计算机发酵过程控制系统

计算机控制系统控制硬件5操作软件

控制对象

发酵罐

发酵液45

6

4

5

6 菌种或细胞

图*"#!!计算机发酵过程控制系统的组成

-<计算机控制系统的功能计算机控制系统的功能主要包括数据信息的采集和处理%发酵过程的操作控

制&数据信息的采集和处理是发酵过程控制的前提%主要是利用计算机的传感器及各种仪表获得大量的数据%并对其进行存储和处理/发酵过程的操作控制是通过不同的控制系统参与发酵过程的控制%所采用的控制系统主要包括直接数字控制系统!L(#"B&L(.(&’KB)%&#)KE?E&"$%//+"’计算机设定值控制系统!E"&G)(%&B)$I

94-第九章!发酵工艺的控制

GD&"#B)%&#)KE?EK"$%ZF+"和集散控制系统!L(E#(ND&"LB)%&#)KE?E&"$%/+Z"&微生物发酵过程是一个非线性’多变量及随机性的动态过程%因而发酵体系是

一个较复杂的控制对象&一般将发酵过程控制分为三个不同层次的控制水平%且每一级水平的过程控制都要涉及复杂的程序&

第一级水平的控制包括阀’泵的开关’仪表的重新校对’在线维持及故障切断过程等顺序操作%发酵过程中的灭菌及培养基分批作业属于这一级水平的控制&此级控制通常较为简单%仅通过计算机传感器控制即可完成&

第二级水平控制包括将各种控制回路与控制系统相连%这些控制回路主要是温度’GP值’泡沫’溶解氧等简单的参数%它可使这些参数维持在某一特定值&实际生产中可采用//+系统’ZF+系统及/+Z系统来完成&

采用//+系统只需将传递器直接接入计算机%而不需要控制元件%将来自对象的检测值与给定值作比较%根据偏差值和一定数学模型进行计算%然后输出代表检测量的相应的数字信号或开关量%转化成控制信号后通过执行器对发酵进行控制&此控制系统具有较大的灵活性和精确性%可使系统的控制质量得到较大的提高&

而ZF+系统是计算机根据过程参数信息和其他数据%按照描述生产过程的数学模型进行计算%得到最佳的控制条件%从而使生产处于最佳工作状态&这就要求有一个可靠的能反映过程变化的数学模型%它可通过理论推导’经验归纳或计算机模拟获得&

对于较为复杂的控制系统通常采用/+Z系统来完成%它是在//+系统的基础上发展而来%而又不同于//+系统%它是集计算机技术’网络技术’自动控制技术等先进技术于一身的生产控制系统%其可靠性高’分散控制’集中监测’扩展灵活’组态方便等特点使/+Z得到了广泛应用%并逐渐成为工业控制系统的主要潮流&目前%国内大型的制药企业’啤酒发酵企业’味精生产企业等都采用/+Z系统来进行发酵控制&

最高级的控制即生产能力的提高和过程最优化的控制水平%此水平的控制目前仍处于初级发展阶段%原因是能长时间使用的在线传感器的数量有限%利用现有的传感器或电极在线直接测定生物物质和极少量的产物几乎不可能或很困难&但随着传感器生产技术的进步%计算机控制技术的发展%生化过程数据库的建立%并通过人机系统沟通使用者与知识库%最终实现生产过程的自动优化控制&

!三"计算机在最优化控制中的作用发酵过程的计算机优化控制%或者说采用知识工程’专家系统的发酵过程控制

系统将是今后发展的必然趋势&为实现发酵过程高级系统控制%尚需在现有计算机控制基础之上建立生化过程数据库%依靠专家指导’归纳和分析%并利用知识工

:5- 发酵工程

程的方法发挥和完善数据库的功能&通过人机系统沟通使用者与知识库%然后在生产过程中实现生产的优化控制&

华东理工大学张嗣良等运用细胞代谢流分析与控制为核心的生物反应工程学

观点%通过试验研究%提出立即与参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术与多参数调整的防盗技术%设计了一种新概念生物反应器%以物料流检测为手段%通过过程优化与放大%达到大幅度提高青霉素’红霉素’金霉素’肌苷’鸟苷’重组人血清白蛋白等发酵产品的发酵水平&

赵德等在植酸酶发酵过程中采用/+Z计算机控制系统优化发酵工艺%使植酸酶发酵转化率从76<4R提高到88<3R%为企业取得了显著的经济效益&徐玲等基于国产XF+和X0,模版设计了柠檬酸发酵过程计算机分布式控制系统%实现了对年产-万&柠檬酸发酵厂的全自动优化控制%运行实践证明%系统控制方法先进%可靠性强%提高了产品得率%节能降耗%取得了相当好的经济效益&戴雅丽等在啤酒发酵过程中%采用由分级分布式计算机组成的温度控制系统硬件’软件的组成及控制方法%温度控制精度高于人工控制%并完全满足工艺要求&肖应旺等针对补料分批发酵过程的特点%设计了一套适合于现场控制策略的计算机系统&其中现场控制部分采用,^M,0公司的+-::P;F@+进行数据的采集和常规控制任务/上位机采用国产组态王编程%考虑到组态王在编制复杂算法程序方面的局限性%故用

\J编制复杂控制算法程序%实现组态王的二次开发&实际应用表明%该系统可靠’稳定’控制精度较高&

二!发酵过程参数监测

工业发酵研究和开发的目标是利用微生物以较为经济的方式获得高附加值的

产品&过去人们通过优良菌种的选育和改良’培养基的优化和补料工艺的实现’生产条件的控制和优化等方法来实现此目标&而近几年来%随着在生物技术参数的检测’生物过程的仪器化’生物过程建模和自动化控制等方面取得了长足的发展%工业发酵研究和开发取得了巨大的进步和丰硕的成果&

!一"发酵过程的参数发酵过程的好坏完全取决于良好生产环境的创造和控制%通过对发酵过程的各

参数的测量和调节可直接有效地达到既定的目标&生物发酵控制系统主要检测和控制温度’GP值’搅拌速率’空气流量’罐压’液位’黏度’+,-’补料速度及补料量等参数&根据获得的途径不同%发酵过程的参数可分为状态参数和间接状态参数&

状态参数是指能直接反映发酵过程中微生物的生理代谢状况的参数%如GP

25-第九章!发酵工艺的控制

值’/,’溶解+,-’尾气,-’尾气+,-’黏度’菌体浓度等&在各种状态参数中GP值和溶解氧可能是最重要和广泛使用的&通过控制酸碱的流加或碳源的流加速度来调节GP值%而溶解氧的调节通常采用改变通气量’搅拌速度’罐压’通气成分!纯氧或富氧"和加糖’补料等方法&而尾气分析和空气流量的在线测定同样十分重要&采用红外和顺磁氧分析仪可分别测定尾气+,- 和,- 含量%另外也可以用一种快速’不连续的’能同时测多种组分的质谱仪测定&

间接状态参数是指那些采用直接状态参数计算求得的参数%如比生长速率!%"’摄氧率!YMC"’+,- 释放速度!@?C"’呼吸商!CI"’体积氧传质速率!,@!"’氧得率系数!Q]0,"等!表9I5"&

表*"&!通过基本参数求得的间接参数

检测对象 所需基本参数 换算公式

摄氧率

!YMC"!

空气流量L!$$)K0>"%发酵液体积% !@"%进气 和 尾 气 ,- 含 量

@,-%(%%@,-%)D&%

YMCUL!@,-%(%[@,-%)D&"

%

呼吸强度

!I,-"" YMC%菌体浓度S I,-U

YMCS

氧得率系数

!Q]0,"#I,-%%%基质得率系数

QZ&%基质分子量P2Q]0,U26

-@a$-[! "YQZP a Y

26::a@6::[

’933[

$3 4-::

+,- 释放率!@?C"

空气流量L!$$)K0>"%发酵液体积 % !@"%进气 和 尾 气 +,- 含 量@+,-%(%%@+,-%)D&

’

@?CUL!@,-%)D&[++,-%(%"

% UI,-S

比生长速率

!%"$I,-%Q]0,%I: ( %UIY-[I:Q]0,

菌体浓度!S&"

I,-%Q]0,%I: %I:& S&U3"Q!I,-[:: "34S

呼吸商!CI"进气和尾气 ,- 和+,-含量

CIU@?CYMC

体积氧传质系数!,@!"

YMC%@@%@# ) ,@!U YMC!@#[@@"

!!!YMC(单位体积发酵液%单位时间的耗氧量!又称摄氧量"%$$)K0>/"I)-(单位质量的干菌体%单位时间的耗氧量!S称呼吸强度"%$$)K0!..>"/#Q]0,(耗氧量所需菌体量%Q]0,U.S0.@/$%(单位体积的菌体%单位时间增长的菌体量%%ULK0KL3/%@,-%(%%@,-%)D&(分别为进’出口氧含量/&QZ(消耗的基质量所得的菌体量%QZU.S0.9/’@B)-%(%%@+,-%)D&(分别为进’出口+,-含量/(I: (%U:时的呼吸强度/)@@%@

#(分别为液体中的#Y浓度和在液体中的,-饱和浓度&

-5- 发酵工程

而这些参数的检测是发酵过程控制的重要依据%通常采用以下两种方式%一是在线仪器监测/二是发酵样品离线分析和数据整理&常用的工业发酵仪器见表

9I6&

表*"’!常用的工业发酵仪器

分类 测量对象 传感器 控制方式 评!!论

就地使用的探头

温度 F&热电隅 盘管内冷水打循环&注入蒸汽加热

也可用热敏电阻%采用小型的加热元件

GP值 玻璃与参比电极’凝胶复合电极

加酸’碱或糖’氨水 发酵罐内常用复合电极%需 耐 蒸 汽 灭菌%有一定寿命

溶氧!/," 极 谱 型 F& 与 1.01.+K或原电池型 1.与FN电极

对搅拌转速’空气流量’气体成分和罐压有反应

极谱型电极一般更贵和牢靠

泡沫电导探头0电容探头 开关式加入适量消

泡剂也采用消泡桨

搅拌 转速计’功率计 改变转速 小规模发酵罐不测量功率

其他在线仪器

空气流量 质量流量计’转子流速计

流量控制阀

液位 应变规’压电晶体’测压元件!差压变送器"

溢流或流入液体 用于小规模设备的测压元件

压力 弹簧隔膜 压力控制阀 小规模设备不常用

料液流量 磁流量计%工业控制计算机补料系统

流量控制阀%电子秤 用于监控补料和冷却水

气体分析,- 含量+,- 含量

顺磁分析仪0质谱仪红外分析仪0质谱仪

主要用于计算呼吸数据

!二"在线仪器监测最常用到的在线监测仪器包括有标准化检测装置’传感器’气体分析仪’高效

液相色谱等&标准化检测装置的大部分仪表用于温度’压力’搅拌转速’功率输入’

流加速率和质量等物理参数的检测&对发酵液中的GP值’溶解氧’尾气中,- 和

尾气+,- 等化学参数的检测可采用GP电极’溶氧电极’+,- 电极’膜管传感器等传感器和气体分析仪等来进行监测&

近年来%随着计算机技术和传感器技术的快速发展%一系列新型的仪器设备如

35-第九章!发酵工艺的控制

激光浊度计’流动注射式分析仪’生物传感器等对菌体量’基质浓度和产物浓度等参数可实现在线监测&这些装置多已实现了商品化生产%但还存在无法耐受高温高压灭菌’可靠性低’稳定性差等问题%因此现在仅在实验室和中试规模下使用&我们相信随着计算机技术和新型检测技术的突飞猛进%越来越多的在线监测仪器会应用于工业生产&

!三"离线发酵分析由于缺乏可靠的生物传感器或一种能够无菌取样系统%一直以来菌体量’发酵

液中的基质!糖’脂质’盐’氨基酸"浓度和代谢产物!抗生素’酶’有机酸和氨基酸"浓度等参数%较难采用在线仪器检测%而多是采用人工取样和离线分析%虽然结果具有明显的不连贯和滞后性%但对发酵工艺的控制和优化仍然十分重要&目前所使用的离线分析方法主要包括有湿化学法’分光光度分析’红外光谱分析’原子吸收’液相色谱!PF@+"’气相色谱!c+"’气相色谱I质谱联用!c+I Z"及核磁共振!0^M"等&离线测定生物量的方法见表9I7&

表*"(!离线测定生物!菌和细胞"量的方法

方!!法 原!!理 评!!价

压缩细胞体积 离心沉淀物的体积 粗糙和快速

干重 悬浮颗粒干后的重量 如培养基含固体%难以解释光密度 浊度 要保持线性需稀释%缺点同上显微观察 血球计数器上做细胞计数 费力%通过成像分析可最大化

荧光或其他化学法 分析与生物量有关的化合物%如1SF’/01’蛋白等

只能间接测量%校正困难

平板活计数 经适当稀释.数平板上的菌落 测量存活的菌%需长时间培养

红外过程分析技术可以快速’简易和无破坏性地获得样品或反应过程体系的红外光谱&衰减全反射探头的应用使它可用于水溶液的多成分定量分析&红外光谱对应于化学键的振动和转动产生的吸收%含有丰富的化学组成及结构信息%同时也会受到环境条件的影响&由于传统峰高’峰面积的定量法在解决此问题时有一定局限性%故杭海峰等采用人工神经元网络来解决%他们考察了螺旋藻培养中GP值对碳酸盐红外吸收光谱的影响&用人工神经元网络建立了直接通过红外吸收光谱的变化确定GP值总碳浓度的方法%对实际过程进行测定%取得了满意的结果&啤酒营养丰富%但其中所含嘌呤会引发或加重某些疾病%因此%对酿造过程中嘌呤含量的检测就显得尤为重要&李志良等采用高效液相色谱法测定麦汁’发酵液和啤酒中的嘌呤含量%分析嘌呤在发酵过程中的变化情况&通过研究发现麦汁中的

45- 发酵工程

嘌呤主要来源于麦芽%开发低嘌呤啤酒应采用高辅料比酿造技术%或采用合理的后处理工艺%如高浓度稀释工艺可相对降低单位体积啤酒中嘌呤的含量%以及选择合适的吸附剂&毛淑杰等采用气相色谱I质谱联用法初步分析确定了食醋中有35种挥发性香气成分%此方法为食醋的内在质量评价和鉴定提供了特征数据&

思 考 题

2<发酵过程中温度升高对微生物生长和产物形成有什么影响1 什么原因造成温度升高1

-<何为发酵热1 如何测量和计算1

3<怎样控制最适宜的发酵温度1

4<生产中为什么要控制GP值1 怎样调节和控制GP值1

5<发酵过程中哪些因素引起GP值的上升或下降1

6<泡沫的实质和形成原因是什么1 它对发酵生产有什么影响1

7<发酵生产中消除泡沫的方法有哪些种1 各有什么优缺点1

8<尾气分析包括哪些内容1 排出气体之中+,-控制的意义是什么1

9<基质浓度对发酵有什么影响1 说明补料分批发酵的优点和作用1

2:<何为补料的内容和原则1 如何进行控制1

22<发酵工业生产中控制的主要参数有哪些1 怎样控制1

2-<发酵过程染菌的防治措施有哪些1

23<如何判断各种发酵的异常现象染菌对发酵生产造成的危害1

24<说明噬菌体污染的途径和危害及防止噬菌体污染的措施&

25<综述发酵过程中主要参数对发酵的影响及检测和控制方法&

55-第九章!发酵工艺的控制

第十章!发酵工程产物的获取

发酵工程产物的获取%即微生物代谢产物的分离纯化%其目的在于从发酵液中或细胞内分离并纯化出高纯度的目标产物%又称为发酵液的后处理或下游加工过程!L)A%E&#"’$G#)B"EE(%."&通过发酵方法所获得的发酵液%目标产物在发酵液中的浓度很低%有的还是胞内产物%因此%要得到最终产品%必须把目标产物从发酵液中分离出来%其过程具有难度大’收率低的特点&另外%由于生物活性的要求%在分离纯化的过程中应尽量采取温和条件%以免影响产品的稳定性&下游处理的费用通常要占产品总成本的-:R*7:R%特别是一些基因工程药物%如用重组/01方法生产的蛋白质%要求更高的技术和纯度%这时甚至要达到成本的8:R*9:R%并且这种偏向还有继续加重的趋势&

发酵液中成分复杂%产物含量很低%杂质的浓度很高%并且这些杂质有很多与目标产物的性质很接近&因此%下游加工过程直接影响产品的价格%这就要求我们更加深入地研究后处理技术%降低生产成本&

发酵产物的分离方法主要有沉淀法’吸附法’溶剂萃取法’离子交换法等&发酵液经过初步纯化后%体积大大缩小%目标物质浓度已经提高%但纯度达不到要求%必须进一步精制&目标产物的纯化或精制方法因其性质而不同%常用的如蒸馏’升华’吸附’离子交换’萃取等方法&一般目标产物的提取和精制的工艺过程见图2:I2&

图!+"!!目标产物提取和精制的工艺流程

第一节!发酵液的预处理

发酵液预处理是进行发酵产品分离纯化的第一道工序&发酵结束后%发酵液

中产物浓度通常很低%一般只有2:*3:C.0$3%而杂质含量却很高%包括有大量的菌体细胞%未利用完的培养基’各种蛋白质胶状物’色素’金属离子以及其他代谢产物等&发酵液中的某些无机盐%不仅影响产品质量%而且在采用离子交换法提取时%由于树脂大量吸附无机离子而减少对生化物质的交换&发酵液中含有大量的可溶性黏胶状物质%主要是核酸’杂蛋白质’不溶性多糖%这些杂质不仅使发酵液黏度增加%影响液固分离%还会影响后面的提取操作&

一!发酵液预处理的目的与方法

!一"发酵液预处理的目的!2"改变发酵液的物理性质%促进从悬浮液中分离固形物的速率%提高固液分

离的效率&!-"尽可能使产物转入便于后处理的某一相中!多数情况下是液相"&!3"除去发酵液中部分杂质%以利于后续各步操作&确定预处理方法的基本条件(!2"了解产物存在的部位&!-"了解目的产物的稳定性%发酵液预处理的GP值’温度以及化学试剂选择

等等%完全取决于目的产物的稳定性&!3"了解提取工艺对滤液质量的要求%滤液一般要求澄清’GP值适中’有一定

的浓度%但不同的提取工艺路线%对滤液的质量要求不完全相同&即使是工艺路线大体相同%预处理过程也会有区别&例如新生霉素可用溶媒萃取法%转相时GP值控制在6<:*6<5%蛋白质析出不多%乳化少%所以发酵液可以不加任何处理而直接进行过滤后萃取&

!二"发酵液预处理的方法

2<菌丝体及蛋白质的处理!2"化学变性&使蛋白质变性的其他方法还有大幅度改变GP值’加有机溶剂

!丙酮’乙醇等"及添加表面活性剂等&生产上较常用加入酸化剂将发酵液GP值调到酸性范围!GP-*3"%使蛋白质变性而沉淀&加有机溶剂使蛋白质变性%因价格昂贵%所以只适用于处理量较小或浓缩液的情况&

!-"加各种沉淀剂沉淀&某些化学试剂能与蛋白质结合形成复合物沉淀&在酸性溶液中%蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐’水杨酸盐’钨酸盐’苦味酸盐’鞣酸盐’过氯酸盐等形成沉淀&在碱性溶液中%能与一些阳离子如 1.a’+D-a’

b%-a’_"3a和FN-a等形成沉淀&

75-第十章!发酵工程产物的获取

!3"等电点沉淀&蛋白质是一种两性物质%在酸性溶液中带正电荷%碱性溶液中带负电荷%而在某一GP值条件下%净电荷为零%称为该蛋白质的等电点%此时它在水中溶解度最小%能沉淀除去&但有些蛋白质在等电点状态仍有一定的溶解度%所以单靠等电点法不能除尽蛋白质&

!4"热处理变性&加热能使蛋白质变性%加热可加速分子运动%加速碰撞’凝聚%破坏胶体平衡%还能使液体黏度降低%加快过滤速度%同时变性蛋白质在水中溶解度较小而产生沉淀&例如在链霉素生产中%采用GP值为3<:*3<5情况下%加热至7:*75‘%维持:<5>时过滤速度可提高3倍%黏度降低到原来的206&加热变性的方法只适合于对热较稳定的物质%如链霉素’灰黄霉素%因此加热温度和时间必须严加控制&

!5"吸附&利用吸附作用常能有效地除去杂蛋白质&在发酵液中%加入一些反应剂%它们互相反应生成的沉淀物对蛋白质具有吸附作用而使其凝固&例如在四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌%生成亚铁氧化锌钾O-b%33_"!+0"64-的胶状沉淀%能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去&

!!-O4_"!+0"6a3b%Z,4$O-b%33_"!+0"64-7a3O-Z,4

!6"加入絮凝剂&絮凝剂是天然的或人工合成的有机高分子化合物%如壳聚糖’海藻酸钠’明胶及酰胺类衍生物’聚苯乙烯类衍生物和聚丙烯酸类衍生物等&絮凝是指在某些高分子絮凝剂的存在下%由于架桥作用%使细胞聚集形成粗大的絮凝团%有助于过滤%是一种以物理集合为主的过程&絮凝剂常与无机电解质凝聚剂搭配使用%加入无机电解质使悬浮粒子间的排斥能降低%脱稳而凝聚成微粒%然后加入絮凝剂%两者相辅相成%提高了絮凝效果&

!7"加入凝聚剂&凝聚是在中性盐作用下%由于双电层排斥电位的降低%而使胶体系统不稳定的现象&影响凝聚作用的主要因素是无机盐的种类’化合价以及无机盐的用量&常用的凝聚剂有1K-!Z,4"3.28P-,’1K+K3.6P-,’_"+K3’b%Z,4’.+,3等&

-<酶解法去除不溶性多糖当发酵液中含有较多不溶性多糖时%黏度增大%液固分离困难%可用酶将它转

化为单糖以提高过滤速度&例如在蛋白酶发酵液中加!I淀粉酶%将培养基中多余的淀粉水解成单糖%就能降低发酵液黏度%提高滤速&

3<高价金属离子的去除对提取过程和成品质量影响较大的无机杂质主要是+’-a ’ .-a’_"3a等高价

金属离子%预处理中应将它们除去&可以采用以下两种方法(!2"离子交换法%滤液通过阳离子交换树脂%可除去某些离子&!-"沉淀法%利用这些金属能形成某些不溶性的盐类%从发酵液中沉淀出来%最

85- 发酵工程

后被过滤除去&

二!发酵液的固液分离及设备

固液分离是发酵生产中经常用到的单元操作&固液分离的方法很多%常规方法有分子筛’重力沉降’浮选分离’离心分离和过滤等&固液分离过程根据颗粒的收集方式分为两大类型&沉降和浮选为第一类%液体受限于一个固定的或旋转的容器而颗粒在液体里自由移动%分离是由于内外力场的加速作用产生的质量力施加在颗粒上造成的&这种力场可能是重力场’离心力场或磁场%分离过程不以颗粒到达收集表面为结局%如果过程是连续的%被收集的颗粒必须从筛分容器中转送和排放&如果作用力是重力或离心力!除浮选外"%在固体和液体之间必须有密度差&第二类是过滤%颗粒受到过滤介质的限制%而液体可以自由通过介质&不同性状的发酵液应选择不同的固液分离方法和设备%其中用于发酵液固液分离的方法主要是离心和过滤&

!一"过滤法传统的过滤操作是在某一支撑物上放过滤介质%注入含固体颗粒的溶液%使液

体通过%固体颗粒留下&过滤设备按照推动力不同可分为4类(重力过滤’加压过滤’真空过滤’离心过滤&无论哪一类过滤设备都可分为分批!间歇"和连续操作&加压过滤设备由于结构复杂%操作繁杂%连续化较难%故使用较少/真空设备易于实现连续化%是常用的过滤设备&过滤设备的种类见表2:I2&

表!+"!!过滤设备的种类

装置 操作方式 形!式

加压过滤设备 间歇式 !密闭式圆盘过滤器

"压滤器

#加压叶状过滤器

$水平板型加压过滤器

%工业型管状过滤器连续式 &加压圆盘型!或圆盘型"过滤器

’加压圆筒型被覆过滤器真空过滤设备 间歇式 !吸滤缸!槽"

"c’K(.>"#倾斜型过滤器

#真空叶状过滤器连续式 $多室圆筒型真空过滤器

%圆盘型真空过滤器

&水平型真空过滤器

95-第十章!发酵工程产物的获取

按料液流动的方向不同%过滤可以分为常规过滤和错流过滤&

2<常规过滤料液垂直穿过滤饼和过滤介质的微孔&常规过滤设备主要有板框压滤机和真

空鼓式过滤机&!2"板框压滤机&这是目前较常用的一种过滤设备%广泛应用于发酵工业的培

养基制备/霉菌’放线菌’酵母等多种发酵液的固液分离&具有过滤面积大%能耐受较高压差%结构简单%耗能少的特点%适合于不同特性的发酵液&但是这种设备不能连续操作%劳动强度大%非生产占用时间长&自动板框过滤机是一种较新型的压滤设备%它使板框的拆装’滤渣的去除和滤布的清洗等操作都能自动进行%大大缩短了非生产的辅助时间%并减轻了劳动强度&

!-"真空鼓式过滤机&真空鼓式过滤机在负压下工作%最典型的是外滤面多室式真空转鼓过滤机&其基本原理是普通的真空吸滤%主要适用于霉菌发酵液的过滤%而对于细小的菌体或黏度大的发酵液%需加大助滤剂或在转鼓面上预铺一层助滤剂&操作过程分为4个阶段(吸滤’洗涤’吸洗液’刮除固形物&能连续操作%实现自动控制&

-<错流过滤错流过滤的介质通常为微孔滤膜或超滤膜%主要适用于处理含有悬浮粒子微

小的发酵液&但固I液相不易分离完全%滤膜易被污染%膜和污染层容易吸附产物%使产率下降&

!二"离心法离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异%在离心场中使不同密

度的固体颗粒加速沉降的分离过程&与过滤不同%离心只能得到一种较为浓缩的悬浮液或浆体/而过滤可获得水分含量较低的滤饼&当固体颗粒细小而难以过滤时%离心操作十分有效&离心分离具有分离速率快’分离效率高’液相澄清度好等优点&但离心设备较过滤机价格昂贵得多%而且设备投资高’能耗大&

离心机是利用转鼓高速旋转所产生的离心力%来实现悬浮液’乳浊液的分离或浓缩的分离机械&按其作用原理不同%可分为过滤式离心机和沉降式离心机两类&离心沉降设备从操作上看%有间歇!分批"操作和连续操作/从形式上看有管式’套筒式’碟片式等/从出渣方式上看%有人工间歇出渣和自动出渣等方式&发酵工业中常用的旋风分离器属于离心沉降设备&沉降式离心机转鼓上无孔%不需过滤介质%在离心力的作用下%物料按密度的大小不同分层沉降而得到分离%可用于液I

:6- 发酵工程

固’液I液和液I液I固物料的分离&过滤离心机转鼓上开有小孔%有过滤介质%在离心力作用下%液体穿过过滤介质经小孔流出而得以分离%主要用于处理固体颗粒较大’固体含量较高的悬浮液&

2<碟片式离心机碟片式离心沉降机是发酵工业应用最广的离心沉降设备&它具有一密闭的

转鼓%鼓中放置有数十个至上百个锥顶角为6:W*2::W的锥形碟片%碟片与碟片间的距离用附于碟片背面具有一定厚度的狭条来调节和控制%一般碟片间的距离为:<5*-<5$$%当转鼓连同碟片以高速旋转时%碟片间悬浮液中的固体颗粒因有较大的质量%先沉降于碟片的内腹面%并连续向转鼓颈部进液管周围的排液口排出&碟片式离心机既能分离低浓度的悬浮液!液I固分离"%又能分离乳浊液!液I液I固分离"&两相分离和三相分离有所不同%液I固或液I液两相分离用的碟片为无孔式&液I液I固三相分离用的碟片在一定位置有孔%以此作为液体进入各碟片间的通路%孔的位置是处于轻液和重液两相界面的相应位置上%其分离工作原理见图2:I-的左右两侧&碟片式离心机根据排出分离固体的方法不同分为喷嘴型和液I液I固分离的工作原理碟片式离心机和自动分批排渣型碟片式离心机&

2<料液/-<清液/3<轻液/4<重液/5<进料管/6<重清液分隔板/7<碟片

图!+"#!碟片式离心机液"固分离和液"固的工作原理

-<管式离心机管式离心机的转鼓细长%可以在很高的

转速下工作%而不至使转鼓内壁产生过高的应力&管式离心机可用于微生物细胞的分离%还可用于细胞碎片’细胞器’病毒’蛋白质’核酸等生物大分子的分离&管式离心机也是沉降式离心机%由于其转鼓直径较小%容量有限%因而生产能力小&

管式离心机可用于液I液分离和固液分离&用于液I液分离时可连续操作%用于固I液分离时为间歇操作%操作一定时间后需将沉积于转鼓上的固体定期人工卸渣&管式离心机设备简单’操作稳定’分离效率高&其结构和工作状况见图2:I3%图中!’"为结构图%!N"为工作状况示意图&

26-第十章!发酵工程产物的获取

2<机座/-<转筒/3<乳浊液进入管/4<清液排出管/5<重液排出管/6<皮带轮/7<挠性轴/8<平皮带/9<支撑轴承/2:<挚动器/

22<清液/2-<重液/23<澄清的液体/24<渣

图!+"$!管式离心机结构示意图

图!+"%!篮式过滤离心机分离原理图

3<篮式离心机工业上常用的篮式离心机属于离心过

滤机&所谓离心过滤机就是利用离心力代替压力差作为过滤推动力&常用的过滤离心设备有三种(!三足式离心机/"卧式刮刀离心机/#螺旋卸料离心机&篮式过滤离心机的转鼓为一多孔圆筒%圆筒转鼓内表面铺有滤布&操作时%被处理的料液由圆筒口连续进入筒内%在离心力的作用下%清液透过滤布及鼓壁小孔被收集排出%固体微粒则被截留于滤布表面形成滤饼&其分离原理见图2:I4&

-6- 发酵工程

第二节!微生物细胞的破碎

细胞破碎!B"KK#DG&D#""技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁%使细胞内容物包括目标药物成分释放出来的技术&微生物的代谢产物有的分泌到细胞外%有的存在于细胞内部&为了获得胞内的蛋白质’酶’多肽和核酸等生化物质%首先必须收集细胞或菌体%进行破碎/有效的细胞破碎对分离和纯化任何细胞内活性产物都是必要的&

细胞破碎的方法大致可以分为物理破碎法’化学破碎法和生物破碎法&

一!物理破碎法

物理破碎法主要靠剪切力来破碎细胞&在破碎细胞前常常需要对细胞进行冻I融预处理%这样可以提高破碎细胞的效果&高强度剪切力有时可以使蛋白质发生变性&

常用的有以下几种&

!一"高压匀浆法该方法利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀后%因高速撞击和突然减压而使

细胞破裂&这一操作可多次循环&影响高压破碎的主要因素有操作压力’破碎次数’阀型设计’温度和细胞浓度等&细胞破碎程度通常由可溶蛋白质的释放量来确定&高压匀浆破碎法的工艺放大比较容易%可以从实验室规模直接放大&

高压匀浆法可大规模应用%且适用于多种微生物细胞%仅少数易造成堵塞的团状或丝状真菌以及较小的革兰氏阳性菌除外&

!二"挤压法此法是对高压法的改进%将浓缩的菌体悬液冷却至[-5*[3:‘形成冰晶

体%施以5:: F’以上的高压冲击%将冷冻细胞从高压阀小孔挤出使之破碎&其特点是破碎率高%细胞破碎程度低%活性保留率高%适用范围广%但不宜用于对冻融敏感的物质&

!三"高速搅拌珠研磨法此法是将细胞悬浮液与研磨剂!通常是直径"2$$的无铅玻璃小珠"一起快

速搅拌或研磨%利用玻璃珠间以及玻璃珠与细胞间的互相剪切’碰撞促进细胞壁破裂而释出内含物&高速搅拌珠研磨机的典型设备如图2:I5所示&高速搅拌珠研

36-第十章!发酵工程产物的获取

磨破碎法最早用于染料和喷漆工业上颜料的研磨加工%在改变其设计后用于生物制药行业中的细胞破碎处理&

2%-<料液进口和出口/3%4<搅拌部分冷却剂进口和出口/5%6<磨室冷却剂进口和出口/1<具有冷却夹套的圆筒形磨室/J<具有冷区装置的搅拌轴和圆盘/

+<环形震动狭缝分离器//<变速马达

图!+"&!O2.P;AFLC"#+型珠研磨机!参考俞俊棠<新编生物工艺学<-::3"

影响高速搅拌珠研磨机破碎细胞效果的主要因素有仓体设计’搅拌盘设计’搅拌速度’研磨珠尺寸’研磨珠装量’细胞浓度’进料速度’温度和待破碎细胞种类等&

此法可实现连续操作&其不足是在破碎过程中产生的热量会使样品温度迅速上升%因此必须采取冷却措施&影响珠磨破碎的因素很多%如珠体的大小和用量’搅拌器的转速’进料速度’细胞浓度和冷却温度等&这些参数不仅影响细胞破碎程度%还影响能耗&珠子的大小应根据细胞大小和浓度及操作过程中不带出珠子的要求来选择&

