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1 TECNICAS SEPARATIVAS Clasificación: Precipitación. líquido - líquido Extracción en fase sólida Destilación Cromatografía
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TECNICAS SEPARATIVAS
Clasificación:
Precipitación.
líquido - líquido
Extracción
en fase sólida
Destilación
Cromatografía
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Estado I
A , B
Sistema Homogéneo
Estado II
A + B
Sistema Heterogéneo
Estado III
A / B
Dos fases separadas
Proceso 1
Proceso 2
Transformaciones físicas y/o químicas
Mecánico, físico o
raramente químico
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CROMATOGRAFIA
Definición:
“Es una técnica capaz de separar compuestos en base a diferencias de su afinidad por una fase estacionaria y una móvil”.
Sistema Cromatografico:
Fase Móvil
Fase Estacionaria
Soluto
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Proceso físico - químico que rige la separación:
-Adsorción:
El soluto se adsorbe en la superficie de las partículassólidas de la fase estacionaria. Es un fenómeno superficial, aumentado con la formación de puentesde hidrógeno.
- Partición o Reparto:
El soluto se equilibra entre el líquido de la fase estacionaria y la fase móvil, por diferencia de solubilidad. Hasta llegar a un equilibrio
Proceso Cromatográfico (1)
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- Intercambio Iónico:
Los aniones o cationes se separan en base a una columna rellena con un intercambiador de iones ( resina)
- Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel:
No existen interacciones entre la fase estacionaria y el soluto. Se separa por tamaño de partícula.
Proceso Cromatográfico (2)
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Fase
estacionariaFase
móvil
Proceso
cromatográfico
Capa fina
Columna
Adsorción
I. Iónico
Exc. Molecular
AdsorciónColumna
Papel
Capa fina
Columna
Partición
ParticiónColumna
Líquida
LíquidaLíquida
Sólida
Gas
Gas
Técnica
cromatográfica
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Métodos Cromatográficos
Fundamento:
* Son métodos en los que los componentes de una mezcla se van repartiendo de forma diferenciada entre dos fases: una móvil y otra estacionaria.* La fase móvil puede ser un gas (cromatografía de gases) o un líquido (cromatografía líquida).* La fase estacionaria es generalmente un líquido, que recubre la superficie de partículas sólidas, o en ocasiones el mismo sólido.
La fase estacionaria, puede ser un lecho plano (Cromatografía de capa fina o sobre papel) o desarrollarse sobre una columna (Cromatografía columnar)
(cromatografía de capa fina o sobre papel)
CROMATOGRAFIA SOBRE COLUMNA
(cromatografía líquida)
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TERMINOLOGÍA Y PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS
Eluyente : Así se denomina a la fase móvil portadora de la muestra
Eluato: es el término con el que se define la salida del eluyente
ELUYENTE columna
ELUATO(entra) (sale)
(proceso de ELUCIÓN
Flujo: mide la velocidad de la fase móvil, se expresa como gastoen volumen ( ml disolvente/minuto de recorrido de la columna)o gasto lineal (cm de recorrido/minuto)
CROMATOGRAMA: Gráfica que expresa la respuesta del detectoren función del tiempo de elución
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Análisis Cromatográfico
*La cromatografía, permite no sólo separar los componentes de una muestra, sinó tambien su identificación y cuantificación.
Análisis cualitativo
Esta basado en la medida de parámetros cromatográficos ( tiempos y volúmenes de retención)
Análisis cuantitativo
Está basado en la medida de alturas u áreas de picos cromatográficos que se relacionan con la concentración.
La columna cromatográfica y la forma con la quese diseña, constituye el corazón de la separación.
El detector situado al final de la columna es elque garantiza la respuesta de los componentesque se separan ( los hay de muy diversos tipos)
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Análisis cualitativo cromatográfico
Los parámetros cromatográficos que se utilizan en el análisis cualitativoson dos: tiempo de retención(tR) y volumen de retención (vR)
Procedimiento: ambos parámetros han de ser comparados con los de unasustancia patrón
Inconvenientes: No se tiene siempre certeza de que ambos parámetrossean reproducibles, ni aún manteniendo condiciones de trabajo constantes.Es preferible utilizar valores relativos, en vez de absolutos.
