Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de ...

Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las prominencias maxilar y mandibular

de embriones de pollo.

Yorindel Juliana Cardozo Amaya

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Odontología

Bogotá, Colombia

2019

Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las prominencias maxilar y mandibular

de embriones de pollo.

Yorindel Juliana Cardozo Amaya

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Odontología

Director:

Ph.D. Médico Veterinario. Edwin Acosta Virgüez

Codirector:

M.Sc. Odontólogo. Belfran Carbonell Medina.

Línea de Investigación:

Genética del Crecimiento y Malformaciones

Grupos de Investigación:

Morfología y Ecología Evolutiva (Biología)

Crecimiento y Desarrollo Craneofacial (Odontología)

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Odontología

Bogotá, Colombia

2019

A Mamá y a mi Maye que son la base y el soporte de mi vida. A Ush, mi hermanita. A Camilo, que aún sin estar, siempre permanece y confía en mí. Y, por último, A mis amigos de laboratorio, sin ustedes no hubiera sido lo mismo. .

Contenido VI

Agradecimientos

Doctora Clementina Infante Contreras, por haberme recibido en el programa de Maestría

en Odontología.

Doctor Humberto Arboleda Granados, por abrir las puertas y permitir el uso de los equipos

de laboratorio del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia.

Doctor Gonzalo Arboleda, director del grupo de investigación Muerte Celular por el permiso

para el uso del cuarto de cultivo.

Profesor Mauricio Rey, por la instrucción en el manejo de cultivos y aporte de materiales

necesarios para su desarrollo.

Laboratorio Nacional de diagnóstico Veterinario del Instituto Colombiano Agropecuario

LNVD-ICA, al profesor Néstor Mossos Campos y a Ingeniero Diego José Alarcón Galindo,

Gerente Operativo de Triángulo Pollo Rico S.A.S., por la donación de los huevos

fertilizados para la realización de esta investigación.

Este proyecto fue financiado con el Convenio De Cooperación Especial No. 201527–2015

a través del proyecto # 3731 del Banco de la República, al proyecto HERMES 35853 y

37504 de la DIB UNAL.

Gracias a la Facultad de Ciencias, y de Odontología de la Universidad Nacional por el

apoyo e infraestructura.

Contenido VII

Resumen

La vía de señalización Notch es compleja puesto que es temporal y contexto- dependiente;

durante la diferenciación celular está involucrada repetidamente en gran variedad de

procesos y su modulación tiene un potencial terapéutico, promoviendo la homeostasis en

los tejidos. Tanto la activación canónica como la no canónica de la vía Notch puede

promover la transcripción de genes diana de la vía Notch, entre ellos Hey1.

Diversos estudios han mostrado presencia de la señal de algunos componentes de la Vía

Notch durante el desarrollo de las prominencias faciales, y específicamente marcación del

gen diana Hey1 en las prominencias maxilar (PMx) y mandibular (PMn) de embriones de

pollo. Sin embargo, no se conoce si esta marcación se deriva de procesos canónicos o no

canónicos de la vía por lo que en este estudio se propuso establecer si la expresión de

Hey1 en la prominencia maxilar y mandibular depende exclusivamente de la vía canónica

de Notch.

Para alcanzar este objetivo se hizo necesario primero, describir la expresión de los

diferentes componentes de la vía Notch; y en específico, los sitios de expresión del gen

diana Hey1. Enseguida, detallar la expresión de los componentes de la vía Notch en el

ectodermo de las prominencias maxilar y mandibular (donde se hizo evidente su

expresión); para finalmente determinar la expresión de Hey1 al inhibir la liberación de

NOTCHIC (la porción intracelular del receptor Notch) en las prominencias maxilar y

mandibular.

Para esto, se identificó la expresión y los sitios de expresión mediante RT-PCR, hibridación

in situ e inmunofluorecencia sobre cortes; se detalló la expresión en el ectodermo,

mediante la separación del ectodermo y la medición de la transcripción de los diferentes

componentes mediante RT-PCR y finalmente se determinó si la expresión de Hey1 se

debía a la liberación de NotchIC, inhibiendo esta liberación farmacológicamente (in vitro e

VIII Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las

prominencias maxilar y mandibular de embriones de pollo

in vivo) usando DAPT - un inhibidor de γ-secretasa -, y midiendo la transcripción de los

diferentes componentes de la vía, entre ellos Hey1, mediante RT-PCR e hibridación in situ.

Los resultados obtenidos mostraron que definitivamente todos los componentes de la vía

Notch que fueron estudiados están presentes en la PMx y PMn; adicional a esto todos

estos componentes (a excepción de Notch2 quien solo se expresa en el ectodermo), se

expresan tanto se en el ectodermo como en el mesénquima, pero, es necesaria la

presencia del ectodermo para el mantenimiento de la expresión de los ligandos Jag/Ser1

y Dll1 y los genes diana Hey1 y Hey2 en el mesénquima de las prominencias

(aparentemente con una activación no canónica de la vía). Y además, la expresión de los

genes diana de la Vía Notch se mantiene, incluso después de haber inhibido la liberación

de NotchIC.

Por lo anterior se concluye que: la expresión de los componentes de la vía Notch coincide

con los resultados de otros autores, confirmando que la vía Notch podría estar cumpliendo

una función importante en la morfogénesis, y posiblemente en desarrollo de las estructuras

derivadas de la PMx y la PMn; el ectodermo cumple una función fundamental en el

mantenimiento de señales de la vía Notch en el mesénquima; y finalmente, la expresión

de Hey1 en la PMx y la PMn NO depende exclusivamente de la vía canónica de Notch.

Palabras clave: Anomalías congénitas, Hey1, Crecimiento y Desarrollo, Ectodermo y Mesénquima, Vía de señalización Notch.

Contenido IX

Abstract

The Notch signaling path is complex, because it is temporal and context-dependent; during

cell differentiation it is repeatedly involved in a great variety of processes and its modulation

has a therapeutic potential, promoting homeostasis in tissues. Both canonical and non-

canonical activation of the Notch pathway can promote the transcription of target genes of

the Notch pathway, including Hey1.

Several studies have shown the presence of the signal of some components of the Via

Notch during the development of facial prominences, and specifically marking of the Hey1

target gene in the maxillary (PMx) and mandibular (PMn) prominences of chicken embryos.

However, it is not known if this marking is derived from canonical or non-canonical

processes of the pathway, so in this study it was proposed to establish whether the

expression of Hey1 in maxillary and mandibular prominence depends exclusively on the

canonical Notch pathway.

In order to achieve this goal it was first necessary to describe the expression of the different

components of the Notch pathway; and specifically, the sites of expression of the target

gene Hey1. Next, detail the expression of the components of the Notch pathway in the

ectoderm of the maxillary and mandibular prominences (where its expression became

evident); to finally determine the expression of Hey1 by inhibiting the release of NOTCHIC

(the intracellular portion of the Notch receptor) in the maxillary and mandibular

prominences.

For this, expression and expression sites were identified by RT-PCR, in situ hybridization

and immunofluorescence on cuts; the expression was detailed in the ectoderm, by

separating the ectoderm and measuring the transcription of the different components by

RT-PCR and finally it was determined whether the expression of Hey1 was due to the

X Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las


release of NotchIC, inhibiting this release pharmacologically (in in vitro and in vivo) using

DAPT - a γ-secretase inhibitor -, and measuring the transcription of the different

components of the pathway, including Hey1, by RT-PCR and in situ hybridization.

The results obtained showed that definitely all the components of the Notch pathway that

were studied are present in the PMx and PMn; In addition, all these components (except

for Notch2, which is only expressed in the ectoderm), are expressed both in the ectoderm

and in the mesenchyme, but the presence of the ectoderm is necessary for the

maintenance of the expression of the ligands Jag / Ser1 and Dll1 and the target genes Hey1

and Hey2 in the mesenchyme of the prominences (apparently with a non-canonical

activation of the pathway). And in addition, the expression of the target genes of the Via

Notch is maintained, even after inhibiting the release of NotchIC.

Therefore, it is concluded that: the expression of the components of the Notch path

coincides with the results of other authors, confirming that the Notch pathway could be

playing an important role in morphogenesis, and possibly in the development of the

structures derived from the PMx and the PMn; the ectoderm plays a fundamental role in

maintaining signals of the Notch pathway in the mesenchyme; and finally, the expression

of Hey1 in the PMx and the PMn does NOT depend exclusively on the canonical Notch

mecanisms.

Keywords: Congenital Abnormalities, Hey1, Growth and Development, Ectoderm and

Mesenchyme, Notch signaling pathway.

Contenido XI

Contenido

1 Capítulo 1. Marco teórico. ...................................................................................... 23

1.1 Desarrollo temprano, formación de arcos branquiales y prominencias faciales.

23

1.2 CCN y la vía de señalización Notch. ................................................................... 28

1.3 Notch en el patronamiento de los AB. ................................................................ 29

1.4 La vía de señalización Notch. ............................................................................. 31

1.4.1 Ligandos canónicos de la vía Notch. ................................................................... 33

1.4.2 Ligandos no canónicos de la vía Notch ............................................................... 35

1.4.3 Receptores Notch. .............................................................................................. 36

1.4.4 Activación y regulación de la vía Notch. .............................................................. 38

1.4.5 Genes diana de la vía Notch. .............................................................................. 40

1.4.6 Hey, Gen diana de la vía Notch........................................................................... 41

1.5 Alteraciones de la vía Notch y sus consecuencias en el desarrollo

craneofacial. ................................................................................................................. 41

2 Capitulo2. Expresión de diferentes componentes de la vía Notch en las

prominencias maxilar y mandibular. ........................................................................... 43

2.1 Introducción. ........................................................................................................ 44

2.2 Metodología. ......................................................................................................... 46

2.2.1 Incubación de embriones y extracción de embriones. ......................................... 46

2.2.2 Disección de las prominencias maxilar y mandibular. ......................................... 47

2.2.3 División de las prominencias maxilar y mandibular en fragmentos. ..................... 47

2.2.4 Extracción de RNA. ............................................................................................. 48

2.2.5 Retrotranscripción. .............................................................................................. 49

2.2.6 PCR. ................................................................................................................... 49

2.2.7 Hibridación in situ. ............................................................................................... 51

2.2.8 Preparación de embriones para secciones histológicas. ..................................... 52

2.2.9 Inmunofluorescencia de secciones histológicas. ................................................. 52

2.3 Resultados. .......................................................................................................... 54

XII Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las


2.3.1 Expresión de diferentes componentes de la vía Notch en las prominencias maxilar

y mandibular. .................................................................................................................. 54

2.3.2 Descripción de la distribución de N1 en la PMx y PMn. ....................................... 55

2.3.3 Descripción de la distribución de Hey1 en la PMx y PMn..................................... 56

2.4 Discusión. ............................................................................................................. 58

2.5 Conclusiones. ....................................................................................................... 62

3 Capítulo 3. Expresión de la vía Notch en el ectodermo de las prominencias

maxilar y mandibular, y su relación con la expresión en el tejido subyacente

“mesénquima”. ............................................................................................................. 63

3.1 Introducción. ......................................................................................................... 65

3.2 Metodología. ......................................................................................................... 67

3.2.1 Incubación y extracción de embriones. ................................................................ 67

3.2.2 Preparación de láminas histológicas. ................................................................... 67

3.2.3 Tinción de ácido peryodico de schiff (PAS del inglés Periodic Acid-Schiff). ......... 67

3.2.4 Disección de las prominencias maxilar y mandibular, y separación del ectodermo.

68

............................................................................................................................... Cultivo de tejidos

....................................................................................................................................... 70

3.2.5 ................................................................................................................................ 70


3.2.7 Retrotranscripción................................................................................................ 70

3.2.8 PCR. .................................................................................................................... 71

3.3 Resultados. ........................................................................................................... 73

3.3.1 Determinación de la existencia de la lámina basal subyacente al ectodermo de las

prominencias. ................................................................................................................. 73

3.3.2 Expresión de la vía Notch en el ectodermo y el mesénquima de las prominencias.

73

3.3.3 Influencia del ectodermo en el mantenimiento de la expresión de componentes de

la vía Notch en el mesénquima de las prominencias. ...................................................... 74

3.4 Discusión. ............................................................................................................. 77

3.5 Conclusiones ........................................................................................................ 82

4 Capítulo 4. Expresión de Hey1 al inhibir la liberación de NOTCHIC en las

prominencias maxilar y mandibular. ........................................................................... 83

4.1 Introducción. ......................................................................................................... 84

4.2 Metodología. ......................................................................................................... 86

4.2.1 Incubación y extracción de embriones. ................................................................ 86

4.2.2 Cultivo celular. ..................................................................................................... 86

4.2.3 Ensayos para determinar concentración ideal de DAPT. ..................................... 88

Contenido XIII

4.2.4 Ensayos de toxicidad celular para tratamiento con DAPT. .................................. 89

4.2.5 Conteo celular con azul de tripán. ....................................................................... 89

4.2.6 Disección y cultivo organotípico de las prominencias maxilar y mandibular. ....... 90

4.2.7 Tratamientos con DAPT en cultivo organotípico de prominencias (PMx y PMn) in

vitro. 91

4.2.8 Inmunofluorecencia sobre cultivo celular. ............................................................ 91


4.2.10 Retrotranscripción. ............................................................................................ 91

4.2.11 PCR. ................................................................................................................. 92

4.2.12 Tratamientos de DAPT in vivo. .......................................................................... 93

4.2.13 Hibridación In Situ. ............................................................................................ 93

4.3 Resultados. .......................................................................................................... 94

4.3.1 Estandarización del cultivo primario derivado de prominencias maxilar y

mandibular. .................................................................................................................... 94

4.3.2 Efecto del tratamiento con DAPT en la expresión de Hey1 y NOTCHIC. ............ 96

4.3.3 Expresión de Hey1 y otros componentes de la vía Notch al inhibir el complejo γ-

secretasa en las prominencias. ...................................................................................... 98

4.4 Discusión. ............................................................................................................101

4.5 Conclusiones. .....................................................................................................106

4.6 Sugerencias ........................................................................................................107

5 Bibliografía. ............................................................................................................120

XIV Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las


Lista de Imágenes

Pág.

Figura 1. 1. Formación de las células de la cresta neural. .............................................. 24

Figura 1. 2. Migración de las CCN. ................................................................................. 25

Figura 1. 3 Estructura de los AB. .................................................................................... 27

Figura 1. 4. Código Dlx en el patronamiento de la PMx, PMn y AB2. ............................. 31

Figura 1. 5. Ligandos canónicos de la vía Notch. ........................................................... 34

Figura 1. 6. Ligandos no canónicos de la vía Notch. ...................................................... 36

Figura 1. 7.Receptores Notch. ........................................................................................ 37

Figura 2. 1. Extracción de embriones. ............................................................................ 46

Figura 2. 2. Disección de las prominencias maxilar y mandibular de embriones de pollo

en estadío HH23. ............................................................................................................ 48

Figura 2. 3. Expresión de genes transcritos correspondientes a la Vía Notch. ............... 54

Figura 2. 4. Patrones de expresión de N1 en las prominencias maxilar y mandibular de

embriones de pollo en estadío HH23. ............................................................................. 55

Figura 2. 5. Patrones de expresión de Hey1 en las prominencias maxilar y mandibular de


Figura 2. 6. Expresión de HEY1 en cortes histológicos de las prominencias maxilar y

mandibular. ..................................................................................................................... 57

Figura 3. 1. Retiro de ectodermo de las prominencias maxilar y mandibular de embrión

de pollo en estadío HH23. ............................................................................................... 69

Figura 3. 2. Presencia de la lámina basal en las prominencias maxilar y mandibular. .... 73

Figura 3. 3. Expresión de diferentes genes de la vía Notch en el ectodermo y

mesénquima de las prominencias (PMx y PMn). ............................................................. 74

Figura 3. 4. Expresión de los componentes de la vía Notch en las prominencias integras

(PMX y PMn), y en el mesénquima sin influencia del ectodermo. ................................... 75

Figura 3. 5. Expresión de los componentes de la vía Notch en el ectodermo

prominencias (PMx y PMn), sin influencia del mesénquima. ........................................... 76

Figura 3. 6. Expresión de genes de la vía Notch en ectodermo y mesénquima de las

prominencias maxilar y mandibular. ................................................................................ 80

Contenido XV


prominencias maxilar y mandibular. ............................................................................... 83

Figura 4. 1. Tipo de envase usado para el cultivo, dependiendo del experimento a

realizar. .......................................................................................................................... 87

Figura 4. 2. Diseño experimental para la determinación de concentración ideal de DAPT

para inhibir Hey1 en el cultivo celular. ............................................................................ 88

Figura 4. 3. Diseño experimental para la determinación de toxicidad celular de DAPT a

una concentración de 20µM. .......................................................................................... 89

Figura 4. 4. Ecuación para realizar el cálculo de viabilidad celular con Azul de Tripán. . 90

Figura 4. 5. Cultivo celular primario derivado de prominencias maxilar y mandibular de


Figura 4. 6. Contraste de cultivos celulares con y sin tratamiento con DAPT. ................ 96

Figura 4. 7. Expresión de Hey1 cuando se aplican diferentes concentraciones de DAPT.