!四"超声波破碎法此法是利用25*-5CPH的超声波来处理细胞悬浮液&一般认为在超声作用

下%液体发生空化作用%空穴的形成’增大和闭合可产生极大的冲击波和剪切力%使细胞破碎&

超声波振荡器有不同的类型%常用的为电声型%超声波振荡器又可分为槽式和探头直接插入介质两种形式%一般情况%后者破碎效果比前者好&

声波处理细胞悬浮液时%破碎作用受许多因素影响%如超声波的声强’频率’液体的温度’压强和处理时间’介质的离子强度’GP值和菌种的性质等&

超声破碎法是一种强烈的破碎方法%适用于多种微生物细胞的破碎&处理小

46- 发酵工程

量样品时操作简便%液量损失少&但超声处理易使敏感的活性物质变性失活%噪声难忍%有效能量利用率极低%操作过程产热量大%需在冰水或有外部冷却的容器中进行&该法对冷却的要求苛刻%故不易放大%目前主要用于实验室研究&

!五"干燥法经过干燥后的菌体%其细胞膜的渗透性发生变化%同时部分菌体会发生自溶%

然后用丙酮’丁醇或缓冲液等溶剂处理时%胞内物质就会被提取出来&干燥法有空气干燥’真空干燥’喷雾干燥和冷冻干燥等&

二!化学破碎法

破碎细胞的化学方法是一类利用化学试剂改变细胞壁或细胞膜的结构或完全

破除细胞壁形成原生质体后%在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质的方法&常用的化学试剂有酸’碱’脂溶性有机溶剂!如丁醇’丙酮’氯仿等"’变性剂’某些表面活性剂’抗生素’金属螯合剂等%

化学破碎法取决于化学试剂的类型和细胞壁或膜的结构与组成%不同化学试剂对各种微生物作用的部位和方式有所不同&化学破碎法的优点是(!对产物释放具有一定选择性&可使一些较小分子质量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过%而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内&控制条件可以有选择地释放出位于细胞内不同部位的产物&"细胞外形保持完整%碎片少%浆液黏度低%易于固液分离和进一步提取&该方法的缺点是(!通用性差%某种试剂只能作用于特定类型的细胞/"作用时间长%效率低%一般胞内物质释放率在5:R以下/

#有些试剂有毒性%在随后的产物提取精制过程中%需设法除去残留试剂%以保证产品的安全&

!一"酸碱用酸碱来调节溶液的GP值%改变细胞所处的环境%从而改变两性产物蛋白质

的电荷性质%使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用力降低而易于溶解到液相中去%便于后面的提取&

!二"QR?@螯合剂可用于处理革兰氏阴性菌!如?*.50/"%它对其细胞外层膜有破坏作用&革兰

氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子+’-a或 .-a结合脂多糖和蛋白质来维持&

56-第十章!发酵工程产物的获取

!三"表面活性剂表面活性剂可促使细胞某些组分溶解%其增溶作用有助于细胞的破碎&表面

活性剂都是两性化合物%分子中有一个亲水基团和一个疏水基团&在适当的GP值和离子强度下%它们聚集在一起形成微胶束%疏水基团聚集在胶束内部将溶解的脂蛋白包在中心%而亲水基团则向外层%这样使膜的通透性改变或使之溶解%该法特别适用于膜结合的酶的溶解&表面活性剂有天然的!如胆酸盐及磷脂"和合成的3阴离子型如十二烷基磺酸钠/非离子型如吐温!SA""%"/阳离子型如二乙氨基十六烷基溴4两类&一般地说%离子型的比非离子型的更有效%但也容易使蛋白变性&

!四"有机溶剂有机溶剂能分解细胞壁中的类脂&常用的是甲苯%它被细胞壁脂质层吸收后

会导致细胞壁膨胀%最后造成细胞壁的破裂%细胞内的产物释放到水相中&除甲苯外%其他苯对类脂的分解作用也十分强烈&可处理的菌体有无色杆菌’芽孢杆菌’梭菌’假单胞杆菌等菌体&但甲苯具有致癌性%且较易挥发而很少采用&此外%氯仿’二甲苯及高级醇等也有类似的作用&一般选用具有与细胞壁中脂质的溶解度参数类似的溶剂作为细胞破碎用的溶剂&

!五"变性剂变性剂如盐酸胍!.D’%(L(%">?L#)B>K)#(L""和脲!D#"’"能破坏氢键%降低胞内

产物之间的相互作用%使之容易释放&

三!生物破碎法

常用的生物破碎法主要是酶溶法%酶解法是利用酶反应%分解破坏细胞壁上的特殊键%从而达到破碎的目的&常用的溶酶有溶菌酶’"I2%3I葡聚糖酶’"I2%6I葡聚糖酶’蛋白酶’甘露糖酶’糖苷酶’肽链内切酶’壳多糖酶等&

酶溶法可分为外加酶法和自溶法两种&酶解时可以在细胞悬浮液中加入特定的酶%也可以采用自溶作用&

!一"外加酶法在外 加 酶 法 中%常 用 的 溶 酶 有(溶 菌 酶 !K?E)H?$""’"I2%3I葡 聚 糖 酶

!.KDB’%’E""’"I2%6I葡聚糖酶’蛋白酶!F#)&"’E""’甘露糖酶!$’%%’%’E""’糖苷酶!.K?B)E(L’E""’肽键内切酶 !"%L)G"G&(L’E""’壳多糖酶等%而细胞壁溶解酶!H?$)K?’E""是几种酶的复合物&此外%可采用的酶还有其他类型的蛋白酶’脂肪

66- 发酵工程

酶’核酸酶’溶菌酶’透明质酸酶等&溶酶同其他酶一样具有高度专一性%蛋白酶只能水解蛋白质%葡聚糖酶只对葡聚糖起作用&因此%利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶%并确定相应的次序&例如对酵母细胞采用外加酶法破碎时%先加入蛋白酶水解蛋白质I甘露聚糖结构%使二者溶解%再加入葡聚糖酶作用于裸露的葡聚糖层%最后只剩下原生质体%这时若缓冲液的渗透压变化%则细胞膜破裂%释放出胞内物质&

单一酶不易降解细胞壁%需要选择适宜的酶及酶反应系统%确定特定的反应条件%并结合其他的处理方法%如辐射’加入高浓度盐及;/S1%或利用生物因素促使生物对酶解作用敏感等&

如果是破碎酵母细胞壁%至少有两种酶是必需的%即细胞壁I溶解蛋白酶和

"IK%3I葡萄糖酶%但是"I2%6I葡萄糖酶’甘露糖酶和甲壳素酶将加速这一溶解过程&对于细菌%糖苷酶’0I乙酰胞壁酰I!I丙氨酸酰胺酶和多肽酶的混合物将加速

肽聚糖的溶解&在破碎革兰氏阳性菌时%为了去除外部双层脂质需要用表面活性剂进行预处理&

某些重要微生物细胞壁的降解酶见表2:I-&

表!+"#!重要微生物细胞壁的降解酶

生物体 酶 水解键的类型

细菌 糖苷酶 肽聚糖中1c1和11^之间的"I2%4键残基

0I乙酰胞壁酰I!I丙氨酸酰胺酶

某些糖肽中的0I乙酰胞壁酰基残基和!I氨基酸残基之间的键

多肽酶 甘氨酸I甘氨酸%丙氨酸I甘氨酸等的肽键真菌’酵母 "I2%3I葡聚糖酶 聚糖中随机"I2%3键

"I2%6I葡聚糖酶 聚糖中随机"I2%6键甘露聚糖酶 2%-I或2%3I或2%6I"I#I甘露糖苷键

甲壳素酶 甲壳糖和壳糊精中的0I乙酰I6I#I氨基葡萄糖苷"I2%4键

蛋白酶

藻类 纤维素酶 纤维素中的!I2%4键

!二"自溶法自溶法!’D&)K?E(E"是一种特殊的酶溶方式%它是利用微生物自身产生的酶来

溶菌%而不需外加其他的酶&事实上%微生物在生长代谢过程中%大多能产生一定的水解自身细胞壁上聚合物结构的酶%以便使生长繁殖进行下去&控制一定条件%可以诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力%以达到细胞自溶的

76-第十章!发酵工程产物的获取

目的&影响自溶过程的主要因素有(温度’时间’GP值’激活剂和细胞代谢途径等&微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法&例如%对谷氨酸生产菌%可加入

:<:-8$)K0@0’-+,3和:<:28$)K0@0’P+,3配成GP2:的缓冲液%再配3R的细胞悬浮液%加热至7:‘%保温搅拌-:$(%%菌体即自溶&在有些产品的生产中用于大生产%如酵母自溶物的制备’维生素J2-等&

酶溶法具有产物可选择性释放’核酸泄出量少’细胞外形完整等优点&但也存在明显不足(对不稳定的微生物%易引起所需蛋白质的变性%并且%自溶后细胞悬浮液的黏度增大%过滤速率下降/溶酶价格高%回收利用困难%大规模使用成本高/通用性差%不同的菌种需不同的酶%且最佳条件不易确定/存在产物抑制作用%导致释放率低&因此%酶溶法目前还只限于实验室规模应用&

第三节!发酵产物的分离和纯化

与在发酵液中一样%目的产物在经固I液分离所得液相中的浓度一般也很低%通常需经浓缩’粗提等操作%提高产物的浓度和纯度%这是初分离阶段需要解决的任务&常用的初分离方法主要有沉淀’萃取’膜分离’吸附和离子交换等&发酵产物经初分离后%除去不少杂质%体积也大为缩小%但纯度仍达不到要求%需进一步纯化&大分子产物的纯化主要用层析法%特别是液相层析法%而小分子产物的纯化则主要用结晶法&此外%一些用于初分离的方法如超滤’纳滤和超临界流体萃取等也可应用于纯化过程&

一!发酵产物的分离

!一"沉淀法沉淀!G#"B(G(&’&()%"是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低’生成固体凝聚

物的现象%是利用某种沉淀剂使需提取的微生物药物或杂质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程&

沉淀操作常在发酵液经固I液分离除去不溶性杂质及细胞碎片后进行%所得沉淀物可直接干燥制成产品或进一步纯化成高纯度成品&常见的沉淀方法主要有盐析’等电点沉淀’有机溶剂沉淀’非离子型聚合物沉淀’聚电解质沉淀和复合盐沉淀等&

2<盐析沉淀法盐析是在高浓度中性盐存在下%使生物分子在水溶液中的溶解度降低而产生

沉淀的方法%主要适用于蛋白质!酶"等大分子物质&在高浓度中性盐存在条件下%

86- 发酵工程

它们在水溶液中的溶解度降低而产生沉淀&!2"基本原理&蛋白质在水中的溶解度与其表面性质有关&蛋白质等大分子

物质以一种亲水胶体形式存在于水溶液中%无外界影响时%呈稳定的分散状态&蛋白质分子的表面除带有电荷的基团外%还含有由憎水基团形成的区域%在憎水基团的周围%水分子有序排列%如图2:I6所示&

2<水分子/-<阴离子/3%7<荷正电区域/4<阳离子/5<荷负电区域/6%8<憎水区域

图!+"’!蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域

图!+"(!蛋白质的盐析机理示意图!参考顾觉奋等<分离纯化工艺原理<2994"

当向蛋白质溶液中逐渐加入中性盐时%会产生如下现象(开始蛋白质溶解度增大%这是由于蛋白质的活性系数降低的缘故%这种现象称为盐溶/当继续加入电解质时蛋白质的溶解度随之减小%这种现象称为盐析&蛋白质的盐析作用是由于静电作用引起的盐溶

和憎水作用引起的盐析两种作用相互作用的

结果&!-"无机盐的选择&在蛋白质盐析中%一

般阴离子的盐析效果比阳离子好%尤其以高价阴离子更为明显&不同无机盐对碳氧血红蛋白溶解度的影响如图2:I7所示&

!3"影响盐析作用的各种因素&对于特

96-第十章!发酵工程产物的获取

定的蛋白质%影响蛋白质盐析的主要因素有无机盐的种类’浓度’温度和GP值&

!盐的种类(在相同的离子强度下%盐的种类对蛋白质的溶解度有一定影响&一般来说%半径小的高价离子的盐析作用强%而半径大的低价离子的盐析作用弱&常用的盐析剂有硫酸铵’硫酸钠’磷酸钾’磷酸钠等%其中硫酸铵的盐析效果强%溶解度大%能使蛋白质稳定%受温度影响小%故使用最为广泛&但在高GP值下硫酸铵水解后可释出氨%对设备有腐蚀性%在食品中残留有异味%在药品中残留有毒性%故必须在后续工序中除去&

"溶质的起始浓度(对于同一种蛋白质%起始浓度不同则有不同的沉淀范围&如碳氧血红蛋白%用硫酸铵盐析时%若起始浓度为3:.0@%其沉淀范围在58R*65R饱和度/若起始浓度为3.0@%则沉淀范围在66R*73R饱和度&蛋白质起始浓度通常取-<5R*3<:R为宜%过高易使不同蛋白质产生共沉淀%不利于分离%而过低则中性盐用量太大%也不利于蛋白质的回收&

#溶液的GP 值(对蛋白质进行盐析时%其特征常数"值是随GP 值而变化的%且"值变化一个单位%溶解度变化2:倍&通常"值在蛋白质等电点附近为最小%故常选择等电点GP值为盐析GP值&

$操作温度(在高浓度的盐溶液中%蛋白质的溶解度会随温度升高而减小%此时温度稍高一点%有利于蛋白质沉淀%故在一般情况下%蛋白质的盐析可在常温下进行%但对温度敏感的蛋白质则应在:*4‘的低温下进行&

-<等电点沉淀法氨基酸’多肽’蛋白质及核酸类等两性电解质在溶液GP值处于等电点GX时%

分子表面净电荷为零%导致溶解度降低%形成沉淀&利用这一特性%调节溶液GP值%使两性电解质沉淀析出的操作称为等电点沉淀&

!2"基本原理&不同的两性电解质有不同的等电点%故可用等电点沉淀将它们分离开&本法适用于疏水性较强的蛋白质%如酪蛋白在等电点处能形成粗大的凝聚物&但不适用于亲水性强的蛋白质%如明胶%在低离子强度下%在等电点处不产生沉淀&

!-"等电点操作时注意事项&!中离子的种类和浓度对生物分子等电点的影响(若蛋白质结合阳离子!如+’-a ’ .-a’b%-a"多%可使其等电点升高/结合阴离子!如+K[’Z,-[4 ’PF,-[4 "多%则使等电点降低&

"等电点附近的盐溶作用(通常中性盐浓度增加时%对应于最低溶解度的GP值向酸性方向偏移%且最低溶解度会有所增大&

#目的产物的不稳定性(如!I糜蛋白酶和胰蛋白酶在等电点附近不稳定&等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的蛋白质!如酪蛋白"%而对于亲水性很

:7- 发酵工程

强的蛋白质!如明胶"%由于在水中溶解度较大%在等电点的GP 值下不易产生沉淀&所以%等电点沉淀法不如盐析沉淀法应用广泛&但该法仍不失为有效的蛋白质初级分离手段&例如%从猪胰中提取胰蛋白酶原!GXU8<9"时%可先于GP3<:左右进行等电点沉淀%除去共存的许多酸性蛋白质!GX为3<:左右"&工业生产胰岛素!GXU5<3"时%先调GP值至8<:除去碱性蛋白质%再调GP值至3<:除去酸性蛋白质!同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果"&

与盐析法相比%等电点沉淀的优点是操作简单%试剂消耗少%引入的杂质也少%无需后继的脱盐操作&但是%如果沉淀操作的GP值过低%容易引起目标蛋白质的变性%而且沉淀往往不完全%故很少单独使用%常与盐析’有机溶剂沉淀等方法联合使用%且在实际工作中常用做去除杂质的手段&

3<有机溶剂沉淀法利用与水互溶的有机溶剂能使蛋白质沉淀的性质来减小蛋白质的溶解度而发

生沉淀的方法%常应用于酶制剂’氨基酸’抗生素等发酵产物的提取上&常用的能使生物大分子物质沉淀的有机溶剂有甲醇’乙醇’异丙醇和丙酮等%其中乙醇是最常用的沉淀剂&

!2"有机溶剂沉淀机理&一般来说%溶质分子质量越大越容易被有机溶剂沉淀&其机理是(加入有机溶剂后%会使系统的介电常数减小%因而在不同蛋白质粒子表面上%具相反电性离子基团之间的吸引力增加%这就促使它们相互聚集%并沉淀出来&

!-"影响有机溶剂沉淀的因素&有机溶剂沉淀法的影响因素是多方面的%如溶剂的种类和用量’沉淀的温度’GP 值和时间’溶液中的盐类’吸附剂的性质和用量等&

!溶剂的种类和用量(不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率%受蛋白质的种类’温度’GP值和杂质等因素所影响%但大致上以丙酮为最佳%乙醇次之%甲醇更次%因此要通过试验加以选择&

乙醇是最常用的沉淀剂&在沉淀过程中乙醇与水混合时放出大量的稀释热%使溶液的温度显著升高&对不耐热的酶影响较大%生产上常用搅拌’少量多次加入的办法%以避免温度骤然升高损失酶活力&

"温度(有机溶剂对酶的沉淀能力也受到温度的影响%一般温度越低沉淀越完全%所以沉淀过程必须注意冷却降温%使沉淀在较低的温度下进行&

#GP值(在酶结构稳定范围下选择溶解度最低处的GP值%有利于提高沉淀效果&适宜的GP值可大大提高分离的分辨能力&

$时间(用有机溶剂沉淀酶类有产生变性的可能%尤其是在还没有沉淀之前%

27-第十章!发酵工程产物的获取

这种可能性更大&所以在加溶剂时要搅拌均匀%其量不能一下子过多%以防局部浓度过高%引起酶的失活%并且又要在形成沉淀之前%尽可能快速加完%以缩短溶剂与酶的接触时间%沉淀完全后%应立即压滤和烘干%尽快除去湿酶中的有机溶剂&

%溶液中的盐类(在沉淀过程中%加入一些对酶有保护作用的盐类%对减少酶活的损失%提高收率十分有利%并且还可以使沉淀物凝聚而易于过滤&所以在酶沉淀前先用适量的磷酸二氢钠和氯化钙进行热处理%再用乙醇沉淀%有利于过滤的进行&

&吸附剂的性质和用量(如果在有机溶剂沉淀的同时还用吸附的办法%则要注意吸附剂及其用量和吸附温度的选择&由于酶的作用%底物对酶有保护作用%所以一般采用底物作吸附剂%不同吸附剂的吸附能力不同%在用淀粉作吸附剂时%玉米淀粉的吸附力较大%应采用增加吸附剂用量和在较低温度下吸附%则效果较好&以湿淀粉作吸附剂时%应先经8:*2::‘加热或加2:R硫酸钠于98‘处理-:$(%后使用&

4<其他沉淀法对于生化药物的沉淀分离法还有很多%如聚电解质沉淀法%加入聚电解质的作

用和絮凝剂类似%同时兼有一些盐析和水化等作用/选择性变性沉淀法%就是根据混合溶液中各种分子在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点%选择适当条件%使目的成分存在于溶液中%且保持其活性%其他成分由于环境的变化而变性%从溶液中沉淀出来%从而达到纯化有效成分的目的%如热变性沉淀法%酸碱变性沉淀法%利用某些试剂造成选择性变性&

一些离子型多糖化合物可用于食品蛋白质的沉淀&用得较多的是酸性多糖%如羧甲基纤维素’海藻酸盐’果胶酸盐和卡拉胶等&其沉淀作用主要是靠静电引力%如羧甲基纤维素能在低于等电点的GP值下沉淀蛋白质&用于蛋白质沉淀的多聚物还有(阴离子聚合物如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸’阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季铵盐’表面活性剂十二烷基硫酸钠!Z/Z"%它们在分离膜蛋白或核蛋白时特别有用&

此外%阳离子型表面活性剂如十六烷基季铵盐溴化物!+S1J"’十六烷基氯化吡啶!+F+"可用于沉淀酸性多糖类物质%如黏多糖&

!二"萃取法萃取!"e&#’B&()%"指利用不同物质在选定溶剂中溶解度不同来分离混合物中

组分的过程&这些混合物必须不能混溶或部分混溶%以能形成两相而便于分离&取操作不仅可以提取和增浓产物%还可以除去类似物质%使产物得到初步纯化&其

-7- 发酵工程

次%所选用的溶剂对药物应有巨大的溶解度和选择性%用量较少就能完全提取%并使药物和杂质分离&这样%经过萃取才能达到浓缩和提纯的目的&最经典的萃取方法是溶剂萃取&近3:多年来它与其他技术结合发展出了多种新的萃取方法%如双水相萃取’反胶团萃取和超临界流体萃取等&

2<溶剂萃取溶剂萃取又称液I液萃取%溶剂萃取法是利用一种溶质组分!如产物"在两个互

不混溶的液相!如水相和有机溶剂相"中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离操作%广泛应用于抗生素’有机酸’维生素’激素等发酵产物工业规模上的提取&在溶剂萃取中%被提取的溶液称为料液%欲分离的物质称为溶质%用以进行萃取的溶剂称为萃取剂&经萃取分离后%大部分溶质被转移到萃取剂中%所得溶液称为萃取液!相"%被萃取出溶质后的料液称为萃余液!相"&

!2"萃取方式&工业上萃取操作包括三个步骤(’<混合%料液和萃取剂充分混合形成乳浊液%生物物质自料液转入萃取剂中/N<分离%将乳浊液分成萃取相和萃余相/B<溶剂回收&

混合I分离萃取过程%按操作方式分类%可以分为单级萃取和多级萃取%后者又可以分为错流萃取和逆流萃取&下面讨论各种萃取操作的理论收率的计算方法&在计算中假定萃取相和萃余相能很快达到平衡%即每个级别都是理论级别%而两相完全不互溶%能完全分离&

!单级萃取(单级萃取只包括一个混合器和一个分离器&料液_和溶剂Z加入混合器中经接触达到平衡后%用分离器分离得到萃取液@和萃余液M%如图2:I8所示&

图!+")!单级萃取流程图!参考罗大珍等<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

"多级错流萃取(料液经萃取后的萃取液再用新鲜萃取剂进行萃取称为多级错流萃取&

由图2:I9可以看出%第一级的萃余液!M2"作为第二级的料液%第二级的萃余

37-第十章!发酵工程产物的获取

液!M-"再作为第三级的料液%各自都用新鲜萃取剂!Z-%Z3"进行萃取&同理%还可进行8级萃取%此种萃取方式溶剂消耗量大%得到的萃取液平均浓度较低%萃取较完全&在萃取因素相同情况下%萃取级数越高%萃余率越低&

图!+"*!多级错流萃取流程图!参考顾觉奋等<发酵产品工艺学<-::2"

#多级逆流萃取(在第一级中加入料液!_"%萃余液顺序作为后一级的料液%而在最后一级加入萃取剂!Z"%萃取液顺序作为前一级的萃取剂%料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反%故称为逆流萃取&从图2:I2:可以看出%第一级的萃余液!M2"作为第二级的料液%第二级的萃余液!M-"作为第三级的料液%依此类推&而萃取剂!Z"只在最后一级加入%最后一级的萃取液!@3"作为第二级的萃取剂%第二级的萃取液!@-"作为第一级的萃取剂&与错液萃取相比%萃取剂耗量较少%萃取液的平衡浓度较高%而且萃取较完全&

图!+"!+!多流逆流吹去流程图!参考顾觉奋等<发酵产品工艺学<-::2"

47- 发酵工程

!-"溶剂萃取过程的理论基础&溶剂萃取是把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中%如把水相中的醋酸抽提到醋酸乙酯中&因而理解溶液中物质的溶解作用是溶剂萃取技术开发过程中溶剂选择的前提&

!物质的溶解和相似相溶原理(萃取是通过溶质在两个液相之间的竞争性溶解!分配"而实现的&从能量变化的角度可将溶解分为三个过程(

溶质J各质点的分离(原先是固态或液态的溶质J%先分离成分子或离子等单个质点%此过程需要吸收能量%对离子晶体而言该能量就是晶格能%对分子则是升华能或汽化能&这种能量的大小通常与分子之间的作用力有关%一般顺序为(非极性物质"极性物质"氢键物质"离子型物质&

溶剂1在溶质J的作用下形成可容纳J质点的空位/在溶质J的影响下溶剂分子相互作用形成可容纳J质点的空位&此过程也需要吸收能量%其大小与溶剂分子1之间的相互作用力有关%一般顺序与上述相同(非极性物质"极性物质"氢键物质&该能量还与溶质分子J的大小有关%如溶质分子J较大%则容纳J质点的空位就要大些%这就要破坏较多的溶剂分子 1之间的键或作用力%相应的能量需要就较大&

溶质质点J进入溶剂1形成的空位(溶质分子J与溶剂分子 1之间也存在相互作用力&此过程放出能量%放出能量的大小有以下规律(

1’J均为非极性分子"一非极性分子’另一极性分子"均为极性分子"J被

1溶剂化&溶剂化也称溶剂合化%是指一定数目的溶剂分子较牢固地结合在溶质质点上&若溶剂是水%则称为水!合"化&有溶剂化能力的溶剂称为溶剂化溶剂&

目前还不能定量地解释溶解的规律%应用较多的仍然是#相似相溶$原理&分子之间可以有两方面的相似(一是分子结构相似%如分子的组成’官能团’形态结构的相似/二是能量!相互作用力"相似%如相互作用力有极性的和非极性之分%两种物质如相互作用力相近%则能互相溶解&与水#相似$的物质易溶于水%与油#相似$的物质易溶于油就是相似相溶原理的表现&

"溶剂的互溶性规律(物质分子之间的作用力与物质种类有关%作用力包括较强的氢键和较弱的范德华力&氢键与化合键能相比较弱%但比范德华力要强得多&氢键是由一个氢原子和两个强电负性原子结合构成的%如1)P2J%这里%#2$表示氢键%它是一种带方向性的作用力!轴向强偶极作用力"&形成氢键必须有能够接受电子的部分1)P%即电子受体/还须有给出电子的部分J%即电子供体&

按照生成氢键的能力%可将溶剂分成4种类型(

0型溶剂(不能形成氢键%如烷烃’四氯化碳’苯等%称惰性溶剂&

1型溶剂(只有电子受体的溶剂%如氯仿’二氯甲烷等%能与电子供体形成氢键&

57-第十章!发酵工程产物的获取

J型溶剂(只有电子供体的溶剂%如酮’醛’醚’酯等%萃取溶剂中的SJF!磷酸三丁酯"’叔胺等&

1J型溶剂(同时具备电子受体1)P和供体J的溶剂%可缔合成多聚分子%因氢键的结合形式不同又可分成3类&

#溶剂的极性(溶剂萃取的关键是萃取溶剂的选择%而选择的依据是#相似相溶$的原则&

相似有两方面(一方是分子结构相似%这相对容易考察/另一方面是分子间作用能相似%即分子间相互作用力相似&在发酵工业上%对后一点考察较多的是分子极性&

介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度%如果已知介电常数%就能预测该化合物是极性的还是非极性的&

根据萃取目标物质!产物"的介电常数%寻找极性相接近的溶剂作为萃取溶剂%也是溶剂选择的重要方法之一&

良好的溶剂应该满足以下要求(有很大的萃取容量%即单位体积的萃取溶剂能萃取大量的产物/有良好的选择性%理想情况是只萃取产物而不萃取杂质/与被萃取的液相!通常是水相"互溶度要小%且黏度低’界面张力小或适中%这样有利于相的分散和两相分离/溶剂的回收和再生容易/化学稳定性好%不易分解%对设备腐蚀性小/经济性好%价廉易得/安全性好%沸点高%对人体无毒性或毒性低&

发酵工业常用的溶剂有酯类’醇类和酮类等&在生物转化中率取溶剂的选择准则如下&在物理化学方面(与水溶液不互溶/对产物有较高的分配系数/与水溶液不发生乳化/低黏度/在密度上同水有较大差别&在生物学方面(应在消毒过程中热稳定&在经济和环境等方面(对生物催化剂’酶或活细胞无毒性/低成本/能大批供应/对人员无毒/不易燃&

$分配定律和分离因数(在溶剂萃取过程中%通常将含有溶质的未提取过的溶液称为料液!_"%通常是水溶液/从料液中提取出来的物质称为溶质/用来萃取产物的溶剂常称为萃取剂!Z"/溶质转移到萃取剂中与萃取剂形成的溶液称为萃取液!@"/被萃取出溶质后的料液称萃余液!M"&

溶质的分配平衡规律即分配定律是指在一定温度’压力下%溶质分布在两个互不相溶的溶剂里%达到平衡后%它在两相的浓度比为一常数,%该常数称为分配系数&

!!,USQU萃取相浓度萃余相浓度

应用该式的条件是(必须是稀溶液/溶质对溶剂的互溶没有影响/必须是同一种分子类型%即不发生缔合或解离&

67- 发酵工程

!3"影响溶剂萃取的主要因素&由于产物所在的发酵液或水相中往往还存在与产物性质相近的杂质’未完全利用的底物’无机盐’供微生物生长代谢的其他营养成分等%必须考虑这些物质对萃取过程的影响&影响溶剂萃取的主要因素有溶液的GP值’温度’盐析作用和溶剂性质等&

!GP值(GP值直接影响表观分配系数&GP值除影响, 外%还可能对选择性有影响&如青霉素在GP-萃取时%醋酸丁酯萃取液中青霉稀酸可达青霉素含量的2-<5R%而在GP3的条件下萃取%则可降低至4&

"温度(温度会影响生化物质的稳定性%所以一般在室温或低温下进行&同时%温度影响分配系数,%因为温度通过影响溶质的化学电位而影响溶质在两相中分配&

#盐析(无机盐类如硫酸铵’氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中%另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度&如提取维生素J2-时%加入硫酸铵%可促使其自水相转移到有机相中&

$带溶剂(为提高分配系数,%常添加带溶剂&带溶剂是指能和产物形成复合物%使产物更易溶于有机溶剂中%该复合物在一定条件下又容易分解&如青霉素作为一种酸%可用脂肪碱作为带溶剂%能和正十二烷胺’四丁胺等形成复合物而溶于氯仿中&这样萃取收率能够提高%且可以在较有利的GP值范围内操作&这种正负离子结合成对的萃取%也称为离子对萃取&

!4"萃取剂的选择&萃取用的有机溶剂应对产物有较大的溶解度和良好的选择性&萃取剂的选择性可用分配系数"表征&所选溶剂的分配系数应尽可能大%一般应大于2&或可根据#相似相溶$原则选择与待分离物结构相近的溶剂%就溶解度而言%重要的#相似$反映在分子极性上%因介电常数是化合物摩尔极化程度的量度%故常根据被提取物的介电常数来选择适当的溶剂&表2:I3列出了一些常用溶剂的介电常数&

表!+"$!一些常用溶剂的介电常数!#&=" _0$

!溶剂 介电常数 !溶剂 介电常数 !溶剂 介电常数

乙烷 2<9: 氯仿 4<87 丙醇 --<-环己烷 -<:- 乙酸乙酯 6<:- 乙醇 -4<3四氯化碳 -<-4 -I丁醇 25<8 甲醇 3-<6苯 -<-8 2I丁醇 27<8 甲酸 59甲苯 -<37 2I戊醇 -:<2 水 78<54二乙醚 4<34 丙酮 -:<7

此外%选择溶剂时还应注意(与料液的互溶度应尽可能小/毒性低/化学稳定性高/腐蚀性低%沸点低%挥发性小/价格便宜%来源方便%便于回收等&

工业生产上常用的溶剂有乙酸乙酯’乙酸戊酯和丁酯等&

77-第十章!发酵工程产物的获取

!5"溶剂的回收&由于在溶剂萃取法中要使用大量的有机溶剂%溶剂消耗的费用在药物生产中占有很大比例%而且大量废溶剂的排放对环境也不利%所以溶剂的回收便成为了一个重要方面&溶剂的回收任务包括回收用过的萃取剂’萃余相中所含的溶剂和洗涤结晶所用的溶剂&溶剂的回收方法有简单蒸馏和精馏&

-<双水相萃取利用不同物质在双水相间分配系数不同的特性进行萃取的方法称为双水相萃

取&其机制与溶剂萃取相似%不同的物质进入双水相系统后%因在两相中的分配系数不同而使它们分别富集于上相或下相%从而达到分离的目的&

!2"双水相的形成&不同高分子化合物如聚乙二醇和葡聚糖以一定的浓度与水混合%溶液先呈混浊状态%待静置平衡后%可逐渐分层形成互不相溶的两相(上相富含聚乙二醇%下相富含葡聚糖%所形成的两相被称为双水相&离子型和非离子型高聚物都能形成双水相系统&一般认为%两种聚合物的水溶液互相混合时%是形成两相还是混合成一相取决于两个因素(一是分子间的作用力%二是熵的增加&对于大分子而言%前者占主导%因而主要由它来决定混合的结果&两种聚合物的分子之间%若存在较强的斥力%达到平衡后%有可能形成两相%两种聚合物分别进入其中的一相/若存在较强的引力!如带有相反电荷的两种聚电解质"%它们会相互结合而进入共同的相/若斥力或引力不够强%则两者可相互混合&