Bajo condiciones de flujode fase móvil Fc constante:
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Tiempo de retención
tiempo de retención ajustado = t’r = tr - tm
retención relativa = α = t’r2 / t’r1
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CROMATOGRAFIA PLANA
xba Rf =
a - distancia recorrida por el analito.
b - distancia recorrida por el frente
ab
Es muy semejante a la Cromatografía líquidatanto en aplicaciones como en funcionamiento
La fase móvil se mueve por capilaridad, gravedado bajo la acción de un campo eléctrico (electro-cromatografía)
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Cromatografía en Papel y Capa Fina (TLC)
Sembrado:
Puntiforme Banda
Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)
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x
Cualitativa
x x x x x
Identificación Pureza Ausencia
Cuantitativa
x x x x
Preparativa
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Fase Estacionaria (1):
Partición: La fase estacionaria es líquida,sobre un soporte sólido inerte.
1 - Común (Agua)
2 - Reversa o Inversa (parafina)
El papel contiene un 20 % de agua retenido aunquenosotros lo notemos seco, esa es la fase estacionaria.
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Exclusión molecular: Tierras de DiatomeaSephedex (geles)
Adsorción:
Silica Gel (Oxido de Silicio).Alumina (Oxido de Aluminio).Celulosa.Fluorisil (Silicato de Magnesio).Sulfato de Calcio.
Fase Estacionaria (2):
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Intercambio Iónico:
Resinas
Catiónicas
Aniónicas
Acido sulfónico
RSO2- H+
Acido carbóxilico
Ión amonio cuaternario
Grupo amina
RCO2- H+
R3NR+ OH-
R3NH3+ OH-
Fase Estacionaria (3):
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Fase Móvil
COOHOHNH2SHCHOCOCOOROCH3
Hidrocarburos No SaturadosHidrocarburos Saturados
Acidos carboxílicosAlcoholesAminasTiolesAldehidosCetonasEsteresEteres
Alta
Baja
Polaridad
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Cromatografía de capa fina (1)
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Revelado Difiere de acuerdo al objetivo planteado
Clasificación de reveladores
H2SO4
I2
Lámpara ultravioleta
No Destructivo
Destructivo
Técnica de bañadoAplicación
Técnica de pulverización
Revelado (1)
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H2SO4
Lámpara ultravioleta
I2
Ftalato de anilina (azúcares)
Ninhidrina (Amino-ácidos) Resorcina (Cetosas)Difenilamina + U.V. 254 (I. Clorados)
Generales
Selectivo
Específico
Revelado (2)
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Estimación del área de la mancha (por medida, pesada)
Determinación indirecta (raspado y valoración)
Determinación directa (Densitómetro)
Detector Fuente de luz
Placa cromatográfica
Cromatografía Cuantitativa
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AguaMetanolEtanolAcetonaPiridinaEter dietil.CloroformoBencenoTetraclorurode CarbonoCiloexanoEter de petróleo
Polaridad Compuesto a Cromatografiar Técnica
CompuestosiónicosAcidosFenolesAlcoholesAminasEsteresAldehídosCetonasNitro deriv.Halogeno deriv.Hidrocarburosalinfáticos
Disolventes
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Cromatografía Sobre Columna
•Cromatografía Gas- Líquido•Cromatografía Líquida de Alta
Resolución (HPLC)
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Fundamento
Todo el proceso de separación acontece en la columna
A la salida de la columna existe un detector quedetecta cada componente eluído
La respuesta adopta la forma de un pico maso menos Gaussiano.
La separación es tanto mas eficaz cuanto mas resueltos aparezcan los picos.
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INSTRUMENTACIÓN
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CROMATOGRAFIA DE GASES (G.C.)