....................................................................................................................................... 96


....................................................................................................................................... 97


....................................................................................................................................... 97

Figura 4. 8. Expresión de NOTCHIC (NICD) clivado al realizar tratamientos con DAPT. 98

Figura 4. 9. Expresión de genes de la vía Notch en el cultivo organotípico de las

prominencias tratadas con DAPT. .................................................................................. 99

Figura 4. 10. Expresión de Hey1 en embrión de pollo al realizar tratamiento in vivo con

DAPT. ...........................................................................................................................100

Figura 4. 11. Resumen de la dinámica de la vía Notch en las prominencias maxilar y

mandibular de embriones de pollo en estadío HH23. ....................................................104


mandibular de embriones de pollo en estadío HH23. ...............................................105

XVI Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las


Lista de tablas

Pág.

Tabla 2. 1. Número de embriones por experimento ........................................................ 47

Tabla 2. 2. Temperaturas de anillamiento utilizadas para cada uno de los genes de la vía

Notch. ............................................................................................................................. 49

Tabla 2. 3. Cebadores usados para cada uno de los genes de la vía Notch. .................. 50

Tabla 3. 1. Número de embriones por experimento. ....................................................... 67

Tabla 3. 2. Temperaturas de anillamiento utilizadas para cada uno de los genes. .......... 71

Tabla 3. 3. Cebadores usados para cada uno de los genes. .......................................... 71

Tabla 4. 1. Número de embriones por experimento. ...................................................... 86

Tabla 4. 2. Temperaturas de anillamiento utilizadas para cada uno de los genes. ......... 92

Tabla 4. 3. Cebadores usados para cada uno de los genes. ......................................... 92

Tabla 4. 4. Porcentajes de viabilidad celular en cultivos tratados y no tratados con DAPT

al 20uM. .......................................................................................................................... 95

Lista de símbolos y abreviaturas

AB Arcos Branquiales

AER Cresta Apical Ectodérmica

ANK Repeticiones De Ankirina

Bmp Proteína Morfogenética Ósea

CCN Células De La Cresta Neural

CCNC Células De La Cresta Neural Craneal

CCNT Células De La Cresta Neural Troncal

CN Cresta Neural

CSL Cbf1, Su(H), Lag1

D Dominio Dorsal

DAPT N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine T-Butylester

DICD Porcion Intracelular De Delta

Dlk1 Delta-Like1

Dll1 Delta1

Dll2 Delta2

Dll3 Delta3

Dll4 Delta4

Dlx Distal-Less Homeobox

DSL Delta, Serrate, Lag2

E Ectodermo

EGFL7 EGF-Like Domain-Containing Protein 7

EGF-like Repeticiones Similares Al Factor De Crecimiento Epidérmico

E-M Epitelio-Mesenquimal

EMI Dominio Similar A Emilina

EN Ectodermo Neural

End1 Endotelina1

ENN Ectodermo No Neural

ETA Receptor De Endotelina Tipo A

EtOH Etanol

FEZ Zona Ectodermal Frontonazal

Fgf Factor De Crecimiento Fibroblástico

Fzd Frizzled Receptor

GAPDH Gliceraldehído-3-Fosfato Deshidrogenasa

Hes1 Hairy/Enhancer Of Split Motif 1



18 Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de NotchIC en las

prominencias maxilar y mandibular de embriones de pollo.

Hey1 Hes Related Family Bhlh Transcription Factor With Yrpw Motif 1

Hey2 Hes Related Family Bhlh Transcription Factor With Yrpw Motif 2

HeyL Hes Related Family BHLH Transcription Factor With YRPW Motif L

Hox Homeobox

I Dominio Intermedio

Jag/ser Jagged/Serrate

Jag1 Jagged1

Jag2 Jagged2

JICD Porción Intracelular De Jagged

KUZ Kuzbanian

L Ladder (Marcador De Peso)

LNG Lin12/Notch/Glp1

M Mesénquima

ML Mesodermo Lateral

N1 Notch1

N2 Notch2

NECD Notch Extracelular Domain

NotchIC Porción Intracelular De Notch

NSL Secuencias De Localización Nuclear

NTMD Notch Transmembranal Domain

P Prominencia Integra

PAS Ácido Peryodico De Schiff

PFn Prominencia Frontonasas

PMn Prominencia Mandibular

PMx Prominencia Maxilar

Ra Ácido Retinóico

RAM Región De Unión A Rbpjκ

S1 Primer Clivaje Del Receptor Notch

S2 Segundo Clivaje Del Receptor Notch

S3 Tercer Clivaje Del Receptr Notch

Shh Sonic Hedgegoh

Tgf-β Factor De Crecimiento Transformante-Β

TN Tubo Neural

V Dominio Ventral

vWFC Región Similar Al Factor Willebrand Tipo C

Wnt Wingless-Int

Nota: En general, para los componentes de las vías de señalización, las siglas escritas únicamente

con su inicial en mayúscula hacen referencia a los ácidos nucleicos, mientras que las siglas escritas

completamente en mayúsculas hacen referencia a las proteínas.

Capítulo 1 Marco teórico 19

Introducción

Una gran cantidad de malformaciones que se dan en los seres humanos se presentan en

el componente craneofacial; estos trastornos afectan a los individuos de manera integral

(física, social, ambiental, cultural, etc.) por lo que a través del tiempo se han despertado

inquietudes sobre las causas de su origen y desarrollo.

Las malformaciones craneofaciales se han abordado a partir de diferentes puntos de vista:

histológico, anatómico y fisiológico, entre otros; pero los más comunes últimamente, son el

genético y molecular, debido a que responden varias inquietudes al respecto y dan

resultados más precisos sobre la causa de las perturbaciones, lo que se ha denominado de

manera amplia el estudio de la Biología del Desarrollo Craneofacial.

Para que se lleven a cabo diferentes funciones en el desarrollo de organismos

pluricelulares, las células tienen que comunicarse, así como lo hacen de forma macro, los

seres humanos. La comunicación de célula a célula es dada por la unión de ligandos a

receptores, generando señales químicas que desencadenan una cascada de mecanismos

intracelulares utilizados para cambiar el comportamiento celular. Estos mecanismos son

conocidos como vías de señalización (1).

Los estudios sobre desarrollo craneofacial llevados a cabo con diferentes modelos, han

mostrado una fuerte señalización de los componentes de la vía Notch en prominencias

faciales (2); también en centros de origen de órganos de los sentidos, conocidos como

plácodas (3). Las perturbaciones de la actividad de esta vía se han relacionado con varios

trastornos genéticos humanos como el síndrome de Alagille, el cual se caracteriza por

mutaciones en Jagged1 (Jag1) - un ligando de esta vía de señalización -, o mutaciones en

el gen Jagged2 (Jag2), que dan como resultado, malformaciones como paladar fisurado y



anquiloglosia (4)(5). Por otro lado, mutaciones inducidas en uno de los genes diana de esta

vía, Hes1, producen defectos en estructuras que se derivan de Células de la Cresta Neural

(CCN) Craneal: paladar fisurado, agenesia del hueso frontal, malformación de base craneal,

y disminución en el tamaño del maxilar superior e inferior, por mencionar algunos (6)(7).

La vía de señalización Notch es muy conservada, y se ha estudiado ampliamente desde

que fue descubierta hace casi 90 años por Morgan y Col., quienes observaron que la

pérdida parcial de ésta, resultaba en la formación de muescas en el margen del ala de la

mosca Drosophila melanogaster (8).

El mecanismo de señalización de la vía Notch involucra el contacto de una célula con su

vecina (9). Los receptores Notch, se unen canónicamente a los ligandos transmembrana,

Delta, Serrate y Lag2 (DSL); o a ligandos no canónicos, un grupo heterogéneo de

moléculas, que no pertenecen al grupo DSL; uno de ellos es el ligando tipo Delta-like 1

(Dlk1), conocido también como Pref-1, que puede actuar como inhibidor de ligandos DSL o

activador de receptores Notch (10).

La unión ligando-receptor, promueve una serie de clivajes proteolíticos en el receptor Notch,

que involucran a la enzima γ-secretasa. Estos clivajes resultan en la liberación del dominio

intracelular del receptor, denominado NOTCHIC o NICD por sus siglas Notch Intracelular

Domain, que cumple varias funciones como transductor de señal biológicamente activo(11).

Una vez liberado NotchIC, se transporta al núcleo, interactúa con cofactores que

contribuyen a la transcripción de varios genes diana. En los diversos estudios se han

descrito los genes diana para diferentes especies: en Drosophila, E(spl); en C. elegans,

REF-1 y en mamíferos: Hes, Hey, y Esr (12)(13). En pollo se han estudiado los genes Hey

y Hes (2).

El grupo de investigación Crecimiento y Desarrollo Craneofacial de la Universidad Nacional

de Colombia (Facultad de Odontología), y en los últimos años en equipo con el grupo de

Morfología y Ecología Evolutiva (Facultad de Ciencias) han venido incursionando en la

señalización génica de Notch en el componente craneofacial de embriones de pollo (14). El

grupo de Crecimiento identificó la presencia de expresión de Hey1 a través de Hibridación


in situ en prominencias faciales durante estadíos iniciales (HH14 a HH25). Un hallazgo

importante fue que en el estadío HH23, a los 4 días de incubación, cuando ya hay una

especificación clara de cada uno de los tejidos embrionarios de las prominencias, y las CCN

han migrado ya a los arcos (15); se observa la expresión de Hey1 en la fosita nasal,

prominencia maxilar y el área ventral y dorsal de la prominencia mandibular (16).

Aunque definitivamente, tal como se menciona en el párrafo anterior, existe una expresión

del gen diana Hey1 en la prominencia maxilar y mandibular, no se conoce si esta expresión

en esas prominencias se debe a la liberación de NotchIC mediada por γ-secretasa, o por el

contrario, si la expresión se da independiente del clivaje del receptor, promovido a través

de otro mecanismo (17); entonces, es necesario determinar si se mantiene la expresión de

Hey1 al inhibir la liberación de NotchIC mediada por γ-secretasa para saber si:

¿La expresión de Hey1 en la prominencia maxilar y mandibular depende

exclusivamente de la vía canónica de Notch?



La anterior pregunta de investigación da lugar a los siguientes objetivos planteados en el

presente trabajo:

Objetivo general:

Establecer si la expresión de Hey1 en la prominencia maxilar y mandibular depende

exclusivamente de la vía canónica de Notch.

Objetivos específicos:

Describir la expresión de los diferentes componentes de la vía Notch; y en específico, los

sitios de expresión del gen diana Hey1.

Detallar la expresión de los componentes de la vía Notch en el ectodermo de las

prominencias maxilar y mandibular.

Determinar la expresión de Hey1 al inhibir la liberación de NOTCHIC en las prominencias

maxilar y mandibular.


1 Capítulo 1. Marco teórico.

1.1 Desarrollo temprano, formación de arcos branquiales

y prominencias faciales.

Para comprender como se estructuran las prominencias maxilar y mandibular, es necesario

conocer el origen de los tejidos que forman parte de éstas. Las capas embrionarias

denominadas: endodermo, mesodermo, y ectodermo, se organizan durante gastrulación,

un proceso que en los humanos ocurre hacia la tercera semana de vida intrauterina (18).

La gastrulación consiste en una serie de eventos donde, de un disco bilaminar conformado

por epiblasto e hipoblasto, comienzan a delaminarse y a migrar células del epiblasto a

través del nodo primitivo y de la línea primitiva, hasta generar 2 capas secundarias, el

mesodermo y consecutivamente el endodermo (19). El ectodermo se forma por una

expansión hiperbólica del epiblasto restante (20).

Genes como Nodal y Noggin son requeridos para la formación del mesodermo y endodermo

durante la gastrulación (21)(22). Así mismo, vías de señalización como la de la proteína

morfogenética ósea (Bmp), el factor de crecimiento transformante-β (Tgf-β), el factor de

crecimiento fibroblástico (Fgf) y Wingless-int (Wnt), y factores solubles cómo el ácido

retinoico (Ra) (en los dominios más caudales), participan en la diferenciación de células

progenitoras embrionarias (23), las cuales incluso in vitro son capaces de generar cuerpos

embrionarios trilaminares (24)(25).

Posterior a la gastrulación, el nodo primitivo y la notocorda (N en la Figura 1.1.), actúan

como inductores del ectodermo (26), para promover el inicio de la neurulación - proceso en

donde se forma el tubo neural (TN) a partir de Ectodermo Neural (EN) - (Figura 1.1.).



Después de que aparece el EN, se desarrolla una población de células en cada pliegue del

ectodermo que se está neurulando (Cresta Neural (CN)), entre el límite del EN y el

ectodermo no neural (ENN) (27) . Las células provenientes de estas crestas, se denominan

Células de la Cresta Neural (CCN), las cuales se subdividen en dos poblaciones: las Células

de la Cresta Neural Troncal (CCNT) y las Células de la Cresta Neural Craneal (CCNC);

diferenciados por la expresión, y la ausencia de expresión de genes Homeobox (Hox),

respectivamente (28).

Ilustración del proceso de neurulación, por el cual se forma el tubo neural y se inducen las CCN a partir

de señales provenientes de la notocorda (N). ENN: Ectodermo no neural, CN: Cresta neural, EN:

Ectodermo Neural, TN: Tubo neural; modificado de “Evolution of vertebrates as viewed from the crest”,

2015 (29).

La inducción y migración de las CCN involucra una serie de procesos: se inicia con la

inducción desde el ENN y el mesodermo lateral (ML), lo cual genera cambios

conformacionales (alteraciones en cadherinas) en la CN, promoviendo la transformación

Figura 1. 1. Formación de las células de la cresta neural.


epitelio-mesenquimal (E-M); en ese momento, las CCN ya inducidas adquieren una

dirección de migración dorsolateral, luego una migración ventral como se observa en la

Figura 1.2., para finalmente colonizar los arcos branquiales (AB) - que concomitantemente

están siendo delimitados en las regiones ventrolaterales del embrión (30)(31)(32).

Los AB son protuberancias que se hallan en la superficie lateral rostral embrionaria, están

compuestos por las tres capas embrionarias, y tal como se dijo anteriormente llegan a ser

poblados por las CCN (33).

La migración de las CCN hacia los AB es conducida por interacciones que ocurren con la

matriz extracelular y las células alrededor (otras CCN, células del mesénquima

mesodermal, y posiblemente del epitelio endodermal y ectodermal) (34). Estas

interacciones juegan un papel importante en la polarización y organización de las CCN al

interior de las estructuras que colonizan (34)(35).