另外%高聚物与小分子化合物也能形成双水相系统%如聚乙二醇与硫酸铵或硫酸镁水溶液形成的双水相系统中%上相富含聚乙二醇%下相富含无机盐&其成相机制目前还不十分清楚%有人认为是盐析作用所致&

表!+"%!几种典型大的双水相系统

类型 聚合物5 聚合物1无机盐

1

聚乙二醇!F;c"聚乙烯醇

聚乙烯吡咯烷酮

葡聚糖

聚丙二醇

聚乙二醇

聚乙烯醇

葡聚糖

J /;1;葡聚糖.P+K聚丙二醇

聚乙二醇

+ 羧甲基葡聚糖钠盐 羧甲基纤维素钠

/ 聚乙二醇

硫酸钾

硫酸铵

硫酸钠

87- 发酵工程

表2:I4列出了几种典型的双水相系统&表中%1类为两种都是非离子型聚合物/J类为其中一种是带电荷的聚电解质/+类为两种都是聚电解质//类为一种是聚合物%另一种是无机盐&

双水相形成的条件和定量关系可用相图来表示%由两种聚合物和水组成的双水相系统的相图如图2:I22所示&图中%纵坐标为聚合物g的浓度%横坐标为聚合物F的浓度%曲线 SOJ称为双节线&双节线把相图分为两个区域(下方为均匀区%在此区域不能形成两相/上方为两相区%可形成两相%表明只有当)’I的浓度达到一定值时才能形成两相&例如%整个系统的组成为点P 时%可形成两相%其上相和下相分别由点H和& 表示&直线HP&称为系线&系线长度是表征双水相系统性质的一个重要参数&同一系线上各点所代表的系统%具有相同的组成%但两相的体积比不同%且服从杠杆规则&, 点称为临界点%此时%系线的长度为零%两相间的差别消失%即成为一相&

图!+"!!!聚合物D#S和水系统的相图示意图!参考俞俊棠等<新编生物工艺学<-::3"

!-"影响双水相分配的主要因素

!成相聚合物的相对分子质量(减小聚合物相对分子质量可使蛋白质容易分配到富含该聚合物的相中&例如%在F;c0葡聚糖系统中%减小F;c的相对分子质量’加大葡聚糖的相对分子质量%可使蛋白质更多地转入富含F;c的上相&此种现象带有普遍性%且溶质相对分子质量越大%其影响程度也越大&

"成相聚合物的浓度(由相图!图2:I22"可知%随成相聚合物总浓度的增加%系统远离临界点%系线长度增加%两相的差别增大&蛋白质趋于向一相分配&在一定范围内%增加成相聚合物浓度可增加蛋白质的分配系数&

#盐的种类和浓度(不同的无机离子在两相中有不同的分配系数%因而盐类的

97-第十章!发酵工程产物的获取

加入会在两相间形成电位差%而影响溶质特别是荷电大分子!如蛋白质’核酸等"的分配系数&例如加入0’+K%可增加荷正电的溶菌酶的分配系数%而减小荷负电的卵蛋白的分配系数%更利于两者的分离&在高盐浓度!如2*5$)K0@0’+K"下%因盐析作用使蛋白质易分配于上相%分配系数随盐浓度增加而增大%且不同蛋白质的效应不同%可利用来分离不同的蛋白质&

$GP 值(会影响蛋白质分子中可解离基团的离解度%改变蛋白质所带的电荷%进而改变其分配系数&系统中存在不同盐类时%GP 值的效应不同&有时GP值的微小变化会使蛋白质的分配系数改变-*3个数量级&

%温度(可影响相图%因而也影响分配系数&这种影响在临界点附近较明显%离临界点较远处影响减小&

!3"双水相萃取法的应用&双水相萃取法可应用于多种生物物质的分离和提取%特别是胞内酶的提取&提取胞内酶时%破碎细胞后得到的匀浆一般黏度很大%而所含细胞碎片又很小%用离心或膜过滤技术很难分离&用双水相系统可有效去除细胞碎片%并使酶得到初步纯化&除蛋白质类物质外%双水相系统还可用于核酸’病毒等的分离&

常用的双水相系统为聚乙二醇0葡聚糖和聚乙二醇0无机盐两种%后者中聚乙二醇0硫酸盐或磷酸盐系统最为常用&

与溶剂萃取法相比%双水相萃取系统中的两相大部分是水%不涉及有机溶剂%对被分离物质无破坏作用%有时还有保护作用%故工艺条件非常温和&所用的设备简单%操作方便%即使在常温下操作亦不易失活&在设计合理的系统中%分离速度快%回收率高%可达8:R*9:R&此外%该技术将传统的固I液分离转化为液I液分离%因此可利用工业化的高效液I液分离设备%使系统易于放大%且各种参数均可按比例放大而不降低产物的收率&

3<反胶团萃取反胶团萃取的本质是液I液萃取&但与一般溶剂萃取不同%反胶团萃取是利用

表面活性剂在有机溶剂中形成分散的内含亲水微环境的反胶团%使生物分子溶于此亲水微环境%进而进行萃取的分离方法&

反胶团是表面活性剂在非极性的有机溶剂中形成的纳米级聚集体&表面活性剂在溶剂中的浓度超过某一临界浓度!称为临界胶团浓度"时%会发生自聚集而形成胶团&若所形成的胶团中%表面活性剂的疏水基团向外与有机溶剂相互作用%亲水基团在内形成一个亲水的极性核%则称为反胶团&反胶团内的极性核具有溶解水的能力%其溶解水量与所用有机溶剂和表面活性剂的种类’浓度’温度’离子强度等条件有关&反胶团内溶解的水通常称为微水相或#水池$&生物分子如蛋白质的

:8- 发酵工程

水溶液与含有反胶团的有机溶剂接触后%蛋白质会转而溶于此#水池$中&由于周围水层和亲水基团的保护%蛋白质不会与有机溶剂接触%因而不会变性失活&

在反胶团萃取过程中%待分离溶质在互不相溶的两相间传递%先是通过表面液膜扩散从水相到达相界面%再由界面进入反胶团%最后含有待分离溶质的反胶团扩散进入有机相%然后经相反的类似过程完成萃取&

反胶团是无色透明的热稳定性系统&阳离子’阴离子和非离子型表面活性剂均可形成反胶团&目前研究使用最多的是阴离子表面活性剂1"#)E)K,S!丁二酸I-I乙基己基磺酸钠%简称1,S"&该表面活性剂易得%分子极性头小%有双链%形成反胶团时不必加入助表面活性剂%形成的反胶团大%有利于生物大分子的进入%其中以1,S0异辛烷0水系统最为常用&其他如吐温!SA""%"类非离子表面活性剂’山梨糖醇酯类’各种聚氧乙烯类表面活性剂’烷基三甲基卤化铵和磷酸酯类也较常用&

反胶团萃取具有选择性高%萃取过程简单%且可正’反萃取同时进行%能有效防止生物大分子变性失活等优点%在医药’食品工业’农业化学等领域得到广泛的应用&例如%利用1,S0异辛烷反胶团系统为萃取剂%已成功地对核糖核酸’细胞色素+和溶菌酶混合物进行分离&

4<超临界流体萃取超临界流体萃取是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系%即利用压力

和温度变化影响超临界流体溶解能力来分离溶质的方法&超临界流体是物质介于气相和液相之间的一种特殊的聚集状态&在相图!图

2:I2-"中任何物质均存在一临界点%当流体!气体或液体"处于该临界点以上的温度和压力下时即成为超临界流体&超临界流体兼有气体和液体的双重特性(其密度和溶解能力接近于液体%因而具有与液体溶剂相当的萃取能力/而黏度和扩散系数接近于气体%因而渗透能力较强!表2:I5"&

表!+"&!气体#超临界流体和液体性质的比较

性质相态

气体 超临界流体# 液体

密度0!.0B$3" 2:[3 :<7 2<:黏度0BF## 2:[3*2:[- 2:[- 2:[2

扩散系数0!B$-0E" 2:[2 2:[3 2:[5

#此处超临界流体是指3-‘和23<78 F’下的+,-&##2BF!厘泊"U2$F’.E&

这使超临界流体具有良好的溶解和传质特性%而且这种特性在临界点附近对压力和温度的变化非常敏感%十分有利于萃取操作&

28-第十章!发酵工程产物的获取

图!+"!#!5N# 的+"#""图!参考严希康<生化分离工程<-::2"

超临界流体萃取操作较为简单%因影响物质在超临界流体中溶解度的主要因素是温度和压力%故可通过改变压力和温度来完成&

+,- 的临界点较低%临界温度为32<:6‘%临界压为7<38 F’%超临界操作可在常温和可操作压力!8*-: F’"条件下进行%加之无毒%化学稳定性高%价格低廉%是最常用的超临界流体萃取剂&

超临界萃取技术具有低能耗’无污染和适于分离易受热分解的高沸点物质等优越性%自-:世纪6:年代以来取得了长足的进步%已得到工业应用%如维生素’甾类’抗生素’生物碱’香料’油脂等医药’食品和化妆品原料的生产&超临界萃取可用于产物的精制%除提取有效成分外%还可用于去除抗生素等医药产品中的杂质和有机溶剂等&但所用高压设备的价格高%制造周期长%投资大%更换产品时清洗困难%限制了它的大规模应用&

!三"膜分离法膜分离是利用物质通过膜的传递速度不同而进行分离的过程&膜的传递机制

十分复杂%涉及的推动力有浓度差’压力差’电位差和温度差等&不同膜分离过程

-8- 发酵工程

的工作原理和操作方式各有不同%重要的膜分离方法如表2:I6所示&生物分离过程中最常用的膜分离技术有微滤’超滤和反渗透&

表!+"’!生物分离常用的膜分离方法

类!型 传质推动力 分离原理 应用举例

微滤! _" 压力差!:<:5*:<5 F’" 筛分 除菌%回收菌%分离病毒超滤!Y_" 压力差!:<2*2<: F’"筛分 蛋白质’多肽和多糖的回收和浓缩纳滤!0_" 压力差!2<:*4 F’" 筛分’道南效应 小分子有机物的浓缩%水的软化反渗透!M," 压力差!-<:*2: F’" 筛分 盐’氨基酸’糖的浓缩%淡水制造透析!/Z" 浓度差 筛分 脱盐%除变性剂电渗析!;/" 电位差 荷电’筛分 脱盐%氨基酸和有机酸分离

渗透气化!F\"压力差’温差溶质与膜的亲和作用 有机溶剂与水的分离%共沸物的

分离

2<膜的材料!结构膜分离过程的核心是膜%膜质量的好坏直接关系到膜分离的效果&为实现高

效率的膜分离操作%对膜的要求有(透过速度大%选择性高%非特异性吸附低%机械强度好%不易被微生物侵袭%耐热’可高温灭菌%耐化学试剂%廉价等&这些条件常不能同时满足%但市售的膜品种较多%可根据具体要求选择&

!2"制备膜的材料&可用于制备膜的高分子材料主要有天然高分子材料’合成高分子材料和特殊材料三类&

天然高分子材料%主要是纤维素的衍生物%有醋酸纤维素’硝酸纤维素和再生纤维素等&其中醋酸纤维素膜的透过速度大%截盐能力强%常用做反渗透膜%也可用于微滤膜和超滤膜&缺点是(最高使用温度较低!3:‘"/最适GP 值范围为

3*6%不能超过-*8%使清洗困难/易与氯起作用%使膜的使用寿命缩短/纤维素骨架易受微生物侵袭%不好保存&

合成高分子材料%主要有聚砜’聚丙烯腈’聚酰亚胺’聚酰胺’聚烯类和含氟聚合物等%其中以聚砜最为常用&聚砜膜的优点是(使用温度范围广%通常可达

75‘/GP值范围大%可在GP2*23范围内使用(耐氯能力强%短期清洗时对氯的耐受量可高达-::GG$%长期贮存时为5:GG$/孔径范围宽&缺点是操作压力低%其极限操作压力平板膜为:<7 F’&中空纤维膜为:<27 F’&

特殊材料有电解质复合物’b#,-0聚丙烯酸’b#,-0碳等&另外值得一提的还有无机材料%如陶瓷’微孔玻璃’不锈钢和碳素等%这些材料机械强度高’耐高温’耐化学试剂及有机溶剂%且通透量大%便于清洗%但这类膜加工困难%造价也高%常用于一些对膜有特殊要求的领域&

38-第十章!发酵工程产物的获取

在实际应用中%目前以纤维素膜和聚砜膜使用最广&!-"膜的结构&膜的结构因其制造工艺和材料的不同而有所不同&目前使用

的多为不对称膜&所谓不对称膜是指其在厚度方向具有不对称结构!图2:I23"%由表面活性层和支撑层两层组成(表面活性层薄而致密%起膜分离作用%决定了膜的选择透过性/支撑层厚而孔径较大%对表面活性层有支撑作用%而对透过流体则阻力很小%这样既可加大膜的机械强度%又可减少膜的堵塞&不对称膜的孔径小%透过量大%膜孔不易堵塞%易于清洗&

图!+"!$!醋酸纤维素膜横截面示意图!参考严希康<生化分离工程<-::2"

-<膜的性能和参数!2"孔道特征&包括孔径’孔径分布和孔隙度&孔径分布指膜中一定大小的孔

的体积占整个孔体积的百分数%孔径分布窄的膜比宽的膜要好&孔隙度指整个膜中孔所占的体积百分数&

!-"水通量&单位时间内通过单位膜面积的水流量%也叫透水率%即水透过膜的速率&水通量的大小取决于膜的物理特性!如厚度’化学成分’孔隙度"和系统的条件!如温度’膜两侧的压力差’接触膜的溶液的盐浓度及料液平行通过膜表面的速度"&在实际使用中%水通量将很快降低%在处理蛋白质溶液时%水通量通常为纯水的2:R%水通量决定于膜表面状态%在使用时%溶质分子会沉积在膜面上&

截留率和截断分子量(截留率指对一定相对分子质量的物质%膜能截留的程度%定义为(

48- 发酵工程

!!&U2[.G0.J

式中(.G)某一瞬间透过液的浓度%C$)K0$3/.J)截留液浓度%C$)K0$3&如&U2%则.GU:%表示溶质全部被截留/如7U:%则.GU.J%表示溶质能自由

透过膜&用已知相对分子质量的各种物质进行试验%测定其截留率%得到的截留率与相

对分子质量之间的关系称为截断曲线&如图2:I24所示&较好的膜应该有陡直的截断曲线%可使不同相对分子质量的溶质完全分离/相反%斜坦的截断曲线会导致分离不完全&

图!+"!%!截断曲线

截断分子量! Q+,"指相当于一定截留率!通常为9:R或95R"的相对分子质量&显然%截留率越高%截断分子量的范围越窄的膜越好&截留率不仅与溶质分子的大小有关%还受如下因素的影响(

!分子的形状(线性分子的截留率低于球形分子&

"吸附作用(膜对溶质的吸附对截留率有很大的影响%溶质分子吸附在孔道壁上%会降低孔道的有效直径%因而使截留率增大&在极端的情况下%膜面上的吸附层形成可逆的致密层%其截留率不同于超滤膜的截留率&

#其他高分子溶质的影响(如料液中同时有两种高分子溶质存在%其截留率不同于单独存在的截留率%特别是对于较小的一种高分子溶质&这是由于高分子溶质形成的浓差极化层的影响&一般说来%两种高分子溶质要相互分离%其相对分子质量须相差2<:倍以上&

$其他因素(温度升高’浓度降低会使截留率降低%这是由于吸附作用减小的

58-第十章!发酵工程产物的获取

缘故/错流速度增大使截留率降低%这是由于浓差极化作用减小的缘故/GP值’离子强度会影响蛋白质分子的构象和形状%因而也对截留率有影响&另外%膜的性能参数还有抗压能力’GP值适用范围%对热和溶剂的稳定性’毒性等&

3<膜分离过程机理在膜分离过程中%通过膜相际有三种基本传质形式(!被动传递过程/"促进

传递过程/#主动传递过程&物质通过膜的分离过程较为复杂&不同物理’化学性质!如粒度大小’分子量’

溶解情况等"和传递属性!如扩散系数"的分离物质%对于各种不同的膜!如多孔型’非多孔型"其渗透情况不同%机理各异%因此%建立在不同传质机理基础上的传递模型也有多种%在应用上各有其局限性%不论哪类模型都涉及物质在膜中的传递性质&

多孔膜的分离机理主要是筛分作用%非多孔膜的分离机理一般是溶解I扩散作用&前者主要用于超滤’微滤’渗析等%后者主要用于反渗透’气体分离’渗透蒸发等&有机物的反渗透过程可用优先吸附I毛细管流动模型来解释&液膜分离机理是溶解I扩散与促进传递&

4<膜的污染与清洗膜分离过程中的最大问题是膜的污染&污染造成膜的通透量下降%影响目的

产物的回收&一般认为%污染的原因是膜与料液中某一溶质的相互作用%和吸附在膜上的溶质与其他溶质的相互作用&污染必须通过清洗才能消除&经清洗后%如膜的水通量达到或接近原指标则可视为污染已经消除&

减轻污染的方法%一是对料液进行预处理&如先让料液经过预过滤器%将较大颗粒去除后再进行膜分离%这对中空纤维和螺旋卷式的超滤器尤为重要&又如调节GP值使蛋白质远离等电点以减少吸附%用;/S1络合+’-a以防沉淀等&二是制膜时改变膜的表面极性和电荷%如聚砜膜用大豆卵磷脂的酒精溶液预处理%醋酸纤维素膜用阳离子表面活性剂处理%可减轻污染&

为保证膜分离操作稳定高效%必须对膜进行定期的清洗&清洗的方法随膜系统而异%可用物理方法亦可用化学方法&物理方法有加海绵球’增大流速’逆洗!对中空纤维超滤器"’脉冲流动’超声处理等&化学清洗一般选用水’盐溶液’稀酸’稀碱’表面活性剂’络合剂’氧化剂和酶溶液等为清洗剂&可根据膜和污染的性质进行选择%以既清洗污染而又不损害膜的性能为宜&

此外%许多生化物质特别是生化药物需要在无菌条件下进行操作%故必须对膜及滤器实行无菌处理&有的膜及滤器可用高温灭菌%但有的不耐高温%则可用化学法灭菌%常用的消毒剂有7:R乙醇’5R甲醛和-:R环氧乙烷等%许多超滤设备还有配套的清洁剂和消毒剂供使用&

68- 发酵工程

5<膜分离技术的应用在膜分离过程中%被分离物质不发生相变’分配系数较大%操作条件温和%所用

设备简单’维修费用低%易于自动化&因此%膜分离技术备受重视%自-:世纪6:年代不对称膜制造技术获得突破以来发展迅速%现已广泛应用于医药’食品工业及水处理等领域&在微生物工程中的应用主要有(!菌体’细胞的分离和收集/"小分子产物的纯化%如抗生素’氨基酸’柠檬酸和醋酸等/#大分子产物的纯化%主要是酶制剂等/$纯净水的制备/%纯净水和最终制品的除菌和除热源/&作膜反应器中的分离部件等&

!四"离子交换法离子交换法!()%"eB>’%."G#)B"EE"又称为树脂法%系利用合成的离子交换树

脂作为吸附剂%将产物从发酵液中吸附在树脂上%然后在适宜的条件下洗脱下来%达到分离’浓缩’提纯的目的&在发酵工程中%离子交换法广泛用于水的处理和小分子产物如抗生素’氨基酸’有机酸等的提取&

2<离子交换法的基本原理离子交换法的基本原理主要包括两方面(一是在一定条件下离子交换反应的

方向和限度%这就是离子交换平衡问题%即离子交换热力学/二是离子交换反应的历程和达到平衡的时间%这就是离子交换速率问题%即离子交换动力学&

离子交换平衡(离子交换反应是可逆反应%这种可逆反应在固态的树脂和水溶液接触的界面间发生%在水溶液中离子交换树脂中固定不变的骨架上的功能基团能离解出可交换的离子Ja%它在较大范围内可以自由移动并能扩散到溶液中%同时%溶液中的同类型离子1a也能扩散到整个树脂结构内部%这两种离子之间的浓度差推动着它们之间的交换&浓度差越大%交换速度就越快&当这种交换反应进行到一定程度时%就建立了离子交换平衡状态%结果离子交换树脂上和溶液中都同时含有1a和Ja两种离子&

最简单的描述离子交换平衡的理论是用类似于化学反应或类似于膜排斥现象

来解释的&即把离子交换看作是简单的化学反应%可用基本的质量作用定律来描述离子在树脂相与溶液相之间的分配&

离子交换速率(离子交换反应在动态下进行%因此%离子交换的效果除受离子浓度和选择系数的影响外%还受离子从溶液进入到树脂表面和在树脂内部的扩散过程的影响%即离子交换速率的影响&

-<树脂和操作条件的选择!2"树脂的选择&选择合适的树脂是应用离子交换法分离物质的关键&选择

78-第十章!发酵工程产物的获取

时首先要考虑待分离物质的荷电性质%若在其稳定的GP值下带正电荷%选用阳离子交换剂/带负电荷则选用阴离子交换剂&其次要兼顾吸附和解吸难易情况%一般对强碱性抗生素宜选用弱酸性树脂%因用强酸性树脂解吸困难/弱碱性物质宜选用强酸性树脂%因用弱酸性树脂时弱酸’弱碱生成的盐易水解%不易吸附&同理%强酸性物质宜用弱碱性树脂%弱酸性物质宜用强碱性树脂&对两性物质如蛋白质等%要根据其等电点来选择树脂类型&此外%还要根据待分离物质的分子大小选择合适的交联度%此时要顾及树脂的选择性和机械强度等%原则是在不影响交换容量的条件下%尽量提高交联度&

!-"交换条件的选择&交换条件中最重要的是离子交换时的GP值&合适的

GP值应在待分离物质稳定的范围内%能使待分离物质和树脂离子化&例如赤霉素为弱酸%G,’U3<8%用强碱性树脂提取%选GP7%GP(G,’%使赤霉素形成阴离子%能吸附在强碱性树脂上&

使用前还需将树脂预处理成一定的型式&一般来说%对弱酸’弱碱性树脂%为使树脂能离子化%应处理成钠!0’a"型或氯!+K["型/对强酸’强碱性树脂%各种型式均可%但待分离物质在酸’碱条件下易破坏时%则不宜采用氢!Pa"型或羟!,P["型树脂&对偶极离子应采用氢型树脂&此外%还要注意尽量减少溶液中的竞争性离子&

!3"洗脱条件的选择&洗脱条件与吸附条件正相反&如GP值范围%酸性条件下吸附者应在碱性条件下解吸/碱性条件下吸附者则在酸性条件下解吸&洗脱剂通常都采用缓冲液%将GP值控制在合适范围内&

洗脱前%一般应对吸附有待分离物质的树脂进行洗涤%尽量去除杂质%以利于纯化&洗涤液可用水’稀酸或盐!如铵盐"溶液等&

3<离子交换过程离子交换的操作主要包括以下几个步骤&!2"树脂的预处理和转型%在交换前必须对新的和使用过的树脂进行预处理和

转型&!-"交换%所谓交换是指被交换物质从料液中交换到树脂上的过程%有正交换

和反交换两种方法&!3"洗脱!即解析"%所谓洗脱是指用一定的洗脱剂将被交换物质从树脂上洗脱

下来的过程&

!五"吸附法吸附!’LE)#G&()%"是溶质从液相或气相转移到固相的现象&利用固体吸附的

88- 发酵工程

原理从液体或气体除去有害成分或提取回收有用目标产物的过程称为吸附操作&吸附操作所使用的固体一般为多孔微粒%具有很大的比表面积%称为吸附剂!’LIE)#N"%&"&吸附剂对溶质的吸附作用按吸附作用力区分主要有三类%即物理吸附’化学吸附和离子交换&在发酵工业中%吸附主要用于发酵液除臭’脱色及目标产物的提取’浓缩和粗分等方面&

2<吸附原理固体表面的分子或原子与液体表面分子一样%处于特殊的状态%具有不饱和的

剩余力%即存在着表面力%所以它们能够吸附外界物质%如分子’原子或离子%使这些外界物质在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层%从而降低表面能%使自身达到稳定状态&人们将物质从流体相!气体或液体"浓缩到固体表面的过程称为吸附作用%把在表面上能够发生吸附作用的固体称为吸附剂%被吸附的物质称为吸附物&不同的固体物质的表面自由能不同%所以对其他物质的吸附能力不同%表面自由能越高%吸附能力越强&

吸附作用力也属于范德华力%它是一组分子引力的总称%包括3种力%即定向力’诱导力和色散力&定向力是极性分子之间产生的作用力%是由于极性分子的永久偶极矩产生的分子间的静电引力&分子的极性越大%定向力也越大%它还与热力学温度成反比&诱导力是指极性分子和非极性分子之间的吸引力%极性分子产生的电场作用会诱导非极性分子极化%产生诱导偶极矩%两者之间相互吸引而发生吸附作用%这种力与温度无关&色散力是非极性分子之间的引力%即当分子由于外围电子运动及原子核在零点附近振动%正负电荷中心出现瞬时相对位移时%产生快速变化的瞬时偶极矩%这种瞬时偶极矩还能使外围非极性分子极化%被极化的分子又反过来影响瞬时偶极矩的变化而产生这种色散力&色散力是普遍存在的%与外层电子数有关%随着电子数的增多而增加%并且也不取决于温度&此外还有氢键%这是介于库仑引力和范德华力之间的定向力%比诱导力和色散力都大&

固体物质一般有多孔性和非多孔性两类%非多孔性固体只具有很小的比表面积%可以通过粉碎使其颗粒尺寸变小而增加其比表面积&多孔性固体由于颗粒内微孔的存在而具有很大的比表面积%甚至每克可达数百平方米&非多孔性固体的比表面积仅取决于外表面%而多孔性固体的比表面是由外表面和内表面共同组成&内表面积可比外表面积大数百倍%并且具有较高的吸附势%所以多孔性吸附剂的应用更为广泛&

-<吸附的类型按照吸附剂和吸附物之间作用力的不同%吸附可分为3种类型&!2"物理吸附&吸附剂和吸附物通过分子间引力!范德华力"产生的吸附称为

物理吸附&这是最常见的一种吸附现象%它的特点是吸附不仅限于一些活性中心%

98-第十章!发酵工程产物的获取

而是整个自由界面都起吸附作用&物理吸附是可逆的%被吸附的分子由于热运动会离开固体表面%分子脱离固体

表面的现象称为解吸&由于分子力的普遍存在%一种吸附剂可吸附多种物质%故物理吸附没有严格选择性&物理吸附与吸附剂的表面积’细孔分布和温度等因素有密切关系&

!-"化学吸附&化学吸附是由于吸附剂和吸附物之间电子的转移%发生化学反应而产生%属于库仑力%需要的活化能较高%需在较高的温度下进行&化学吸附的选择性较强%即一种吸附剂只对某种或特定几种物质有吸附作用&因此化学吸附在吸附后较稳定%不易解吸&

!3"交换吸附&吸附剂表面如由极性分子或离子所组成%则它会吸引溶液中带相反电荷的离子而形成双电层%这种吸附称为极性吸附&同时在吸附剂与溶液间发生离子交换%即吸附剂吸附离子后%同时要释放出等摩尔的离子于溶液中&离子的电荷是交换吸附的决定因素%离子所带电荷越多%电荷相同的离子其水化半径越小%它在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力就越强&

-<吸附剂的应用在微生物发酵工程中%活性炭’苯乙烯’二乙烯苯等大网格吸附剂已成功地用

于维生素J’头孢菌素’四环素等的提取&一些不能用离子交换法提取的弱电解质或非离子型物质也可考虑用它来提取&此外%大网格吸附剂还可用于食品工业中糖浆的脱色%及造纸’印染等工业中含酚’氯及硝基化合物废水的处理&

3<常用吸附剂吸附剂按其化学结构可分为两大类(一类是有机吸附剂%如活性炭’淀粉’聚酰

胺’纤维素’大孔树脂等/另一类是无机吸附剂%如白土’氧化铝’硅胶’硅藻土’碳酸钙等&在医药工业生产中常用的吸附剂有活性炭’白土’氧化铝’硅胶’大孔树脂等%其中应用较广的是活性炭及大孔树脂吸附剂&

!2"活性炭&活性炭具有吸附力强’分离效果好’价格低’来源方便等优点&但由于来源不同或制法不同%生产批号不同%吸附力就可能不同%因此很难使其标准化&生产上常因采用不同来源或不同批号的活性炭而得不到重复的结果&另外%由于活性炭色黑质轻%往往易污染环境&依据形状活性炭可以分为(粉末状活性炭’颗粒状活性炭和锦纶I活性炭&

!-"漂白土&抗生素工业应用较多的吸附剂是酸性白土%也叫活性白土&如从链霉素!或金霉素"发酵废液中提取维生素J2-&

!3"氧化铝&活性氧化铝是常用的吸附剂之一%特别适用于亲脂性成分的分离%具有价廉’再生容易’活性易控制’吸附能力强’重演性好等优点&其缺点是有

:9- 发酵工程

时会发生副反应’操作不便’手续烦琐&氧化铝有碱性’中性和酸性之分/碱性氧化铝适用于碱性下稳定的化合物%而酸性氧化铝适用于酸性下稳定的化合物&氧化铝的活性和含水量有很大关系&水分会掩盖活性中心%故含水量愈高%活性愈低&

!4"硅胶&具有多孔性的硅氧烷交链结构%骨架表面具有很多硅醇基团%能吸附很多水分&水分基本以游离状态存在%加热时即能除去&在高温下!5::‘"硅胶的硅醇结构被破坏%失去活性&活化后的硅胶极易吸水而活性下降%一般在使用之前用22:‘再活化:<5*2<:>后使用&硅胶既能吸附极性物质也能吸附非极性物质%可用于氨基酸’脂肪类化合物的分离&

!5"大孔吸附树脂&大孔吸附树脂!$’B#)G)#)DE#"E(%"又称全多孔树脂%是大孔网状聚合物吸附剂%由聚合单体和交联剂’致孔剂’分散剂等添加剂经聚合反应制备而成&聚合物形成后%致孔剂被除去%在树脂中留下了大大小小’形状各异’互相贯通的孔穴&因此大孔树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率%且孔径较大%在2::*2:::%$之间%故称为大孔吸附树脂&

大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体%加入乙烯苯为交联剂%甲苯’二甲苯为致孔剂%它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构&树脂一般为白色的球状颗粒%粒度为-:*6:目%是一类含离子交换基团的交联聚合物%它的理化性质稳定%不溶于酸’碱及有机溶剂%不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响&树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子!吸附质"之间的范德华引力%通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作%使有机化合物根据吸附力及其分子质量大小的不同可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离’纯化’除杂’浓缩等不同目的&

二!发酵产物的纯化

!一"结晶技术结晶!B?#E&’KK(H’&()%"是物质从液态或气态形成晶体的过程%作为精制的一种

重要手段%主要用于抗生素’氨基酸’有机酸等小分子的纯化生产&

2<结晶的过程结晶包括三个过程(首先%形成过饱和溶液/然后是晶核的形成/最后%晶体

生长&

-<结晶的条件溶液达到过饱和是结晶的前提%过饱和是结晶的推动力&在此%我们不对结晶

的动力学做过多的讨论%而是对一般生化药物成分结晶的条件和方法予以关注&!2"浓度&一般情况下%要求结晶液具有较高的浓度%这样有利于溶液中溶质

分子间的相互碰撞聚合%以得到较高的结晶收率&但是浓度过高时%相应杂质的浓

29-第十章!发酵工程产物的获取

度及溶液黏度也增大%反而不利于结晶析出%有时会生成纯度较差的粉末结晶%甚至形成无定形沉淀&因此%应根据工艺和具体情况确定或调整合适的浓度%才能得到较好的晶体&

!-"纯度&各种物质在溶液中均需达到一定的纯度才能析出晶体%杂质分子的存在将影响结晶物质分子的规则排列&一般说来纯度愈高愈容易结晶%结晶母液中目的产物的纯度一般应不低于5:R&有时虽然纯度不高%但通过改变母液的条件!如加入有机溶剂"%也能得到结晶&

!3"GP值&结晶与目的产物在母液中的溶解度是密切相关的%生物分子在其等电点附近时溶解度最低%所以一般将结晶母液的GP值调整到待结晶物质的等电点附近%这样有利于晶体析出&实际上%大分子带有少量净电荷对结晶是有利的%尤其是希望获得较大晶体时&例如5R浓度的溶菌酶溶液%将GP 值调整到

9<5*2:<:范围%在4‘放置过夜便可析出晶体&!4"温度&选择在低温条件下进行结晶%不仅可以降低溶解度%有利于溶质的

过饱和%而且不易使生物活性物质变性失活%还可以抑制细菌的繁殖&如果降温速度快%则结晶粒小%降温慢则结晶粒大&生化制药上通常希望晶体的颗粒小一些%这一方面可以减少晶体内部的杂质含量%同时也减少了需要粉碎而带来的麻烦&但是温度过低不利于溶液的浓缩%且有时会由于黏度大而使结晶变得缓慢%使结晶时间加长&例如制霉菌素的浓缩液在5‘条件下冷却4*6>后%即能结晶完全%析出制霉菌素晶体&