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Columnas (1)
Son de acero inoxidable o vidrio, tienen un diámetro de 3 a 6 mm y una longitud de 1 a 5 m. Se rellenan con la fase estacionaria sólida o un soporte inerte recubierto con la fase estacionaria
Columnas empaquetadas
Columnas tubulares abiertas o capilares
Son de sílice fundida, son mucho más finas y mas largas que las empaquetadas.Tienen mayor resolución y sensibilidad.Tienen menor tiempo de análisis y se maneja menor cantidad de muestra
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Columnas (2)No se puede mostrar la imagen en este momento.
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Gases Portadores
La elección de la fase móvil influye en el funcionamiento de la columna y el detector. Los gases más utilizados son: H2, He y N2. Los flujos son distintos, mientras que el de N2 es 10 cm/s, el H2 y el He pueden utilizarse a un flujo mayor.
Por lo tanto se debe mantener el el flujo del gas portador a una velocidad constante.
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Inyección de la muestra (1)
La muestra se inyecta con un jeringa a través de un septup de goma y se vaporiza. Generalmente 0.1 a 10 µL.Se controla la temperatura del horno de inyección.Para columnas tubulares se usan puertos de inyección más elaborados pues no pueden manejarse muestras tan grande.
La inyección se fraciona: Sólo el 0.1 a 10 % del volumen de 0.1 a 2 µL de muestra inyectada llega a la columna; el resto se elimina.
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(CG)
Ejemplos:Conductividad térmica ( general-no destructivo)Ionización en llama (destructivo)Captura electrónica (específico-no destructivo)
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Detector de Conductividad Térmica (1)
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Detector de Conductividad Térmica (2)
Consiste en un filamento caliente de tungsteno.La resistencia eléctrica del filamento aumenta con su temperatura.
Cuando de la columna emerge un soluto, la conductividad térmica de la corriente de gas disminuye, de modo que el filamento se enfría, baja la resistencia y se observa un cambio en la señal de salida.
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Detector de Conductividad Térmica (3)
Responde linealmente en cuarto órdenes de magnitud de concentración del soluto.
1-
El H2 y He producen la mayor sensibilidad. Por ser los gases con mayor conductividad térmica.
2-
Para aumentar la sensibilidad:3-
Se eleva la corriente del filamentoa-Se reduce el gasto en el detectorb-
Se reduce la temperatura en el cuerpo del detectorc-
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Detector de Ionización de Llama (1)
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Detector de Ionización de Llama (2)La señal es proporcional al número de carbonos susceptiblesde ionizarse
1-
La respuesta es lineal en siete órdenes de magnitud de concentración del soluto.
2-
La señal de fondo (valor de referencia) es muy estable.3-
Los átomos de carbono de compuestos orgánicos pueden producir radicales CH, los cuales a su vez producen iones CHO+ en la llama
CH + O CHO+ + e-
Sólo uno de cada 10 000 átomos produce un ión.
No es sensible a CO2, H2O y NH3
La sensibilidad es mas de 100 veces mayor que la del detector de conductividad térmica. También es unas 2 veces mayor cuando el gas portador es N2 que cuando es He.
4-
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Otros detectores (1):Detector de captura de electrones:El N2 que entra al detector es ionizado por electrones de alta energía (rayos β) que se emiten de una lámina delgada que contiene 63Ni o 3H. Se produce una corriente hacia el ánodo constante. Cuando llega una molécula de analito con alta afinidad electrónica, capturan algunos de los electrones y la corriente hacia el ánodo disminuye.
Es especialmente sensible a moléculas que contienen halógenos, grupos carbonilo conjugados, grupos nitrilo, compuestos nitro y compuestos organometálicos.
No es sensible a hidrocarburos, alcoholes y cetonas.
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Otros detectores (2):
Detector fotométrico de llama
Es un fotómetro de emisión óptica, útil para el análisis de compuestos que contienen fósforo (536 nm) y azufre (394 nm).
Espectrofotómetros de masa
Espectrofotómetros de infrarrojo de transformada de Fourier
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Análisis Cualitativo
Comparar el tiempo de retención del pico del problema con el de un patrón.
Se agrega al problema una muestra conocida. Si el tiempo de retención es idéntico al de un componente del problema, el área de ese pico aumentará.