Ilustración de vista sagital de la segmentación del romboencéfalo, y la migración de las Células de la

Cresta Neural a las estructuras ventrales del embrión en desarrollo (en este caso la ilustración hace

referencia a un embrión en de pollo en estadío HH23). La prominencia frontonasal (PFn) y la

prominencia maxilar (PMx) tienen poblaciones de las CCNC provenientes del Mesencéfalo (lila);

además, la PMx y la prominencia mandibular (PMn) reciben poblaciones del Romboencéfalo

(específicamente la Rombómera 1 (Azul), la Rombomera 2 (celeste) y la Rombomera 3 (Menta)). R1:

Figura 1. 2. Migración de las CCN.



Rombomera 1; R2: Rombomera 2; R3: Rombomera 3; R4: Rombomera 4; R5: Rombomera 5; R6:

Rombomera 6; R7: Rombomera 7; R8: Rombomera 8; PFn: Prominencia frontonasal; AB2: Segundo arco

branquial; AB3: Tercer arco branquial; AB4: Cuarto arco branquial. Adaptado de “The Contribution of

the Neural Crest to the Vertebrate Body”, 2006 (36).

Aunque inicialmente se encontró que el patrón de migración de las CCNC dependía del

origen axial (rombomérico o cefálico) asociado a la expresión o no de genes Hox (37)(38);

también se ha observado que otras vías de señalización pueden afectar dicho patrón: Bmp,

Fgf, Sonic Hedgehog (Shh), Wnt, y Notch (39)(40).

En el caso específico de Wnt, se ha demostrado que puede afectar (inhibir) la inducción de

las CCN o su motilidad, cuando ya están migrando (41). Así mismo, componentes de la vía

Notch, como el ligando Jagged/Serrate (Jag/Ser) y la interacción ligando-receptor (Delta-

Notch) han sido descritos en la inducción de las CCNC (42).

Una vez las CCNC han terminado de migrar, se ha encontrado en embriones de pollo, que

aquellas CCNC que darán origen a derivados ectomesenquimales se hacen HNK-1/NC1

negativas; esto ocurre entre los 3-4 días de incubación (HH18-HH23) en el pollo (43); tiempo

en el cual, los tejidos de los AB están claramente segregados: los arcos están cubiertos

externamente por ectodermo e internamente por endodermo; el mesénquima se organiza

de manera estructurada de tal forma que en su periferia están ubicadas CCN y en la región

más central se encuentran las células del mesénquima mesodermal derivado del

mesodermo paraxial cefálico (Figura 1.3.). (31)(44)(45).


Figura 1. 3 Estructura de los AB.

En la ilustración se puede observar la distribución de los diferentes tipos celulares en cada arco

branquial (AB). A. Ilustración de embrión de pollo, la línea punteada muestra el corte realizado. B. vista

dorsal de estructuras señaladas en el cuadro amarillo en “A”; en la imagen se observa grosso modo la

distribución de los tejidos que conforman los arcos branquiales. AB1: Primer arco branquial; AB2:

Segundo arco branquial. Modificado de “Development of the Pharyngeal Arches”, 2003 (46).

Luego de que se han estructurado los AB, hacia la cuarta semana de vida intrauterina en

humanos, en ratones en estadío E9.5, y en embriones de pollo en HH18; se forman una

serie de abultamientos en la zona ventral de lo que será la cabeza, llamados prominencias

faciales; de ellas, la prominencia frontonasal (PFn) - la única que no está distribuida en

pares - se sitúa en el eje medio en la región más rostral de lo que será la cabeza, y

desciende para conformar la frente y la zona central del tercio medio facial, que incluye el

área premaxilar. La PFn será limitada y dividida por las fositas nasales en tres prominencias:

la prominencia frontal, las prominencias nasales mediales, y las prominencias nasales

laterales, éstas últimas conformarán las alas de la nariz, y se aproximarán a otras

prominencias que aparecerán como abultamientos en la cercanía (superior) al AB1,

denominadas, las prominencias maxilares (PMx), quienes, junto con la PFn, contribuyen a

la formación del maxilar, del labio superior, y el paladar. Otro abultamiento (este si originado



propiamente en el AB1), dará origen a la denominada prominencia mandibular (PMn) de la

cual se desarrollará la mandíbula y sus tejidos yuxtapuestos (47)(48).

1.2 CCN y la vía de señalización Notch.

La consolidación de la cara es un fenómeno activo; éste proceso envuelve una secuencia

de eventos que dependen de las interacciones E-Ms (49)(50)(51), lo que derivará

finalmente, en el caso de las CCN, a la diferenciación de distintos tipos de células para la

conformación de los tejidos de la cabeza: neuronas, células gliales, y células que

conformaran el cartílago, el hueso y el músculo, etc. (52).

La gran mayoría de las CCN, sin importar su estado (premigratorias o migratorias), son

multipotentes (53). Estudios in vitro han mostrado que a pesar de tener el potencial para

diferenciarse en gran variedad de tejidos, las CCN únicamente se diferencian a uno de

estos, dependiendo del medio de cultivo de diferenciación en el que sean colocadas

(54)(55); es decir, que el ambiente que rodea a las CCN es determinante para su

diferenciación (34).

Una vía que controla los procesos de especificación, migración, y posterior diferenciación

de las CCNC es la vía Notch (56)(57). Realizando estudios de ganancia y pérdida de función

de Notch en embriones de ratón (E10.5) se concluyó que la ganancia de función de Notch

en las CCN genera una migración celular anormal y deficiente, y aumento de la proliferación

celular. La pérdida de la señalización Notch en CCN da como resultado una proliferación

celular disminuida y una migración deficiente (58). Adicionalmente, estudios en cultivos

derivados de células madre humanas pluripotentes, han demostrado que Notch también es

indispensable para la diferenciación de las CCN. Durante la diferenciación de las CCN se

la vía de señalización Notch se activa, evidenciado por la presencia del dominio intracelular

del receptor Notch clivado (NOTCHIC) - particularmente del receptor Notch1 (N1); además,

con la activación de N1, se observó una significativa sobrerregulación de la expresión de

los genes diana de la vía: Hes1 y Hes5, así como del gen que codifica para el ligando Jag1

(58).

Realizando los estudios de pérdida de función de Notch con DAPT durante 10 días, se notó,

un cambio de linaje en las CCN, que se traduce en una disminución en la expresión de


Neurogenina 2 y Neurogenina 3. Igualmente, las células con menor expresión del gen Jag1

mostraron una disminución de la expresión de todos los genes específicos de cresta neural,

que se estudiaron (59).

1.3 Notch en el patronamiento de los AB.

Durante el desarrollo de las prominencias faciales se ha identificado la expresión de la vía

de señalización Notch. En estudios desarrollados en embriones de pollo, en estadíos

tempranos, se describieron los patrones de expresión de los diferentes genes de la vía

Notch, a través de hibridación in situ: Notch1(N1), Jagged2 (Jag2), Hairy/Enhancer Of Split

Motif 1 (Hes1), y Hes Related Family BHLH Transcription Factor With YRPW Motif 1 (Hey1)

se identificaron en los arcos branquiales durante los estadíos HH14-HH18 (60); Notch2

(N2), Delta1 (Dll1) y Jagged1 (Jag1) mostraron su expresión en los estadíos HH14-HH23;

y para los estadíos HH19-HH25, N1 y Jag2 fueron identificados (61). En estos últimos

estadíos se observó una expresión coincidente del receptor N1 y los ligandos Jag/Ser, por

lo que los autores plantearon una posible co-expresión de estos genes (62).

Los ligandos de la vía Notch han mostrado una expresión evidente en los AB. En el modelo

de embrión de pollo (estadíos HH18 a HH25) se ha identificado la expresión de Jag1 y Jag2,

sin embargo, no se ha aclarado la función específica de estos componentes durante el

desarrollo de los AB (63); investigaciones en ratones han mostrado una fuerte expresión de

Jag2 en el epitelio de los AB durante el estadío E10.5 y también la persistencia este gen en

estructuras derivadas de estos arcos, en estadíos más avanzados. Adicionalmente, existen

reportes de la expresión de Jag2 en AB de pez cebra, en un estadío tardío de desarrollo

(36 hpf) (62)(64). De forma similar, el gen que codifica para el ligando Delta 4 (Dll4) se

expresó en los AB de embriones de pollo durante estadíos HH8-HH30, pero su expresión

es poco específica (65).

En estudios desarrollados en pez cebra (28 hpf - 36 hpf), el receptor N2 mostró un

patronamiento definido en el área de los AB, con una expresión más fuerte en las CCN más

ventrales y una expresión más débil -que coincide con la expresión de Jag1b y Hey1- en

las CCN más dorsales, delimitando patrones morfológicos entre el AB1 y el AB2 (64).



En cuanto a los genes diana, ratones Mutantes para Hes1 sufren alteraciones en las arterias

de los AB y se ha concluido que este gen puede tener un papel muy importante en la

formación de músculo liso vascular y en la proliferación celular a nivel del ectodermo

faríngeo; por otro lado, en el análisis de la expresión de Hey1, se muestra una expresión

contundente en la primera y segunda hendidura faríngea, entre E8.5 y E11.5 en embriones

de ratón, esta expresión es persistente en estructuras relacionadas con los AB. Hes

Related Family BHLH Transcription Factor With YRPW Motif 2 (Hey2) se encuentra

expresado en el AB1 de embriones de ratón en estadíos tempranos (E8.5 a E 10.5) (66),

mientras que en pez cebra se encontró expresión de este gen en el ectodermo de AB1 y

AB2 (28-36 hpf), esta expresión se extiende ventralmente en estadíos más avanzados

hasta desaparecer en el endodermo de los AB (64).

A pesar de que en el mesénquima de los AB del embrión de ratón, hay una fuerte expresión

de Hes related family BHLH transcription factor with YRPW motif L (HeyL) otro gen diana

de la vía, se ha concluido que este gen, no tiene un papel muy importante en la formación

de estructuras craneofaciales derivadas de los AB, y que su expresión no es afectada al

realizar perdida de función en mutantes homocigotos (Dll1-/- y N1-/-) (67).

La vía Notch, además, puede interactuar con otras moléculas durante el desarrollo

craneofacial. Una de las moléculas que se ha propuesto es Endotelina1 (End1), la cual

garantiza la identidad ventral de la mandíbula, e inhibe la señal de algunos componentes

de la vía Notch manteniéndolos dorsales (64). Corriente abajo de End1, los genes Distal-

less homeobox (Dlx) muestran un código bastante marcado (Figura 1.4) en cuanto a la

identidad dorsoventral de las prominencias maxilar y mandibular (68), y a través de End1

podrían interactuar con componentes de Notch.


Figura 1. 4. Código Dlx en el patronamiento de la PMx, PMn y AB2.

Esquema de un embrión de Pollo en estadío HH23. Los genes Dlx proporcionan la identidad dorso-

ventral en la prominencia maxilar (PMx), prominencia mandibular (PMn) y segundo arco branquial

(AB2). Modificado de “Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in

craniofacial development”, 2010 (39).

1.4 La vía de señalización Notch.

Si se habla sobre el desarrollo de órganos y tejidos, es importante hablar sobre un gran

número de vías de señalización conservadas. Una de estas vías es la vía Notch, la cual se

desarrolla a partir de una comunicación yuxtacrina de célula a célula y puede promover o

suprimir: la proliferación y muerte celular, la adquisición de características específicas

celulares y programas de diferenciación celular; además como una de sus funciones más

importantes, puede generar cambios a través de inhibición lateral, esto entre otras

funciones (69)(70).



La vía Notch juega un papel principal en diferentes procesos, y no es sorpresivo que

alteraciones en cualquier componente de esta vía generen múltiples desordenes. Cambios

en la conformación de componentes de la vía Notch generan, desde condiciones congénitas

como el síndrome de Alagille y CADASIL, hasta condiciones patogénicas como el cáncer

(71).

La vía de señalización Notch tiene diferentes componentes; sus ligandos son conocidos

como los DSL, debido a que contienen un dominio llamado Delta-Serrate-Lag-2. En

mamíferos, los ligandos presentes son DLL1, Delta2 (DLL2) y DLL4, y JAG1 y JAG2,

homólogos de Serrate (SER) (72). De estos, en el grupo de investigación Crecimiento y

desarrollo craneofacial, de la Universidad Nacional de Colombia, se han identificado los

genes Dll1, Jag1 y Jag2 en el desarrollo craneofacial temprano de embriones de pollo (63).

Los receptores por otro lado, en Drosophila melanogaster reciben el nombre de Notch, en

C. elegans Lin-12 y GLPI, y en mamíferos Notch1-4 (N1-4); son proteínas

transmembranales heterodiméricas con tres porciones definidas, su porción N-terminal,

extracelular (Notch Extracellular Domain, NECD) encargada de interactuar con el ligando,

la porción transmembranal (Notch Transmembranal Domain NTMD) y la porción C-terminal,

intracelular (Notch Intracellular Domain NICD, ó llamada también NOTCHIC) (73). En

desarrollo craneofacial de embriones de pollo el receptor N1 ha sido de gran interés

(74)(75).

Una vez unido el ligando al receptor, la fuerza ejecutada por el ligando, al generar la

endocitosis dentro de la célula señalizadora, promueve un cambio conformacional del

receptor, al cual lo acompañan una serie de escisiones proteolíticas, generando el clivaje

de NOTCHIC, lo cual inicia la señal (76)(77).

El complejo enzimático encargado de suscitar la escisión de NOTCHIC es conocido como

γ-secretasa, y se compone por Nicastrina, Presenilina1, PEN2 y APH1 (78). La Nicastrina

además de reconocer el sustrato, es requerida en la estabilización de la Presenilina1,

debido que en su ausencia, la Presenilina1 no cuenta con unidades c-terminales maduras

(79)(80). A su vez, la Presenilina1 es críticamente requerida para el clivaje intracelular de

Notch, puesto que contiene el sitio de unión y el sitio catalítico del complejo, donde


promueve la escisión de NOTCHIC, dada posiblemente por proteasas como PEAK A y

PEAK B (81).

Gracias a la importancia de este complejo en la activación de la vía (al promover el clivaje

de NOTCHIC), se ha convertido en una de las mayores dianas terapéuticas, motivando el

desarrollo de un control farmacológico que previene la proteólisis de Notch (82)(83). Uno

de los tratamientos farmacológicos más usados para la inhibición del complejo γ-secretasa

es el N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-ButylEster (DAPT), el cual

se une a la porción C-terminal de la presenilina, evitando la catálisis del receptor (84).

Al llevarse a cabo la proteólisis de N, NOTCHIC migra al núcleo y se une con el complejo

corepresor (CSL: CBF1, Su(H), LAG1), que cambia su función para convertirse en un

complejo coactivador, interactuando con el factor general TFIID, promoviendo la

transcripción de los genes diana de la vía conocidos como Hey y Hes (9). Éstos genes se

comportan clásicamente como represores transcripcionales, sin embargo, modificaciones

postraduccionales pueden cambiar su función; como por ejemplo, al fosforilar HES1 puede

llegar a ser un activador o disminuir su capacidad de unión a ADN, dependiendo del dominio

que sea fosforilado (85).

1.4.1 Ligandos canónicos de la vía Notch.

Los ligandos canónicos de la vía Notch, o ligandos DSL, son proteínas transmembranales

tipo 1, que tienen dominios extracelulares con sitios de unión similares, una porción N-

terminal, con un dominio DSL que se especializa en la unión a los receptores, y múltiples

repeticiones (6 a 16), similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF-like). Los ligandos

JAG/SER tienen mayor cantidad de repeticiones EGF-like y una regíon próxima a C-

Terminal que es rica en cisteína, denominada región similar al Factor Willebrand tipo C

(vWFC) (Figura 1.5) (86). El dominio DSL en Jagged, se relaciona con el síndrome de

Alagille (si presenta mutaciones) y con la activación de Notch dependiente del ligando (87).