!5"时间&结晶的形成和生长需要一定的时间%如果在合适的条件下%小分子物质在几小时或几分钟内便可析出晶体&对于蛋白质等生物大分子%由于分子量大’立体结构复杂%其结晶的过程比小分子物质要困难得多&微生物制药一般要求在几小时内结晶%不宜过长%防止药效发生改变&

!6"晶种&对于不易结晶的物质!即难以形成晶核"常常需要在结晶母液中加大晶种%以加速结晶%提高晶体的质量&例如%在糜蛋白酶溶液中加入微量糜蛋白酶结晶后%可导致大量结晶形成&有时用玻璃棒摩擦器壁也能促进某些物质晶体析出&需要加大晶种形成结晶的制品%大多数收率不高&

!7"加入不同溶剂结晶&利用抗生素在不同溶剂中的溶解度不同%使抗生素从原来的溶液中析出&如利用巴龙霉素易溶于水而不溶于乙醇的性质%故可在巴龙霉素的浓缩液中加入2:*-:倍体积的95R的乙醇!同时调节GP 值至7<-*7<3"%巴龙霉素硫酸盐便可结晶析出&

在实际生产实践中%某一种药物的结晶过程往往是几种条件的综合应用%并不是靠某一种条件单独进行的&有些生物大分子会因为结晶条件的不同可以形成两

-9- 发酵工程

种以上晶体&

3<结晶的方法结晶的关键是溶液的过饱和度&要获得理想的晶体%就必须制备好合适的过

饱和溶液&在工业生产上应用的结晶方法主要有以下几种(!2"冷却结晶&是指溶液经冷却降温达到过饱和而使产物结晶析出的方法%适

用于溶解度随温度下降而显著减小的物质%如肌苷酸结晶用的就是这种方法&对溶解度随温度升高而显著减小的物质%可采用加温结晶%如红霉素%可将其提取液调GP值至9<8*2:<-%再加温至45*55‘%红霉素碱即结晶析出&

!-"浓缩结晶&是指溶液经减压蒸发达到过饱和而使产物结晶析出的方法%此法适用于溶解度随温度变化不大的物质&如灰黄霉素%将其丙酮萃取液经真空浓缩除去丙酮%即可得到结晶&

!3"化学反应结晶&是指通过加入反应剂或调节GP值%产生新物质并使其浓度超过溶解度而结晶析出的方法&如青霉素醋酸丁酯提取液中加入乙醇I醋酸钾溶液%可生成青霉素钾盐%因其难溶于醋酸丁酯而结晶析出&

!4"盐析结晶&是指通过加入沉淀剂或稀释剂%使溶质的溶解度降低而结晶析出的方法&常用的沉淀剂有固体氯化钠%常用的液体稀释剂有甲醇’乙醇和丙酮等&如普鲁卡因青霉素结晶时%加入适量食盐%使其溶解度降低%可使晶体易于析出&

在生产实践中%常将几种方法结合使用&如方法!2"和!4"并用结晶维生素

J2-(先将维生素J2-水溶液通过氧化铝吸附去除杂质%用5:R丙酮洗下维生素J2-后%加入4倍体积的丙酮%于冰库中放置3L%即可得到维生素J2-的结晶&

4<重结晶利用结晶物质与杂质在不同溶剂中或不同温度下的溶解度不同%将粗制品以适

当溶剂溶解%经脱色等步骤处理后%再以适当的方法将活性物质结晶出来称为重结晶&用于重结晶的溶剂一般应具备下列条件(!2"对抗生素有一定的溶解度%但溶解度不宜过大%当外界条件!如温度’GP

值等"改变时%其溶解度能明显地减小&!-"对色素’降解产物’异构体等杂质具有较好的溶解性&!3"无毒性或极其微弱’沸点较低便于回收利用等&重结晶的溶剂一般有蒸馏

水’丙酮’乙酸乙酯’低级醇和石油醚&

!二"液相层析液相层析是指流动相为液体的层析方法%按固定相不同又可分为两类(固定相

39-第十章!发酵工程产物的获取

为固体的称为液I固层析/固定相为液体的称为液I液层析&如在柱层析过程中%含有不同溶质的溶液从柱床的顶端加入后%持续输入流动相%溶液中的溶质在流动相和固定相之间分配%分配系数大的溶质存留在固定相上的概率大%随流动相移动的速度小%而分配系数小的溶质则相反&经多次差异分配后%可使不同的溶质因移动速度不同而得到分离&

在层析过程中%溶质均随流动相以同一流速移动%并可逆地与固定相相互作用%即溶质在固定相与流动相之间存在着动态平衡分布&在一定温度下%溶质在两液相间的平衡关系也服从分配定律&

液相层析方法有很多种%按溶质分子与固定相的相互作用机制不同%可分吸附层析’分配层析’凝胶过滤’离子交换层析和亲和层析等几大类%表2:I7列出了几种微生物工程中常见的液相层析方法&这些方法备有优缺点%适用于不同的对象和场合%在实际应用中可根据需要进行选择&

表!+"(!常见液相层析方法比较

层析方法 分离原理 适用对象

吸附利用不同组分!溶质"在吸附剂表面吸附和解吸能力的差异进行分离

抗生素’氨基酸’维生素等的分离纯化%及脱色’除热源’去组胺等杂质

离子交换利用溶质所带电荷的不同及溶质与离子交换剂库仑作用力的差异进行分离

离子型化合物或可解离型化合物如氨基酸’多肽’蛋白质’核酸等的分离&样品溶于不同GP值及离子强度的水溶液中

凝胶层析!体积排阻"

利用分子大小及形状的不同所引起的溶质在多孔填料体系中滞留时间的差异进行分离

可溶于有机溶剂或可溶于水溶液中的任何非交联型化合物的分离%生物大分子的分离’脱盐及相对分子质量测定

正相利用溶质极性不同而产生的在吸附剂上吸附性强弱的差异进行分离

中’弱至非极性化合物如脂溶性维生素’甾体化合物’中药组分等的分离&样品溶于有机溶剂中

反相利用溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异进行分离

大多数有机化合物%生物大’小分子加多肽’蛋白质’核酸’多糖等的分离&样品一般溶于水中

疏水作用利用溶质的弱疏水性及疏水性对盐浓度的依赖性而使溶质进行分离

具弱疏水性且其疏水性随盐浓度而改变的水溶性生物大分子的分离

亲和利用溶质与填料上配基之间的弱相互作用力即非成键作用力所导致的分子识别现象进行分离

多肽’蛋白质’核酸’多糖等生物分子及可与生物分子产生亲和相互作用的小分子的分离与分析

手性利用手性化合物与配基之间的识别现象进行分离

手性化合物的拆分与分析

49- 发酵工程

此外%根据固定相形状不同%液相层析可分为柱层析’纸层析和薄层层析三类&对液相柱层析%还可按操作压力大小分类(柱压低于:<5 F’的称为常压液相层析/柱压为:<5*5 F’的称为中压液相层析/柱压在5 F’以上的称为高压液相层析&柱压与载体的颗粒大小有关%载体粒径小%柱压高%分离效能高%故高压液相层析又常被称为高效液相层析&

现代液相层析装置种类繁多%但其基本配置都相同%主要包括贮液器’输液泵’层析柱’检测器’记录仪和分部收集器!图2:I25"%其中前四部分是必需的&贮液器用于放置原料液’淋洗液和洗脱液等&输液泵提供一定流速的稳定液流&层析柱用以装填层析介质%层析介质随层析方法不同而异%是层析分离的核心部分&料液加载于层析柱上端后%在泵压的推动下随流动相进入柱床%与层析介质上的固定相相互作用%进行分离%用检测器检测被分离组分的流出情况%信号可直观地记录于记录仪%并用分部收集器收集所需的组分%完成层析分离的过程&

2<原料及溶液系统/-<输液泵/3<记录仪/4<层析柱/5<检测器/6<分步收集器

图!+"!&!液相层析装置的基本配置!参考李津等<生物制药设备和分离纯化技术<-::4"

液相层析法分离效率高%设备较简单%操作方便%条件温和%在操作过程中生物活性物质不易变性失活%且操作方法和条件多样%适于多种物质的分离%因而在生物分离领域得到了广泛应用&

2<离子交换层析离子交换层析是以离子交换剂为固定相%适宜的缓冲溶液为流动相进行分离

的一种层析方法&离子交换剂装柱’平衡后加样%样品随流动相进入柱床%其中的待分离组分离子与离子交换剂的活性离子进行交换%并结合于功能基团上&选用合适的洗脱液和洗脱方式可将待分离组分置换出来并随洗脱液流出&而且%与离子交换剂结合力小的组分先置换出来%而与离子交换剂结合力强的组分后置换出

59-第十章!发酵工程产物的获取

来%使不同的组分按结合力从小到大得以分离&离子交换层析的基本原理和操作与离子交换法相同%这里不再重复&两者所

用离子交换剂的活性基团类型也相同%其区别主要在于基质的材料等有所不同&离子交换树脂的基质是合成树脂%它们的颗粒大%孔径小%主要用于小分子物质的提取%很少能用于大分子物质&而层析用离子交换剂主要是用来分离生物大分子物质的%因此在基质的材料和制造上要考虑这一特殊需求&

层析用离子交换剂的基质材料主要有纤维素’交联葡聚糖’交联琼脂糖三类&这三者常用于制备常压和中压层析用的离子交换剂&离子交换纤维素具有开放性长链和松散的网状结构%表面积较大%大分子可自由通过%实际交换容量大&它的亲水性好%洗脱条件温和%不易使生物大分子失活%回收率也较高&交联葡聚糖离子交换剂的电荷密度和交换容量高于离子交换纤维素%但其膨胀度受环境GP值及离子强度的影响也较大%从而影响流速&这类交换剂的优点是它还有分子筛作用%使分离效果更好&交联琼脂糖的特点是比交联葡聚糖具有更大的刚性%且理化性质稳定%并有很高的流速性质和分辨能力%交换容量为2::*-5:$;d0.%约是交联葡聚糖的5:倍&由于刚性大%能耐受较高的压力%故交联琼脂糖离子交换剂可用于中压液相层析&

与离子交换树脂相比%层析用离子交换剂的粒度较小%一般在几个微米!高压层析"至几十微米!中压层析"/而孔径较大%可达数十至上百纳米&

现已有许多类型的离子交换剂可供选用%离子交换层析也已成为生物分离的一种常用方法%广泛应用于各种生化物质如蛋白质’多肽’核酸’病毒和多糖等的分离纯化和分析&

-<凝胶层析凝胶层析是以多孔型凝胶填料为固定相%按分子大小对溶液中各组分进行分

离的液相层析方法&按流动相不同%凝胶层析又可分为水相系统和有机相系统两类&前者所用的凝胶是亲水性的%用来分离水溶性大分子物质%称为凝胶过滤层析/后者的凝胶是疏水性的%用来分离脂溶性大分子物质%称为凝胶渗透层析&

凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒%其内部具有立体网状结构%形成很多孔穴&当含有不同大小溶质的料液进入凝胶层析柱后%比凝胶孔径大的溶质分子不能进入孔穴内部%被完全排阻在外%只能在凝胶颗粒间的空隙随流动相向下流动%并首先流出/而小分子溶质则可以完全进入凝胶内部%经历的流程长%流动速度慢%最后流出/而分子大小介于两者之间的溶质在流动中可部分透入凝胶内部%它们流出的时间也介于两者之间%且分子大的溶质先流出%分子小的溶质后流出&从而使各个组分按分子大小从大到小的顺序依次流出%达到分离的目的&

69- 发酵工程

凝胶的种类’型号很多%不同类型的凝胶在性质及分离范围上差别甚大%进行凝胶层析时要根据样品的性质及分离要求选择合适的凝胶%这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素&

一般来讲%选择凝胶首先要根据样品的情况确定合适的分离范围%根据分离范围来选择合适型号的凝胶&凝胶的分级分离范围应包括待分离组分的相对分子质量%但要合适%范围过小会使某些组分得不到分离%范围过大则分辨率低%亦会使分离效果变差&

其次要考虑凝胶粒径的大小&粒径小%分辨率高%但阻力大%流速低%时间长%有时反而会造成严重的扩散%不利于分离&粒径大%流速快%分辨率低%但若条件得当%有时也可以得到满意的结果&在实验室通常多用5:*3::+$粒径!溶胀后的直径"的凝胶&

凝胶层析用的层析柱%其体积和高径比与层析分离效果的关系密切&对于分组分离%柱床体积一般为样品溶液体积的5倍或略高一点%柱的直径与长度比为

2T!5*2:"即可&对于分级分离%则要求柱床体积大于样品体积-5倍以上%甚至多达2::倍%柱的直径与长度比在2T!-5*2::"&柱的长度一般不超过2::B$&为得到高分辨率%可将柱子串联使用&

凝胶柱的装填质量将直接影响分离效果%凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀’无纹路’无气泡&有条件者可用如蓝色葡聚糖I-:::上柱%观察其在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度&如色带狭窄’平整’均匀下降%表明柱中的凝胶装填质量好%可以使用/如色带弥散’歪曲%则需重新装柱&

样品的浓度大一些为好%上样前要除去不溶物&柱子平衡后可上样%加样要尽量快速’均匀&加样量视具体实验要求而定%分级分离时加样体积一般为柱床体积的2R*5R%而分组分离时一般为柱床体积的2:R*-5R&

洗脱液的成分应与膨胀凝胶用的溶液相同&为了防止凝胶可能的吸附作用%洗脱液一般都含有一定浓度的盐&

洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果&洗脱速度取决于多种因素%包括柱长’凝胶种类’颗粒大小等%可通过预试验来选择&流速一般在-*2:B$0>&

凝胶柱装好后可反复使用%毋需特殊处理&但多次使用后%凝胶颗粒会逐步压紧%流速减慢&这时可将凝胶倒出%重新装柱&短期不用时可加入适量的抗菌剂%通常为:<:-R的叠氮化钠%4‘下保存&

3<亲和层析亲和层析是利用生物分子间特异的亲和力而进行分离的一种层析技术&许多生物大分子具有与其结构相对应的特异分子可逆结合的特性%如抗原与

79-第十章!发酵工程产物的获取

抗体’酶与底物或抑制剂’激素与受体等%这种结合往往是特异的而且是可逆的%生物分子间的这种结合能力称为亲和力&亲和层析时%将具有亲和力的分子对中的一种固定在不溶性基质上%利用分子间亲和力的特异性和可逆性而对另一种分子进行分离&被固定在基质上的分子称为配体&配体与基质共价结合%构成亲和层析的固定相%称为亲和吸附剂&例如%分离酶可选择其底物及类似物或竞争性抑制剂为配体%分离抗体可以选择抗原作为配体%并将配体共价结合于适当的不溶性基质上&将制备好的亲和吸附剂装柱%平衡%样品溶液通过时%待分离分子便与配体发生特异性结合%留在固定相上%而其他杂质则不能与配体结合%随流动相流出&然后用适当的洗脱液将待分离分子从配体上洗脱下来%即可得到纯化的物质&

选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析能否取得成功的关键之一%它包括基质和配体的选择’基质的活化’配体与基质的偶联等&

凝胶层析用的凝胶如纤维素交联葡聚糖’琼脂糖’聚丙烯酰胺及多孔玻璃珠等均可作亲和吸附剂的基质%其中琼脂糖凝胶具有非特异性吸附’稳定性好’孔径均匀适当’易活化等优点%能较好地满足上述条件%应用最为广泛&

配体按其与待分离物质的亲和性不同%可分为特异性配体和通用性配体两类&特异性配体是只与一种或少数几种生物大分子结合的配体%如生物素与亲和素’抗原与抗体’酶与其抑制剂’激素与受体等%它们结合都具有很高的特异性&但寻找特异性配体一般比较困难%尤其对于一些性质还不很了解的生物大分子%通常需通过大量实验来寻找合适的特异性配体&通用性配体一般是指特异性不是很强%能与某一类生物大分子结合的配体%如各种凝集素可以结合各种糖蛋白%核酸可以结合M01’结合有M01的蛋白质等&通用性配体的特异性虽然不如特异性配体%但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率&而且%这些配体还具有结构稳定’偶联率高’吸附容量高’易于洗脱’价格便宜等优点%因而得到广泛的应用&

基质一般不能直接与配体连接%偶联前需要先活化&基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理%使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团&不同的基质有不同的活化方法%如琼脂糖可用溴化氰’环氧氯丙烷等活化/聚丙烯酰胺凝胶可通过对甲酚胺基的修饰而活化/多孔玻璃珠的活化通常采用与硅烷化试剂反应%在多孔玻璃上引进氨基%再通过这些氨基引入活性基团&

除活化时直接引入的活化基团外%还可通过对活化基质的进一步处理%得到更多类型的活性基团&这些活性基团可以在较温和的条件下与多种含氨基’羧基’醛基’酮基’烃基’巯基等的配体反应%使配体偶联于基质上&另外%通过碳二亚胺’戊二醛等双功能试剂的作用也可以使配体与基质偶联&通过以上方法%几乎任何一

89- 发酵工程

种配体均可找到适当的方法与基质偶联&亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法&上样时应注意选择适当的

条件%包括上样流速’缓冲液种类’GP值’离子强度’温度等%使待分离物质能充分结合在亲和吸附剂上&上样后%可用平衡缓冲液洗涤%尽量洗去杂质%然后再进行洗脱&

亲和层析的洗脱方法可分为特异性洗脱和非特异性洗脱两种&特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的特异亲和性而

将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来&其优点是特异性强%可进一步消除非特异性吸附的影响%得到较高的分辨率&另外洗脱条件也更为温和%可避免蛋白质等生物大分子变性&

非特异性洗脱是指通过改变洗脱液GP值’离子强度’温度等条件%降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来&若待分离物质与配体的亲和力较弱%一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗%即可在杂质之后将待分离物质洗脱下来%这种方式操作简单’条件温和%不会影响待分离物质的活性&

!三"干燥干燥指采用汽化的方法以除去物料中的水分!或溶剂"的操作过程&物料水

分汽化一般是用加热方法来实现的&在干燥过程中%水分先从物料的内部扩散到表面然后汽化转移至气相中%带走水蒸气的气体称为干燥介质!通常是空气"%干燥介质除带走水蒸气外%还供给水分汽化所需要的热能&干燥的主要目的有(

!提高产物的稳定性/"有利于保存与运输/#使药品达到标准/$便于进一步处理&

工业上被干燥物料的种类繁多%性质各异%适用的干燥方法及设备也有多种%主要有喷雾干燥’气流干燥’沸腾干燥和冷冻干燥等&

2<喷雾干燥喷雾干燥是生物制品生产中最常用的干燥方法之一%它的功能不只是单一的

干燥%还包括造粒’蒸发和固体干燥物分离等一系列过程&喷雾干燥是将液态物料在热风中喷雾成细小液滴%于下落过程中%水分被蒸发

而成粉末状或颗粒状产品的过程&其基本流程如图2:I26所示&原料液由输液泵输送至雾化器%将料液分散成雾滴%雾滴在干燥器中与吹入的热空气直接接触%使雾滴水分蒸发至干%废气经旋风分离器5分离后排出%干燥产品送至旋风分离器1进一步分离%出料为产品&

99-第十章!发酵工程产物的获取

2<供材系统/-%23<过滤器/3<鼓风机/4<加热器/5<空气分布器/6<雾化器/7<干燥器/8<循环风机/9<排风机/2:<旋风分离器1/22<旋风分离器5/2-<碟阀/23<加热系统/

24<气流输送系统/25<空气/26<空气出口/27<产品

图!+"!’!喷雾干燥!带气流输送系统"流程图!参考罗大珍等<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

2<加料斗/-<螺旋加料器/3<空气过滤器/4<风机/5<预热器/6<干燥管/7<旋风分离器/8<废气/9<湿料/

2:<空气/22<干料

图!+"!(!气流干燥装置!参考欧阳平凯等<生物分离

原理及技术<2999"

喷雾干燥形成的雾滴群%比表面积大%干燥时间短!25*3:E%甚至几秒"%生产能力大%产品的颗粒分布’密度’湿含量及色’香’味等可在一定范围内调节&喷雾干燥可以将蒸发’结晶’过滤’粉碎等过程一次完成%且易于实现机械化’自动化%减少粉尘飞扬%故已广泛应用于抗生素’酵母粉和酶制剂等热敏性物料的干燥&目前%已从喷雾干燥发展出喷雾冷却’喷雾萃取和喷雾冷冻等方法%使之更适用于对热敏感的生物制品的分离精制&喷雾干燥的缺点是能耗大%热效率低%节能降耗问题比较突出&

-<气流干燥气流干燥是一种连续’高效’固体流态化的

干燥方法%其工作原理是将加热后的空气通过干燥器%以对流传热的方式%将热量传递给湿物料%湿物料中的水分或溶剂受热汽化%形成的水汽及气体由载热体带出干燥器&其基本流程如图

2:I27所示&物料由加料斗经螺旋加料器送入气流干燥

管的底部&空气由风机收入%通过过滤器滤去杂

::3 发酵工程

质%经预热器加热至一定温度后进入气流干燥管%在干燥管中气流与物料接触%上升的热气流带动物料并流向上%在接触中发生传热传质过程%水分蒸发进入热气流中%使物料得到干燥&已干燥的物料颗粒随热气流进入旋风分离器中%在那里气流与固体颗粒得到分离&

气流干燥的优点是(干燥强度大%干燥时间短%仅需:<5E至几秒%加之是并流操作%特别适用于热敏性物料的干燥&装置简单%占地面积小%易于建造和维修%生产能力大%热效率高%且易实现自动化’连续化生产%成本较低&但气流干燥也有系统阻力大’动力消耗较大’易磨损物料等缺点&

3<沸腾干燥沸腾干燥是一种热效率高’适用范围广的干燥方法%主要用来干燥颗粒直径为

3:+$至6$$的粉状和颗粒状的物料&物料由给料器进入干燥器的床面%加热的热空气由干燥器的底部经过布风板与固体物料接触形成沸腾状态%达到气I固相的热质交换&此种气I固传热效果好%热效率很高&物料干燥后由出料口排出%废气由沸腾床顶部经除尘器分离%带出产品后排空&沸腾干燥器形式多样%其中以卧式沸腾干燥器应用较多&

与喷雾干燥和气流干燥不同%物料在沸腾干燥器内的停留时间较长%容易引起物料破坏%因此不适于热敏性物质的干燥&

4<冷冻干燥冷冻干燥是指将被干燥液体冷冻成固体%在低温低压条件下利用水的升华性

能%使冰直接升华成汽后除去而达到干燥目的的一种干燥方法&冷冻干燥要求高真空度及低温%适用于易受热分解的药物&冷冻干燥的成品呈疏松状%易溶解%一些生物制品如血浆’抗生素’疫苗’蛋白类药物以及一些需以稳定的固体保存而临用前溶解的注射制剂多用此法制备&

冷冻干燥过程一般分三步进行%即预冻结’升华干燥和解吸干燥&为利于干燥%一般将冻干产品溶液配制成含4R*25R固体物质的稀溶液%先进行预冻%将溶液中的自由水固化%赋予干后产品与干燥前有相同的形态%防止抽空干燥时起气泡’浓缩’收缩等不可逆变化的产生%减少因温度下降引起的物质可溶性降低&将预冻后的产品置于密闭的真空容器中%并适度加热将产品温度维持在共熔点以下%使冰晶升华成水蒸气逸出而使产品脱水干燥&通过该步升华干燥可除去约9:R的水分%在干燥物品的毛细管壁和极性基团上还吸附有一些水分&为进一步除去这些水分%需接着将温度升至产品可以承受的温度进行解吸干燥&此时%为使解吸出来的水蒸气有足够的推动力逸出产品%必须使产品内外形成较大的蒸汽压差%故此阶段箱内必须是高真空&经过冻干后产品内残余水分一般在:<5R*4R&

2:3第十章!发酵工程产物的获取

冷冻干燥法具有保持产品成分稳定’抑制微生物生长和酶的降解’使之能长期保存等优点%非常适合于热敏性和黏稠性生物物质的干燥%是制备生物制品的常规方法&

思 考 题

2<简述发酵液预处理的目的和方法&

-<说明发酵液相对纯化和固液分离工程要点’方法和设备&

3<蒸发分为几类1 请写出蒸发的基本流程并说明各种蒸发操作的方法&

4<结晶过程分为哪几个阶段1 各阶段的特征是什么1

5<结晶的首要条件是什么1 制备过饱和溶液一般有哪几种方法1

6<在发酵产物精制过程中%除特殊产品外一般要求制得的晶体粗大而均匀些%请说明理由&

7<过饱和度是结晶的推动力%在实际结晶操作中%过饱和度是越大越好吗1 为什么1

8<在采用加晶种进行结晶的工艺中%如何掌握加晶种的时机1

9<说明气流干燥’沸腾床干燥!流化床干燥"’喷雾干燥!喷雾式或离心式"’冷冻干燥!升华干燥"’真空干燥’红外线干燥和微波干燥的原理’设备和工艺要点&

2:<干燥过程可以怎样降低能耗1

22<在工业生产规模前提下考虑发酵产物后处理过程必须注意并满足什么条件1

2-<简述各种分离纯化技术的工作原理和特点&

-:3 发酵工程

第十一章!发酵工程与新能源开发

能源是发展农业’工业’国防’科学技术和提高人民生活水平的重要基础&煤’石油’天然气是当今世界最重要的三大化石燃料%它们以及从它们中分离出来的各种燃料照亮了我们这个世界%使整个世界变得美丽多姿&然而%这些资源在地球上的蕴藏量是有限的%按照目前这些能源的消耗速度%并考虑人口增长等因素%有人估计石油和天然气不过几十年%煤不过几百年就会消耗完&因此开发利用可再生能源迫在眉睫&发酵工程在沼气’乙醇’生物柴油’氢能等新能源的开发利用方面发挥了重要作用&

第一节!沼气发酵

沼气!N().’E"是指有机物质!如作物秸秆’杂草’人畜粪便’垃圾’污泥及城市生活污水和工业有机废水等有机废弃物"在厌氧环境中%在一定的温度’湿度’酸碱度等条件下%通过种类繁多’数量庞大’功能不同的非产甲烷菌!%)%$"&>’%)."%E"和产甲烷菌!$"&>’%)."%"共同发酵作用产生的一种可燃性气体&沼气产生的过程称为沼气发酵%国际通称厌氧消化&沼气由5:R*8:R+P4’-:R*4:R+,-’

:R*5R0-’小于2R的P-’小于:<4R的,-与:<2R*3RP-Z等气体组成&由于沼气含有少量 P-Z%所以略带臭味&

沼气是一种可再生清洁能源%甲烷作为燃料%获得同等的热量燃烧过程放出的温室气体量最低&每立方米纯甲烷的发热量为34:::=%每立方米沼气的发热量为

-:8::*-36::=%即2$3沼气完全燃烧后%能产生相当于:<7C.无烟煤提供的热量&可用于产业化供气’燃气发电’燃气汽车’火车和转化化工产品等&而以甲烷为主要成分的沼气生产又是消除环境中污染物的清洁过程&其原料来源主要是畜禽养殖场’农林废弃物’垃圾填埋场和工业’生活有机废水&通过沼气生产加工过程%能够最大化地减少温室气体排放%控制臭气的释放%避免粪便流失造成的水资源污染%同时产生可利用的沼气能源和营养丰富的肥料&可以达到改变农村粪便’垃圾任意堆放的状况%减少污染物排放量%保护水源’改善农业生产环境和居民生活水平%减少疾病传播%减少温室气体排放等效果&

一!沼气发酵的机理

厌氧消化过程是一个非常复杂的由多种微生物共同作用的生化过程&不同的学者对其内部机理有着不同的解释&-:世纪3:*6:年代%被普遍接受的是两阶段理论%即将有机物消化过程分为酸性发酵和碱性发酵两个阶段&2979年 ^<F<J#?’%&根据大量事实把甲烷的形成过程分为三阶段&他在二阶段理论的基础上%将第一阶段进一步分为两个阶段(水解I发酵阶段与产氢’产乙酸阶段&从而提出三阶段理论%消化示意图见前第七章第一节&几乎与J#?’%&提出三阶段理论的同时%又有人提出了厌氧消化过程的四菌群学说&实际上%是在上述三阶段理论的基础上%增加了一类细菌)))同型产乙酸菌%其主要功能是可以将产氢产乙酸细菌产生的 P-’+,- 合成为乙酸&但研究表明%实际上这一部分由 P- 和+,- 合成而来的乙酸的量较少%只占厌氧体系中总乙酸量的5R左右&下面主要介绍三阶段理论&

2967年%J#?’%&的研究表明%厌氧过程主要依靠三大主要类群的细菌%即水解产酸细菌’产氢产乙酸细菌和产甲烷细菌的联合作用完成&因而将沼气发酵过程分为三个连续的阶段即水解酸化阶段’产氢与产乙酸阶段’产甲烷阶段&

!一"水解酸化阶段在该阶段%复杂的大分子’不溶性有机物在微生物胞外酶作用下水解成简单的

可溶性小分子有机物%然后这些简单的有机物在产酸菌的作用下经过厌氧发酵和氧化转化成乙酸’丙酸’丁酸等挥发性有机酸和醇类’醛类等&

!二"产氢产乙酸阶段在这一阶段%产氢产乙酸菌把除乙酸’甲酸’甲醇以外的第一阶段产生的中间

产物%如丙酸’丁酸等脂肪酸和醇类等转化成乙酸’P-和+,-等&在水解阶段和产氢产乙酸阶段%因有机酸的形成与积累%GP值可下降到6以

下&伴随着有机酸和含氮化合物的分解%消化液的酸性逐渐减弱%GP值可回升至

6<5*6<8&

!三"产甲烷阶段在该阶段%产甲烷细菌利用乙酸’乙酸盐’P- 和+,- 产生+P4&此过程分别

由生理类型不同的两种产甲烷细菌共同完成%其中一类把P-和+,-转化为甲烷%另一类则通过乙酸或乙酸盐的脱羧途径来产生甲烷&一般认为%在厌氧生物处理

4:3 发酵工程

过程中约有7:R的+P4产自乙酸的分解%其余的则产自 P-和+,-&实际上%在厌氧反应器的运行过程中%厌氧消化的三个阶段同时进行并保持一

定程度的动态平衡&这一动态平衡一旦被外界因素如温度’GP值’,@M!有机负荷"等所破坏%则产甲烷阶段往往出现停滞%其结果将导致低级脂肪酸的积累和厌氧消化进程的异常&

二!影响沼气发酵的主要因素

沼气发酵是由多种微生物参加完成的%它们在沼气池中进行新陈代谢和生长繁殖过程中%需要一定的活动条件%只有人工为其创造适宜生产条件%才能使大量的微生物迅速繁殖%加快沼气池内的有机物分解&另外%控制沼气池内发酵过程的正常运行%也需要一定的条件&因此%只有满足微生物的生长条件和沼气池正常运行条件%才能获得产气率高的效果&

综合起来%人工制取沼气的基本条件是(沼气微生物’发酵原料’发酵浓度’GP值’严格厌氧环境和适宜的温度&这些条件哪一个对沼气细菌不适应%都会使沼气发酵停止&

!一"适宜的温度厌氧消化产沼气发酵过程是一个复杂的生化反应过程%温度是影响沼气发酵

的重要因素&一般认为%产甲烷菌适宜的温度范围为5*6:‘%在35‘和53‘上下可以分别获得较高的消化效率&温度为4:*45‘时%厌氧消化的效率较低&根据产甲烷菌适宜温度条件的不同%厌氧消化可分为常温消化!25*-:‘"’中温消化!3:*35‘"和高温消化!5:*55‘"三种类型&无论是高温消化还是中温消化%其系统中允许的温度波动范围为(k!2<5*-<:"‘&当温度波动超过5‘时%系统即停止产气%并导致有机酸的大量积累而破坏了消化的进行&在中温消化时%由于其温度与人的体温接近%故对寄生虫卵和大肠菌的杀灭率低/而高温消化对它们的杀灭率可达到9:R以上%出水能满足卫生要求&

近年来%国内外就温度对厌氧发酵产沼气的影响开展了大量卓有成效的研究工作&早在-:世纪3:年代%就有人开始研究厌氧微生物和产气条件之间的关系%并发现在厌氧消化过程中%温度对产沼气的影响极其重要&温度主要是通过对厌氧微生物细胞内某些酶的活性的影响而影响微生物的生长速率和微生物对基质的

代谢速率%从而影响到厌氧生物处理工艺中污泥的产量%有机物的去除速率%反应器所能达到的处理负荷/温度还会影响有机物在生化反应中的流向和某些中间产物的形成以及各种物质在水中的溶解度%会影响到沼气的产量和成分等&

5:3第十一章!发酵工程与新能源开发

!二"适当的酸碱度

GP值对于废水的厌氧消化处理极其重要%是甲烷化厌氧消化过程是否正常的标志之一&产酸细菌和产甲烷细菌适应的GP值范围是不同的%与产甲烷细菌相比%产酸细菌对GP值的变化不太敏感%其适宜的GP值范围在4<5*8<:&有的甚至可以在GP值为5<:以下的环境中生长繁殖&而产甲烷细菌对GP值变化的适应性很差%中温产甲烷细菌的最适GP值为6<8*7<-&GP值低于6<3或高于