Métodos Analíticos (1)
Se debe identificar en dos o más tipos de columnas.
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Métodos Analíticos (2)
Análisis Cuantitativo
El área de un pico es proporcional a la cantidad de ese componente.1- Los cromatógrafos modernos tienen integradores y computadoras que calculan las áreas2- Planímetro.3- Para un pico gaussiano, el producto de la altura por el ancho medido a la altura media es igual al 84 % del área total4- Puede dibujarse un triángulo con dos lados tangentes a los puntos de inflexión en cada lado del pico. El área es 96 % del área de un pico gaussiano.
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Métodos Analíticos (3)
Cómo los detectores no responden de la misma manera a todos los solutos, debe medirse un factor de respuestaempírico F
Concentración del soluto Área del solutoConcentración del patrón Área del patrón
= F
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INSTRUMENTACIÓN
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CROMATOGAFIA LIQUIDA DE ALTA PERFORMANCE (H.P.L.C.)
Desgasificador
de disolventes
Abastecimiento
de disolvente
Filtro
Bomba
Válvula de seguridad y purga
Columna analítica
Espacio térmico
Lectura
Amplificador
Recoleccióno descarga
Descarga
Gases disueltos
Jeringa o válvula para la muestraIntroducción de la muestraPreco-
lumna
Medidorde presión
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Fase estacionaria
Todos los tipos de cromatografía pueden realizarse en el modo de alta resolución.
Un soporte común es el partículas microporosas de sílice con diámetro de 5 a 10 µm.
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Disolventes
Los disolventes utilizados deben ser muy puros.
Se puede utilizar un solo disolvente (elección isocrática).
Se puede cambiar un solo disolvente por otro luego de un tiempo apropiado.
Se puede cambiar continuamente de composición del disolvente (elección por gradiente).
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Bombas
La calidad de una bomba es determinada por el grado de estabilidad y reproducibilidad del flujo que genera
Se trabaja hasta 10 mL/min a presiones hasta de 40 Mpa (400 atm)
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Válvula de Inyección:
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HPLC
(Detector de índice de refracción)
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Detector Ultravioleta (1)
Celda de flujo:0.5 cm de camino ópticoy 10 µL de capacidad
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Detector Ultravioleta (2)
Es el detector más utilizado, porque muchos solutos absorben dicha radiación y es bastante sensible a ella
El sistema más simple emplea la emisión a 254 nm de una lámpara de mercurio y detección a una sola longitud de onda.
También se utilizan una lámpara de deuterio y un monocromador para mediciones a longitud de onda variable.
El intervalo lineal comprende cinco órdenes de magnitud de concentración de soluto
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Detector de Índice de Refracción
Es casi universal, responde a casi cualquier soluto.
La sensibilidad es unas mil veces menor que la de un detector ultravioleta, y no es útil en gradiente.
Detector Electroquímico
Es bastante selectivo, porque sólo cientos analitos se oxidan o se reducen con facilidad.
Pueden detectarse por oxidación: fenoles, aminas aromáticas, peróxido y mercaptanos. Y por reducción: cetonas, aldehidos y nitrilos.
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Otros detectores:
ultravioleta 0.1 - 1 siíndice de refracción 100 - 1000 noelctroquímico 0.01 - 1 nofluorescencia 0.001 - 0.01 siconductividad 0.5 - 1 noespectrofotometría de masa 0.1 - 1 siinfrarrojo de tranformada de Fourier 1000 si
DetectorLímite de detección
¿Util con gradiente?
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES
Son al día de hoy dos poderosísimas herramientas de análisis
Ambas admiten acoplamiento con otras técnicas de detección(hibridación de técnicas, por ejemplo con espectrometría de masas o plasmas..etc)
La cromatografía de gases, requiere muestras gaseosas o fácilmente volatilizables.
El resto de muestras que no poseen esas características puedenser analizadas por HPLC.
Ambas técnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades queofrece la selección de la columna cromatográfica, permiten abordaranálisis de multicomponentes en muestras de diversa procedencia, conelevada precisión y sensibilidad (dependiendo del detector).
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EJEMPLO CG