Figura 1. 5. Ligandos canónicos de la vía Notch.

Ilustración de la estructura de los ligandos canónicos de la vía Notch presentes en mamíferos. SS:

Cadena corta precursora de unión a la señal; NTD: dominio N-terminal; DSL: Dominio Delta-Serrate-Lag-

2, EGF-Like: Repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico; EGF-Like Ca2+: Repeticiones

similares al factor de crecimiento epidérmico parcialmente unidas a iones de cálcio; vWFC: Región rica

en cisteina similar al Factor Willebrand tipo C; DOS: Dominios similares a Delta y OSM-11 requeridos

para señalización en trans; CTD: Porcion C-Terminal del ligando. Modificada de “Notch: Implications of

endogenous inhibitors for therapy”, 2010 (88).

Los ligandos de la vía Notch tienen diversas funciones y su señalización tiene distintas

localizaciones, incluso los ligandos homólogos regulan la vía Notch de manera distinta, a

pesar de no poderse identificar precisamente la función de cada uno de ellos (89)(90). Así

mismo, como cada ligando actúa de manera diferente, JAG2 y DLL1 pueden actuar

sinérgicamente en el desarrollo celular, tal como ocurre en el desarrollo del oído (91),

además juegan un rol dual como activadores de los receptores N y como mediadores de la

acción de γ-secretasa, puesto que aumenta la producción de NOTCHIC, la porción

intracelular de Jagged (JICD) y de Delta (DICD), al ocurrir la unión del ligando al receptor

(92).


Por otro lado, estos ligandos están, entre muchas otras cosas, regulados por el tráfico

intracelular, puesto que al no haber endocitosis de ligandos DSL, y haber acúmulo de estos

en la superficie de la membrana, se detiene la activación de la vía Notch, comportándose

como dominantes negativos (93)(94).

1.4.2 Ligandos no canónicos de la vía Notch

Como se ha mencionado previamente, los ligandos no canónicos de la vía Notch, son un

grupo heterogéneo de proteínas de naturaleza soluble o ancladas a membrana que no

cuentan con la región DSL, pero interactúan con los receptores Notch. Unos de los ligandos

anclados a membrana más conocidos son el Delta-like1 (DLK1) y Delta-like2 (DLK2), que

son similares al ligando Dll1, sin embargo, tienen diferencias estructurales (Figura1.6) (95).

DLK1 también es conocido como PREF1 o FA1 y es un ligando anclado a membrana, que

interactúa con Notch como cis-inhibidor y a su vez es regulado negativamente por la señal

de Notch (10). Por otro lado, se ha observado que DLK1 puede actuar como sustituto de

OSM11, en la activación de la señal de Notch junto a ligandos DSL y en C. elegans.

Adicionalmente, debido a que tanto DLK-1 como JAG1 contienen dominios DOS, se ha

planteados que DLK-1 compite con JAG1 por el sitio de unión con los receptores Notch

(repeticiones EGF-like 24-29 del receptor) (96).

Otra proteína que se relaciona estructuralmente a los ligandos Dll es el receptor similar a

Notch EGF-relacionado (DNER), una proteína transmembranal que contiene 10

repeticiones EGF-like y no contiene un dominio DSL. A diferencia de Dlk1, DNER actúa

como un activador de la vía Notch al unirse con el receptor N1, promoviendo la

morfogénesis de células gliales y expresándose específicamente en células de Purkinje

(97).

Un ligando no-canónico adicional es la EGF-like domain-containing protein 7 (EGFL7), una

molécula secretada, la cual, además de no tener un dominio DSL, cuenta entonces con un

dominio similar a Emilina (EMI). Ésta se une a 4 isoformas del receptor de Notch e inhibe

la inducción de la vía Notch a través de Jagged. La función principal de este ligando es

inhibir el mantenimiento de células progenitoras neuronales (98).



Ilustración de la estructura de los ligandos no canónicos de la vía Notch mencionados. SS: Cadena

corta precursora de señal, EGF-Like: Repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico; EGF-

Like Ca2+: Repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico parcialmente unidas a iones de

cálcio, FSTL: Dominio similar a Folistatina, EMI: Dominio similar a Emilina Cc: región enroscada

“Coiled-coil” DOS: Dominios similares a Delta y OSM-11 requeridos para señalización en trans.

Modificada de “Notch: Implications of endogenous inhibitors for therapy”, 2010 (88).

1.4.3 Receptores Notch.

Los receptores N tienen diversas funciones que pueden ser potenciadas o inhibidas,

dependiendo de las moléculas con las que interactúen (99). Se ha demostrado en diferentes

casos, que la inhibición del receptor N, disrumpe la diferenciación de cartílago y que su

señal es necesaria para regular la condrogénesis en el desarrollo del pollo (100).

Estos receptores son proteínas transmembranales que tienen una arquitectura modular,

procesada como una única cadena (Figura 1.7), e incluyen en su porción extracelular

múltiples repeticiones (29-36) de dominios EGF-like que pueden estar unidas a iones de

calcio (101), o tener modificaciones como glicosilación o fucosilación, que regulan el

comportamiento de estos receptores (102). La regulación negativa de este receptor, toma

lugar en las tres repeticiones Lin12/Notch/Glp1 (LNG) y un dominio de heterodimerización

que evita la autoactivación (103).

Figura 1. 6. Ligandos no canónicos de la vía Notch.


En el medio, se encuentra el NTMD, anclando la proteína a la membrana. NOTCHIC

contiene 7 repeticiones de ankirina (ANK), una región de unión a RBPjκ (RAM), y un

dominio de localización PEST que promueve la degradación de la señal, contribuyendo a

la desactivación de NOTCHIC. Las secuencias de localización nuclear (NSL) median el

clivaje de NOTCHIC dada por el complejo γ-secretasa (Figura 1.7) (104).

Notch puede actuar como un receptor cuya totalidad de repeticiones EGF-like, forman un

tándem, o discretos sitios de unión, los cuales pueden interactuar con muchas proteínas

durante su desarrollo (105). La activación dada por ligandos, sobre estos receptores se da

cuando entre dos células, son expresados en trans y depende de las EGF-like 11 y 12; pero

de expresarse el ligando en cis, en la misma célula, las repeticiones 24-29 del receptor son

las que interactúan con él (106).

Adicionalmente, Notch es capaz de responder a un gran rango de cambios micro

ambientales, y no únicamente a un modelo ligando-receptor (107), así como existen

mecanismos donde la interacción se da por medio de vesículas directamente en el núcleo

celular (108).

Además, El receptor Notch puede interactuar con diferentes vías de señalización como Wnt,

Hedgehog, Hipoxia y TGF-β promoviendo o inhibiendo la expresión de sus genes diana

(109).

Figura 1. 7.Receptores Notch.



Ilustración de la estructura de los receptores Notch encontrados en mamíferos.Con dos líneas

horizontales se señalan los sitios de activación por ligandos en cis, mientras que con una vertical

superior los sitios de inhibición por ligandos en trans. Una línea horizontal indica los dominios de

inhibición. SS: Cadena corta precursora de señal, EGF-Like: Repeticiones similares al factor de

crecimiento epidérmico; EGF-Like Ca2+: Repeticiones similares al factor de crecimiento epidérmico

parcialmente unidas a iones de cálcio,LNG: Repeticiones Lin12/Notch/Glp-1, TM: dominio o región

transmembranal, RAM: Región de unión a RBPjκ, NSL: Secuencias de localización nuclear, ANK:

Repeticiones de ankirina, OPA: Dominio OPA, PEST: dominio de localización PEST. Modificada de

“Notch: Implications of endogenous inhibitors for therapy”, 2010 (88).

1.4.4 Activación y regulación de la vía Notch.

El receptor Notch, sufre diferentes escisiones proteolíticas que empiezan antes de la unión

ligando receptor y la activación de la vía. El primer clivaje (S1), visto claramente en los

receptores de mamíferos N1 y N2, ocurre en el trans-Golgi, donde gracias a una enzima

denominada Furin-like Convertasa se originan los fragmentos NECD de 180 kDa, y

NOTCHIC (que contiene a NTMD) de 120 kDa. Los dos productos permanecen asociados

no covalentemente en la superficie celular (110).

La mecánica en las membranas celulares de las células vecinas, afecta la activación de la

vía Notch (111)(112). Por ejemplo el área de contacto es un factor que puede influenciar la

actividad; de manera que al haber mayor área de contacto, hay mayor señal de Notch (113).

En contraste, un estudio propone que la unión de un ligando a su receptor es necesaria,

pero no es suficiente para desencadenar la activación, debido a que pueden haber

modificaciones estructurales del receptor que afecten la activación de la vía (114). Como

ejemplo, unas de las enzimas encargadas de realizar modificaciones de los ligandos son

las enzimas Fringe, en su conjunto Lunatic, Manic y Radical. Radical Fringe modifica un

subconjunto de EGF-like, previamente modificadas por Lunatic Fringe y Manic Fringe. Estas

modificaciones pueden potenciar o inhibir la actividad dependiendo del dominio que alteren.

Si adicionan GlcNAc a O-Fucosas de EGF-like 8 y12, se potencia la actividad de Notch

señalizado por Dll, mientras que si la agrega en EGF-like 6 y 36 inhibe la actividad de Notch

señalizado por Jag1 (115)(116). Además, la O-fucosiltransferasa, encargada de agregar O-


fucosa a serinas y treoninas de dominios EGF-like, es requerida positivamente y corriente

arriba en la señalización de Notch, dependiente o independiente de Fringe. Sin embargo,

su sobrexpresión inhibe la vía Notch (117). La regulación de los ligandos DSL también

puede darse por glicosilación de los dominios EGF-like y ubiquitinación del ligando mediada

por E3 ligasas y Epsinas (118)(119).

Por otro lado, Numb es un inhibidor de la vía Notch, presente en Drosophilas, tiene la

capacidad de unirse al receptor, impidiendo que se una a los ligandos, lo que regula la

activación de la vía mediada por ligandos y evita los clivajes del receptor (120).

Una vez el ligando puede unirse al receptor, el sitio del segundo clivaje (S2) es expuesto

(121), gracias a la fuerza mecánica que ejerce el ligando sobre el receptor, al ser

ubiquitinado e iniciar la endocitosis por la célula señalizadora, una fuerza en el rango de los

2 a los 8 pN (122)(123). En ese instante, una metaloproteasa de la familia ADAM, genera

el corte de NECD, promoviendo que la célula señalizadora pueda hacer endocitosis del

complejo ligando-NECD (124). Dos proteínas han sido propuestas por diferentes autores,

una de ellas Kuzbanian (KUZ), la cual promueve el clivaje S2 en Drosophila, sin embargo,

la asociación de KUZ y el sitio de corte de S2 en receptores de mamíferos aun no es clara

(125). Por otro lado ADAM-TACE se relaciona con S2 en estudios llevados a cabo, tanto en

Dosophila como en mamíferos (126).

Ya realizado el segundo clivaje del receptor, queda dispuesto para ser reconocido y

escindido (S3) por el complejo γ-secretasa, donde Nicastrina lo reconoce y Presenilina1

promueve el clivaje para liberar a NOTCHIC (127). NOTCHIC se trasloca al núcleo donde

interactúa con la familia CLS , el cual también se conoce como RBPjκ, LMP2 y CBF1, y

forma parte de un complejo proteico activador de genes diana de Notch (128)(129)(130).

Muchos mecanismos moleculares interconectados están envueltos en la represión selectiva

de la transcripción de los genes diana de la vía Notch, los cuales pueden modificar la

cromatina que da acceso a activadores locales y a los genes diana y el bloqueo de

NOTCHIC directamente(12). CSL también se comporta como correpresor interactuando

con proteínas que reclutan histonadesacetilasas y otras enzimas que modifican la

cromatina, sin embargo, la prolongada interacción de este complejo no garantiza la



represión de los genes diana, puesto que depende de la interacción de CLS con NOTCHIC

(131)(132). La βII-tubulina puede modular la señal de la vía Notch, a través del transporte

de NOTCHIC, promoviendo o inhibiendo la migración al interior del núcleo. Al inhibirlo,

NOTCHIC se degrada sin generar actividad (133). Su(H), el cual pertenece al complejo

CSL, es necesario para la expresión de los genes diana de la vía Notch en respuesta a la

activación del receptor, puesto que al inhibirlo, también hay inhibición de la traducción de

los genes diana y puede activar directamente la transcripción de los mismos (134)(135).

Finalmente ITCH (también parte de CSL), no es necesario para la activación de Notch, pero

controla la degradación de NOTCHIC en ausencia del ligando, puesto que es requerido

para la endocitosis de Notch como target de lisosomas y cataliza la poliubiquitinización

(136).

1.4.5 Genes diana de la vía Notch.

A partir de la unión de diferentes ligandos de la vía Notch, se pueden activar diferentes

genes blanco. Por ejemplo, Dll1 se ha caracterizado por promover la expresión de la familia

Hes, mientras que Dll4, induce la expresión de la familia de genes Hey1 (137).

Las proteínas HES poseen una configiración basic-Helix-Loop-Helix (bHLH)

estructuralmente similares a Hairy y a E(spl), con dominios denominados Orange y WRPW.

En N-terminal tienen una secuencia de ADN E-box, y puede reclutar los correpresores

TLE1-4, a través de su tetrapeptido WRPW (138). Los genes Hes1, Hes5 y Hes7, pueden

ser promovidos por la vía Notch, mientras Hes2, Hes3 y Hes6, parecen tener mecanismos

independientes (139)(140).

Las proteínas HEY, también conocidas como HERP, son bastante conservadas durante la

evolución, con una estructura bHLH similar a la de las proteínas HES; la diferencia más

relevante es que en lugar de un tetra péptido WRPW se encuentra un YRPW para Hey1 y

Hey2, y un YXXW en el caso de HeyL - los cuales no se unen a correpresores TLE -, y se

siguen por un péptido TE(1/V)GAF, cuya función aún no es conocida (141).


1.4.6 Hey, Gen diana de la vía Notch.

Como se ha descrito anteriormente, las proteínas HEY son proteínas bHLH, y pertenecen

a la familia de genes hairy and enhhancer of Split. Su señal está relacionada con desarrollo

embrionario, homeostasis de tejidos y procesos de diferenciación. En mamíferos, se han

identificado 3 proteínas HEY: HEY1, HEY2 Y HEYL (142)(143).

El gen Hey está relacionado con el desarrollo del corazón (144) el desarrollo vascular (66),

miogénesis (145), homeostasis y desarrollo óseo (146), desarrollo neural (147) y del oído

(148). Además cumple funciones en el sistema inmune, regulando la diferenciación de

linfocitos T (149) y está involucrado en desarrollo de neoplasias (150).

Adicionalmente la vía Notch, puede interactuar con otras vías, promoviendo la transcripción

de los genes diana Hey; la inducción de Hey mediada por Tgfβ/BMP puede darse a partir

de Smad, quien se une a promotores transcripcionales de Hey, o a partir de la interacción

de NOTCHIC con Smad1/5. Asimismo, Hey puede interactuar con cofactores que reclutan

la histona deacetilasa, y con factores de transcripción, inhibiendo la transcripción de genes

como Gata1/2/4/6, Runx2, Hand1/2 y MyoD (144).

1.5 Alteraciones de la vía Notch y sus consecuencias en

el desarrollo craneofacial.