7<8%甲烷生成过程减弱甚至停止产甲烷&因此%GP值对厌氧消化产甲烷过程的影响主要是对产甲烷菌细菌的限制%通常%厌氧发酵适宜的 GP 值范围在

6<:*8<:%GP 值过高或过低都会抑制厌氧微生物的生理活性%从而限制 +P4的产量&

!三"接种物如果没有沼气细菌作用%沼气池内的有机物本身是不会转变成沼气%所以沼气

发酵启动时要有足够数量含优良沼气菌种的接种物%这是制取沼气的重要条件&在农村含有优良沼气菌种的接种物%普遍存在于粪坑底污泥’下水污泥’沼气

发酵的渣水’沼气污泥’豆制品作坊下水沟中的污泥%这些含有大量沼气发酵细菌的污泥称为接种物&沼气发酵加入接种物的操作过程称为接种%新建沼气池头一次装料%如果不加入足够数量含有沼气细菌的接种物%常常很难产气或产生率不高%甲烷含量低无法燃烧&另外%加入适量的接种物可以避免沼气池发酵初期产酸过多而导致发酵受阻&

!四"足够的发酵原料沼气发酵原料是产生沼气的物质基础%又是沼气发酵细菌赖以生存的营养来

源&因为沼气细菌在沼气池内正常生长繁殖过程中%必须从发酵原料里吸取充足的营养物质%如水分’碳素’氮素’无机盐类和生长素等%用于生命活动%成倍繁殖细菌和产生沼气&

有机物中的碳水化合物如秸秆中的纤维素和淀粉是细菌的碳素营养%有机物中的有机氮如畜粪尿中的含氮物质是细菌的氮素营养&当有机物被细菌分解时%一部分有机物的碳素和氮素被同化成菌体细胞%以及组成其他新生物质%另一部分有机物则被产酸细菌分解为简单有机物%后经甲烷菌的作用产生甲烷&因此%沼气发酵时%原料不仅需要充足而且需要适当搭配&保持一定的碳’氮比例这样才不会因缺碳素或缺氮素营养而影响沼气的产生和细菌正常繁殖&

大量的实验表明%在厌氧处理工艺中%+,/T0TF的比例控制在!-::*

6:3 发酵工程

3::"T5T2为宜%其中碳以+,/计算%氮’磷以元素含量计算&虽然厌氧微生物对0’F的需求相对较少%但由于许多厌氧微生物自身缺乏合成必要的维生素与氨基酸的能力%因而必须进行人为的投加%以提高其酶活力&为了保证厌氧细菌的增殖%有时需要在消化系统中额外补充某些专门的营养%如钾’钠’钙等金属盐是形成细胞或非细胞的金属配合物所必需的/镍’铝’钴’钼等微量元素可提高产甲烷菌酶系统的活性%增加产气量&

!五"严格的厌氧环境沼气发酵中起主要作用的是厌氧分解菌和产甲烷菌&它们怕氧%在空气中暴

露几秒钟就会死亡%就是说空气中的氧气对它们有毒害致死的作用&因此%严格的厌氧环境是沼气发酵的最主要条件之一%我们根据沼气细菌怕空气的特性%采用了树脂和cM+双封闭的池体%水汽封闭性能完全可以达到沼气发酵运行要求/在使用过程中%只要无硬性撞击和特殊性的意外%在较长的时间内不存在漏气问题&

!六"发酵原料浓度沼气池中的料液在发酵过程中需要保持一定的浓度%才能正常产气运行%如果

发酵料液中含水量过少%发酵原料过多%发酵液的浓度过大%产甲烷菌又食用不了那么多%就容易造成有机酸的大量积累%结果使发酵受到阻碍/如果水太多%发酵液的浓度过稀%有机物含量少%产气量就小&所以沼气池发酵液必须保持一定的浓度%根据多年实践农村沼气池一般采用6R*2:R的发酵料液浓度较适宜%在这个范围内%沼气的初始启动浓度要低一些便于启动&夏季和初秋池温高%原料分解快%浓度可适当低一些/冬季’初春池温低’原料分解慢%发酵料液浓度保持在2:R为宜&

!七"有毒物质在厌氧消化系统中%有毒物质的存在会对厌氧消化过程产生抑制和毒害作

用&最常见的有毒物质如Z-[!Z,-[4 ’蛋白质的分解是其主要来源"’0P3’

0Pa4 ’+0[’+K[’有机氯化合物等&如当消化池Z,-[4 浓度过高%会使硫酸盐还

原细菌过度增殖%其还原2份的Z,-[4 时用去8个 Pa%从而使得+P4 的生成减少了两份&当池中0Pa

4 浓度大于25:$.0@时%将出现氨中毒现象&近年来%关于厌氧消化细菌对有毒物驯化去除的相关实验报道较多&在保证毒性有机物以较低的浓度以及缓慢的速度进入反应器的条件下%厌氧微生物可慢慢对其适应并最终将其降解&

7:3第十一章!发酵工程与新能源开发

!八"混合和搅拌通过搅拌可使得各种物质相互混合%以利于微生物充分接触%使反应有效进

行%还能均衡消化池中的GP值%防止局部有机酸积累%也利于沼气的释放&搅拌方式通常有(机械搅拌’水力搅拌和沼气搅拌&

三!沼气生产的工艺流程

一个完整的大中型沼气发酵工程%无论其规模大小%均包括了如下的工艺流程(原料!废水或固体有机物"的收集’预处理’消化器!沼气池"’出料后的处理和沼气的净化与储存等!图22I2"&

图!!"!!沼气发酵的基本工艺流程图!参考周孟津等<沼气实用技术<-::4"

2<原料的收集充足而稳定的原料供应是厌氧消化工艺的基础&原料的收集方式又直接影响

原料的质量&收集到的原料一般要进入调节池储存&因为原料收集时间往往比较集中%而消化器的进料常需花2L内均匀分配&所以%调节池的大小一般要能储存

-4>废物量&在温暖季节%调节池常可兼有酸化作用%这对改善原料性能和加速厌氧消化有好处&

-<原料的预处理原料常混杂有各种杂物%为便于用泵输送及防止发酵过程中出现故障%或为了

减少原料中的悬浮固体含量%有的在进入消化器前还要进行升温或降温等%因而要对原料进行预处理&在预处理时%应将牛粪和猪粪中较长的草’鸡粪中的鸡毛去除&否则极易引起管道堵塞&再配用切割泵进一步切短残留的较长纤维和杂草%可有效地防止管路堵塞&鸡粪中还含有较多贝壳粉和沙砾等%必须沉淀清除%否则会很快大量沉积于消化器底部并且难以排除&乙醇和丙酮I丁醇废醪因加热蒸馏%排出温度高达2::‘%因此需要降温后才能进入消化器%有条件时还可采用各种固液分离机械将固体残渣分出用作饲料%有较好的经济效益&有些高强度的无机酸碱废水在进料前还应进行中和%最好采用酸性和碱性废水混合处理%如将酸性的味

8:3 发酵工程

精废水和碱性的造纸废水加以混合即可收到良好效果&农业固体废弃物如秸秆等经过揉碎机处理后效果更好&

3<消化器"沼气池#消化器或称沼气池是沼气发酵的核心设备&微生物的繁殖’有机物的分解转

化’沼气的生成都是在消化器里进行的%因此%消化器的结构和运行情况是沼气工程设计的重点&首先要根据发酵原料或处理污水的性质以及发酵条件选择适宜的工艺类型和消化器结构&目前应用较多的%工艺类型及消化器结构有三类&

4<出料的后处理出料的后处理为大型沼气工程所不可缺少的构成部分%过去有些工程未考

虑出料的后处理问题%造成出料的二次污染&出料后处理的方式多种多样%最简便的是直接用作肥料施入土壤或鱼塘%但施用有季节性%不能保证连续的后处理&可靠的方法是将出料进行沉淀后再将沉渣进行固液分离%固体残渣用作肥料或配合适量化肥做成适用于各种花果的复合肥料/清液部分可经曝气池’氧化塘等好氧处理后排放%也可用于灌溉或再回用为生产用水&目前采用的固液分离方式有沙滤式干化槽’卧螺式离心机’水力筛’带式压滤机和螺旋挤压式固液分离机等&

5<沼气的净化!储存和输配沼气发酵时会有水分蒸发进入沼气%由于微生物对蛋白质的分解或硫酸盐的

还原作用也会有一定量 P-Z气体生成并进入沼气&大型沼气工程%特别是用来进行集中供气的工程必须设法脱除沼气中的水和 P-Z&水的冷凝会造成管路堵塞%有时气体流量计中也充满了水%脱水通常采用脱水装置进行&P-Z是一种腐蚀性很强的气体%它可引起管道及仪表的快速腐蚀&P-Z本身及燃烧时生成的Z,- 对人也有毒害作用&沼气中的P-Z含量在2*2-.0$3%蛋白质或硫酸盐含量高的原料%发酵时沼气中的 P-Z含量就较高&硫化氢的脱除通常采用脱硫塔%内装脱硫剂进行脱硫&

沼气的储存通常用浮罩式储气柜%以调节产气和用气的时间差别%以便稳定供应用气&沼气的输配是指将沼气输送分配至各用气户!点"%输送管道通常采用金属管%近年来采用高压聚乙烯塑料管&

四!发酵废物产沼气的实例

吉林省梨树县酒精厂年加工玉米7万&%年产食用酒精-万&%日排放酒精糟液

9::$3&该厂于2993年建成处理酒精槽液的沼气工程%以减轻糟液污染并获得沼气’高蛋白饲料为目的&图22I-为酒精槽液产沼气工艺流程&

9:3第十一章!发酵工程与新能源开发

图!!"#!酒精糟液发酵产沼气工艺流程!参考李艳等<发酵工程原理及技术<-::8"

酒精糟液经过套管换热器冷却后%进行固液分离%湿干糟一部分经烘干处理%获得安全水分的高蛋白饲料%作为商品饲料出售/另一部分就地卖给养猪专业户&分离后的稀糟液一般为6:‘上下%经过调质配料%泵进厌氧消化器&该系统采用高温!54‘"运行%日产沼气近283:$3&沼气供给锅炉助燃和供给职工食堂作炊事燃气&厌氧消化器排出的消化液经沉淀后%流入储气罐作储气的水封液%同时又进行/级厌氧消化%之后经地下管道排入厂区外的氧化塘%进行自然曝气处理&沉淀罐的浓缩液回流到配料罐%供调解进料的GP值&

五!沼气发酵与新农村建设

目前%中国沼气池的推广应用规模居世界首位%国家计划到-:2:年%要达到

-6::万口%年产沼气总计约25:亿$3&-::4年底%我国大中型沼气工程约-:::个%年产沼气5<5V2:9 $3%预计到-:2:年%沼气目标产量达到约2<9V2:2: $3&与此同时%国家加大对农村沼气建设的投资力度%仅-::8年将3:亿元用于建设

--5万户沼气’3万多个农村沼气乡村服务网点和75::多个养殖小区和联户沼气工程&我国结合水体污染控制和治理%重点安排在东部沿海发达地区和内陆大中城市郊区%#三湖三河一库一线!太湖’巢湖’滇池%淮河’海河’辽河%长江三峡库区%南水北调工程沿线"$等重点水域周边地区以及#菜篮子$基地进行大型沼气工程建设%处理工农业有机废水%并获得优质气体燃料&

大力推广沼气能源开发和利用具有重大的生态’经济’社会效益&主要表现在以下几个方面(!解决农村能源问题/"改善生态环境(首先%由于利用生物能源所产生的+,- 可被新生长的植物所固定%所以只要及时植树造林%使生物质的消耗量与生长量持平%从理论上讲%利用生物能将不会导致大气中+,- 的增加%有利于减缓地球气候变暖的趋势&其次%用焚烧’热分解’填埋等物理化学方法处理工农业及民用废弃物%会对大气’地下水造成二次污染%采用生物处理方法%既可以避免和防止污染%又可以获得生物能%可谓一举两得&第三%当今常规能源)))煤和石

:23 发酵工程

油在燃烧后%都会产生对人体有害的+,’氧化氮以及含硫’铅等有毒物质的化合物&而生物能源)))酒精和沼气等在燃烧后不会产生这样多的有毒化合物&#促进农村经济的可持续发展(生物能源的开发利用不仅能够大大加快村镇居民实现能源现代化进程%满足农民富裕后对优质能源的迫切需求%同时也可在乡镇企业等生产领域中得到应用&沼气发酵能增加有机肥料资源%提高质量和增加肥效%从而提高农作物产量%改良土壤/使用沼气%能大量节省秸秆’干草等有机物%以便用来生产牲畜饲料和作为造纸原料及手工业原材料/兴办沼气可以减少乱砍树木和乱铲草皮的现象%保护植被%使农业生产系统逐步向良性循环发展/兴办沼气%有利于净化环境和减少疾病的发生&这是因为在沼气池发酵处理过程中%人畜粪便中的病菌大量死亡%使环境卫生条件得到改善/用沼气煮饭照明%既节约家庭经济开支%又节约家庭主妇的劳作时间%降低劳动强度/使用沼肥%提高农产品质量和品质%增加经济收入%降低农业污染%为无公害农产品生产奠定基础&常用的物质循环利用型生态系统主要有种植业)养殖业)沼气工程三结合’养殖业)渔业)种植业三结合及养殖业)渔业)林业三结合的生态工程等类型&其中种植业)养殖业)沼气工程三结合的物质循环利用型生态工程应用最为普遍%效果最好&

第二节!乙醇发酵

燃料乙醇!!D"K"&>’%)K"是目前应用规模最大的液体生物能源&目前发酵法生产酒精的原料是玉米’甘蔗’薯类等%但仅利用其中的淀粉%其余部分如蛋白质’脂肪’纤维等%限于技术’投资和管理等原因%大多数企业不能很好地利用%相当部分随冲洗水’洗涤水排入企业周围河流%不但浪费了粮食资源%而且严重污染了环境&随着人口的不断增长和社会工业化进程不断加快%粮食’能源和环境问题将变得越来越突出%利用纤维质原料生产乙醇为解决上述问题提供了一条有效的出路&

一!乙醇发酵的机理

酵母菌的乙醇发酵过程!图22I3"包括葡萄糖酵解!; F"和丙酮酸的无氧降解两大生化过程&整个过程可分为4个阶段%共2-步&简而言之%由2$)K葡萄糖生成-$)K丙酮酸/丙酮酸先由脱羧酶脱羧生成乙醛%再由乙醇脱氢酶还原成乙醇&总反应式为(

!!+6P2-,6a-1/Fa-P3F, $..4 -+-P5,Pa-+,-a-1SFa2:<6C=

酒化酶是从葡萄糖到乙醇的一系列生化反应中各种酶及辅酶的总称%这些酶

223第十一章!发酵工程与新能源开发

均为酵母的胞内酶&

图!!"$!酒精的代谢途径

二!乙醇生产的工艺流程

乙醇的生产方法可分为微生物发酵法和化学合成法两大类&其中微生物发酵法最常用%而且简单&

微生物发酵法是指利用淀粉质’糖质或纤维质原料%通过微生物发酵作用生成乙醇的方法%简称发酵法&制得的酒精称为发酵酒精%目前普遍采用酵母菌作为发酵菌&此外亦可用运动发酵单胞菌!O;75758-(752/0/("和乙醇高温厌氧菌!H+4:75-8-4:52-.34:43+-850/.1("作为酒精发酵菌种&根据其原料不同%发酵酒精可分为淀粉质原料酒精’糖质原料酒精’纤维质原料酒精’亚硫酸盐纸浆废液酒精等&这里主要介绍以纤维质为原料生产酒精的方法%其工艺流程如图22I4所示&

图!!"%!纤维质原料制造酒精工艺流程!参考罗大珍等<现代微生物发酵及技术教程<-::6"

!一"纤维质原料的预处理预处理的目的是解除木质素’半纤维素等对纤维素的保护作用和破坏纤维素

-23 发酵工程

的结晶结构%增加其表面积%以提高纤维素水解糖化的效率&纤维素预处理的方法有(物理法’化学法’物理化学法和生物法&

2<物理法常用方法有压缩球磨’爆破粉碎’冷冻粉碎’超微粉碎’高能辐射’微波和超声

波处理等%这些方法均可使纤维素粉化’软化%提高纤维素的酶解转化率&特点是设备成本高%能耗大&处理后的粉末纤维素类物质没有胀润性%且体积

小&将原料粉碎成极细的颗粒%一方面使其表面积大大增加%另一方面破坏其结晶性%以便在随后的糖化阶段中易于反应&

-<化学法化学法是利用酸’碱’氨’氧化剂等溶剂处理&作用机理是使纤维素’半纤维素

和木质素膨胀并破坏其结晶性%使其溶解并降解%从而增加其可消化性&!2"酸水解法&用稀硫酸可以达到较高的反应速率%稀酸预处理有两种基本类

型(高温!26:‘"’连续反应’低固体负荷!5R*2:R"/低温!"26:‘"’间歇反应’高固体负荷!2:R*4:R"&稀酸法费用高%有腐蚀性%对人体有害%需要在耐腐蚀的反应器内进行&反应完成后要对酸进行回收以降低成本&

影响稀酸水解的因素主要有原料粉碎度’液固比’反应温度’时间’酸种类和浓度等&

!-"碱水解法&氢氧化钠或液氨可用于对木质纤维素原料的预处理%效果取决于原料中木质素的含量&碱水解的机理是对分子间交联木聚糖半纤维素和其他组分的酯键皂化&随着酯键的减少%纤维素原料的孔隙率增加&碱处理是一种有效的预处理技术%但对碱处理的废液必须要做进一步的处理%此外碱处理过程中会损失部分纤维素%不太适合大规模生产&

碱预处理的效果取决于原料中木质素的含量&据报道%处理用碱量为每克物料:<2*:<25.时%纤维素的水解率最高&该法的缺点在于处理物料体积密度低%悬浮浓度很低时%搅拌就困难%而且不利于传送&

!3"氨解法&氨解能改善纤维素碱化’羧甲基化和酶降解的反应活性%效果显著%但成本相对较高&通过氨的回收过滤循环工艺可以脱去纤维素原料中6:R*8:R的木质素%使纤维原料的水解效率增加&

!4"氧化法&采用臭氧与 P-,%作氧化剂脱去木质素%不产生对进一步反应起抑制作用的物质%反应在常温常压下进行%但需臭氧量较大%整个过程成本较高&

P-,- 对纤维质的预处理可以增强酶催化水解的敏感度&!5"溶剂法&采用各种有机溶剂对纤维素进行预处理以提高纤维素的水解效

率&如用酒精除去木质素%在28:‘条件下%将木质素溶解在5:R酒精水溶液中

323第十一章!发酵工程与新能源开发

处理2>%分离回收后可得到无定形的粉末&用丙酮纯化处理纤维素%丙酮能渗透到纤维素内部%影响纤维素分子内和分子间氢键的稳定性%导致纤维素立体结构变化%氢键的持久性减弱或破坏&

3<物理化学方法常用的有水蒸气爆破’+,-爆破和氨冷冻爆破等&水蒸气爆破是将纤维素原

料用高温水蒸气处理适当时间!温度越高%时间越短"%然后连同水蒸气一起从反应器中急速放出降压而爆破%使纤维素周围的木质素与半纤维素所构成的结合层遭到破坏%使得纤维素易于被降解利用&此过程中加入Z,-或+,-可以更有效地除去其中的半纤维素%提高酶水解的效率%减少对酒精发酵有抑制作用的物质生成%但增加了水蒸气爆破的成本&+,- 爆破类似于水蒸气爆破%但成本高%基本没有抑制酒精发酵的物质生成&氨冷冻爆破是利用液氨在相对较低压力!2<5 F’左右"和温度!5:*8:‘"下%将纤维素原料处理一定时间%然后突然释放压力爆破原料%使纤维素结构发生变化%可以避免水蒸气爆破中高温引起的糖变性及酒精发酵抑制物的生成%氨冷冻爆破能显著提高纤维素酶水解的效率&

4<生物法降解木质素的微生物有白腐菌’褐腐菌’软腐菌等真菌&研究最多的是白腐

菌%这类菌产生的木素过氧化酶’锰过氧化物酶和漆酶可以降解纤维素原料中的木质素%从而提高纤维素的酶解效率&常用微生物有(@4:/=5:/5=(/((12B4:7/(=5:-’

@5:/501(B4:(/.505:’@;-3+1((34:.5:41(’N574(107-:/1(’)+-84:5.+-434.+:;(5(6=5:/17’)041:531(5(3:4-31(’)50;=5:1("/.+:51(’)05;=5:1(24:0404;’)+042/-:-6"/-3-’9=5:53:/.+17=10B4:1048317 等&此法的优点是成本低%设备简单%作用条件温和%能耗低%无污染/缺点是周期过长以及白腐菌在生长过程中会利用掉部分纤维素和半纤维素&生物法虽然在试验中取得了一定的成功%但还停留在实验阶段&

在实际对纤维素原料进行预处理时%单一的处理方法很难达到预定的效果%往往采用各种不同的组合方法%常见的有先采用机械破碎%然后采用爆破’化学或生物的方法进行处理%可显著提高纤维素的水解效率&

!二"纤维质的水解预处理后的纤维素需经酸或酶水解后%释放出的葡萄糖方可进入酒精发酵

途径&

2<纤维素的水解!2"纤维素的酸水解&用于水解纤维素的酸主要有硫酸和盐酸&酸催化纤维

423 发酵工程

素分解的机理是(酸在水中解离并产生 Pa%Pa与水构成不稳定的水合氢离子

!P3,a"%当纤维素上的"I2%4葡萄糖苷键和P3,a接触时%后者将一个Pa交给"I

2%4葡萄糖苷键上的氧%使得这个氧变成不稳定的4价氧&当氧键断裂时%与水反应生成两个羟基%并重新放出氢离子 Pa&Pa可再次参与催化水解反应&在一定的酸浓度范围内%纤维素水解反应的速度与酸的浓度成正比&温度增加%酸水解反应的速度也加快&纤维素水解时产生的单糖在水解过程中会进一步分解%生成各种糖的分解产物&减少水解过程中单糖的分解是水解工艺要解决的重要问题&酸水解有稀酸水解法和浓酸水解法&稀酸水解要求在高温’高压下进行%反应时间几秒钟或几分钟%在连续生产中应用较多&稀酸水解又有常压水解和加压水解法&后者又可分为固定水解法’分段水解法和渗滤水解法&浓酸水解法相应地要在较低的温度和压力下进行%反应时间比稀酸水解长得多&其主要优点是糖的回收率高%约有9:R的半纤维素和纤维素转化的糖被回收&

!-"纤维素的酶水解&纤维素酶是由3个基本成分组成的酶系统(!内切

"I2%4葡聚糖酶类%也叫 + +分解酶或+e 酶%作用于纤维素分子内部的非结晶区%随机切割"I2%4I葡萄糖苷键%同时生成许多新的分子链末端&"外切"I葡聚糖酶类%也叫微晶纤维素分解酶或+2 酶&此类酶含有两个酶系%即"I2%4I葡聚糖葡萄糖水解酶和"I2%4I葡聚糖纤维二糖水解酶&这两种酶都作用于纤维素分子链的非还原性末端%切割"I2%4键%产物分别是葡萄糖和纤维二糖&#"I2%4I葡萄糖苷酶%也叫+N酶或纤维二糖酶%它能水解纤维二糖和短链寡糖为葡萄糖&

影响纤维素酶水解的因素包括(!底物%即底物的结构和浓度/"纤维素酶%即酶的来源和用量/#水解条件%即GP值’温度’抑制剂和活化剂等&纤维素酶的最适GP4<5*5<5%最适温度4:*6:‘&纤维素酶可由酶促反应的产物和类似底物的某些物质引起竞争性抑制%如纤维二糖%葡萄糖和甲基纤维素通常是纤维素酶的竞争性抑制剂/植物体内的某些酚’单宁和花色素也是其天然的抑制剂/卤化物’重金属’去垢剂和染料等也能使其失活&J’-a’+’-a’+,+K-’+D-a ’ .-a ’ %-a和

b%-a能使纤维素酶活化&在酶作用条件改变后%某些物质可在抑制剂和活化剂之间转换&

纤维素酶生产菌种主要是木霉属!H:/.+5"4:7-(=*"中的里氏木霉!H*:44(6.4/"’曲霉属!<(=4:>/001("和青霉属!)48/./00/17EG<"&产生纤维素酶的细菌有梭菌属!@05(3:/"/17"’纤维单胞菌属!@400105758-("’杆菌属!&-./001("’高温单胞菌属!H+4:757585(=5:-"’瘤胃球菌属!C17A85.5..1("’拟杆菌属!&-.34:/5"4("’欧文菌属!?:Z/8/-"’醋弧菌属!<.435B/2:/5"’小双孢菌属!P/.:52/(=5:-"’链霉菌属!93:4=357;.4("等&纤维单胞菌!@*A/7/"和高温单胞菌!H*A1(.-"是被广泛研

523第十一章!发酵工程与新能源开发

究的两种产生纤维素酶的细菌&-:世纪5:年代%美国M""E"博士从腐烂的纤维材料上分离了大量的菌种&研究发现绿色木霉!H*B/:/"4"分泌胞外纤维素酶的能力最强%由该菌产生的纤维素酶复合体系具有分解天然纤维素所需要的三种组分&为了纪念M""E"的杰出贡献%绿色木霉!H*B/:/"4"被更名为里氏木霉!H*:44(4/"&

纤维素酶的生产可采用液体深层发酵和固态发酵两种工艺&纤维素酶液态发酵是目前大规模生产纤维素酶的主要方法&与其他液态发酵

流程相似%整个发酵过程是在液态的环境中进行的&液态发酵具有所需人工少%适宜大规模生产’易进行污染控制’产品质量好等优点%但也存在能耗大’原料要求高%产品中酶浓度低的缺点&

纤维素酶固态发酵是微生物在没有游离水的固体培养基上生长&采用的主要微生物是霉菌&纤维素酶固态发酵的流程如图22I5所示&

图!!"&!纤维素酶固态发酵的流程!!!!参考马晓建等<燃料乙醇生产与应用技术<-::7"

623 发酵工程

影响固态发酵的因素种类很多%主要有基质’水分’温度’GP 值’通风等因素的影响&该工艺具有培养基简单’固态废料量少’能耗低’投资少’处理的废水量少等优点%但也存在适应微生物种类有限’氧传递难控制’工艺参数测量困难’工作量大’所需人工较多等缺点&

-<半纤维素的水解!2"半纤维素的酸水解&采用:<-R*:<5R稀酸水解使半纤维素降解为单糖

及寡糖%所产生的糖容易进一步转化为糖醛%这是我国糖醛生产的一个主要方法&!-"半纤维素的酶水解&半纤维素酶是一个多酶体系%分为三类(!外切型"I

木聚糖酶%作用于木聚糖的非还原端%产物是木二糖/"内切型"I2%4I木聚糖酶%优先作用于糖键的内部%将半纤维素分解为寡糖/#外切型"I木糖苷酶%作用于短链的木寡糖并产生木糖&在这三类酶中%后两类具有顺序协同作用%并分别受各自产物的抑制&一般认为半纤维素酶是一类诱导酶&嗜热放线菌!H+4:757585(=5:-A-(.-"中的内切型"I2%4I木聚糖酶’外切型"I木糖苷酶’!I!I阿拉伯呋喃糖苷酶和醋酸木聚糖酯酶间有很显著的协同作用&能够产生木聚糖酶的菌种包括细菌’真菌’黑曲霉’木霉等%关键是要选择合适诱导底物和最佳的培养基组成&丝状真菌能分泌胞外木聚糖酶且产酶水平高于酵母和细菌%但其产木聚糖酶的同时也产纤维素酶&

!三"纤维质的发酵过程

2<纤维素的发酵过程!2"发酵纤维素生产酒精的菌种&纤维素原料酒精发酵的菌种可能是酵母%如

9-..+-:57;.4(.4:4B/(/-4’9-..+-:57;.4(.-:/(=4:>48(/(’9-.+-:57;.4((-24’

)/.+/-(3/=/3/(等/霉菌%如N1(-:/175K;(=5:17’’41:5(=5:-.:-((-等/细菌%如

O;75758-(752/0/(等&酵母%特别是9*.4:4B/(/-4%具有酒精得率高’发酵过程不易受污染’耐酒精能力强’副产物少等特点%工业上得到广泛应用&另外%某些嗜热’超嗜热细菌与一些霉菌能直接利用纤维素原料发酵生成酒精受到重视&近年来%采用原生质融合技术与基因工程技术对传统酒精发酵菌种进行改造%为纤维素原料发酵生产酒精提供了新的菌种来源&

!-"工艺方法&纤维素发酵生产酒精的工艺以纤维素类物质为原料生产酒精%工艺方法有直接发酵法’两段发酵法’同时糖化发酵法’固定化细胞发酵法等&

!直接发酵法(选取合适的酒精发酵菌株直接利用纤维素发酵得到酒精%不需要经过酸解或酶解等前处理&该方法设备简单%成本低廉%但酒精产率不高%产生有机酸等副产物&利用混合菌直接发酵可部分解决这些问题&

723第十一章!发酵工程与新能源开发

"两段发酵法(先将预处理后的纤维素原料经酶水解为还原糖%然后发酵得到酒精%酒精产物的形成受末端产物抑制%低细胞浓度及基质抑制等因素的限制&可采用减压发酵法’快速发酵法克服酒精产物的抑制&对细胞进行循环利用%可以克服细胞浓度低的问题&筛选在高糖浓度下存活并能利用高糖的微生物突变株%克服基质抑制&

#同时糖化发酵法(同时糖化发酵法!E($DK’&%")DEE’BB>’#(!"B’&()%’%L!"#$"%&’&()%%ZZ_"是采用+DK!边糖化边发酵!ZZ_"的方法&纤维素酶对纤维素的酶水解和发酵糖化过程在同一装置内连续进行%水解产物葡萄糖由菌体的不断发酵而被利用%消除了葡萄糖对纤维素酶的反馈抑制作用&酶水解一般为5:‘左右%而酒精发酵通常是35‘%解决的办法是筛选耐高温的产酒精酵母%如假丝酵母’克劳森氏酵母等&最新研究表明%从土壤中分离到的,01B4:57;.4(7-:K/-681(0)-8:是一株耐高温的酒精酵母&它在48‘生长很好%45‘培养-4>%能从含2-<7R葡萄糖的蔗渣糖化液生成5<4R的酒精&另一种解决ZZ_工艺中糖化与发酵条件不一致的方法是采用分散’耦合并行系统%使纤维素糖化与酒精发酵分别在两个生物反应器中进行%在两个反应器之间构建循环输送系统%完成葡萄糖从糖化生物反应器到酒精发酵两个步骤的耦合%达到糖化与发酵在互不干扰’各自所需的受控环境中独立’同步进行&实现了纤维素酶解反应与其产物存在分离的耦合&而且反应器中葡萄糖浓度可以通过循环周期及循环浓度进行调控&

ZZ_法可增加水解率%减少糖转化过程中的抑制作用/酶的需求量减少’产率更高/葡萄糖被迅速转化生成酒精%所以对消毒条件要求降低/工序周期更短’使用单反应器%因而反应器的容量更小&ZZ_法的缺点是(水解和发酵两个过程的温度不相容/得到的酒精中含有微生物/酒精对酶具有抑制作用&

$固定化细胞发酵法(’EE’?DC(以肠溶衣聚合物为载体固定化纤维素酶%可保留6:R以上的酶活性%回收率高达2::R&并且对微晶纤维素的水解率明显高于游离酶%经重复使用三次%水解率没有下降&对于固定化细胞的研究%目前研究较多的是9-..+-:57;.4EG<和O;757585(EG<的固定化%常用载体有海藻酸钙’卡拉胶’多孔玻璃等&固定化细胞发酵法的发展方向是混合固定化细胞发酵%如酵母与纤维二糖酶一起固定化%将纤维二糖基质转换成酒精%此法颇引人注目%被看作是纤维素原料生产酒精的重要阶梯&

-<半纤维素的发酵过程

O’#BH"AEC’于2959年第一次提出了用木糖发酵酒精&298:年%Q’%.等人再次提出木糖可被某些微生物发酵成酒精&迄今为止已发现2::多种微生物能代谢木糖发酵生成酒精%包括细菌’真菌’酵母菌&

823 发酵工程

!2"细菌发酵木糖产酒精&细菌转化木糖为5I"I木酮糖!5I"I]D"有三个途径(一是利用木糖异构酶将木糖直接转化为木酮糖%然后再磷酸化生成5I"I]D/二是通过氧化还原反应%首先由需01/P的木糖还原酶将木糖还原成木糖醇%再由需

01/a的木糖醇脱氢酶氧化木糖醇为木酮糖%再磷酸化/三是先将木糖磷酸化为

5I"I木糖%再异构化为5I"I]D&生成5I"I]D%需要透膜酶!G"#$"’E""’木糖异构酶及木糖激酶等%均为诱导酶%诱导物是戊糖类%如#I木糖’阿拉伯糖’核糖等&不同菌可经 P F’;/’; F等不同途径代谢&丝状真菌发酵木糖产酒精真菌中发酵戊糖产生酒精的主要集中在尖镰孢菌!N1(-:/175K;(=5:17"及粗糙脉孢菌!’41:5(=5:-.:-((-"&这类菌的生长及发酵受苯环类物质及木质素的抑制%自身既可产生纤维素酶及半纤维素酶%又具有发酵戊糖和己糖为酒精的能力&丝状真菌的木糖代谢途径与酵母相同&h’HL(等报道了’41:5(=5:-.:-((-87:以商品木聚糖为碳源经液体通气培养%产生的半纤维素酶达24Y0$@!4L"&

!-"酵母发酵木糖产酒精&能够发酵木糖的丝状真菌和酵母基本上都走氧化还原的途径%即(

!!木糖木糖还原酶

$.....01/P木糖醇

木糖脱氢酶

01/$.....a 木酮糖 $...