Las malformaciones craneofaciales, se han relacionado con la vía de señalización Notch,

puesto que su expresión coincide con cambios en la morfogénesis y diferenciación de

tejidos de la cabeza. Estudios desarrollados en embriones de ratón (E10.5) muestran que

al realizar la pérdida de función de Notch presentan defectos en el cierre del tubo neural,

excencefalia, anencefalia, micrognatia, huesos frontonasales reducidos, cartílago nasal

más corto, labio y paladar fisurado. Adicionalmente muestran reducción en marcadores de

migración de células de la cresta neural en las mismas estructuras (58).

Ratones mutantes homocigotos de Delta3 (Dll3) mostraron defectos craneofaciales

específicos, entre ellos el paladar fisurado bilateral, mientras que ratones mutantes



heterocigotos para N1 mostraron una reducción estadísticamente significativa (P<0.5) de la

altura mandibular y el alargamiento del paladar duro (151).

En experimentos desarrollados en Xenopus, se inyectaron ovocitos fecundados con RNA

de Dll3, lo que inhibió la formación de neuronas primarias, esto debido a que la expresión

ectópica de una forma constitutivamente activa de N1 impide la producción de estas

neuronas (152).

Hey1, es uno de los genes diana de Notch y su estudio es relevante, debido a que su

expresión promueve la neurogénesis, somitogénesis y vasculogénesis en diferentes

organismos. En ratón E8.5 y E9.0 se ha revelado a través de hibridación in situ la expresión

específica de Hey1 durante el desarrollo del sistema nervioso, los somitas, el corazón y la

región craneofacial; específicamente en E9.5 se expresa en los recién formados primer y

segundo arco branquial, las vesículas óticas, la placa de piso del tubo neural, el cerebro

anterior y el septum transversum. Un día después se expresa en las fosas nasales y en los

brotes del primordio de la extremidad, donde persiste en E11.5. Hey1 es importante para

los precursores de los músculos, los nervios espinales y la región craneofacial. En E12.5,

la señal se observó en los folículos de la barba, en el telencéfalo, en el labio superior y en

las extremidades (153)(13)(66).

En defectos craneofaciales sindrómicos también se ha identificado la influencia de

componentes de la vía de señalización Notch; uno de ellos, el síndrome de Alagille, cuyo

fenotipo craneofacial presenta una frente prominente, ojos hundidos con moderado

hipertelorismo, fisuras palpebrales oblicuas ascendentes, puente nasal deprimido, nariz

recta con punta bulbosa, orejas grandes, mandíbula prominente y mentón puntiagudo; este

síndrome es relacionado en el más del 90% de los casos con mutaciones en los genes Jag1

y N2 (4)(154).

Otro síndrome asociado con la vía de señalización Notch, pero un poco menos frecuente

es el Síndrome de Hadju-Cheney, que se caracteriza por dimorfismo craneofacial

(deformidad craneal con impresión basilar y mandíbula retraída) y alteraciones

esqueléticas. Simpson et al. identificaron tres mutaciones diferentes en el exón 34 del gen

N2, asociado a pérdida ósea progresiva y más de 11 mutaciones en N3 (155).

2 Capitulo2. Expresión de diferentes componentes de la vía Notch en las prominencias maxilar y mandibular.

Resumen

En estudios realizados previamente se observó que la evaluación de la expresión de

componentes de la vía Notch no es específica, puesto que en lugares donde no se observa

esta expresión, si es posible evidenciarla mediante otras metodologías. Además, a pesar

de que ya se ha evaluado la expresión de los genes diana de la vía por medio de RT-PCR,

y se ha visto su patronamiento dorso-ventral, es importante evaluar los otros componentes

de la vía; por lo que se propuso confirmar mediante RT-PCR la expresión de ligandos,

receptores y genes diana de la vía, en la prominencia maxilar (PMx) y la prominencia

mandibular (PMn), puesto que permite verificar la actividad de la vía Notch.

Específicamente se evaluaron los sitios de expresión de Notch1 (N1) y de Hey1 por medio

de Hibridación in situ y RT-PCR de diferentes secciones de las prominencias (PMx y los

dominios dorsal (D), intermedio (I) y ventral (V) de las prominencias), esto debido a que

era necesario para el desarrollo del presente trabajo.

Adicionalmente, pretendiendo observar la expresión de la proteína HEY1 el ectodermo de

las prominencias, se realizó una inmunofluorecencia sobre secciones histológicas.

Los resultados mostraron que todos los componentes de la vía Notch están presentes en

la PMx y la PMn; en específico N1 y Hey1 se expresan a lo largo de las prominencias y se

detectó una clara expresión de la proteína HEY1 en el ectodermo y el tejido subyacente.

Lo anterior coincide con los resultados de otros autores, confirmando que la vía Notch

podría estar cumpliendo una función importante en la morfogénesis, y posiblemente en

desarrollo de las estructuras derivadas de la PMx y la PMn.



2.1 Introducción.

Después de la migración de las Células de la Cresta Neural (CCN) desde las diferentes

regiones del tubo neural, estas células llegan a la Prominencia Maxilar (PMx) y la

Prominencia Mandibular (PMn) donde al relacionarse con las otras capas celulares

(mesénquima mesodermal, ectodermo, endodermo), se generan interacciones

moleculares, que dan lugar a la formación de cartílagos y huesos del maxilar y la mandíbula

(156)(157). Entre las moléculas que promueven el patronamiento de las diferentes

estructuras cartilaginosas y óseas que componen el tercio inferior facial, se encuentran por

ejemplo el ligando Endotelina1 (End1), quien desempeña un papel fundamental en la

especificación ventral; experimentos hechos en ratón y pez cebra demuestran que en

ausencia de End1 o del receptor de Endotelina tipo A (ETA), el esqueleto facial ventral se

transforma en dorsal o no se desarrolla (158)(159); mientras que al expresarse

dorsalmente End1, puede transformar la región dorsal promoviendo una morfología ventral

(160).

Las moléculas blanco de End1 ya descritas por diferentes autores incluyen a Hand2 en la

región del vértice de cada arco, a Dlx3, Dlx5, Dlx6 y Msx1 en el dominio ventral (un poco

más arriba de lo que respecta a Hand2), y Bapx1 en el dominio intermedio de las

prominencias mandibulares (161)(162). Los genes Dlx muestran un código colineal de

expresión durante el desarrollo de la PMx y la PMn de embriones de pollo: en la región

maxilar y temporomandibular es clara la expresión de Dlx1/2, en el dominio dorsal

(proximal) de la PMn se expresan los genes Dlx1/2/5/6, y en el vértice de la PMn se

expresan Dlx1/2/5/6/3/4 (39); coincidiendo en que al alterarse su expresión se producen

modificaciones estructurales en el patronamiento dorso-ventral: se ha encontrado que

ratones Dlx5 -/- y Dlx6 -/- muestran cambios en el esqueleto mandibular ventral (163).

Ahora bien, con respecto a Bapx1, en pez cebra, se ha demostrado que hay afección en

la formación de la articulación temporomandibular al haber ausencia de Bapx1 (162). Por

último, acorde a lo mencionado más arriba, mutaciones en Hand2 resultan en agenesia de

la región ventral mandibular tanto en peces como en ratones (162)(164).

Otra vía que tiene relación con el patronamiento facial, y que además se ha encontrado

interacciona con las vías ya mencionadas, es la vía de señalización Notch. Zuñiga et al.

(2010) Identificaron en pez cebra, que una mutación de Jag1b (un ligando de la vía Notch)

45

da como resultado la expansión dorsal de los genes (descritos en el párrafo anterior) que

se expresan ventralmente, y la transformación ósea dorsal a una morfología ventral;

además, ellos encontraron en su estudio que la expresión de End1 inhibe la expresión de

Jag1b y Hey1 (uno de los genes diana) en el dominio ventral. En conjunto, estos resultados

demuestran que la señalización Jag-N garantiza la identidad dorsal, y es inhibida por End1,

en pez cebra (64). Por otro lado, en embriones de pollo, Castro-Larios (2018) (68)

(investigado el patronamiento dorsoventral de Hey1 y su relación con la expresión de End1)

encontró un posible antagonismo entre End1 y Hey1, lo que coincidiría con lo encontrado

por Zuñiga et al.

Es importante señalar que el trabajo de Castro-Larios únicamente evaluó los genes diana

de la vía, pero no los demás componentes de esta vía. Además, aunque estudios previos

(14)(16)(165) por hibridación in situ, ya reportaron los patrones de expresión de los

diferentes componentes de la vía Notch, se sabe que en sitios donde no se observa

marcación por hibridación in situ de la expresión de algunos de los componentes de la vía

en las prominencias faciales, si es posible detectarla mediante otras metodologías (68);

entonces se propone confirmar mediante RT-PCR la expresión de los componentes

principales para la actividad de la vía Notch en las prominencias faciales (PMx y PMn), y

en específico, los sitios de expresión de Hey1 en dichas prominencias; y además,

comprobar el patrón de expresión de al menos uno de los receptores de la vía Notch (N1).



2.2 Metodología.

2.2.1 Incubación de embriones y extracción de embriones.

Huevos fertilizados fueron incubados en incubadora GQF 1502 sportsman (GQF MFG Co.

Inc. GA. USA). Durante 4 días (96 horas) aproximadamente, para alcanzar el estadío HH23

(15).

Los huevos se desinfectaron con Etanol 70% y se les adhirió cinta de enmascarar

desinfectada creando un área quirúrgica (Figura 2.1A). Con una aguja hipodérmica y

jeringa de 10 cm3 se extrajeron 5 cm3 de albúmina (Figura 2.1B). Con unas tijeras iris

curvas (de punta fina) estériles se cortó la cascara generando una ventana quirúrgica

(Figura 2.1C). A través de la ventana quirúrgica y con ayuda de una luz led, se observó la

anatomía del embrión verificando su clasificación en estadío HH23 acorde a criterios de

Hamburger y Hamilton (15). Enseguida se extrajeron los embriones en PBS/DEPC frio

(sobre hielo) (Figura 2.1D). La cantidad de embriones utilizados por cada experimento se

muestra en la tabla 2.1.

Figura 2. 1. Extracción de embriones.

Proceso de extracción de embriones de pollo en estadío HH23. A. Fotografía que muestra un huevo

de Gallina con cinta de enmascarar desinfectada y adherida, creando un área quirúrgica. B. Fotografía

que muestra la punción del huevo de gallina antes del retiro de la albúmina, la punción se realiza en el

extremo más romo del huevo, se puede observar parte de la aguja hipodérmica (lila), la jeringa de

10cm3, el soporte del huevo y la cinta de enmascarar usada para crear la ventana quirúrgica. C.

Fotografía que muestra el corte realizado en el huevo, se observa vascularización de membranas

47

extraembrionarias y la localización del embrión (cabeza de flecha). D. Fotografía que muestra

embriones extraídos en una caja de Petri de 9.5 cm de diámetro puesta sobre hielo.

Tabla 2. 1. Número de embriones por experimento

2.2.2 Disección de las prominencias maxilar y mandibular.

Inicialmente, con ayuda de pinzas de tungsteno Dumont #5 - Fine Forceps (Fine Science

Tools, Inc. B.C., Canadá) estériles, se retiraron las membranas extraembrionarias de los

embriones (N=15), estos embriones se cambiaron a otro recipiente con PBS/DEPC frío

libre de membranas.

Con agujas de insulina y observando a través de un estereomicroscopio Nikon® SMZ745

(Nikon® Tokio, Japón) se realizó la disección de las prominencias como se muestra en la

Figura 2.2. y con una micropipeta Pipetman ClassicTM P1000 (GilsonTM USA) se colocaron

en un tubo de microcentrífuga estéril para realizar la RT-PCR. Se centrifugó y se extrajo el

sobrenadante dejando en el tubo únicamente las prominencias.

2.2.3 División de las prominencias maxilar y mandibular en

fragmentos.

Con el fin de realizar una RT-PCR de los segmentos correspondientes a la PMx y la PMn,

con agujas de insulina y observando a través de un estereomicroscopio Nikon® SMZ745

(Nikon® Tokio, Japón), se realizó la división de estas prominencias, tal como aparece en

la Figura 2.2.D, resultando en 4 tipos de fragmentos: 1) Prominencia maxilar (PMx), 2)

dominio dorsal (D) de la prominencia mandibular (PMn), 3) dominio intermedio (I) de la

PMn y 4) dominio ventral (V) de la PMn. Asimismo, con una micropipeta Pipetman

Metodología # Embriones # Réplicas

RT-PCR 15 3

Hibridación in situ 3 3

Inmunofluorescencia sobre cortes 2 3



ClassicTM P1000 (GilsonTM WI, USA) se colocaron en diferentes tubos de microcentrífuga

estéril – cada tipo de fragmento retirado en un tubo diferente - para posterior tratamiento.

Figura 2. 2. Disección de las prominencias maxilar y mandibular de embriones de pollo en

estadío HH23.

Fotografías que muestran las prominencias maxilar y mandibular de embriones de pollo siendo

disecadas. A. Fotografía de proceso de disección, se observan las agujas de insulina usadas para este

proceso. B-C. Córtes histológicos, vista frontal y sagital respectivamente, indican los límites usados

para realizar el corte de las prominencias maxilar y mandibular. D. Fotografía de prominencias maxilar

y mandibular de embriones de pollo en estadío HH23 las cuales han sido disecadas. Las líneas

punteadas indican por donde se fragmentaron las prominencias. PMx: Prominencia maxilar; PMn:

Prominencia mandibular; Cor: Coronal; Cau: Cudal; D: Dorsal; I: Intermedio; V: Ventral.

2.2.4 Extracción de RNA.

Se agregó 1mL de TRIzolTM (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) por cada 50-100 mg

de cada una de las muestras (la muestra no excedió el 10% de la solución), a las cuales

se les debía realizar extracción de RNA. Esta mezcla fue homogenizada usando un

sonicador Q125 (Qsonica NY, USA), con las siguientes condiciones: 20% de amplitud y

3/1 pulsos por 12 segundos.

La concentración final de RNA en cada una de las muestras fue >13ng/µL.

49

Este protocolo se basó en la guía de usuario para el manejo de TRIzolTM (Thermo Fisher

Scientific Inc. MA, USA) proporcionado por la casa comercial y el publicado por

Chomczynski, P. y Mackey, K. en 1995 (166) (Anexo A).

2.2.5 Retrotranscripción.

Para realizar la retrotranscripción se usó el protocolo sugerido por la casa comercial para

el uso del kit SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher Scientific Inc.

MA, USA). Se usó el primer Oligo(dT) para estas muestras (Anexo B).

Para todas las muestras, la concentración final de cDNA fue de 200ng/µL para poder

proseguir con la PCR.

2.2.6 PCR.

Se siguió el protocolo sugerido por la casa comercial para el kit GoTaq® PCR Systems

(Promega Co. WI, USA) (Anexo B). Las temperaturas de anillamiento se observan en la

Tabla 2.2. y los Cebadores usados en la Tabla 2.3. Como gen reportero, Gliceraldehído-3-

fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

Los Cebadores descritos a continuación (Tabla 2.3), estaban previamente reportados por

Petrovic y Hayes (167)(168).

Tabla 2. 2. Temperaturas de anillamiento utilizadas para cada uno de los genes de la vía

Notch.

Cebadores Temperatura de anillamiento (oC)

GAPDH 64

Notch1 60

Notch2 60

Delta1 60

Jagged1 60

Hey1 61

Hey2 60

Hes4 60

Hes5 60



Tabla 2. 3. Cebadores usados para cada uno de los genes de la vía Notch.