磷酸化5IFI]D

酵母菌中可发酵木糖的菌株有@-8"/"-EG<’)/.+/-EG<和)-.+;(5048EG<三个属%特点是#半通氧$环境&木糖还原酶需要01/P’木糖醇脱氢酶需要01/a

为辅助因子&在厌氧环境中%01/P没有受氢体!如,-"%不能转化为 01/a%即不能再生%菌株停止发酵%并大量积累木糖醇&如果向培养物中加入丙酮’乙醛或

3I羟基丁酮等受氢体%就可使积累的01/P氧化为01/a%从而恢复酒精的产生&因此%在半好氧的木糖发酵中%氧只是作为受氢体而支持发酵&如通入大量的氧%则产生的酒精很可能被氧化为酸或同化成高分子物质&

!3"基因工程菌发酵木糖产酒精&研究集中在大肠杆菌!?*.50/"’絮凝性细菌!O*752/0/("和酿酒酵母!9*.4:/B/(/-4"上&0(B>)KE将葡萄糖磷酸转移酶!F&Ec"的基因导入到?*.50/中%使之可以同时发酵葡萄糖’木糖’阿拉伯糖的混合糖%酒精产量可达理论值的87R*94R&重组的絮凝性细菌被导入了4种基因%分别为大肠杆菌K;01!e?K’E"(E)$"#’E""’K;0J!e?KDK)C(%’E""’3-01!&#’%EC"&)K’E""’3E3!&#’%EC"&)K’E""%能以木糖为唯一碳源生产酒精%产量可达理论值的86R&鲍晓明等采用 F+M 技术克隆@05(3:/"/173+4:75+;":5(10A1:/.17 木糖异构酶基因

K;01%成功转移至酿酒酵母 P258受体菌中%得到重组酵母转化子 P62-%实现了在酿酒酵母内得到木糖异构酶的活性表达%为进一步在酿酒酵母中建立新的木糖

923第十一章!发酵工程与新能源开发

代谢途径打下了基础&

三!纤维质发酵生产酒精的发展机遇与挑战

随着化石资源逐渐枯竭%油价进一步高涨%这给燃料乙醇带来了一定的发展空间和历史机遇&国家能源供应多元化是国家能源战略一个重要方面%在世界未来的能源结构中%可再生生物能源将是能源利用的主体之一%世界各国日益重视燃料乙醇的开发与应用&

在我国%每生产2&酒精需要-<7&粮食&利用纤维素类物质代替粮食生产酒精是一项利国利民的工程&根据国家*燃料乙醇及车用乙醇#十五$发展专项规划+%我国燃料乙醇产业发展的方向是定位于推动农业产业化’改善国民经济二元结构’保护环境和促进可再生能源利用%并以此为目标逐步建设一个全新的’工艺技术先进’综合利用水平高和具有国际影响力的产业&在国家#十一五$规划中明确表示要加快发展风能’太阳能’生物质能等可再生能源&

利用纤维素生产酒精的纤维素酶成本太高%酶用量偏大%利用纤维素生产酒精工业化仍然面临诸多挑战(

!2"对纤维素原料预处理技术仍没有一种经济’节能’环保的工业化技术可应用%特别是对纤维素原料的综合利用/

!-"降低纤维素酶工业化规模生产的成本仍然有待解决/!3"基因工程技术与原生质融合技术离工业化仍有一段距离&因此%还需加强技术研究力%如(!2"以基因工程手段选育高产纤维素酶’木质素酶菌种/!-"研究固体发酵技术%解决污染率高和成本高的问题/!3"进一步研究纤维质原料的预处理’酶水解及水解液发酵生产酒精等技术%

有效地降低生产成本&纤维质乙醇生产技术发展前景%表现在以下几个方面&

2<原料前景随着纤维质乙醇关键技术的突破及工业化运行成功%-2世纪将更多使用粮食

等农产品以外的生物质来生产燃料乙醇%利用不适宜于种粮食的土地及森林资源%种植适宜的能源植物&此外%大量的发酵工业产生的含纤维素的废水及废渣&

-<生产技术前景由于原料成本降低及生产技术进步等%燃料乙醇的价格在逐步降低&

3<发动机技术前景发展灵活燃料汽车是燃料乙醇应用技术的一个方向&美国’巴西等国已经成

:-3 发酵工程

功开发出既可使用纯汽油或纯乙醇及二者任意比配成混合燃料的汽车!__\"&目前%巴西已使用的__\汽车超过了-::万辆&

第三节!生物制氢

氢能!>?L#)."%"%"#.?"具有清洁’高效’可再生的特点%是未来重要的新能源物质&生物制氢技术利用可再生资源%特别是可利用工农业有机废弃物产氢%效率高%能耗低%污染少%成本低%具有巨大的发展潜力&

广义地讲%生物制氢过程可以分为5类(!利用藻类或者青蓝菌的生物光解水法/"有机化合物的光合细菌!FZJ"光分解法/#有机化合物发酵制氢/$光合细菌和发酵细菌耦合法/%酶法制氢&细菌发酵法无需光照条件’具有更高的产氢效率’更易于实现工业化&而且发酵法产氢可以与废水和固体废弃物处理相结合%利用其中的有机质产氢%既有效地处理了废弃物又获得了氢能%可降低制氢成本&狭义地讲%生物制氢仅指微生物产氢%包括光合细菌!或藻类"产氢和厌氧细菌发酵产氢等&在此只讨论狭义上理解的生物制氢%这也是利用生物制氢的主要研究方向&

一!厌氧发酵制氢的主要微生物

自然环境中能够通过厌氧发酵产氢的细菌种类很多&c#’?等人将所有的产氢微生物分为4类(!专性厌氧的异养微生物%它们不具有细胞色素体系%通过产生丙酮酸或丙酮酸的代谢途径来产氢%包括梭菌属!@053:/"/17"’甲基营养菌!P43+;053:5=+("’产甲烷菌!P43+585>48/.2-.34:/-"’瘤胃细菌!C17482-.34:/-"及一些古细菌!<:.+-4-"等/"兼性厌氧菌%含有细胞色素体系%能够通过分解甲酸的代谢途径产氢%包括大肠杆菌!?(.+4:/.+/-.50/"’肠道细菌!?834:52-.34:"等/

#需氧菌!<4:524("%包括产碱杆菌属!<0.-0/>484("和一些杆状菌!&-./001("等/

$光合作用细菌!)+535(;83+43/.2-.34:/-"&目前发酵法产氢研究较多的有梭状芽孢杆菌属!@05(3:/"/17EG<"%如丁酸梭状杆菌!@05(3:/"/17213;:/.17"和拜氏梭状芽孢杆菌!@05(3:/"/17=-(341:/-817"等/肠道芽孢杆菌属!?834:52-.34:EG<"%如产气肠杆菌!?834:52-.34:-4:5>484("和阴沟肠杆菌!?834:52-.34:.05-.-4"等&

二!厌氧发酵制氢的机理

生物制氢的方法可分为细菌发酵法和光合生物法&利用厌氧发酵进行微生物产氢的方式可分为两种类型(!利用纯菌进行微生物产氢/"利用厌氧活性污泥或其他混合物%以混合培养方式进行产氢&

2-3第十一章!发酵工程与新能源开发

细菌发酵法利用碳水化合物作为能源%并将其转化成氢气%无需光照条件%反应条件温和’能耗低’能妥善解决能源与环境的矛盾%促进经济与环境的协调发展%使氢气成为真正的绿色能源&同时实现产能和除废的双重目的&因此%在生物制氢方法中%细菌发酵制氢法更具有潜力&目前发酵法产氢研究得最多的产氢细菌种类主要包括梭状芽孢杆菌属!@05(3:/"/17"%如丁酸梭状杆菌!@05(3:/"/17213;:/.17"和拜氏梭状芽孢杆菌!@05(3:/"/17=-(341:/-817"等&肠道芽孢杆菌属!?834:52-.34:"%如产气肠杆菌!?834:52-.34:-4:5>484("和阴沟肠杆菌!?834:652-.34:.05-.-4"等&另外还有#4(10A5B/2:/5B10>-:/(%P->-(+-4:-40("48/以及

@/3:52-.34:/834:74"/1(等也有一些相关的产氢方面的研究&此外%近年来混合菌产氢的研究已受到广泛关注%并取得显著成果&

细菌发酵产氢可概括为4种途径(

2<厌氧发酵产氢该类群中以梭菌属!@05(3:5"/17"的产氢研究最为典型&有机物氧化产生的

01/PaPa一般可通过与乙酸’丁酸和乙醇发酵等过程相连而使01/再生%但当01/PaPa的氧化过程慢于形成过程时%为避免01/PaPa的积累%细胞则以释放 P- 的形式保持体内氧化还原的平衡&丙酮酸经丙酮酸I铁氧还蛋白氧化还原酶作用后%当环境中无合适的电子受体时%氢化酶将接受铁氧还蛋白!!"##"IL)e(%%_/"传递的电子%以Pa作最终电子受体而产生分子氢%见图22I6&

2<丙酮酸I铁氧还蛋白氧化还原酶/-<磷酸转乙醚酶/3<乙酸激酶/4<磷酸丁酸酶和丁酸激酶

图!!"’!厌氧细菌产氢途径!参考毛宗强等<氢能)))-2世纪的绿色能源<-::5"

-<通过甲酸裂解途径产氢

?*.50/可厌氧分解甲酸产生 P- 和+,-%该过程由甲酸氢解酶!_P@"系统催化进行&_P@系统含有分解甲酸产氢的甲酸脱氢酶!_/P"和不分解甲酸产 P-的_/P%它可能与不同的厌氧还原酶系统!0,[3 $0,[- %延胡索酸$琥珀酸"相连&

3<葡萄糖产氢甲酸在甲酸氢解酶的作用下分解产生+,-和P-&降解产物除产生P-外%还

--3 发酵工程

有酸’醇和+,- 等!图22I7中的1分支途径"&如果有0,[3 或延胡索酸等合适电子受体时%甲酸也可能通过电子传递链将之还原为0,[- 或琥珀酸%所以在该类群细菌的甲酸产氢过程中%应设法阻断途径6的发生&

4<古细菌产氢古细菌是性质很特殊的细菌类群&它可利用性质完全不同的有机物例如糖

类’肽类’醛类’丙酮酸及!I酮戊二酸等%在2::‘高温条件下进行异养生长并产氢&该菌含有性质独特的氢酶%活性中心含有金属0(具有可溶性%电子供体不是

01/P而是01/FP&丙酮酸的产氢机理%研究表明%丙酮酸在丙酮酸I铁氧还蛋白氧化还原酶参与下%电子从还原性的_L传递给01/F使其被还原为01/FP%硫氢酶在接受来自01/FP的电子的同时将01/FP氧化%而产生分子氢&

2<丙酮酸甲酸裂解酶/-<甲酸氢解酶

图!!"(!兼性厌氧细菌的产氢途径!参考毛宗强等<氢能)))-2世纪的绿色能源<-::5"

三!厌氧发酵制氢的研究实例

目前我国哈尔滨工业大学在该领域的研究卓有成效%处于国际领先地位&在良好运行条件下%生物制氢反应器最高持续产氢能力达到5<7$30!$3.L"&中国农业大学汤桂兰从5种污泥中筛选出最佳天然产氢菌源%采用恒温厌氧发酵工艺%在批式厌氧反应器中%以人工配置的葡萄糖废水作为底物%利用鸡粪堆肥’牛粪堆肥’河底污泥’污水处理厂厌氧污泥’留民营厌氧发酵污泥等作为天然产氢菌源%筛选最佳产氢菌源&研究发现%留民营厌氧发酵污泥的累积产氢量’氢气含量和氢气产量最大%分别达4:3-$@’5:R和3<-3$)KP-0$)K葡萄糖&发酵产氢代谢产物以丁酸和乙酸为主%乙酸的含量占到-2R*-9R%丁酸的含量占到3:R*58R%并含有部分丙酸和乙醇%属于丁酸型发酵%丁酸0乙酸比值最高达到-<29&实验中氧

3-3第十一章!发酵工程与新能源开发

化还原电位随时间迅速降低达到[5::$\左右%以厌氧为主&并用c)$G"#&H模型能够很好地反映其产氢过程和产氢菌生长过程&同时从底物种类’GP 值’温度’底物浓度对产氢的影响探讨最佳产氢工艺&研究结果表明最佳的产氢底物为葡萄糖/GP值是影响厌氧产氢的最重要的一个因子/混合细菌厌氧产氢最佳的

GP值’温度和底物浓度分别为6<:’45‘’5.0@/响应曲面法能够全面地表征温度’GP值和底物浓度对厌氧发酵产氢的综合影响%引入J)eIJ">%C"%的中心组合实验设计原理对厌氧产氢条件进行研究%分别建立了温度’GP值和底物浓度对氢气产量’产氢速度’混合菌系生长速度的二次多项数学模型&通过回归方程和响应曲面%得到了相应的最佳工艺&

Y"%)等人利用制糖厂废水厌氧发酵产氢%以5@厌氧反应器连续运行29:L%控制条件为6:‘%GP6<8%PMS从:<5*3L%分别获得的产氢速率为298$$)K0!@.L"和34$$)K0!@.L"%产气中氢气的含量达到64R%+,- 含量36R%有少量甲烷产生!:<23R"&现已广泛应用固定化细胞技术来产氢&已报道用琼脂’玻璃珠’卡拉胶’聚戊醇’聚氨基甲酸乙酯泡沫’藻酸钙等作载体或包埋剂来固定光合作用细菌产氢&由于发酵产氢条件要求严格%体系复杂%影响因素多%目前大部分研究仍处于实验室阶段%实现发酵产氢的持续性和稳定性%还有相当大的困难%离实际应用还有一段距离&

四!厌氧发酵制氢存在的问题

氢能已成为两次能源危机后各国政府能源政策的支持重点%而生物制氢技术被公认为未来替代能源中最有应用前景的主要技术%成为目前世界能源科学技术领域的研究热点%促进了生物制氢技术的诸多进展&但在研究中发现%该途径存在厌氧细菌在发酵制氢过程中的产氢量和原料利用率均比较低等问题&主要存在以下问题(

!2"目前发酵法产氢技术存在的主要问题是氢气产率低%只有理论氢转化率的

-:R*3:R%而这一转化率只有达到6:R*8:R的情况下才算是一种经济可行的生物产氢技术&此外%经过发酵产氢处理后的污水或固体废弃物还需要相应的后处理才能够不对环境造成二次污染&

!-"从目前有关厌氧发酵细菌产氢的报道来看%大部分研究仅侧重厌氧发酵细菌产氢工艺方面的研究%该方面的研究方法同废水厌氧生物处理的研究类似&大部分工作仅限于产氢反应器的结构以及温度’GP值’底物浓度’水力停留时间等工艺条件的优化等&有关厌氧产氢的理论研究远不够完善%特别有关发酵产氢过程相关的动力学’热力学的研究和理论分析非常缺乏&

4-3 发酵工程

!3"没有对发酵细菌厌氧发酵产氢的液相产物分布作深入和系统的研究%尤其是液相产物和气相产物的分布的关系%以及发酵类型与反应器结构工艺条件的关系&

!4"有关混合细菌产氢中微生物方面的研究比较少%特别是连续生物制氢反应器内部%从接种培养到高效产氢过程中%微生物种群的变化及培养条件对微生物变化的影响&

!5"发酵产氢速度慢&有机废弃物发酵产氢时%由于废弃物自身的原因往往发酵速度缓慢%严重影响了发酵产氢的经济成本%必须设法提高其发酵速度&通常%在利用有机废弃物进行发酵产氢时%固态废弃物应尽量先转化为液态’半固态%然后再进行发酵产氢&固态废弃物转化为液态’半固态的方法通常有溶解’粉碎’水解等&例如%在利用以壳聚糖为主要有机成分的龙虾壳进行发酵产氢时%必须先采用酸’碱预处理将龙虾壳水解再依次经过机械法和化学法预处理’酶水解后%以木质素为主要成分的 (EB’%&>DE才用于发酵产氢&

针对上述技术问题%欲使厌氧发酵产氢技术有所突破%使厌氧产氢技术有较广阔的应用前景%应进一步深入研究如下问题&

!2"无论是纯种还是混菌培养%提高关键菌株产氢效率都是最重要的工作&条件优化手段已不能满足这一要求%需要运用分子生物学的手段对菌种进行改造%以达到高效产氢的目的&

运用代谢工程手段等现代生物技术手段对产氢细菌进行改造的研究目前在生

物制氢领域还没有展开%是很值得深入研究的方向&!-"厌氧产氢技术的工业化应用&厌氧产氢技术研究的最终目的是将其运用

到规模化工业生产中去&如要实施大规模工业化生产%必须研制厌氧产氢控制系统%评估工程投资’运行费用与产氢效率的关系%以及实验室反应器模型放大到工程实践中的偏差&因此%厌氧产氢的工业化应用研究亟待加强&

!3"厌氧发酵产氢数学模式&运用现代数学’生化知识和计算机技术%结合实验数据%可以建立厌氧发酵产氢数学模式%为将来厌氧产氢工业化生产和自控运行提供科学的指导&

!4"发酵副产物的利用和氢气与其他混合气分离工艺的研究&在提高氢气转化率的同时研究其他有用副产品的回收和利用是降低成本’实现工业化生产的有效途径&

五!厌氧发酵制氢的发展机遇与挑战

作为环境友好的洁净能源和高能燃料%氢气在国民经济诸多领域中具有十分

5-3第十一章!发酵工程与新能源开发

重要的用途&可广泛用于航天飞机’火箭等航天工业部门和城市公共交通工具的清洁燃料%世界上一些发达国家已开发出以液氢为燃料的公共汽车/氢气用作保护气体在电子工业和金属高温加工过程中!例如%集成电路%显像管的制备等"也具有广泛的用途&此外%氢气在炼油工业中可用于加氢精制%在有机合成’合成氨工业及食品加工等行业中用途也十分广泛&2994年美国用氢量已达66<2亿$3%日本在2996年用氢量已达2<82亿$3%其中%液氢用量达4:::$3%呈逐年递增趋势&氢能的应用将势不可挡地进入社会生活的各个领域%以氢为燃料的燃料电池将替代靠热机原理工作的发电机%汽车等现代交通工具将从根本上解决尾气的环境污染问题&生物制氢技术作为一种符合可持续发展战略的课题%正在成为各发达国家和发展中国家的短期和长期发展战略目标&氢能源将与人类生产’生活关系越来越密切%发展生物制氢技术势在必行&

同时%随着科学技术的发展和社会的进步%人类对于各种废弃物的态度和认识有了令人瞩目的变化%从消极处理变为积极回收利用%从而把当今世界各国发展所遇到的两个共同难题)))废弃物#过剩$和能源不足有效地协调起来&我国是个农业大国%各种农产品的剩余废弃物长期堆积%再加上一些城市有机废弃物不仅占用了土地%也污染着我们居住的生活环境&利用这类污染物作为底物原料%不仅可以产生氢气%而且%还可以使废弃物不同程度的减量化’资源化%这样就开发出一种行之有效的利用废弃物产生氢气的途径&

从发展趋势上看%采用混合细菌制氢更具有优势%菌群具有很高的产氢能力%可以同纯菌相比&虽然氢气的含量比采用纯菌种%但更易于实现工业化&而且混合菌群来源广泛%除了城市污水处理厂的活性污泥和厌氧消化污泥外%各种土壤里也含有大量的产氢微生物&混合菌系可利用的底物比较广泛%以生产蔗糖’淀粉和果品加工厂等生产过程的废弃物和废水中都可以得到合适的原材料&在未来的生物制氢中存在巨大的潜力%还可以同时实现产能和除废的双重目的&因此%从可再生的有机废水或有机废弃物中利用混合菌系厌氧发酵生产氢气%在生物制能和环境保护领域展现了巨大前景%推动社会主义新农村的建设&

第四节!生物柴油

生物柴油!N()L("E"K"是指以油料作物’野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂’餐饮垃圾油等为原料油通过酯交换工艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料&生物柴油是生物质能的一种%它是生物质利用热裂解等技术得到的一种长链脂肪酸的单烷基酯&生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的

6-3 发酵工程

混合物%这些混合物主要是一些分子质量大的有机物%几乎包括所有种类的含氧有机物%如醚’酯’醛’酮’酚’有机酸’醇等&由于其原料来源等问题%近年来利用发酵法生产生物柴油已成趋势&

一!开发生物柴油的意义

生物柴油指由动植物油脂与短链醇!甲醇或乙醇"进行酯交换反应所制备的脂肪酸单酯&生物柴油是一种无毒’可生物分解’可再生的燃料&生物柴油具有十六烷值高’硫含量及芳香烃含量低%挥发性低和燃油分子中含氧原子等特点%燃烧生物柴油可减少+,’+P4’干碳烟及颗粒排放&生物柴油的+来自大气而非化石燃料所含有的%生产生物柴油所需的能量非常少&用生物柴油发动机Z,-排放量低&生物柴油易生物分解%如果发生泄漏事故%对土壤’河流的污染比化石燃料小得多&

在发达国家和发展中国家纷纷将生物柴油替代石油’柴油列为国家能源可持续发展的重要组成部分%也是-2世纪能源发展战略的基本选择之一&

二!生物柴油生产的工艺流程

!一"工艺流程!2"物理精炼&首先将油脂水化或磷酸处理%除去其中的磷脂’胶质等物质&

再将油脂预热’脱水’脱气进入脱酸塔%维持残压%通入过量蒸汽%在蒸汽温度下%游离酸与蒸汽共同蒸出%经冷凝析出%除去游离脂肪酸以外的净损失%油脂中的游离酸可降到极低量%色素也能被分解%使颜色变浅&各种废动植物油在自主研发的

/h/催化剂作用下%采用酯化’醇解同时反应工艺生成粗脂肪酸甲酯&!-"甲醇预酯化&首先将油脂水化脱胶%用离心机除去磷脂和胶等水化时形成

的絮状物%然后将油脂脱水&原料油脂加入过量甲醇%在酸性催化剂存在下%进行预酯化%使游离酸转变成甲酯&蒸出甲醇水%经分馏后%无游离酸的分出+2-*+26棕榈酸甲酯和+28油酸甲酯&

!3"酯交换反应&经预处理的油脂与甲醇一起%加入少量0’,P做催化剂%在一定温度与常压下进行酯交换反应%即能生成甲酯%采用二步反应%通过一个特殊设计的分离器连续地除去初反应中生成的甘油%使酯交换反应继续进行&

!4"重力沉淀’水洗与分层&!5"甘油的分离与粗制甲酯的获得&!6"水分的脱出’甲醇的释出’催化剂的脱出与精制生物柴油的获得&整个工艺流程实现闭路循环%原料全部综合利用%实现清洁生产&大致描述

如下(

7-3第十一章!发酵工程与新能源开发

!!原料预处理!脱水’脱臭’净化"$反应釜!加醇a催化剂a7:‘"$!!搅拌反应2>$沉淀分离排杂$回收醇$过滤$成品

!二"生产方法生物柴油的生产方法主要有化学法’微生物发酵法’生物酶合成法和工程微藻

法等&这里主要介绍后三种&

2<微生物发酵法微生物油脂是产油微生物利用碳水化合物合成的甘油三酯%其脂肪酸组成和

植物油相近&利用微生物生产油脂具有油脂含量高%生产周期短%生产原料来源广泛%能连续大规模生产等特点&因此%利用微生物转化法获取油脂是一条开发新油脂资源的良好途径&

由于过去微生物油脂常用昂贵的培养基生产%成本比动植物油脂高%所以对微生物油脂的研究主要局限在获取功能性油脂方面%如富含多不饱和脂肪酸的油脂&近年来%随着生物技术的飞速发展使木质纤维素降解技术不断取得突破%为合理利用生物质资源奠定了良好的基础&最近%美国国家可再生能源实验室!0M;@"的报告特别指出微生物油脂发酵可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向&

富含纤维素和半纤维素的秸秆是最有潜力的微生物油脂生产原料&我国每年产秸秆约2:亿&%其中以稻草’玉米秸秆’高粱秸秆’甘蔗渣’棉秆为主&除少量用于造纸’建筑’纺织等行业%或用作粗饲料’薪柴%大部分秸秆未被有效利用而白白烂掉或烧掉%甚至还造成环境污染!例如焚烧"&农作物秸秆的组成一般为(纤维素

32R*4:R%半纤维素35R*48R%木质素25R*-5R&完全水解纤维素可以得到96R*98R的#I葡萄糖%而完全水解半纤维素可以得到木糖%葡萄糖和木糖的含量占所有的组分的7-R*94R%其中葡萄糖和木糖的比例为!-<6*4<7"T2&为了转化可再生植物纤维资源为微生物油脂%其一是充分地将纤维素和半纤维素水解转化为单糖/其二是有效地将水解糖!主要为葡萄糖和木糖"转化为油脂&

酵母菌是最重要的产油脂微生物之一&在以葡萄糖为碳源发酵时%酵母菌菌体油脂含量可达到其干重的34R*74R%而以戊糖为碳源的条件下油脂含量相对较低%因此戊糖转化是决定植物纤维资源生产油脂与生物柴油经济可行的关键因素之一&我们实验室经过多年的不懈努力%初步筛选到一株产油酵母能同时转化葡萄糖’木糖为油脂%菌体含油量超过其干重的5:R&国外学者也曾报道产油微生物转化五碳糖为油脂的例子&和当前乙醇发酵主要利用淀粉类和纤维素水解的六碳糖相比%微生物油脂发酵具有较明显的原材料资源优势%对解决生物质经济公认世界难题之一#全糖转化利用$很有价值&

8-3 发酵工程

-<生物柴油的生物酶合成法!2"脂肪酶在生物柴油生产中的应用&在生物柴油的生产中%脂肪酶是适宜的

生物催化剂%能够催化甘油三酯与短链醇发生酯化反应%生成生物柴油&用于催化合成生物柴油的脂肪酶主要是酵母脂肪酶’根霉脂肪酶’毛霉脂肪酶’猪胰脂肪酶等&近年来%研究者在不断地寻求性能优异的脂肪酶&O’CD.’A’等纯化了酵母

,1:3D7-857;.4(EG<5I22产生的能合成糖脂的胞外脂肪酶%GP 值范围2<9*7<-%GP值低于7<2时%该酶的活性很稳定%优先选择十八碳酰基&

在生物柴油生产中直接使用脂肪酶催化存在的问题有(!脂肪酶在有机溶剂中存在聚集作用%不易分散%催化效率较低/"脂肪酶对短链脂肪醇的转化率较低%且短链醇对酶有一定的毒性%使酶的使用寿命缩短/#脂肪酶的价格昂贵%生产成本较高%限制了在工业规模生产生物柴油中的应用&

!-"固定化脂肪酶在生物柴油生产中的应用&脂肪酶固定化技术在工业规模生产中极具吸引力%因其具有稳定性高%可重复使用%保留酶活性%并有获得超活性的可能%容易从产品中分离&酶的固定化方法很多%其中吸附法制备简单且成本低%被认为是大规模固定化脂肪酶最适宜的方法&诺维信公司已经开发出固定化脂肪酶0)*)H?$435’@(G)H?$"X 等成品&Z’$DC’A’等研究了预处理固定化脂肪酶0)*)H?$"435对生物柴油生产的影响&该酶在经过甲基油酸盐处理

:<5>’豆油处理2->后%油脂醇解的速度明显加快&-::2年日本采用固定化C+/6D5=1(5:;D-4细胞生产生物柴油%转化率在8:R左右%微生物细胞可连续使用

43:>&脂肪酶固定化技术的成功与否是酶法合成生物柴油得以工业化应用的关键&

固定化脂肪酶在许多方面优于游离酶%但是已工业化的实例很少%主要问题之一就是载体%廉价’易于活化和制备的固定化酶的载体很难得到&

!3"全细胞生物催化剂在生物柴油生产中的应用&以全细胞生物催化剂的形式来利用脂肪酶%无需酶的提取纯化%既杜绝了酶活性在此过程中的损失%又节省了设备投资和运行费用&截留在胞内的脂肪酶可看作被固定化&在全细胞生物催化剂的发展中%酵母细胞是有用的工具& ’&ED$)&)等构建了能大量表达米根霉脂肪酶的酿酒酵母 ^S8I2菌株%其胞内脂肪酶的活性达到474<5Y0@&用预先经冻融或风干方法增强了渗透性的酵母细胞来催化大豆油合成脂肪酸甲酯%最后反应液中甲酰质量分数达到72R&不但产生胞内脂肪酶的细胞能用作全细胞生物催化剂%重组后的产胞外脂肪酶的细胞也可以& ’&ED$)&)等构建了一个新的酵母细胞表面%作为_Z蛋白或_@蛋白的细胞壁锚定区&含有一个来自米根霉的先导序列!#F#)M,@"的重组脂肪酶蛋白能与_Z蛋白或_@蛋白相融合%此融合蛋白

9-3第十一章!发酵工程与新能源开发

在一个诱导启动子的控制下表达并分布在新构建的细胞表面&细胞表面的脂肪酶活性达62<3Y0.!细胞干重"&用这种细胞作为全细胞生物催化剂%能成功地催化从甘油三醇和甲醇生产脂肪酸甲酯%反应7->%产率达到78<3R&

-::5年6月4日%*中国环境报+报道(清华大学生物酶法制生物柴油中试成功%采用新工艺在中试装置上生物柴油产率达9:R以上&中试产品技术指标符合美国及德国的生物柴油标准%并满足我国:号优等柴油标准&中试产品经发动机台架对比试验表明%与市售石化柴油相比%采用含-:R生物柴油的混配柴油作燃料%发动机排放尾气中+,’碳氢化合物’烟度等主要有毒成分的浓度显著下降%发动机动力特性等基本不变&

由于利用酶法合成生物柴油具有反应条件温和’醇用量小’无污染物排放等优点%具有环境友好性%因而日益受到人们的重视&但利用生物酶法制备生物柴油目前存在着一些亟待解决的问题(脂肪酶对长链脂肪醇的酯化或转酯化有效%而对短链脂肪醇!如甲醇或乙醇等"转化率低%一般仅为4:R*6:R/甲醇和乙醇对酶有一定的毒性%容易使酶失活/副产物甘油和水难以回收%不但对产物形成一致%而且甘油也对酶有毒性/短链脂肪醇和甘油的存在都影响酶的反应活性及稳定性%使固化酶的使用寿命大大缩短&这些问题是生物酶法工业化生产生物柴油的主要瓶颈&

酶法生产生物柴油主要技术经济指标如下(!2"采用固定床式酶反应器%以植物油及废油等为原料生产生物柴油%转化率

均可达到95R以上%最高转化率可以达到96R&!-"建立了生物柴油精馏装置%分离精制收率高于86R%分离后产品中甲酯含

量大于 97R%分 离 后 产 品 各 项 指 标 完 全 符 合 德 国 生 物 柴 油 生 产 标 准!/X0526:697"&

!3"建立了年产5::&的生物柴油中试生产装置&反应器内固定化酶使用寿命超过-:L&

!4"以地沟油为原料生产生物柴油%成本约为3:58元0&%以普通菜籽油为原料生产生物烧油%成本约为43::元0&&

!5"燃烧性能明显优于:号柴油&在:号柴油中添加-:R生物柴油的燃烧试验表明%燃烧尾气中有毒物质的排放降低35R以上&

3<生物柴油的%工程微藻&法#工程微藻$生产柴油%为柴油生产开辟了一条新的技术途径&美国国家可更

新实验室!0M;@"通过现代生物技术建成#工程微藻$%即硅藻类的一种#工程小环藻$&在实验室条件下可使#工程微藻$中脂质含量增加到6:R以上%户外生产也

:33 发酵工程

可增加到4:R以上%而一般自然状态下微藻的脂质含量为5R*-:R&#工程微藻$中脂质含量的提高主要由于乙酰辅酶1羧化酶!1++"基因在微藻细胞中的高效表达%在控制脂质积累水平方面起到了重要作用&目前%正在研究选择合适的分子载体%使1++基因在细菌’酵母和植物中充分表达%还进一步将修饰的1++基因引入微藻中以获得更高效表达&

利用#工程微藻$生产柴油具有重要经济意义和生态意义%其优越性在于(微藻生产能力高’用海水作为天然培养基可节约农业资源/比陆生植物单产油脂高出几十倍/生产的生物柴油不含硫%燃烧时不排放有毒害气体%排入环境中也可被微生物降解%不污染环境%发展富含油质的微藻或者#工程微藻$是生产生物柴油的一大趋势&