Gen Secuencia (5' a 3') Tamaño del producto ID de la secuencia

GAPDH Fw TTG GCA TTG TGG AGG GTC TT

130bp NM_204305.1 Rev GTG GAC GCT GGG ATG ATG TT

Notch1 Fw TTC CCA GCA CAG CTA TTC CT

225bp NM_001030295.1 Rev CCC ACT GGG TCT CAC TTG AA

Notch2 Fw TCT TGC TGG ACC ATT TTG CC

182bp NM_001252033.1 Rev ACA AAT GAC TGG GGA GAG GG

Delta1 Fw CAC TGA CAA CCC TGA TGG TG

108bp NM_204973.2 Rev TGG CAC TGG CAT ATG TAG GA

Jagged1 Fw CTG TGA GAG CAA CCC CTG TA

104bp X95283.1

Rev TCT CGG CAA GTT CCT CCA TT

Hey1 Fw CGG AGG GAA AGG TTA TTT CG

265bp XM_015282862.1 Rev CAG CAA TGG GTG AGA TAT GTG

Hey2 Fw TCT CCT TCA CCA GCA CCT TC

108bp XM_015284442.2 Rev GGC TGG ATG AGG CTG ACA C

Hes4 Fw GAA GTC CTC CAA ACC CAT CA

257bp NM_001005848.2 Rev AGG TGC TTC ACC GTC ATC TC

Hes5 Fw CCA GAG ACA CCA ACC CAA CT

259bp NM_001012695.1 Rev CAG AGC TTC TTT GAG GCA CC

Se observó el resultado en el fotodocumentador ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad

Laboratories, Inc. CA, USA) realizando previamente una electroforesis en gel preparado

con 2% de agarosa SeaKem LE Agarose (Lonza group Basilea, Suiza) disuelta en buffer

TBE1X. Las condiciones de corrido fueron: 100mv por 40 minutos. Se usó marcador de

peso (Ladder) de 100bp.

Las bandas se extrajeron por medio del kit Zymoclean Gel DNA Recovery D4007 (Zymo

Research CA, USA) y la secuenciación se ejecutó por metodología Sanger (realizada en

el Servicio de Secuenciación y Análisis Molecular (SSiGMol) del instituto de genética de

la Universidad Nacional de Colombia), fueron entregadas en formato FASTA y se

visualizaron través del programa BioEdit.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/XM_415035.6?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=XP5225RX014

51

2.2.7 Hibridación in situ.

Se seleccionaron los embriones completos (N=3) previamente deshidratados y

almacenados en MetOH/PBST 100% realizando un protocolo de 3 días:

El primer día se rehidrataron los embriones por medio de lavados con concentraciones

decrecientes de MetOH/PBST (100, 75, 50 y 25 %) y luego tres lavados con PBST.

Se permeabilizó la membrana celular con proteinasa K (Hoffmann-La Roche (Merck

KGaA). Basilea, Suiza) (10 µg/ml) a temperatura ambiente por 25 min.

Se realizó la fijación con PFA 4% fresco. Se lavó nuevamente en PBST y se pre-incubó en

solución de hibridación por 3 horas a 60 °C. Se dejó toda la noche a 4oC con las ribosondas

antisentido marcadas con Digoxigenina (Dig) para detectar RNAm (correspondiente al

receptor Notch1 y al gen diana Hey1) (61)(169).

El segundo día se realizaron tres lavados de treinta minutos cada uno, con Solución I

(Formamida 50%, Saline Sodium Citarte (SSC) 5X y Dodecilsulfato sódico (SDS) 1%), tres

lavados de treinta minutos cada uno con Solución II (Formamida 50% y SSC 2X) y seis

lavados de 30 minutos cada uno con Tris Buffered Saline (TBST).

Se Bloqueó la inespecificidad con solución de bloqueo (suero de oveja al 10% inactivado

con albumina sérica y TBST) por tres horas a temperatura ambiente, y se incubó, con

anticuerpo Anti-Dig (Hoffmann-La Roche (Merck KGaA). Basilea, Suiza) (1:5000 disuelto

en solución de bloqueo) durante toda la noche a 4 °C.

El tercer día se realizaron 6 lavados con TBST por 30 min cada uno, y luego un lavado por

15 min con Alkaline phosphatase buffer (NTMT) (Hoffmann-La Roche (Merck KGaA).

Basilea, Suiza). Se observaron los sitios de hibridación a través de un sistema de detección

nitro-blue tetrazoliumchloride/5-bromo-4-chloro-3’-indolyphosphate p-toluidine salt (NBT/

BCIP) (Hoffmann-La Roche (Merck KGaA). Basilea, Suiza).

Finalmente, los embriones hibridados se lavaron vigorosamente en PBST, 3 veces durante

cinco minutos cada uno y se post-fijaron en PFA 4% durante 15 minutos. Se realizaron

nuevamente tres lavados en PBST y se adquirieron las imágenes con un

estereomicroscopio Axio Zoom V16 (Carl Zeiss AG. Oberkochen, Alemania).



Para determinar la especificidad de las sondas se tomaron en cuenta los patrones

obtenidos con anterioridad y reportados en la base de datos de expresión de genes de

embriones de pollo conocida como GEISHA (Por sus siglas en ingles Gallus Expression in

situ Hybridization Analysis), de la Universidad de Arizona (170), los cuales se observan en

la Figura 2.4B y la Figura 2.5B, Para Notch1 y Hey1 respectivamente.

2.2.8 Preparación de embriones para secciones histológicas.

Una vez embebido cada embrión (N=2) en un cubo de parafina para realizar los cortes, se

adhirió a un casete especial para micrótomo, y se perfilaron los lados opuestos del cubo

hasta hacerlos paralelos entre sí.

Se limpió muy bien el micrótomo con Xilol y Alcohol. Se usó una cuchilla nueva para realizar

los cortes. Se programó el micrótomo para realizar cortes de 7µm de espesor y se obtuvo

una tira de 8 cortes. Con un pincel de pelo de marta se llevó la tira al agua tibia (a

temperatura constante de 90oC). Se reunieron 3 tiras y se recogieron con láminas

SuperFrost Plus™ (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA). Esto da un total de 24 cortes

por cada lámina. Se almacenaron a -20oC por una semana como máximo.

2.2.9 Inmunofluorescencia de secciones histológicas.

Una vez hechos los cortes (Anexo D), se desparafinaron, deshidrataron, fijaron y lavaron

para finalmente realizar la inmunofluorecencia (Anexo E). Se aplicó en solución de bloqueo

(Suero fetal bovino en TBST 1:50) durante 3 horas. Se preparó el anticuerpo primario Anti-

HEY1 antibody (ab98072) (Abcam pcl. Cambridge, Reino Unido) disuelto en solución de

bloqueo (1:1000). Se aplicaron 300uL a cada lámina verificando que se cubrieran todos los

cortes e incubando en medio húmedo durante toda la noche. Se retiró el anticuerpo

primario, se eliminaron los excesos lavando con solución de bloqueo y se incubó en

anticuerpo secundario AlexaFluor® 488 Goat Anti-Rabbit IgG H&L (ab150077) (Abcam pcl.

Cambridge, Reino Unido) por 3 horas a temperatura ambiente, con una concentración

1:1000, sin exponer a la luz. Se retiró anticuerpo secundario y se realizó el montaje con

40ul de glicerol y 4 ',6-diamino-2-fenilindo (DAPI) (1:5000); se almaceno protegido de la

53

luz a 4oC para posterior observación en el estereomicroscopio de fluorescencia Axio Zoom

V16 (Carl Zeiss AG. Oberkochen, Alemania).

Nota: Para la inmunofluorecencia se usó como control positivo la señalización de la vía en el corazón

puesto que la señal de HEY1 se ha observado durante el desarrollo cardiaco (171)(172). Como control

negativo se usaron cortes no tratados con anticuerpo primario (para observar especificidad del

anticuerpo), y no tratados con anticuerpo secundario (para descartar autofluorecencia del tejido).

Ningún control negativo arrojó resultados positivos. En cuanto a las réplicas, se realizó la observación

de 24 cortes encontrando los mismos resultados.



2.3 Resultados.

2.3.1 Expresión de diferentes componentes de la vía Notch en las


Todos los componentes de la vía Notch: los ligandos Dll1, Jag/Ser1; los receptores, N1 y

N2, y los genes diana de la vía, Hey1, Hey2, Hes4 y Hes5; fueron detectados mediante

RT-PCR (Figura 2.3); no obstante, aparecieron algunas bandas adicionales en el carril de

corrida para Jag/Ser1, Dll1 y Hes5. En el caso de Hes5, las tres bandas observadas en

ese carril (cabeza de flecha, Figura 2.3.) corresponden a tres isoformas reportadas

previamente (173). Por el contrario, las bandas adicionales que se amplificaron en los

carriles de corrido de Jag/Ser1 y Dll1 (asteriscos, Figura 2.3) no estaban reportadas, por

lo que los cebadores (Tabla 2.3) utilizados para la amplificación de estos genes se

analizaron por medio de los programas bioinformáticos: UCSC In-Silico PCR y Basic Local

Alignment Search Tool (BLAST). El análisis mostró que uno de los cebadores de los pares

tanto para Jag/Ser1 como para Dll1 es complementario a dos porciones distintas a lo largo

de cada gen, amplificando tanto a una porción de 756bp como una de 104bp en el caso

de Jag/Ser1, y de 847bp y 108bp en el caso de Dll (Anexo C), correspondiendo con las

bandas mostradas en el gel (asteriscos, Figura 2.3). Para todos los casos mencionados

en este párrafo tal como se anotó en la metodología, los amplificados fueron purificados

del gel y secuenciados.

Figura 2. 3. Expresión de genes transcritos correspondientes a la Vía Notch.

55

Electroforesis derivada de RT-PCR para componentes de la vía Notch de muestras de RNA

provenientes de PMx y PMn de embriones de pollo en estadío HH23. Se usó marcador de peso

(Ladder) de 100bp y como gen reportero GAPDH. LIG: Ligandos; REC: Receptores; TG: genes diana

(del inglés Target genes) L: Ladder; G: GAPDH; J1: Jag/Ser1; D1: Dll1; N1: Notch1; N2: Notch2; H1:

Hey1; H2: Hey2; S4: Hes4; S5: Hes5; (-) Control Negativo.

2.3.2 Descripción de la distribución de N1 en la PMx y PMn.

En cuanto a la expresión del receptor de la vía Notch (N1), determinada por hibridación in

situ (Figura 2.4 C), coincide con la reportada en las imágenes de la base de datos GEISHA

(170) para el estadío HH23 (Figura 2.4 B), donde N1 se identificó en el dominio dorsal

extendiéndose hacia ventral de la PMn (Cabeza de flecha, Figura 2.4C), mientras que en

la PMx no fue evidente (asterisco, Figura 2.4C); sin embargo, por RT-PCR, los amplificados

de N1 si se detectaron tanto en la PMx como en la PMn, y en esta última prominencia en

los tres sectores: dorsal (D), intermedio (I), ventral (V) (Figura 2.4D).

Figura 2. 4. Patrones de expresión de N1 en las prominencias maxilar y mandibular de

embriones de pollo en estadío HH23.

Patrón de expresión de N1 en el embrión de pollo en estadío HH23. A. Ilustración de la expresión de

N1 conforme a C. B. Patrón de expresión de N1 en región craneofacial en el estadío HH23, vista lateral,

reportada en GEISHA (170). C. Patrón de expresión de N1 en región craneofacial de embrión de pollo

en estadío HH23, vista lateral. PMx (*); Expresión en la PMn (cabeza de flecha) D. Electroforesis de

RT-PCR realizada para la PMx y los segmentos de la PMn (D, I y V) de embrión de pollo en el estadío

HH23. Se usó como gen reportero GAPDH y un marcador de peso (Ladder) de 100bp. M: Mesencefalo;

PFn: Prominencia Frontonasal; O: Vesícula óptica; VO: Vesícula Ótica; PMx: Prominencia Maxilar; PMn:

Prominencia mandibular; AB2: Segundo arco branquial; L: Ladder; G: GAPDH; D: Dorsal; I: Intermedio;

V: Ventral; (-): Control negativo.



2.3.3 Descripción de la distribución de Hey1 en la PMx y PMn.

En la hibridación in situ, se confirma que el patrón de expresión de Hey1 en la PMn del

embrión de pollo en estadío HH23 (Figura 2.5C) coincide con lo reportado en las imágenes

de la base de datos GEISHA (170) para el estadío HH22 (el estadío más cercano) (Figura

2.5B); donde se observa una expresión marcada en la porción más dorsal-caudal que

disminuye hacia ventral (cabeza de flecha Figura 2.5.B y C). La expresión en la PMx no

fue evidente (asterisco, Figura 2.5.B y C), únicamente se observó esta expresión en el

borde anterior de la PMx (posiblemente el epitelio ectodérmico) que coincide con la

mostrada en GEISHA (170); dicha marcación no se observa en la Figura 2.5C, debido a

la angulación de la cabeza. Por RT-PCR se detectó la expresión de Hey1 en la PMx, y

además, en los diferentes segmentos de la PMn (D, I, V) (Figura 2.5D).

Figura 2. 5. Patrones de expresión de Hey1 en las prominencias maxilar y mandibular de


Distribución de Hey1 en el embrión de pollo en estadío HH23. A. Ilustración de la expresión de Hey1

conforme a C. B. Patrón de expresión de Hey1 en región craneofacial en el estadío HH22, vista lateral,

reportada en GEISHA (170). C. Patrón de expresión de Hey1 en región craneofacial de embrión de

pollo en estadío HH23, vista lateral. PMx (*); Expresión en la PMn (cabeza de flecha) D. Electroforesis

de RT-PCR realizada para PMx y los segmentos de la PMn (D, I y V) de embrión de pollo en el estadío

HH23. Se usó como gen reportero GAPDH y un marcador de peso (Ladder) de 100bp. M: Mesencefalo;

PFn: Prominencia Frontonasal; VN: Vesícula nasal; O: Vesícula óptica; PT: Placoda trigeminal; PE:

Placoda epibranquial; VO: Vesícula Ótica; PMx: Prominencia Maxilar; PMn: Prominencia mandibular;

AB2: Segundo arco branquial; L: Ladder; G: GAPDH; D: Dorsal; I: Intermedio; V: Ventral; (-): Control

negativo.

57

En la inmunofluorescencia en cortes histológicos se observó que la expresión de HEY1 es

abundante en las células del ectodermo de las dos prominencias (PMx y PMn) (Cabezas

de flecha, Figura 2.6.C), y en las células del meséquima (asteriscos, Figure 2.6C), pero

con una marcación más leve en el mesénquima maxilar (PMx) (Figura 2.6C).

Figura 2. 6. Expresión de HEY1 en cortes histológicos de las prominencias maxilar y

mandibular.

Inmunofluorescencia sobre cortes histológicos de región cefálica de embriones de pollo para HEY1

(en verde), como marcador nuclear se usó DAPI (En azul). A. Ilustración de corte histológico, que

muestra las estructuras vistas en B. B. Corte sagital, región cefálica. C. Ampliación de región en B

(Cuadro amarillo). R: Rombencéfalo; M: Mesencéfalo; BF: Bolsa faríngea; O: Vesícula óptica; AB2:

Segundo arco branquial; PMn: Prominencia mandibular; PMx: Prominencia maxilar; Cor: Corazón; PE:

Prosencéfalo.



2.4 Discusión.

En el Capítulo 1, se mencionaron los diferentes componentes de la vía Notch estudiados

en diferentes trabajos, con respecto al desarrollo de las prominencias faciales del embrión

de pollo, donde: en uno, se detectó la expresión de N1, Jag2, Hes1 y Hey1 en los arcos

branquiales durante los estadíos HH14-HH18 (60); en otro, se encontró la expresión de

N2, Dll1 y Jag1 en la PMx y la PMn, en los estadíos HH14-HH23; y finalmente, en otro

trabajo se observó que había expresión de N1 y Jag2 en los estadíos HH19-HH25 durante

la formación de las prominencias faciales (61). En la presente investigación se corrobora

(mediante RT-PCR) que tanto los receptores N1, N2, como los ligandos Jag1 y Dll1, y los

genes diana Hey1, Hey2, Hes4, y Hes5, si se expresan definitivamente en las prominencias

faciales (PMx y PMn), en el estadío evaluado, por lo que podrían estar cumpliendo una

función importante en la morfogénesis y posiblemente en desarrollo de las estructuras que

se formarán allí (64)(66).

En cuanto a la expresión de N1, Carbonell (2012) afirmó que la expresión de este transcrito

en embriones de pollo (HH23) detectada mediante hibridación in situ es semejante al

patrón descrito en el estadío HH21 (también analizado por él): su expresión se observa en

la región ventral de la prominencia maxilar y prominencia mandibular. No obstante, en el

presente estudio no se encontró evidencia de N1 en la PMx al evaluarlo por Hibridación in

situ; sin embargo, al realizar el análisis de la expresión del RNA mediante RT-PCR, se

observa que hay expresión de N1 en ambas prominencias; esto se debe a que no siempre

es fácil de detectar por hibridación in situ los transcritos, o de visualizarlo dependiendo la

cantidad y distribución de células que expresan el transcrito, lo cual coincide con el análisis

de las secciones histológicas realizado por Carbonell, donde afirma que N1 es exclusivo

del mesénquima de la PMx y la PMn (61).

Carbonell (2012) también estudió el patrón de Hey1 en la PMx y PMn y encontró señal

positiva para la expresión de este gen: en toda la prominencia maxilar, en un área

específica localizada en la región dorsal de la prominencia mandibular y en la región ventral

de la misma prominencia” en el estadío HH23 (61); por el contrario, en el presente estudio

la expresión de Hey1 detectada mediante hibridación in situ no fue evidente en la PMx. Al

igual que con N1, Hey1 detectado mediante RT-PCR, está presente en todas las zonas

59

estudiadas, lo que concuerda con lo reportado (68), que por medio de hibridación in situ,

en embrión completo, no siempre es posible detectar las señales provenientes de todos

las capas.

Para el estadío HH21, Carbonell afirma que Hey1 está presente en toda la PMx y en la

región dorsal de la PMn, específicamente en epitelio lateral de la PMx y en el mesénquima

y epitelio lateral de la PMn. En contraste, Castro-Larios (2018), quien analizó la expresión

de Hey1 en el estadío HH21 afirmó que: Hey1 no se expresa en la PMx; pero si en el

dominio ventral y en el dominio dorsal de la PMn, aunque por medio de inmunofluorecencia

sobre cortes histológicos, Castro-Larios si detectó que HEY1 está presente en el

ectodermo de ambas prominencias, con una menor marcación hacia el mesénquima de la

PMn (68), coincidiendo con lo encontrado por Carbonell y lo descrito en este estudio para

el estadío HH23.

Con respecto a la expresión de Hey1 en el dominio dorsal de la PMn; como se mencionó

al principio del presente capítulo, en pez cebra se ha observado que Jag/Ser es un gen

importante para el patronamiento dorsal de la PMn, y que mutaciones en Jag/Ser1 hacen

que se extienda la expresión de los genes ventrales característicos hacia dorsal, y la

morfología dorsal tome características del dominio ventral. Asimismo, se sabe que

Jag/Ser1 interactúa con el receptor Notch promoviendo la expresión de Hey1 únicamente

en el dominio dorsal de la prominencia mandibular (64), coincidiendo con lo observado en

el presente trabajo, donde la expresión de Hey1 obtenida por hibridación in situ, es

evidente en el dominio dorsal y disminuye hacía en la región ventral de la PMn; lo que a

su vez coincidiría con lo reportado por Castro-Larios (2018), y Zuñiga et al. (2010) en donde

además se muestra que este patrón dependería de la expresión de End1(64)(68).

Vale la pena anotar que aunque se ha reportado que Barx1 es un gen blanco de End1 que

se expresa en el dominio intermedio de la PMn y regula la expresión de otros genes como

Hand2, que están implicados en el patronamiento dorsoventral de ésta prominencia (174),

no se encuentran estudios en embrión de pollo que asocien a Barx1 con la vía Notch, pero

es posible que Barx1 sea quien esté implicado en la reducción de la expresión de Hey1 en

la región intermedia de la PMn.



Se sabe que la adhesión entre prominencias palatinas (que se originan de las PMxs) está

orquestada en parte por interacciones Jag/Ser-Notch, cuyas señales inician desde el

epitelio oral, derivado del ectodermo (175); lo que indicaría, para el caso del presente

estudio, que la expresión a nivel ectodérmica de HEY1 observada, podría estar relacionada

en estadíos más avanzados con el adecuado crecimiento de las prominencias palatinas y

la subsecuente fusión las mismas.

Previamente autores han descrito que la vía Notch controla la diferenciación de varios

tejidos provenientes de las CCN, entre ellos hueso y cartílago (176). Se sabe, que los

ligandos Jag/Ser y Dll son expresados en diferentes regiones durante el desarrollo facial,

y están asociados con la especificación de cada una de ellas (177); por ejemplo, Jag/Ser

es requerido para el desarrollo osteoblástico y diferenciación durante la osificación maxilar;

y adicionalmente, ratones mutantes de Jag/ser muestran un decrecimiento en la osificación

maxilar, causado por disminución de factores inductores de osificación (178). Otro estudio

muestra que Ratones mutantes homocigotos de Jag/Ser exhiben paladar fisurado y

anquiloglosia, además de defectos esqueléticos en extremidades (179). En cuanto las

interacciones de estos ligandos con receptores de la vía, en la literatura se encontró que

en modelo murino, dobles heterocigotos para Dll3 y N1 exhibían anomalías axiales

segmentarias localizadas, similares a defectos vertebrales encontrados en humanos, así

como defectos craneofaciales tales como la reducción en la altura mandibular y elongación

en el paladar duro (180).

Aunque, en concordancia a lo mencionado más arriba, la vía Notch también podría estar

regulando desde el ectodermo la diferenciación ósea de las CCNC en el mesénquima; por

otro lado, la expresión de HEY1 en estas células (presumiendo que son CCNC debido a

su organización dentro de las prominencias), observada mediante inmunofluorescencia en

este estudio, y mediante hibridación in situ por Carbonell (61), podría ser consecuencia de

señales que ocurren dentro del mismo mesénquima, y no consecuencia de señales desde

el ectodermo.

En el caso de que la señal de HEY1 expresada en el mesénquima fuese inducida desde

el ectodermo, es curioso que al ser una vía de activación yuxtacrina pueda activarse en el

mesénquima de haber una barrera entre ellas (lámina basal por lo que se decidió

comprobar la existencia de una lámina basal entre el ectodermo y el mesénquima de las

61

prominencias, antes de detallar la expresión de Hey1 en el ectodermo de las prominencias

maxilar y mandibular, y en el tejido subyacente.



2.5 Conclusiones.

Todos los componentes de la vía Notch estudiados, y específicamente Notch1 y Hey1 se

expresan en la PMx y PMn de embriones de pollo en el estadío HH23; y esta expresión

podría estar relacionada con procesos de morfogénesis y posterior desarrollo de

estructuras localizadas en el tercio medio e inferior de la cara.

La expresión de HEY1 en el ectodermo de la PMx y la PMn, coincide con lo reportado por

Carbonell y Castro-Larios en estudios previos realizados en los estadíos HH21; es

necesario detallar la expresión de los componentes de la vía en el ectodermo de estas

prominencias en estadío HH23 y su relación con el tejido subyacente.

Este trabajo, definitivamente caracteriza la expresión de los diferentes componentes de la

vía Notch estudiados, y específicamente Notch1 y Hey1 en la PMx y PMn de embriones

de pollo.

63

3 Capítulo 3. Expresión de la vía Notch en el ectodermo de las prominencias maxilar y mandibular, y su relación con la expresión en el tejido subyacente “mesénquima”.

Resumen

Estudios realizados previamente en conjunto con los resultados del Capítulo 2 muestran

una evidencia clara de la expresión de diversos componentes de la Vía Notch en la

prominencia maxilar y la prominencia mandibular de embriones de pollo. Esta expresión

se da a lo largo del desarrollo temprano facial durante los estadios HH14-HH25.

Adicionalmente, se ha observado que esta expresión no es fácilmente diferenciable en los

tejidos, y específicamente en el ectodermo al realizar técnicas sobre embriones completos,

por lo que se quiso detallar la expresión de los componentes de la Vía Notch en el

ectodermo de las prominencias antes mencionadas. Para detallar la expresión, se

separaron los tejidos de las prominencias, primero tratándolas con Tripsina® (15090046)

(Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) y finalmente separándolas manualmente con

agujas de insulina. A las diferentes muestras se les realizó RT-PCR. Para observar si el

ectodermo tenía influencia sobre la expresión de Hey1 en el mesénquima subyacente

(expresión visualizada en el Capítulo 2 por medio de inmunofluorecencia sobre cortes); se

cultivó el mesénquima durante 24h sin influencia del ectodermo. Los resultados arrojaron

que definitivamente el ectodermo influye sobre la expresión de varios componentes de la

vía (Dll1, Jag/Ser1, Hey1 y Hey2), puesto que, al retirarlo, la expresión de estos genes

desaparece y posiblemente esta expresión sería mediada por mecanismos diferentes a la

vía canónica, entre ellos la interacción de varios comoponentes de la vía con Wnt/β-

catenina. Adicionalmente se obtuvo que el gen que codifica para el receptor N2 es de



expresión exclusiva del ectodermo; y que genes como N1, Hes4 y Hes5 no necesitan del

ectodermo para expresarse en el mesénquima, por lo que aparentemente estos últimos

estarían regulados en el mesénquima por activación no canónica.

Adicionalmente, en el capítulo anterior se propuso realizar la tinción para lámina basal en

los cortes de las prominencias, puesto que era curioso que al ser Notch una vía yuxtacrina

se expresara en tejidos adyacentes, pudiendo haber una barrera entre ellos. Se observó

la presencia de esta membrana y adicionalmente se concluyó que esta podría influenciar

la expresión de Notch en el mesénquima.

65

3.1 Introducción.

Recapitulado, las prominencias maxilar (PMx) y mandibular (PMn) se componen de tres

tejidos principales, ectodermo, mesénquima (ectodermal, proveniente de las células de la

cresta neural – CCN - y mesodermal, proveniente de mesodermo paraxial) y endodermo.

Asimismo, en el proceso de formación de estas prominencias, se requiere de Interacciones

epitelio-mesenquimales (E-M) involucrando a los dos epitelios que componen a la

prominencia, ectodermo y endodermo, y el mesénquima ubicado en medio de estos.

Le Douarin en 2004, mostró la importancia del endodermo en la señalización de CCN,

presentando evidencia de que al extender la señalización endodérmica del rombomero 2

al rombomero 3 (realizando transplantes tisulares), se genera un nuevo pico, en el modelo

aviar (181). Por otro lado, Chai y Maxson (2006), encontraron que el ectodermo regula la

migración de las CCN y su desarrollo, controlando la posición, tamaño y forma de las

prominencias (182). Además, la señalización desde el ectodermo muestra gran

importancia para el desarrollo craneofacial, por ejemplo, la Zona Ectodermal Frontonazal

(FEZ, del inglés: Frontonasal Ectodermal Zone), induce la formación del pico superior, y el

destino mesenquimal (183).

En los Capítulos anteriores del presente trabajo, ya se describió la formación de las

prominencias y los tejidos que la componen (Capítulo 1), y se estudió la expresión de

diferentes componentes de la vía Notch y específicamente el patrón de expresión de Hey1

en la PMx y PMn (Capítulo 2). Como ya se mencionó antes, la vía de señalización Notch

es necesaria en muchos procesos en los que se involucra el ectodermo durante el

desarrollo embrionario; por ejemplo, en las extremidades se expresa en la cresta apical

ectodérmica (AER) para la formación de la extremidad (184); y también es requerida para

la formación de la notocorda, la placa neural axial, la neurogénesis y la formación de las

CCN, entre otras (56)(57); además, gracias a su función de inducción lateral, la vía de

señalización Notch activada en el ectodermo podría promover cambios dentro del mismo

ectodermo, por ejemplo controlando su destino a través de la represión de P63, esto

probado en el modelo murino (185).

Dentro de la discusión de los resultados del Capítulo anterior, donde se evaluó la expresión

de los diferentes componentes de la vía Notch, y donde se observó en los cortes



histológicos, la expresión de Hey1 tanto en el ectodermo como en mesénquima

subyacente; se planteó la necesidad de detallar la expresión de los componentes de la vía

Notch, y particularmente de Hey1 en el ectodermo aislado de la PMx y la PMn; y ver si el

ectodermo influye en la expresión de Hey1 y de los demás componentes de la vía Notch

en el tejido subyacente – “meséquima”.

Aunque existen reportes de la presencia de una lámina basal debajo del ectodermo de los

arcos branquiales (AB) de embriones de pollo en estadíos tempranos del desarrollo (186),

en el presente trabajo se propone realizar la tinción para lámina basal de los cortes de las

prominencias, antes de detallar la expresión por separado de los componentes de la vía

Notch en el ectodermo aislado del mesénquima, para tener una idea de cuán patente es

la lámina basal y poder asumir de mejor manera los resultados de la influencia del

ectodermo sobre las células subyacentes.

67

3.2 Metodología.

3.2.1 Incubación y extracción de embriones.

Se incubaron y extrajeron embriones aproximadamente a los cuatro días de incubación, lo

que corresponde al estadío HH23 según la clasificación de Hamburger y Hamilton (187),

tal como se mencionó en el Capítulo 2. El número de embriones que se usaron por

experimento se observa en la Tabla 3.1.

Tabla 3. 1. Número de embriones por experimento.

Metodología # Embriones # Réplicas

Tinción PAS 1 3

RT-PCR de prominencias 15 3

RT-PCR de tejidos 15 3

3.2.2 Preparación de láminas histológicas.

El embrión obtenido se embebió en parafina y se cortó en micrótomo con un grosor de 7um

(Anexo D); procedimiento está mejor descrito en el Capítulo 2.

3.2.3 Tinción de ácido peryodico de schiff (PAS del inglés Periodic

Acid-Schiff).

Se realizó bajo especificaciones de Baum, 2008 (188). Una vez hechos los cortes

(aproximadamente 15 por lámina), se desparafinaron con Xilol, se rehidrataron con etanol

(EtOH) en concentraciones descendentes (100%, 96%, 80%, 50%), y se lavaron con agua

destilada, para realizar el procedimiento de tinción inmediatamente.

Con una pipeta de transferencia se aplicó Ácido peryódico al 0.5% sobre las láminas y se

agitaron suavemente durante 5 min. Se lavaron las láminas en agua destilada y se agregó

el reactivo de Schiff. Las láminas se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad y se

eliminaron los excesos de reactivo realizando 3 lavados con agua destilada durante 5

minutos cada uno.



Para generar un contraste en la imagen, se agregó a las láminas Hematoxilina de Mayer y

se dejó actuar durante 2 minutos, y se retiró haciendo 3 lavados de 5 minutos cada uno

con agua destilada.

Finalmente, las secciones histológicas se deshidrataron con EtOH en concentraciones

ascendentes (80%, 96% y 100%) y se realizaron 2 lavados con Xilol de 10 minutos cada

uno.

Cuando estuvieron secas las secciones, se les agregó medio de montaje y se visualizaron

a través del estereomicroscopio Axio Zoom V16 (Carl Zeiss AG. Oberkochen, Alemania),

donde se obtuvieron las imágenes.

3.2.4 Disección de las prominencias maxilar y mandibular, y

separación del ectodermo.