三!我国生物柴油的发展现状和产业化前景

!一"我国生物柴油的发展现状我国政府为解决能源节约’替代和绿色环保问题制定了一些政策和措施%早有

一些学者和专家已致力于生物柴油的研究’倡导工作&我国生物柴油的研究与开发虽起步较晚%但发展速度很快%一部分科研成果已达到国际先进水平&研究内容涉及到油脂植物的分布’选择’培育’遗传改良及其加工工艺和设备&海南正和生物能源公司开发的生物柴油已通过专家鉴定&该开发年产2::::&生物柴油的生产工艺特点是(原料适应性强%可以利用榨油厂的油脚’黄连木等油料树木的果实以及城市餐饮废油为原料/采用自主开发的两段法工艺%提高了反应的效率%保证了产品质量/采用的环流喷射技术’真空分馏技术’固体酸催化剂是该公司在本领域的技术创新&所生产的产品已达到国外同类产品的技术水平&目前各方面的研究都取得了阶段性成果%这无疑将有助于我国生物柴油的进一步研究与开发&可以预计%在-*3年内%我国在该领域的研究将会有突破性进展并达到实用水平&

但是%与国外相比%我国在发展生物柴油方面还有相当大的差距%长期徘徊在初级研究阶段%未能形成生物柴油的产业化(政府尚未针对生物柴油提出一套扶植’优惠和鼓励的政策办法%更没有制定生物柴油统一的标准和实施产业化发展战略&因此%我国进入了 QS,之后%在如何面对经济高速发展和环境保护的双重压力这种背景下%加快高效清洁的生物柴油产业化进程就显得更为迫切了&

!二"我国生物柴油的产业化前景我国是一个石油净进口国%石油储量又很有限%大量进口石油对我国的能源安

全造成威胁&因此%提高油品质量对中国来说就更有现实意义&而生物柴油具有

233第十一章!发酵工程与新能源开发

可再生’清洁和安全三大优势&专家认为%生物柴油对我国农业结构调整’能源安全和生态环境综合治理有十分重大的战略意义&目前%汽车柴油化已成为汽车工业的一个发展方向%据专家预测%到-:2:年%世界柴油需求量将从38R增加到

45R%而柴油的供应量严重不足%这都为油菜制造生物柴油提供了广阔的发展空间&发展生物柴油产业还可促进中国农村和经济社会发展&如发展油料植物生产生物柴油%可以走出一条农林产品向工业品转化的富农强农之路%有利于调整农业结构%增加农民收入&

目前我国生物柴油的开发利用还处于发展初期%要从总体上降低生物柴油成本%使其在我国能源结构转变中发挥更大的作用%只有向基地化和规模化方向发展%实行集约经营%形成产业化%才能走符合中国国情的生物柴油发展之路&随着改革开放的不断深入%在全球经济一体化的进程中%在中国加入 QS,的大好形势下%中国的经济水平将进一步提高%对能源的需求会有增无减%只要把关于生物柴油的研究成果转化为生产力%形成产业化%则其在柴油引擎’柴油发电厂’空调设备和农村燃料等方面的应用是非常广阔的&

思 考 题

2<简述沼气发酵的工艺类型和主要特征&

-<影响沼气发酵的主要因素有哪些1

3<简述沼气发酵的工艺流程&

4<简述乙醇发酵的微生物类型和特点&

5<简述乙醇发酵的机理&

6<简述纤维质原料的乙醇发酵工艺流程&

7<简述厌氧发酵制取氢能的主要微生物’存在的问题’发展机遇及面临的挑战&

8<简述制取生物柴油的意义’机理’方法’发展现状及产业化前景&

9<举例说明发酵废物资源化和生态农业的关系和发展趋势&

-33 发酵工程

第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

环境是人类生存和发展必要条件%自古以来%自然界就依靠动物’植物与微生物之间巧妙的生态平衡%使人类及其他生物得以繁衍生息&但进入-:世纪以来%随着人们生活水平的不断提高和工业化的快速发展%人类活动导致了大量污染物进入周围环境%致使生态平衡遭到破坏%环境质量不断恶化%因此%消除环境污染和保护生态环境已成为当务之急&微生物的生物多样性和特殊功能使其在自然界的物质转化过程中有着不可替代的作用%污染物的微生物处理是环境治理的一个重要手段&

发酵工业快速发展所引起的环境污染问题日益受到人们的重视&发酵工业是以生物反应为主%一般不产生或甚少产生有害气体%主要是工业中产生的废水’废渣对环境造成严重污染&

发酵工业的废渣水可以综合利用生产饲料’肥料等%使之#变废为宝$%也可以通过科学处理%达到#净化环境$的目的&

第一节!有机废水的微生物处理

水体的污染物因稀释’水解’氧化’光分解和微生物作用而具有自净能力%但水体自净有一定限度&当污染负荷超过自净容量时%必须施以人工净化措施%即污水处理&待水质达到一定标准%方可排入天然水体或直接供生产或生活之用&发酵工业所排放的污水的污染程度%需要通过总固体!&)&’KE)K(LE%SZ"’悬浮物!EDEG"%L"LE)K(LE%ZZ"’GP值’生化需氧量!N()B>"$(B’K)e?."%L"$’%L%J,/"’和化学需氧量!B>"$(B’K)e?."%L"$’%L%+,/"等指标来检测&在污水处理中%广泛应用J,/作为有机污染物含量指标&对于难降解的工业废水%为了较好地反映水中有机质量%在测定J,/时可以采取接种相应经过训育的微生物中的办法%或选用+,/’S,/!全需氧量"’S,+!总有机碳量"等其他指标&

依处理过程中氧的状况%污水的生物处理技术可分为好氧处理法与厌氧处理法&

一!好氧处理法

好氧生物处理!’"#)N(B&#"’&$"%&"是指在空气或氧的存在下%由好氧微生物将

主要有机物质氧化分解的过程&在处理过程中%废水中的溶解性有机物质%透过细菌的细胞壁和细胞膜而为细胞所吸收/固体的’胶体的有机物先附着在细菌体外%由细菌所分泌的胞外酶将其分解为溶解性物质%再渗入细胞%通过细胞自身的生命活动)))氧化’还原’合成等过程%把一部分被吸收的有机物质氧化成简单的无机物%并放出细菌生长活动所需的能量%而把另一部分有机物转化为生物体所必需的营养物%组成新的细胞物质%使细胞生长繁殖&采用好氧生物法处理污水%处理周期短%基本上没有臭气%其J,/去除率一般可达8:R*9:R%有时高达95R以上&

好氧生物处理法以微生物生长形式不同分为两种(一种是活性污泥法%另一种是生物膜法&

!一"活性污泥法!/A.-T/.2G;6:G7293BA2;;"活性污泥法是利用含大量需氧性微生物的活性污泥%在强力通气条件下使污

水净化的生物方法&活性污泥法在国内外污水处理技术中占据首要地位%它不仅用于处理生活污水%而且在纺织’印染’炼油’焦化’石油化工’农药’绝缘材料’合成纤维’合成橡胶’电影胶片’洗印’造纸’炸药等许多工业废水处理中%都取得了较好的净化效果&

活性污泥指具有活性的微生物菌胶团或絮状的微生物群体&活性污泥是一种绒絮状小泥粒%它是由需氧菌为主体的微型生物群体%以及有机性或无机性胶体’悬浮物等组成的一种肉眼可见的细粒&它具有很强的吸附和分解有机质的能力&它对GP值有较强的缓冲能力%当静置时%能立即凝聚成较大的绒粒而沉降&

2<活性污泥的生物组成活性污泥的生物组成十分复杂%除了大量细菌外%还有原生动物’霉菌’酵母

菌’单胞藻类’病毒等微生物&也可见后生动物轮虫和线虫&其中主要是细菌和原生动物&

细菌起主导作用%是去除有机污染物的主力军&其中好氧的化能异养细菌最多&活性污泥中优势细菌一般为(动胶杆菌属’大肠杆菌属’无色杆菌属’假单胞杆菌属’产碱杆菌属’芽孢杆菌属’黄杆菌属’棒杆菌属’不动杆菌属’球衣菌属’诺卡氏菌属’短杆菌属’微球菌属’八叠球菌属’螺菌属等&其中以革兰氏阴性细菌为主&

原生动物大约--5种以上%以纤毛虫为主约2:种%主要聚集在活性污泥的表面%需氧性生物%以摄食细菌等固体有机物作为营养&其作用是分泌黏液%促进生物絮凝作用/吞食游离细菌和微小污泥%改善水质/作为污水净化的指示生物%一般认为当曝气池中出现大量钟虫等固型纤毛虫时%说明污水处理运转正常%效果良

433 发酵工程

好%当出现大量鞭毛虫’根足虫等时%说明运转不正常%必须及时采取调节措施&

-<活性污泥的功能!2"吸附&废水与活性污泥在曝气池中充分接触%形成悬浊混合液%废水中的

污染物被比表面积巨大的而且表面上含有糖被的菌胶团吸附和黏附&!-"微生物的代谢&呈胶态的大分子有机物被吸附后%首先在微生物分泌的胞

外酶作用下%分解成小分子的溶解有机物%再被微生物吸收到细胞内%为各种代谢反应所降解%一部分成为细胞组成部分%另一部分则被氧化成为+,-和水等&

!3"凝聚与沉淀&活性污泥的另一特点就是具有絮凝性%在沉淀池中活性污泥能形成大的絮凝体%从而从混合液中沉淀下来%达到泥水分离的目的&

3<活性污泥的主要类型及工艺参数活性污泥法2924年在英国应用以来%随着对其净化机制的广泛深入研究%以

及在生产实践中的不断改进和完善%使其得到迅速发展%相继出现多种工艺流程%应用范围逐渐扩大%处理效果不断提高&活性污泥法已成为城市污水’有机工业废水生物处理的主要方法之一&

!2"传统活性污泥法!B)%*"%&()%’K’B&(*’&"LEKDL."G#)B"EE"&属于连续推进式的处理系统%曝气池一般为长条的矩形池%废水从一端进入%另一端流入沉淀池&在曝气池中活性污泥与废水混合%曝气装置多为鼓风式%在池内通过各种充氧设备均匀地通入空气%见图2-I2&

图!#"!!标准活性污泥法流程图!!!参考杨柳燕等<环境微生物技术<-::3"

优点(J,/5 去除率高%出水水质好&缺点(氧利用率低%曝气时间长%适应水质能力差&!-"完全混合式活性污泥法!B)$GK"&"K?$(e"L’B&(*’&"LEKDL."G#)B"EE"&它

是指废水一进入曝气池!方形或圆形"就迅速与池内已有的混合液充分混匀%曝气池中各处水质基本相同%见图2-I-&适用于水质J,/较高和水质不稳定的废水处理&其特点(微生物处于同一生长期内便于控制/另外%整个池中耗氧速率均匀&

533第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

图!#"#!完全混合活性污泥法流程图!!!参考杨柳燕等<环境微生物技术<-::3"

!3"渐减曝气法!E&"GE"##’&()%G#)B"EE"&它是在推流式的曝气池中%随着水流方向%曝气量逐渐减少%从而使曝气池汇总溶解氧的浓度保持一致%避免传统活性污泥法中进水口溶解氧低而出水口溶解氧高的现象%更有利于微生物的代谢活动%同时降低能耗%见图2-I3&

图!#"$!渐减曝气法流程图!!!参考唐受印等<水处理工程师手册<-::4"

!4"高速活性污泥法!>(.>#’&"’B&(*’&"LEKDL."G#)B"EE"&它是采用高的有机负荷%短的停留时间处理有机废水%出水J,/5 和悬浮物较高%主要用于两段活性污泥法处理废水中的前段处理&

!5"接触氧化稳定法!B)%&’B&E&’N(K(H’&()%G#)B"EE"&适合处理以悬浮物或胶体形式存在的J,/5%他们短时间内被曝气池中活性污泥吸附&吸附了有机物的活性污泥在再生池中进行好氧活化%使吸附的有机物被氧化分解%活性污泥恢复吸附有机物的能力%然后再回流到曝气池中%见图2-I4&

图!#"%!吸附再生法流程图!参考肖锦<城市污水处理及回用技术<-::-"

!6"纯氧活性污泥法!GD#")e?."%’B&(*’&"LEKDL."G#)B"EE"&利用纯氧代替

633 发酵工程

常规的空气进行曝气%大大提高了混合液中溶解氧浓度%从而加速废水处理的过程&运行费用较高%见图2-I5&

图!#"&!纯氧活性污泥法流程图

!7"延时曝气法!"e&"%L"L’"#’&()%G#)B"EE"&其曝气时间特别长%剩余污泥量少%出水的J,/5 和氨氮的浓度低&

!8"膜生物反应器!$"$N#’%"N()#"’B&)#"&是近几年发展起来的%将高效膜分离技术与传统活性污泥法相结合的新型水处理技术&它只改革了泥水分离系统%采用膜过滤取代传统的二沉池和沙滤池%提高了泥水分离效率%出水质量高%无悬浮物%无需消毒%并且由于曝气池中活性污泥浓度增大%提高了生化反应效率&分离膜的污染和堵塞是影响其广泛应用的致命弱点&

!二"生物膜法!1-B0-6>93BA2;;"生物膜法和活性污泥法一样%均属于好气生物处理法&活性污泥法主要依靠

曝气池中悬浮流动的活性污泥来分解有机物%而生物膜法则依靠固着于载体表面的微生物膜来净化有机物&

2<生物膜的结构与功能生物膜是利用微生物群落附着在固体填料表面而形成的生物膜来处理废水的

一种方法&生物膜一般呈蓬松的絮状结构%微孔较多%表面积较大%因此具有很大的吸附作用%也有利于微生物进一步对被吸附的有机物进行分解&当膜增厚到一定程度时%衰老的生物膜会剥落而使生物膜得到更新&生物膜中微生物群落包括病毒’细菌’真菌’藻类’原生动物及蚊蝇等后生动物&同活性污泥相比%生物膜中的微生物种类和数量更加丰富%微生物的生态位更加明显&

生物膜的功能是分解废水中的有机污染物%达到净化水质的目的&首先%能分

733第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

泌糖被的好氧微生物在新的载体表面附着%并生长繁殖%然后丝状菌也附着生长%这时原生动物也开始出现&随着细菌生物量的不断增加%生物膜不断增厚%水体中的溶解氧不能扩散到生物膜内层%兼性厌氧菌和厌氧菌就开始生长繁殖%分解水体扩散进来的有机质和好氧微生物的代谢产物%分解糖被中多糖类物质%产生有机酸等物质%使生物膜附着在载体表面的能力下降%同时加上水力搅拌和其他生物的活动%厚的生物膜脱落&在脱落的地方%又形成新的生物膜&由于脱落的生物膜絮凝和沉降能力较差%因此利用生物膜法处理的出水比较混浊%一般要加化学药剂进行处理%去除水中的悬浮物%常用的方法有絮凝沉淀法和气浮法&

-<生物膜法的主要类型和工艺参数根据所用的设备不同%生物膜法可分为(生物滤池’塔式生物滤池’生物转盘’

生物接触氧化法’生物流化床等&!2"生物转盘!又称浸没式生物滤池"&它是由装配在水平横轴上的’间隔很近

的一系列大圆盘所组成%如图2-I6所示&圆盘的一半浸在污水槽中%一半暴露在空气中%污水在槽里流向与水平横轴垂直%与盘面平行&生物黏附在圆盘表面%厚

-*3$$%圆盘以:<8*3#0$(%速度缓慢转动%生物膜交替接触污水和空气%使污水得到净化&

图!#"’!生物转盘示意图

!-"生物接触氧化法!N()K).(B’KB)%&’B&)e(L’&()%G#)B"EE"&其核心部分是生物接触氧化池%其基本结构由池体’支染’填料和曝气装置等&生物接触氧化池中的填料是固定不动的%生物膜就生长在其表面&填料的形式多种多样%早期填料主要是板状’波纹状和管状%它们由于比表面积小%容易堵塞%现已不再使用&目前较多采用半软性填料%也有采用弹性填料&半软性填料具有比表面积较大%不会堵塞%挂膜容易%运输方便等优点&

!3"生物滤池&污水通过表面布满生物膜的滤料%使之得到净化&空气由自然通风或人工通气提供&生物滤池由普通生物滤池和塔式生物滤池两种&

833 发酵工程

图!#"(!塔式生物滤池!参考周群英等<环境工程

微生物学<-::5"

普通生物滤池是最早出现的一种生物处理方法%其特点是结构简单’管理方便&主要组成部分为(’<滤料层!粹!碎"石’炉渣%厚2<5*-$"/N<配水与布水装置!使污水均匀洒向滤料"/B<排水装置!在滤料底部"&

塔式生物滤池占地少’费用低’净化效果佳&构筑物一般高-:$以上%径高比为2T!6*8"%形似高塔%见图2-I7&通常分几层%设隔栅以承受滤料&滤料(煤渣’炉渣’塑料波纹板’酚醛树脂浸泡过的蜂窝纸’泡沫玻璃块等&通常自然通风&

!4"生物流化床反应器!!KD(L(H"LN"L#"’B&"#"&流化床是一种固体颗粒流态化技术%将此技术应用于污水生物处理%是生物膜挂在运动的颗粒上处理废水%称为流化床生物膜法&其结构主体是塔式或柱式反应器%里面装填一定的载体%微生物在载体上形成生物膜%构成#生物粒子$%反应器底部通入污水与空气%从而形成了气’液’固三相反应系统&当污水流速达到某一定值时%生物粒子可以在反应器内自由行动%此时整个反应器出现流化状态%形成了#流化床$%!图2-I8和图2-I9"&流化床特点(高浓度生物量! @\ZZ"通常为23*-:.0@%高的可达4:.0@%而活性污泥只有-*4.0@%高浓度生物量必然导致高净化率/高比表面积%一般为3:::$-0$3%活性污泥为-:*2::$-0$3%生物转盘5:$-0$3/高传质速率%耐负荷冲击能力强/设备小型化’化工化%占地面积小%易于管理和操作&

图!#")!固液两相生物硫化床流程图 图!#"*!三相生物流化床工艺流程图

933第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

二!厌氧处理法

厌氧处理法!’%’"#)N(B&#"’&$"%&"是在缺氧的条件下%利用厌氧性微生物!兼性微生物"分解污水中有机质的方法%也称厌氧消化!’%’"#)N(BL(."E&()%"或厌氧发酵法&其中最受重视的是沼气发酵%也称甲烷发酵&因为其既可以消除环境污染又可开发生物能源%所以应用广泛&厌氧处理法不仅能处理高浓度的有机废水%而且能处理中低浓度的废水%因此在食品’酿造’有机化工和制糖等工业中得到广泛应用&甲烷细菌常见(甲烷杆菌属’甲烷八叠球菌属和甲烷球菌属&它们在自然界中分布广泛%在厌氧污泥’粪便及动物肠道中经常发现&属自养微生物&厌氧处理主要方法如下&

!一"普通厌氧反应器!72823/6/8/23B1-A32/A.23"也称为普通消化池%是最常用的厌氧消化池%污水’污泥定期或连续加入消化

池%消化后的污泥和污水分别经过消化池底部和上部排出&产生的沼气由顶部排出&为了使污水与微生物充分接触%消化池设搅拌装置%定时搅拌池中物&水力停留时间长!6*3:L"%反应器容积大&

!二"厌氧接触反应器!/8/23B1-AAB8./A.93BA2;;"排出的混合液在沉淀池中分离再回流到反应器中&与普通消化池比%不需要

很长的水力停留时间或很大的反应器容积&有效处理的关键在于污泥的沉淀性能和污泥的分离效率&水力停留时间!2*5L"%适合于J,/5 大于25::$.0@的废水%出水的J,/5 在-::*2:::$.0@%运行温度为常温&

!三"厌氧污泥床反应器!/8/23B1-A;6:G7216/8U2.32/A.B3"其内没有载体%絮状污泥在上升水流和气泡的作用下处于悬浮状态%反应器中

水流均匀分布%避免进水短流&上流式厌氧污泥床反应器!DG!K)A’%’"#)N(BEKDL."NK’%C"&#"’B&)#%Y1ZJ"%是应用最广泛的厌氧反应器之一%已在许多废水处理厂中应用&其有机负荷为25C.!+,/"0!$3.L"%+,/去除率达9:R%最高负荷可达3:*5:C.!+,/"0!$3.L"以上&-:世纪8:年代后期我国开发的垂直折流厌氧污泥床%是在厌氧污泥床反应器中添加垂直分隔板%增加污水与污泥接触机会%施工方便%被广泛应用于处理酿酒’柠檬酸’味精’淀粉’乳品’制糖’豆制品’屠宰等农牧产品加工业废水&

:43 发酵工程

!四"厌氧固定膜反应器!/8/23B1-A0-V2G"0-6>32/A.B3"也称厌氧过滤器%是一种装有固定填料的反应器&在填料表面附着的与填料

截留的大量厌氧微生物作用下%进水中的有机物转化为甲烷和二氧化碳等&根据进水方向将厌氧固定膜反应器分为上流式’下流式和平流式3种&根据填料填充的程度分为全充填型和部分充填型&厌氧固定膜反应器有大量的附着生物膜%微生物停留时间长!可超2::L"不易流失%因此运行管理方便&其有机负荷为3*2:C.!+,/"0!$3.L"%+,/去除率达8:R%特别适用于处理低浓度的溶解性有机废水&缺点(容易发生堵塞%特别是底部%进水悬浮物含量一般不超过

-::$.0@&

!五"厌氧流化床反应器!/8/23B1-A06:-G-P2G12G32/A.23"厌氧流化床反应器是一种填有比表面积很大的惰性载体颗粒的反应器%它的

一部分出水回流%与进水混合后进入池内向上流动%使载体颗粒在整个反应器内分布均匀&其特点是(流体与微颗粒之间接触时间长%液膜扩散阻力小%没有固定床中产生的沟流’堵塞’短路等问题/其生物量大’污泥龄长&对处理有毒物质如苯酚的效果比较好&厌氧流化床反应器的微生物浓度可大于3:.0@%有机负荷一般

5*-:C.!+,/"0!$3.L"%水力停留时间为5*2:>%+,/去除率达8:R*85R&

三!发酵工业废渣水的综合利用技术

发酵工业主要采用粮食加工的原料%如淀粉’葡萄糖’花生饼粉’黄豆饼粉’动植物蛋白以及脂肪等作为培养基营养成分&所有发酵工业从发酵液中提取产品后%提取废液中仍残留未被利用的培养基成分’菌体蛋白’其他各种代谢产物’提取使用的化工原料等多种物质&综合利用发酵工业的废渣水具有很高的经济效益&

!一"利用废渣液生产单细胞蛋白单细胞蛋白!E(%.K"B"KKG#)&"(%%Z+F"是指通过培养单细胞蛋白生物而获得的

菌体蛋白质&用于生产Z+F的单细胞生物有微型藻类’非病原细菌’酵母菌类和真菌等%这些单细胞生物可利用各种基质%如糖类’碳氢化合物’石油副产物及有机废水等在适宜的培养条件下生产单细胞蛋白&菌体中的蛋白含量随所采用菌种的类别及培养基质而异&-:世纪初%就已经开始利用发酵工业废渣水生产Z+F%我国于29--年在上海建立第一个酵母厂就对Z+F开展研究&-:世纪8:年代以来%我国一直重视Z+F的开发工作%更加重视在生产Z+F中综合利用工业废渣水&

243第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

例如%利用味精废水生产热带假丝酵母Z+F%禽蛋白达6:R%其产品用作饲料%效果与鱼粉相同/已经成功地在生产中采用柠檬酸发酵生产废液培养光合细菌等&

2<单细胞蛋白"Z+F#的生产工艺单细胞蛋白!Z+F"生产的一般工艺流程如图2-I2:所示&

图!#"!+!H5D生产的一般工艺流程!参考肖冬光<微生物工程原理<-::4"

图!#"!!!柠檬酸发酵废水H5D生产工艺流程

!参考奚旦立<清洁生产与循环经济<-::5"

将生长良好的种子’水’基质’营养物等投入发酵罐中进行培养%可分为分批培养或连续培养%根据菌种的生长需求控制培养条件&为了使废渣水被充分利用%可将部分培养液连续送入分离器进行分离%分离所得上清液回流到发酵罐中继续被菌种利用&分离菌体时%根据菌种类型选择酵母离心机或其他设备%对于难以分离的菌体可以加入适量絮凝剂%提高菌体的沉降性%以便分离&作为动物饲料的单细胞蛋白%离心分离所得菌体经洗涤’干燥即可制得成品&作为人类食品的单细胞蛋白则需除去大部分核酸%即需要破坏细胞壁%溶解蛋白质’核酸%再经过分离’浓缩’抽提’洗涤’喷雾干燥等步骤%最后得到食品蛋白&

-<单细胞蛋白"Z+F#生产工艺实例!2"柠檬酸发酵废水为原料生产Z+F&我

国某厂利用假丝酵母对柠檬酸发酵废水进行综

合利用%在处理废水的同时生产饲料酵母%其工艺流程如图2-I22所示&

-43 发酵工程

在柠檬酸中和废水中补充一定量氮源等%接入假丝酵母的种子培养液%经通气连续培养8*2->%培养液中绝干酵母质量浓度为22<7.0@%培养液中的干酵母回收率达82<5R%成品干酵母对废水回收率为:<96R%成本为892<8元0&%生产的酵母可达到药用标准&同时%可使废水的+,/+#去除率达3:R*5:R&该工艺的特点是%其使用的酵母菌种能够在较低的GP值!GP3<5"下正常生长%可省去或简化灭菌步骤%节省了蒸汽消耗及耐压设备投资&

另外%该菌种还具有较强的絮凝性%静置一定时间后%9:R左右的酵母菌能够沉降下来%大大地节约了离心分离时所需的电能&但是%从废水的净化程度看%该工艺的+,/+#去除率仅达3:R*5:R%其培养酵母后产生的二次废水仍具有较高的+,/+#%还需进行再处理以使之达到排放标准&

!-"味精工业废弃物生产Z+F&江苏如东生物化学总厂在国内建成了第一个以味精废液为原料生产饲料级Z+F的车间&废液不经过滤%只需加少量废氨水%用热带假丝酵母直接发酵%3:‘’2T2通气条件下培养2->后%菌体干物质达

-:.0@左右&图2-I2-利用味精废水通过酵母培养%直接蒸发浓缩全干燥成菌体蛋白的全废液饲料化工艺&该工艺能把废水中的可溶性物质全部回收%废水经发酵后%+,/去除率可达97R以上%只有蒸汽冷凝水排放%做到生产工艺用水闭路循环无废水排放&

图!#"!#!味精废水生产H5D的工艺流程

343第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

!3"用啤酒糟生产Z+F&啤酒糟是啤酒工业的主要副产品%是以大麦为原料%经发酵提取籽实中可溶性碳水化合物后的残渣&在国外%啤酒糟的综合利用很受重视%以广泛应用于饲料’医药’食品等工业&我国的起步较晚&长期以来%我国的啤酒糟主要直接用作农家饲料%用量有限%利用率低&过剩的啤酒糟由于含水量高%难以储存%极易霉变%作为废弃物排放%污染环境%浪费严重&近年来%啤酒糟做饲料称为酿酒企业和饲料工业共同关注的焦点&它约含干物质92<7R%粗蛋白

--<-R%粗脂肪7<9R%粗纤维24<9R%粗灰分4<-R%无氮浸出物4-<5R&啤酒糟生产Z+F的特点是蛋白质含量大大提高%可达3:R*6:R%富含生物活性物质%粗纤维含量降低%消化利用率大幅度提高&湖南益阳微生物所开发的啤酒糟Z+F含蛋白质5:R以上%富含28种氨基酸%氨基酸总量占蛋白质总量的9:R以上&

湿啤酒糟含水8:R左右%由于有大麦壳等杂质%很粗糙%必须通过蒸汽处理

2:$(%后再加入其他配料才能发酵&对于干啤酒糟%粉碎过2$$筛孔是必经工艺%否则发酵就不好&

啤酒糟生产Z+F固体发酵工艺流程如图2-I23所示&

! $.. $..7--

斜面菌种 摇瓶培养 种子罐培养

酒糟处理’ $.. $.. $.. $.. $.. $.. $.. $..无机盐加入 干燥 粉碎 配料 灭菌 接种 发酵 产品烘干 产品

图!#"!$!啤酒糟生产H5D固体发酵工艺流程

!4"用甜菜渣原料生产Z+F&甜菜渣是甜菜制糖后的渣粕%是一种污染环境的废物&近年来有人利用它做原料生产有机酸%也有不少厂家把它烘干后当作磁疗原料出售&由于这些渣粕产量很大%长期又集中%往往出现处理不济于事等现象%致使很多厂家为此付出大量环保处理费&因此%寻求多途径处理甜菜渣变废为宝的课题引人注目&

甜菜渣产地不同%成分也不同&一般干渣含粗纤维-:R*3:R%粗脂肪:<6R左右%粗蛋白7R*2:R%无氮浸出物54R*65R&从成分看%它还是一种粗饲料资源%多用于喂养猪’牛’羊等&由于甜菜渣含有较多游离氨基酸%大量饲喂易引起腹泻%所以要适量添加&在甜菜产地%单靠农户消化甜菜渣是不够的&为了充分利用此资源%可以用微生物固体发酵手段使其转化增殖%其中一项就是把原属粗饲料的甜菜渣转化为较高档的属蛋白精料范畴的菌体蛋白饲料&

甜菜渣不管是干料还是湿料都很粗糙%若以此料发酵%效果极差&甜菜渣只有经磨碎后其可用成分才较易被水解和酶解出来%其纤维素也只有在细粒状时才较易被微生物分解%因此磨碎是甜菜渣发酵成功与否的重要环节&在甜菜产地可考虑用打浆机把甜菜渣打成浓浆使用%也可晒干’粉碎过:<2$$筛孔备用&

443 发酵工程

试验发现%配料加水后经蒸汽焖2:$(%有助于发酵%但这需要增加设备和生产成本%在能源充足’人力资源丰富的地方用这种处理手段可能有效&甜菜渣生产

Z+F固体发酵工艺流程如图2-I24所示&

!!!!!!!!!!!! $..7--

单种培养 混匀种子

$..甜菜渣 磨碎’ $.. $.. $.. $..加辅料 搅拌均匀 发酵 气流干燥 产品

图!#"!%!甜菜渣生产H5D固体发酵工艺流程

!二"利用废渣液生产颗粒复混肥料发酵废液的GP值一般为4*9%含有0’F’O’+’’_"’.和b%等元素以及大

量有机物质%具有较高的肥效%回到土壤中能够直接促进植物的生长&同时%发酵废液也能够促进土壤中多种微生物的生长繁殖%这些微生物通过产生各种生理活性物质促进植物的生长&但是%由于发酵废液量相当大%运输困难%直接作为液体肥料受到地理区域的限制%因此%需要进一步加工制成固体颗粒的肥料&在生产过程中%首先通过多效蒸发器将发酵废液蒸发浓缩至一定浓度%再按照一定比例添加一些辅料%然后进行造粒’干燥%可制成颗粒状的复混肥&

例如%在味精行业中%从提取废液中回收硫酸铵较为普遍%同时%硫酸铵结晶母液可用于制备液体肥料%或进一步加工制备复混肥%其工艺流程如图2-I25所示&如果对发酵液进行等电点提取时采用硫酸调节GP值%提取废液中的铵离子含量相对硫酸根含量少%需适当补充一定铵离子&一般先将提取废液在三效或四效真空蒸发器冲进行浓缩到-5WJf左右%然后泵送至真空结晶器进一步浓缩到4:WJf以上&整个过程可以连续进料’结晶’出料%然后连续热分离&

图!#"!&!废液生产无机肥与复混肥的工艺流程

如果不从提取废液中提取硫酸铵%可直接利用废液制备复混肥%即首先将废液

543第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

浓缩至3:WJf左右%然后采用喷雾干燥法或喷浆造粒法进行干燥%可得有机及无机多元复混肥&

第二节!有机固体废弃物的微生物处理

有机固体废弃物也就是垃圾%它是人们生产或生活过程中%丢弃的一些固体或泥状物&随着人类大规模地开发和利用资源%以及城市人口剧增%工业固体废弃物与城市生活垃圾数量逐年增大%已成为社会的一种负担&固体废弃物具有两重性(一方面占用大量土地’污染环境/另一方面其含有多种有用物质%又是一种资源&

-:世纪7:年代前%世界各国对固体废弃物的认识只停留在处理和防止污染上/7:年代以后%由于能源和资源的短缺%以及对环境问题认识的逐渐加深%人们已由消极的处理转向废物资源化&对可被微生物分解利用的有机废物%已越来越多地采用微生物方法处理&

微生物处理固体废弃物的途径主要有两条(培养微生物%使废弃物转化成含蛋白质’氨基酸’糖类’维生素或抗生素等有益物质的产品/制成有机肥料%增进农业生产&

堆肥法处理技术是固体有机废弃物处理的三大技术之一!卫生填埋’堆肥’焚烧"%通过堆肥处理%将其中的有机可腐物转化为土壤可接受且迫切需要的有机营养土%不仅能有效地解决固体废弃物的出路%解决环境污染和垃圾无害化问题%同时也为农业生产提供了适用的腐殖土%从而维持自然界良性的物质循环&堆肥法就是依靠自然界广泛分布的细菌’放线菌’真菌等微生物%有控制地促进可被微生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化学过程&

堆肥法是一种古老的微生物处理有机固体废弃物的方法%俗称#堆肥!B)$G)E&"$&堆肥法虽然是-:世纪才发展起来的科学技术%但原始的堆肥方式很早就出现了%在我国和印度等东方国家历史尤其悠久&根据处理过程中起作用的微生物对氧气要求的不同%堆肥可分为好氧堆肥法!高温堆肥"和厌氧堆肥法两种&

一!好氧堆肥

好氧堆肥法!’"#)N(BB)$G)E&"是在有氧的条件下%通过好氧微生物的作用使有机废弃物达到稳定化%转变为有利于作物吸收生长的有机物的方法&在堆肥过程中%废弃物中溶解性有机物透过微生物的细胞壁和细胞膜被微生物吸收%固体和胶体的有机物先附着在微生物体外%由生物所分泌的胞外酶分解为溶解性物质%再渗入细胞&微生物通过自身一系列的生命活动%把一部分被吸收的有机物氧化成

643 发酵工程

简单的无机物质%并放出生物生长活动所需要的能量/而把另一部分有机物转化为生物体自身的细胞物质%用于微生物的生长繁殖%产生更多的微生物体&

!一"好氧堆肥原理和过程好氧堆肥是在有氧条件下%好氧细菌对废物进行吸收’氧化’分解&微生物通

过自身的生命活动%把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物%同时释放出可供微生物生长活动所需的能量%而另一部分有机物则被合成新的细胞质%使微生物不断生长繁殖%产生出更多的生物体的过程&在有机物生化降解的同时%伴有热量产生%因堆肥工艺中该热能不会全部散发到环境中%就必然造成堆肥物料的温度升高%这样就会使一些不耐高温的微生物死亡%耐高温的细菌快速繁殖&生态动力学表明%好氧分解中发挥主要作用的是菌体硕大’性能活泼的嗜热细菌群&该菌群在大量氧分子存在下将有机物氧化分解%同时释放出大量的能量&据此好氧堆肥过程应伴随着两次升温%将其分成三个阶段(起始阶段’高温阶段和熟化阶段&

2<起始阶段不耐高温的细菌分解有机物中易降解的碳水化合物’脂肪等%同时放出热量使

温度上升%温度可达25*4:‘&

-<高温阶段耐高温细菌迅速繁殖%在有氧条件下%大部分较难降解的蛋白质’纤维等继续

被氧化分解%同时放出大量热能%使温度上升至6:*7:‘&一般认为%堆温在

5:*6:‘%持续6*7L%可达到较好的杀死虫卵和病原菌的效果&

3<降温和腐熟保肥阶段当高温持续一段时间以后%易于分解或较易分解的有机物!包括纤维素等"已

大部分分解%剩下的是木质素等较难分解的有机物以及新形成的腐殖质&这时%好热性微生物活动减弱%产热量减少%温度逐渐下降%中温性微生物又渐渐成为优势菌群%残余物质进一步分解%腐殖质继续不断地积累%堆肥进入了腐熟阶段&为了保存腐殖质和氮素等植物养料%可采取压实肥堆的措施%造成其厌氧状态%使有机质矿化作用减弱&以免损失肥效&

!二"好氧堆肥工艺的控制参数机械化好氧堆肥过程的关键%就是如何选择和控制堆肥条件%促使微生物降解

的过程能快速顺利进行%一般来说好氧堆肥要求控制的参数有(

2<通风对于好氧堆肥而言%氧气是微生物赖以生存的物质条件%供氧不足会造成大量

743第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

微生物死亡%使分解速度减慢/但供冷空气量过大又会使温度降低%尤其不利于耐高温菌的氧化分解过程%因此供氧量要适当%一般为:<2*:<-$30$(%%供氧方式是靠强制通风%因此保持物料间一定的空隙率很重要%物料颗粒太大使空隙率减小%颗粒太小其结构强度小%一旦受压会发生倾塌压缩而导致实际空隙减小&因此颗粒大小要适当%可视物料组成性质而定&

-<湿度在堆肥工艺中%堆肥原料的含水率对发酵过程影响很大%水的作用一是溶解有

机物%参与微生物的新陈代谢/二是可以调节堆肥温度%当温度过高时可通过水分的蒸发%带走一部分热量&水分太低妨碍微生物的繁殖%使分解速度缓慢%甚至导致分解反应停止&水分过高则会导致原料内部空隙被水充满%使空气量减少%造成向有机物供氧不足%形成厌氧状态&同时因过多的水分蒸发%而带走大部分热量%使堆肥过程达不到要求的高温阶段%抑制了高温菌的降解活性%最终影响堆肥的效果&实践证明堆肥原料的水分在4:R*6:R为宜&

3<垃圾原料的营养配比

+00在!-5*3:"T2发酵最好%过低%超过微生物所需的氨%细菌就将其转化为氨而损失掉/过高%则影响堆肥成品质量%施肥后引起土壤氮饥饿&+0F宜维持在75*25:&

4<发酵温度一般堆肥时%-*3L后温度可升至6:‘%最高温度可达73*75‘%这样可以

杀灭病原菌’寄生虫卵及苍蝇卵&堆肥发酵过程中%温度应维持5:*7:‘&

5<GP值整个发酵过程中GP值范围为5<5*8<5%能自身调节%好氧发酵的前几天由

于产生有机酸%GP值为4<5*5<:/随温度升高氨基酸分解产生氨%一次发酵完毕%

GP值上升至8<:*8<5/二次发酵氧化氨产生硝酸盐%GP值下降至7<5为中偏碱性肥料&由此看出%在整个发酵过程中%不需外加任何中和剂&

!三"好氧堆肥工艺

-:世纪7:年代以前我国垃圾堆肥%主要采用的是一次性发酵工艺%8:年代开始%更多的城市采用二次性发酵工艺&这两种工艺是在静态条件下进行的发酵%称之为#静态发酵$&随着城市气化率的提高和人民生活水平的提高%垃圾组成中有机质含量随之提高%导致含水率提高而影响到通风的进行&因此%高有机质含量组成的城市生活垃圾不能采用静态发酵%而必须采用动态发酵工艺%堆肥在连续翻动或间歇翻动的情况下%有利于孔隙形成和水分的蒸发’物料的均匀’

843 发酵工程

发酵周期的缩短&我国在2987年前后开始了动态堆肥的研究&现在常用的堆肥工艺有(静态堆肥工艺’高温动态二次堆肥工艺’立仓式堆肥工艺’滚筒式堆肥工艺等&

2<静态堆肥工艺静态堆肥工艺如图2-I26所示&该工艺简单%设备少%处理成本低%但占用土

地多&易滋生蝇蛆%产生恶臭&发酵周期5:L&用人工翻动%在第-’7’2-天各翻堆一次%过后35L的腐熟阶段每周翻动一次%在翻动的同时可喷洒适量水以补充蒸发的水分&

图!#"!’!静态堆肥工业简图!参考洪坚平等<应用微生物学<-::5"

-<高温动态二次堆肥工艺高温动态二次堆肥分两个阶段&前5*7L为动态发酵机械搅拌&通入充足

空气&好氧菌活性强&温度高%快速分解有机物&发酵7L绝大部分致病菌死亡&

7L后用皮带将发酵半成品输送到另一车间进行静态二次发酵%垃圾进一步降解稳定%-:*-5L全腐熟&其工艺如图2-I27所示&

2<吊车/-<抛料翻堆机/3<进料皮带运输机/4<供气管/5<出料皮带运输机

图!#"!(!高温动态二次堆肥工艺简图!参考洪坚平等<应用微生物学<-::5"

3<滚筒式堆肥工艺滚筒式堆肥工艺称达诺生物稳定法%如图2-I28所示&滚筒直径-*4$&长

943第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

度25*3:$%滚筒转速:<4*-<:#0$(%&滚筒横卧稍倾斜&经分选’粉碎的垃圾送入滚筒%旋转滚筒垃圾随着翻动并向滚筒尾部移动&在旋转过程中完成有机物生物降解’升温’杀菌等过程&5*7L出料&

图!#"!)!滚筒式堆肥工艺简图!参考洪坚平等<应用微生物学<-::5"

4<立仓式堆肥工艺立式发酵仓高22*25$%分隔6格%如图2-I29所示&经分选’破碎后的垃圾

图!#"!*!立仓式堆肥工艺简图!!!参考洪坚平等<应用微生物学<-::5"

由皮带输送至仓顶一格&受自重力和栅板的控制%逐日下降至下一格&一周全下降至底部%出料运送到二次发酵车间继续发酵使之腐熟稳定&从顶部至以下五格均通入空气%从顶部补充适量水%温度高%发酵过程极迅速%-4>温度上升到5:‘以上%7:‘可维持3L&之后温度逐渐下降&

立仓式堆肥工艺优点(占地少%升温快%垃圾分解彻底%运行费用低%缺点(水分分布不均匀&

二!厌氧堆肥

厌氧堆肥!’%’"#)N(BB)$G)E&"是在

不通气的条件下%将有机废弃物!包括城市垃圾’人畜粪便’植物秸秆’污水发酵工程处理厂的剩余污泥等"进行厌氧发

:53 发酵工程

酵%制成有机肥料%使固体废弃物无害化的过程&在厌氧堆肥过程中%主要经历了以下两个阶段(酸性发酵阶段和产气发酵阶段&在酸性发酵阶段中%产酸细菌分解有机物%产生有机酸’醇’+,-’0P3’P-Z等%使GP值下降&产气发酵阶段中主要是由产甲烷细菌分解有机酸和醇%产生+P4 和+,-%随着有机酸的下降%GP值迅速上升&

堆肥方式与好氧堆肥法相同%但堆内不设通气系统%堆温低%腐熟及无害化所需时间较长&然而%厌氧堆肥法简便’省工%在不急需用肥或劳力紧张的情况下可以采用&一般厌氧堆肥要求封堆后2个月左右翻堆一次%以利于微生物活动使堆料腐熟&

绵阳市城市垃圾无害化综合处理%采用和发展了自己的技术%即厌氧发酵罐技术&方法(包括了分选’粗选’水分检测’大罐密封发酵’细筛’烘干’球磨造粒’包装等工序及其配套设备&该方法可以人为控制城市垃圾的发酵过程%在设备容量容许的情况下%可以做到对城市当天产生的垃圾当天进行处理消化&并同时回收

+P4 和复合肥&

思 考 题

2<根据厌氧发酵技术的原理废水处理可分为哪三类1

-<比较处理废水的各种主要方法的基本原理和工艺%并查阅相关文献举例说明在白酒’啤酒’柠檬酸’抗生素等产品生产废水处理中的应用&

3<采用活性污泥法的基本要求是什么1 简述其组成和功能&

4<简述好氧堆肥法的过程和要求条件&

5<比较几种主要好氧堆肥法的工艺和特点&

6<举例说明利用发酵工业废弃物生产Z+F的微生物菌种和工艺技术&

7<简述升流式厌氧污泥层反应器’厌氧膨胀颗粒污泥床’内循环反应器’厌氧附着膜膨胀床反应器和厌氧流化床反应器’厌氧生物滤池’两相厌氧消化等生物厌氧处理法的工作原理和在发酵工业废水处理中的应用&

253第十二章!发酵工程与有机废弃物处理

参考文献

324蔡信之%黄君红<微生物学3 4<-版<北京(高等教育出版社%-::-<3-4曹军卫%马辉文<微生物工程3 4<北京(科学出版社%-::6<334曹亚莉%田池<固定化微生物细胞技术在废水处理中的应用3=4<微生物学

通报%-::3%3:!3"(77I82<344吞沛霖%蔡谨<工业微生物学3 4<北京(化学工业出版社%-::2<354陈代杰%朱宝泉<工业微生物菌种选育与发酵控制技术3 4<上海(上海科

学技术文献出版社%2995<364陈洪章<生物过程工程与设备3 4<北京(化学工业出版社%-::3<374陈洪章%李佐虎<纤维素酶周期刺激固态发酵研究)))第八届全国生物化

工学术会议论文集3+4<北京(化学工业出版社%2998%-58I-6-<384陈洪章%李佐虎<气相双动态固态发酵技术及其发酵装置3F4<中国发明专

利号(:-2::276<6%-::-<2%--<394陈坚%李寅<发酵过程优化原理与实践3 4<北京(化学工业出版社%-::-<32:4陈坚%堵国成%李寅%等<发酵工程实验技术 3 4<北京(化学工业出版

社%-::3<3224陈世和%陈建华%王世芬%等<微生物生理学原理3 4<上海(同济大学出

版社%299-<32-4陈驹声<中国微生物工业发展简史3 4<北京(中国轻工业出版社%2979<3234陈驹声<近代工业微生物学!下册"3 4<上海(上海科学技术出版

社%298-<3244陈驹声<固定化酶理论与应用3 4<北京(中国轻工业出版社%2987<3254陈驹声<微生物工程3 4<北京(化学工业出版社%2987<3264陈移亮%周卫东%林耀辉<曲酸的发酵生成与检测3=4<亚热带植物通讯%

2998%-7!2"(62I66<3274储距%李友荣<现代工业发酵调控学3 4<北京(化学工业出版社%-::-<3284杜连祥<工业微生物学实验技术3 4<天津(天津科学技术出版社%299-<3294杜连祥%赵征<乳酸菌及其发酵制品生产技术3 4<天津(天津科学技术

出版社%2999<

3-:4冯容保<发酵法赖氨酸生产3 4<北京(中国轻工业出版社%2986<3-24冯容保<国外氨基酸生产的进展3=4<发酵科技通讯%-::-%32!3"(27I28<3--4高年发%杨枫%王淑豪<丝状菌的菌球体生成及控制3=4<天津轻工业学院

学报%299-%24!2"(22I26<3-34顾觉奋%王鲁燕%倪孟辉<抗生素3 4<上海(上海科学技术出版社%-::-<3-44闰桂琴<生命科学技术概论3 4<北京(科学出版社%-::3<3-54韦革宏%杨祥<发酵工程3 4<北京(科学出版社%-::8<3-64国家发展计划委员会高技术产业发展司%中国生物工程学会<中国生物

技术产业发展报告3 4<北京(化学工业出版社%-::3<3-74郭勇<生物制药技术3 4<北京(中国轻工业出版社%-:::<3-84韩德权%赵辉%王彦杰<发酵工程3 4<哈尔滨(黑龙江大学出版社%-::8<3-94韩世豪<林红<赖氨酸生产现状与市场前景3=4<化工设计通讯%-::2%

-7!2"(3-I34<33:4韩仕群%张振华%严少华<国内外利用藻类技术处理废水’净化水体研究

现状3=4<农业环境与发展%-:::%!2"(23I26<3324何忠效%静国忠%许佑良%等<现代生物技术基础3 4<北京(北京师范大

学出版社%2999<33-4贺小贤<生物工艺原理3 4<北京(化学工业出版社%-::3<3334贺延龄<废水的厌氧生物处理3 4<北京(中国轻工业出版社%2998<3344黄秀梨<微生物学3 4<-版<北京(高等教育出版社%-::3<3354洪坚平%来航线<应用微生物学3 4<北京(中国林业出版社%-::5<3364贾仕儒<生化反应工程原理3 4<北京(科学出版社%-::-<3374贾仕儒<生物工程专业实验3 4<北京(中国轻工业出版社%-::4<3384姜淑荣%杨清香<发酵分析检验技术3 4<北京(化学工业出版社%-::8<3394焦瑞身%沈永强<阿氏假囊酵母核黄素高产发酵的研究!5"<阿氏假囊酵

母的诱变育种3=4<医药工业%298:%9(2I6<34:4焦瑞身%王文仲<阿氏假囊酵母核黄素高产发酵的研究!1"<生产罐发酵

3=4<医药工业%298:%9(24I27<3424焦瑞身<微生物工程3 4<北京(化学工业出版社%-::3<34-4李季伦%张伟心%杨启瑞%等<微生物生理学3 4<北京(北京农业大学出

版社%2993<3434李津%俞咏霍%董德祥<生物制药设备和分离纯化技术3 4<北京(化学工

业出版社%-::4<

353参考文献

3444李友荣%马辉文<发酵生理学3 4<长沙(湖南科学技术出版社%2989<3454李育阳<基因表达技术3 4<北京(科学出版社%-::2<3464梁世中<生物工程设备3 4<北京(中国轻工出版社%-::3<3474李艳<发酵工业概论3 4<北京(中国轻工业出版社%2999<3484李艳<发酵工程原理及技术3 4<北京(科学出版社%-::8<3494李寅%高海军%陈坚<高细胞密度发酵技术 3 4<北京(化学工业出版

社%-::6<35:4廖敏%谢正苗%王锐%等<菌藻共生体去除废水中砷初探3=4<环境污染与

防治%2997%29!4"(56I6-<3524林长松<+_固定床生物膜厌氧反应器产沼气发酵效率及机理研究3/4<

中国农业大学博士学位论文%-::9<35-4林稚兰%黄秀梨<现代微生物学与实验技术 3 4<北京(科学出版

社%-:::<3534刘冬%张学仁<发酵工程3 4<北京(高等教育出版社%-::7<3544刘国诠<生物工程下游技术3 4<-版<北京(化学工业出版社%-::3<3554刘如林<微生物工程概论3 4<天津(南开大学出版社%2995<3564刘姝晶%鲁宽科%陈耀祖%等<3I溴甲基头孢烯酸对硝基苄基酯的合成

3=4<中国抗生素杂志%2999%-4!6"(46-I467<3574刘振宇<发酵工程技术与实践3 4<上海(华东理工大学出版社%-::7<3584楼士林%杨盛昌%龙敏南%等<基因工程3 4<北京(科学出版社%-::-<3594伦世仪<生化工程3 4<北京(中国轻工业出版社%299-<36:4罗大珍%王宇钢%朱文<离子注入右旋糖酐生产菌的诱变效应研究3=4<微

生物学报%2997%37!4"(32-I325<3624罗大珍%孙淑莉%钱存柔<曲酸发酵的研究1<紫外线诱变后<(=4:>/001(

A0-B1(*YKX2--3 变异 株 最适发酵条件的研究 3=4<北京大学学报%2982%!4"(78I87<

36-4罗大珍%林稚兰<现代微生物发酵及技术教程3 4<北京(北京大学出版社%-::6<

3634罗贵民%曹淑桂%张今<酶工程3 4<北京(化学工业出版社%-::-<3644马桂亮%梁会仙%李美<利用发酵工业废水培养酵母菌的研究3=4<山东食

品发酵%2999%!-"(4I6<3654马晓建%李洪亮%刘利平<燃料乙醇生产与应用技术3 4<北京(化学工业

出版社%-::7<

453 发酵工程

3664毛思贵<生物工业下游技术3 4<北京(中国轻工业出版社%2999<3674毛宗强<氢能)))-2世纪的绿色能源3 4<北京(化学工业出版社%-::5<3684梅乐和<生化生产工艺学3 4<北京(科学出版社%-::2<查作者3694周孟津%张榕林<沼气实用技术3 4<北京(化学工业出版社%-::4<37:4周群英<环境工程微生物学3 4<-版<北京(高等教育出版社%-::5<3724欧阳平凯<生物分离原理及技术3 4<北京(化学工业出版社%2999<37-4裴疆森<曲酸生产菌种的筛选和发酵培养基条件的优化3=4<食品与发酵

工业%2997%-3!2"(22I24<3734钱存柔%罗大珍%孙淑莉<曲酸发酵的研究5<紫外线照射对黄曲霉产生

曲酸的影响3=4<微生物学报%2982%-2!2"(2:-I2:6<3744钱存柔%黄仪秀<微生物学实验教程3 4<北京(北京大学出版社%2999<3754唐受印%戴友芝<水处理工程师手册3 4<北京(化学工业出版社%-:::<3764翟礼嘉%顾红雅%胡苹%等<现代生物技术导论3 4<北京(高等教育出版

社%2998<3774戎志梅<生物化工新产品与新技术开发指南3 4<北京(化学工业出版

社%-::-<3784沈萍<微生物学3 4<北京(高等教育出版社%-:::<3794孙彦<生物分离工程3 4<北京(化学工业出版社%2998<38:4汤桂兰<废水厌氧发酵生物制氢技术研究3/4<北京(中国农业大学博士

学位论文%-::8<3824陶兴无%江贤君<发酵产品工艺学3 4<北京(化学工业出版社%-::8<38-4王博彦%金其荣<发酵有机酸生产与应用手册3 4<北京(中国轻工业出

版社%-:::<3834王静康%张美景%万涛%等<青霉素盐结晶过程3=4<化工学报%2996%47

!2"(2::I2:7<3844王树青<生化反应过程模型化及计算机控制3 4<杭州(浙江大学出版

社%2998<3854王岁楼%熊陈<生化工程3 4<北京(中国轻工业出版社%299-<3864王狱%方金瑞<抗生素3 4<北京(科学出版社%2988<3874魏群<生物工程技术实验指导3 4<北京(高等教育出版社%-::-<3884魏明奎<微生物学3 4<-版<北京(中国轻工业出版社%2999<3894吴大治%张礼星%徐柔%等<固态发酵生产细菌!I淀粉酶3=4<无锡轻工大

学学报%-:::%29!2"(54I57<

553参考文献

39:4吴根福%杨志坚<发酵工程实验指导3 4<北京(高等教育出版社%-::7<3924吴冠云%潘华珍%吴翚<生物化学与分子生物学实验常用数据手册3 4<

北京(科学出版社%2999<39-4吴乃虎<基因工程原理3 4<北京(科学出版社%-::2<3934吴振强<固态发酵技术与应用3 4<北京(化学工业出版社%-::6<3944邬敏辰%李江华%邬显章<碱性脂肪酶的发酵及提取工艺3=4<河北轻化工

学院学报%2998%29!2"(58I6-<3954熊宗贵<发酵工艺学3 4<北京(中国医药科技出版社%2995<3964熊宗贵<生物技术制药3 4<北京(高等教育出版社%-::5<3974夏焕章%熊宗贵<生物技术制药3 4<北京(高等教育出版社%-::6<3984奚旦立<清洁生产与循环经济3 4<北京(化学工业出版社%-::5<3994肖冬光<微生物工程原理3 4<北京(中国轻工业出版社%-::4<32::4肖锦<城市污水处理及回用技术3 4<北京(化学工业出版社%-::-<32:24游明乐<中国食!药"用真菌发酵工程研究进展3=4<微生物学通报%

-::7%!:-"(3-7I332<32:-4徐福建%陈洪章%李佐虎<气相双动态纤维素酶固态发酵的研究3 4<环

境科学%-::-%-3!5"(53I58<32:34徐浩<工业微生物学基础及其应用3 4<北京(科学出版社%2992<32:44严希康<生化分离工程3 4<北京(化学工业出版社%-::2<32:54严自正%陶增鑫%尹光琳%等<!I山梨糖发酵产生维生素+前体-I酮基I

!I古龙酸的研究1<发酵条件的研究3=4<微生物学报%2982%-2!-"(285I292<32:64颜方贵<发酵微生物学3 4<北京(中国农业大学出版社%2999<32:74杨柳燕%肖琳<环境微生物技术3 4<北京(科学出版社%-::3<32:84杨垂绪%梅曼彤<太空放射生物学3 4<广州(中山大学出版社%2995<32:94杨汝德<现代工业微生物学3 4<广州(华南理工大学出版社%-::2<322:4叶勤<发酵过程原理3 4<北京(化学工业出版社%-::5<32224尹光琳%陶增鑫%严自正%等<!I山梨糖发酵产生维生素+前体-I酮基

!I古龙 酸 的 研 究 5<菌 种 的 分 离 筛 选 和 鉴 定 3=4<微 生 物 学 报%298:%

-:!3"(-46I-52<322-4俞俊棠%唐孝宣<生物工艺学!上册"3 4<上海(华东理工大学出版

社%2992<32234俞俊棠%唐孝宣%邬行彦%等<新编生物工艺学3 4<北京(化学工业出版

社%-::3<

653 发酵工程

32244俞文和<新编抗生素工艺学3 4<北京(中国建材工业出版社%2996<32254臧荣春%夏凤毅<微生物动力学模型3 4<北京(化学工业出版社%-::3<32264张爱军%陈洪章%李佐虎<固体有机废弃物厌氧消化处理的研究现状与

进展3=4<环境科学研究%-::-%25!5"(5-I54<32274张惠展<基因工程概论3 4<上海(华东理工大学出版社%-::3<32284张洪勋%陈景韩<柠檬酸生物工艺学 3 4<北京(中国科学技术出版

社%-::2<32294张克旭<氨基酸发酵工艺学3 4<北京(中国轻工业出版社%-::3<32-:4张克旭%陈宁%张倍%等<代谢控制发酵 3 4<北京(中国轻工业出版

社%2998<32-24张理珉%程立忠%陆和生<发酵液中曲酸的提取方法比较3=4<生物技术%

-:::%2:!5"(44I46<32--4张蓓<代谢工程3 4<天津(天津大学出版社%-::3<32-34张树政<酶制剂工业!上’下册"3 4<北京(科学出版社%2984<32-44张伟国%钱和<氨基酸生产技术及其应用3 4<北京(中国轻工业出版

社%2997<32-54张致平<"I内酰胺类抗生素研究的进展3=4<中国新药杂志%-::-%22!2"(

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社%-::-<32-94诸葛健%沈微%方慧英%等<工业微生物实验与研究技术3 4<北京(科学

出版社%-::7<323:4褚志义<生物合成药物学3 4<北京(化学工业出版社%-:::<32324怀斯曼 1/徐家立%戴有盛%孙万儒%张启先%等译<酶生物技术手册

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753参考文献

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853 发酵工程

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953参考文献

发 酵 工 程W23>28./.-B8Q87-8223-87

李玉英!编著

中 国 农 业 大 学 出 版 社

!图书在版编目!54D"数据

!发酵工程0李玉英编著<)北京(中国农业大学出版社%-::9<5!XZJ0978I7I82227I838I8

!5<发2!1<李2!6<发酵工程!8<Sg9-

!中国版本图书馆+XF数据核字!-::9"第2382:6号

!书! 名!发酵工程

!作! 者!李玉英!8888888888888888888888888888888888888

编著

!策划编辑!梁爱荣!!!!!!!!!!!!! 责任编辑!田树君!封面设计!郑!川 责任校对!陈!莹!王晓凤!出版发行!中国农业大学出版社!社!!址!北京市海淀区圆明园西路-号!!!!邮政编码!2::293!电!!话!发行部:2:I6-73229:%-6-:! !!!!读者服务部:2:I6-73-336

编辑部:2:I6-73-627%-628! !!!!出!版!部:2:I6-73344:!网!!址!>&&G(00AAAlB’Dl"LDlB%0B’DG! 2">/-6BNEEHE9B’D<"LD<B%!经!!销!新华书店!印!!刷!涿州市星河印刷有限公司!版!!次!-::9年5月第2版!!-::9年5月第2次印刷!规!!格!787V98:!!26开本!!-3印张!!4--千字!定!!价!3:<::8888888888888888888888888888888888888

元

!图书如有质量问题本社发行部负责调换

前 言

发酵工程 !!"#$"%&’&()%"%.(%""#(%."是生物工程的重要组成部分%既是一个多学科的交叉体系%又是一个广阔的技术领域%处于生物技术的核心地位%是基因工程’酶工程’细胞工程等生物技术实现产业化的桥梁和主要关键技术&发酵工程技术历史悠久%在人类可持续性发展的进程中%正显示着其巨大的优势%为人类解决所面临的能源短缺和环境污染等重大难题提供全新的思路和途径&发酵工程技术及成果正在被广泛地应用于工农业生产’新能源开发及有机废弃物处理等领域&

本书以典型的发酵工艺流程为主线%全面介绍了发酵工程的基本原理’发酵设备及原料’发酵工业的放大’工艺控制及应用&第一章从发酵工程的概念’发展史’工艺流程及其服务领域等方面介绍发酵工程的基础知识&第二章根据液体’固体培养基及动植物之间的差异分别介绍了在大规模工业发酵中的特有设备&第三章至第六章分别介绍了发酵工业原料及其处理%发酵工业的灭菌%微生物菌种制备技术及发酵工业的逐级放大&第七章和第八章介绍发酵机制及发酵动力学&第九章从溶解氧’GP值’培养基’温度’补料等影响发酵的诸多因素系统介绍了发酵工艺的控制&第十章介绍发酵产品的获取&第十一章和第十二章从沼气’燃料乙醇’氢能和生物柴油方面以及发酵工业废水和废渣综合处理及废弃物资源化方面介绍了

发酵工程在新能源开发和环境治理中的应用&同时结合发酵工程综合实验课的开设%不仅使学生系统掌握了发酵工程的理论知识%也使学生在接触生产实际以前具有更好的动手操作和解决问题的能力&本书注重先进性的同时更强调实用性%可作为高等师范院校’综合性大学和农林院校生物工程专业本科学生的教科书%也可供从事发酵工业生产的科技人员参考&

需要说明的是%为了突出本书的学术性和应用价值%在编写本书过程中%编者参考了许多国内外相关的教材和文献资料%引用了其中部分重要的结论及相关的图表%在此向各位前辈及同行致以衷心的感谢&此外%本书的编写受到南阳师范学院学术著作出版基金资助%中国农业大学出版社的领导和编辑同志对本书的出版做了大量辛勤细致的工作%以及惠丰立教授’黄思良教授’杨建伟教授’夏敏教授等在编写过程中给予宝贵意见%还有刘晶晶和孙朦朦等同学在制图和校对方面所做的工作%在此一并表示谢忱&

由于编者学识和水平所限%加之时间仓促%书中难免有不妥甚至错漏之处%衷心欢迎专家和同行以及广大读者给予批评指正&

编!者

-::9年4月

- 发酵工程

目 录

第一章!发酵工程概述 2!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!发酵工程的概念 2!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!发酵工程的发展简史 3!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!发酵工程工艺流程及发酵类型 6!!!!!!!!!!!!!!!第四节!发酵工程产品类型及发展趋势 8!!!!!!!!!!!!!!!

第二章!发酵设备 25!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!通风发酵设备 25!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!嫌气发酵设备 -5!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!动植物细胞培养反应器 -8!!!!!!!!!!!!!!!!!

第三章!发酵工业原料和培养基 37!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!发酵工业原料和培养基组成 37!!!!!!!!!!!!!!!第二节!发酵工业培养基的种类 44!!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!工业发酵营养基质的配制方法 48!!!!!!!!!!!!!!

第四章!发酵工业灭菌 63!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!常用的灭菌方法及原理 63!!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!培养基与发酵设备的灭菌 68!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!无菌空气制备 77!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

第五章!发酵工业菌种制备 93!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!发酵工业微生物菌种的选育 93!!!!!!!!!!!!!!!第二节!发酵工业微生物菌种保藏 22-!!!!!!!!!!!!!!!!

第六章!发酵工业的放大 227!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!发酵工业种子的扩大培养 227!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!发酵工业设备的逐级放大 2-4!!!!!!!!!!!!!!!!

第七章!微生物发酵机制 234!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!糖’醇’有机酸发酵的代谢控制 234!!!!!!!!!!!!!!第二节!氨基酸发酵的代谢控制 254!!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!抗生素发酵的代谢调控 26:!!!!!!!!!!!!!!!!!

第八章!发酵动力学 27:!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!发酵过程动力学描述 27:!!!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!分批培养动力学 28:!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!连续发酵动力学 289!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第四节!补料分批发酵动力学 294!!!!!!!!!!!!!!!!!!

第九章!发酵工艺的控制 298!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!培养基基质对发酵的影响及调控 298!!!!!!!!!!!!!第二节!溶解氧对发酵的影响及控制 -:4!!!!!!!!!!!!!!!第三节!温度对发酵的影响及控制 -27!!!!!!!!!!!!!!!!第四节!GP值对发酵的影响及控制 ---!!!!!!!!!!!!!!!第五节!+,-浓度对发酵的影响及控制 --6!!!!!!!!!!!!!!第六节!泡沫对发酵的影响及控制 --8!!!!!!!!!!!!!!!!第七节!补料对发酵的影响及控制 -35!!!!!!!!!!!!!!!!第八节!染菌对发酵的影响及控制 -37!!!!!!!!!!!!!!!!第九节!计算机对发酵过程的控制及参数检测 -48!!!!!!!!!!!

第十章!发酵工程产物的获取 -56!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!发酵液的预处理 -56!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!微生物细胞的破碎 -63!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!发酵产物的分离和纯化 -68!!!!!!!!!!!!!!!!!

第十一章!发酵工程与新能源开发 3:3!!!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!沼气发酵 3:3!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!乙醇发酵 322!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第三节!生物制氢 3-2!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!第四节!生物柴油 3-6!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

第十二章!发酵工程与有机废弃物处理 333!!!!!!!!!!!!!!!!第一节!有机废水的微生物处理 333!!!!!!!!!!!!!!!!!第二节!有机固体废弃物的微生物处理 346!!!!!!!!!!!!!!

参考文献 35-!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

- 发酵工程