Una vez retiradas todas las membranas extraembrionarias, con ayuda de una espátula

estéril se pusieron los embriones (N=15) dentro de tubos de microcentrifuga de 1.5mL con

Tripsina® (15090046) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA). Se incubaron durante 20

minutos a 37oC. Se pusieron en hielo durante 5 minutos y se almacenaron a 4oC durante

12 horas (toda la noche).

Con una espátula estéril se retiraron del tubo y se pusieron en una caja de Petri con

solución balanceada de Hanks GibcoTM (14180046) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA,

USA) y con 10% de suero fetal bovino GibcoTM (16000044) (Thermo Fisher Scientific Inc.

MA, USA).

Bajo estereomicroscopio Nikon® SMZ745 (Nikon® Tokio, Japón), se cortaron

prominencias (PMx y PMn) con agujas de insulina. Se realizó la disección de estas

prominencias, tal como aparece en la Figura 3.1.A. Asimismo, con una micropipeta

Pipetman ClassicTM P1000 (GilsonTM USA) se colocaron las prominencias (integras, sin

separar el ectodermo) en un tubo de microcentrífuga estéril, para usar como controles en

las RT-PCRs.

Con la misma micropipeta se extrajo el sobrenadante en su totalidad.

69

A otras prominencias (N=15) - tratadas de la misma manera - se les retiró el ectodermo

(Figura 3.1.C y D), con ayuda de pinzas Dumont #5 - Fine Forceps (Fine Science Tools,

Inc. B.C., Canadá).

Embrión de pollo en estadío HH23 con PMx y PMn disecadas. A. Fotografía de PMx y PMn disecadas

de embrión de pollo en estadío HH23. B. Fotografía de PMx, ampliación a 10X, se observa el límite

entre el ectodermo y el mesénquima. C. Fotografía de PMx a la cual se le ha retirado el ectodermo,

ampliación a 10X. D. Fotografía de embrión al cual se le han retirado la PMx y la PMn, y a estas

prominencias se les ha retirado el ectodermo; se observan las prominencias disecadas y ectodermo

retirado. La línea rosa indica el lugar de donde fueron retiradas. PMx: Prominencia maxilar; PMn:

Prominencia mandibular; Mes: Mesénquima; Ect: Ectodermo.

Se puso cada uno de los tejidos (ectodermo, mesénquima, y de las prominencias integras)

en diferentes tubos de microcentrífuga; se centrifugaron a 1000rpm por 3 minutos y se les

retiró el sobrenadante.

Para realizar extracción de RNA inmediatamente después de la separación de los tejidos,

se agregó TRIzolTM (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) a los tubos que contenían las

Figura 3. 1. Retiro de ectodermo de las prominencias maxilar y mandibular de embrión de pollo en estadío HH23.



muestras (ectodermo, mesénquima y prominencias integras) de acuerdo con lo sugerido

por la casa comercial (Anexo A).

3.2.5 Cultivo de tejidos

Para hacer el cultivo de los tejidos (ectodermo, mesénquima, y de las prominencias

integras), una vez disecados, dentro de una cabina de flujo NU-S425 Lab gard class II

Type2 (NuAire. MD, USA) se agregó a cada muestra 1mL de medio para cultivo (DMEM

(12-604F) (Lonza Group. Basilea, Suiza), suplementado con suero fetal bovino 10%

GibcoTM (16000044) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA), y penicilina-estreptomicina

1% GibcoTM (15140122) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA)), precalentado a 37oC.

En una caja de 24 pozos, se pusieron 300µL de la mezcla en cada pozo, y se incubo la

caja durante 24h. Una vez incubados, se retiró el medio de cada muestra y se agregó

TRIzolTM (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) tal como recomienda la casa comercial,

para comenzar el protocolo de extracción de RNA de cultivo de tejidos (Anexo A).


Las muestras a las que se agregó TRIzolTM (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) fueron

homogenizadas usando un sonicador Q125 (Qsonica NY, USA), con las siguientes

condiciones: 20% de amplitud y 3/1 pulsos por 12 segundos.









71



3.2.8 PCR.







Tabla 3. 2. Temperaturas de anillamiento utilizadas para cada uno de los genes.

Tabla 3. 3. Cebadores usados para cada uno de los genes.

Gen Secuencia (5' a 3') Peso del producto ID de la secuencia









Jagged1

Fw CTG TGA GAG CAA CCC CTG TA 104bp X95283.1


GAPDH 64

Notch1 60

Notch2 60

Delta1 60

Jagged1 60

Hey1 61

Hey2 60

Hes4 60

Hes5 60















con 2% de agarosa SeaKem LE Agarose (Lonza group Basilea, Suiza), disuelta en buffer

TBE1X. Las condiciones de corrido fueron: 100mv por 40 minutos.

73

3.3 Resultados.

3.3.1 Determinación de la existencia de la lámina basal subyacente

al ectodermo de las prominencias.

En las láminas teñidas con PAS (Figura 3.2A), se observó que a lo largo de la PMx, PMn

y el AB2, se demarcaba una línea color fucsia bajo las células del ectodermo (Cabezas de

flecha rojas, Figura 3.2B y C) siendo más evidente en segundo arco branquial (AB2).

Figura 3. 2. Presencia de la lámina basal en las prominencias maxilar y mandibular.

Tinción con ácido peryódico de Schiff/Hematoxilina, en purpura se observan los núcleos de las células

marcadas con hematoxilina y en fucsia la lámina basal subyacente (Cabezas de flecha). A. Corte

sagital de embrión HH23, ampliación 6X, demarcado en el recuadro se observan de coronal (izquierdo)

a caudal (derecho) las prominencias maxilar y mandibular, y finalmente el arco hioideo. B. Ampliación

del recuadro en A a 20X. C. Ampliación de recuadro en B a 40X.

3.3.2 Expresión de la vía Notch en el ectodermo y el mesénquima

de las prominencias.

En la Figura 3.3. se muestra el corrido de las RT-PCRs de los RNAs aislados de las

prominencias integras, y de aquellas donde se realizó la separación para obtener el

ectodermo y el mesénquima por separado, pero sin cultivar. Allí se puede ver que todos

los genes de la vía Notch (incluyendo las isoformas de Hes5 reportadas previamente



(173).) se expresan tanto en la prominencia integra como en el ectodermo separado del

mesénquima, y en el mesénquima mismo; a excepción de Notch2 cuya banda no se

observa en el carril correspondiente al Mesénquima.

Figura 3. 3. Expresión de diferentes genes de la vía Notch en el ectodermo y mesénquima

de las prominencias (PMx y PMn).

Electroforesis derivada de RT-PCR donde se usaron cebadores para los diferentes genes de la vía

Notch en ectodermo, mesénquima y prominencias integrasas de embriones de pollo en estadío HH23,

se usó un marcador de peso (Ladder) de 100bp, y como gen reportero el Gliceraldehído-3-fosfato

deshidrogenasa (GAPDH); M: Mesénquima; E: Ectodermo; P: Prominencia integra.

3.3.3 Influencia del ectodermo en el mantenimiento de la

expresión de componentes de la vía Notch en el mesénquima

de las prominencias.

En la electroforesis de las RT-PCRs de los RNAs aislados de los cultivos (prominencia

integra, mesénquima y ectodermo por separado, cultivados durante 24 horas) se observa

que al cultivar el mesénquima durante 24h (sin presencia de ectodermo), desaparece la

75

expresión de los genes diana Hey1 y Hey2, y de los ligandos Dll1 y Jag/Ser1; los genes

diana Hes4 y Hes5 (sus tres isoformas (173)) mantienen su expresión, al igual que el

receptor N1. Además, la expresión del receptor N2 sigue sin ser detectable.

Electroforesis derivada de RT-PCR donde se usaron los cebadores para los componentes de la vía

Notch, en muestras de tejido derivado de las prominencias (PMx y PMn) de embriones de pollo en

estadío HH23, cultivados durante 24h. El control de la prominencia integra se observa en la parte

superior, y el mesénquima sin influencia del ectodermo en la parte inferior. Se usó marcador de peso

(Ladder) de 100bp y como gen reportero GAPDH. L: Ladder; G: GAPDH; N1:Notch1; N2: Notch2; D1:

Dll1; J1: Jag/Ser1; H1: Hey1; H2: Hey2; S4: Hes4; S5: Hes5.

Figura 3. 4. Expresión de los componentes de la vía Notch en las prominencias integras

(PMX y PMn), y en el mesénquima sin influencia del ectodermo.



En la electroforesis donde se corrieron los cDNAs obtenidos del ectodermo cultivado por

24h sin influencia del mesénquima, se observó la amplificación de todos los componentes

al igual que en el control de la vía Notch (Figura 3.5.).

Electroforesis derivada de RT-PCR de los componentes de la vía Notch en prominencias maxilar y

mandibular de embriones de pollo en estadío HH23, con una muestra de ectodermo cultivada por un

día. Se usó Ladder de 100bp y como gen reportero GAPDH. L: Ladder; G: GAPDH; N1:Notch1; N2:

Notch2; D1: Dll1; J1: Jag/Ser1; H1: Hey1; H2: Hey2; S4: Hes4; H5: Hes5.

Figura 3. 5. Expresión de los componentes de la vía Notch en el ectodermo prominencias (PMx y PMn), sin influencia del mesénquima.

77

3.4 Discusión.

La presencia de lámina basal bajo el ectodermo de la PMx y la PMn puede ser un factor

clave en la morfogénesis y diferenciación de estas prominencias, puesto que se ha

reportado previamente que la lámina basal de algunas estructuras como el cristalino,

promueve la polarización y organización celular, el desarrollo tisular y el mantenimiento de

la función durante la embriogénesis (189)(190). Por ejemplo, teniendo en cuenta que la

lámina basal está compuesta entre otras proteínas, por colágeno tipo IV, laminina y

fibronectina (191), se ha visto que esta última está involucrada en procesos de

morfogénesis durante el desarrollo embrionario del pollo (192); además, se ha encontrado

que la fibronectina es requerida para la diferenciación muscular inicial, asociada con la

señalización mesenquimal durante la morfogénesis musculo-esquelética (193).

En cuanto a la vía Notch, se sabe que ésta también puede interactuar con componentes

de la lámina basal. Brownell y Slavkin (1980) reportaron que cuando ocurren las

interacciones E-Ms que promueven la citodiferenciación y morfogénesis de glándulas

salivales y dientes, dichas interacciones pueden ser inducidas por la unión de

componentes de la vía Notch al colágeno o la fibronectina de la lámina basal (194).

Entonces la lámina basal podría ser parte integral para la trasmisión de señales a través

de la vía Notch en diferentes procesos del desarrollo, como por ejemplo, intervenir en la

interacción E-M entre el ectodermo y el mesénquima subyacente durante la formación de

la cara.

Con relación a la expresión del receptor N2 en las prominencias faciales, Gutiérrez-

Ramírez (2014) encontró una marcación de N2 restringida al ectodermo de la PMx y la

PMn de embriones de pollo en estadío HH23 (195); lo que coincide con lo que muestra el

presente estudio, donde al realizar las electroforesis de los cDNAs de las RT-PCRs del

RNA aislado del mesénquima se observa una ausencia de amplificación del receptor N2,

contrario a lo observado en el ectodermo, donde se ve una evidente amplificación de N2.

Acerca de la expresión de N1, que no se modifica al retirar el ectodermo, el resultado

obtenido en el presente estudio agrega información a lo reportado por Carbonell (2012),

quien señaló que hay una fuerte marcación de N1 en el mesénquima de la prominencia

mandibular (61). Este resultado, junto con el resultado de la expresión N2 lleva a concluir



que: al ser N2 exclusivo del ectodermo, y N1 el único presente en el mesénquima; este

último (N1) podría ser el encargado de activar la vía Notch en mesénquima de las

prominencias.

Con respecto a los cambios en la expresión de los componentes de la vía Notch en el

mesénquima cultivado sin influencia del ectodermo, lo encontrado en el presente estudio

coincide con los resultados de otros trabajos, que muestran una clara influencia del

ectodermo sobre el mesénquima craneofacial para promover la morfogénesis y

diferenciación de diversas estructuras; por ejemplo, en algunos estudios se comprobó que

el ectodermo sí interviene en la migración y diferenciación de las CCN; y que cuando se

produce una modificación de las señales del ectodermo facial, resulta en una alteración

conformacional de las prominencias faciales (49)(51)(182). Adicional a esto, se conoce que

las señales del ectodermo hacia el mesénquima subyacente deben ser coordinadas,

específicas y con dinámicas temporales; señales de las vías Wnt, Fgf y Bmp han sido

involucradas en diferentes interacciones E-M (51)(196).

Enfocándose en estas vías de señalización, estudios en modelo aviar muestran que Bmp

determina la forma del pico superior, regulando las dinámicas de las CCNC en la PMx

(197)(198)(199). A su vez, Fgf8 expresado en el mesénquima promueve el desarrollo óseo;

este gen es coordinado por la señal de Bmp desde el mesénquima, y del mismo Fgf8 desde

el ectodermo (200)(201).

La vía Wnt actúa desde el ectodermo regulando a las dos vías ya mencionadas (Bmp y

Fgf) al promover el crecimiento de los picos de las aves (y por lo tanto de las prominencias)

modulando la señal mesenquimal de Bmp; y en el ratón, al regular la morfología facial

mediante el control de la expresión mesenquimal de Fgf (202)(203). La inhibición de Wnt/β-

Catenina en el ectodermo, causa la inhibición de Fgf y Bmp, y reduce la proliferación e

incrementa la muerte celular, generando también transformación E-M atípica en ratones

transgénicos (204)(205).

Sobre la señal de la vía Wnt, Ladher et al. (2000) la localizaron en todos los tejidos

(ectodermo y mesénquima) de las prominencias faciales durante el desarrollo del pollo, y

postularon que reguladores como Frizzled receptor (Fzd) confieren la especificidad de esta

vía (206); Wnt9B y Wnt2B se han reportado en el ectodermo, mientras que β-Catenina

79

muestra señales tanto en el ectodermo como en el mesénquima (207) (208). A su vez,

genes de la vía, como Wnt11 inducen la morfología facial a través de cambios de destino

celular (209).

Algunos estudios hablan de la interacción (crosstalk) de la vía Wnt/β-Catenina – Notch,

durante el desarrollo (210); se ha visto que Notch puede regular la expresión de los genes

Wnt (211), pero a su vez, también se demostró en otro estudio que β-Catenina por sí misma

podría aumentar los niveles de N1, y específicamente de NotchIC, compitiendo con la

degradación de este receptor dependiente de ubiquitinización; además de incrementar la

actividad transcripcional de Hes y del complejo CSL (complejo necesario para la

transcripción de los genes diana de la vía) (212); lo que coincidiría con lo encontrado en

este estudio, donde se observa que se mantiene la transcripción del gen que codifica para

N1 en el mesénquima en ausencia del ectodermo (con la concurrente desaparición de la

expresión de los ligandos canónicos), de tal manera que la activación del receptor N1 en

el presente trabajo podría estar mediada por ligandos no canónicos existentes en el

mesénquima; a su vez, el receptor clivado (de manera no canónica) podría estar siendo

potenciado por Wnt/ β-Catenina presente en el mesénquima para la transcripción de Hes4

y Hes5, según lo reportado por Jin et al. (2009).

En cuanto a lo observado con el cambio en la expresión de los genes de la familia Hey en

el mesénquima separado del ectodermo, conociendo como ocurre comúnmente la

activación de la vía Notch (69) y teniendo en cuenta que al igual que la expresión de los

genes diana Hey1 y Hey2, los ligandos canónicos de la vía Notch (Dll1 y Jag/Ser1) también

desaparecen, incluso en presencia de N1; se plantea:

1) que la expresión de Hey1 y Hey2 podría estar regulada en el mesénquima por la unión

ligando-receptor de manera canónica, que en ausencia de una señal del ectodermo

posiblemente uno de los genes de la familia Wnt (207), los ligandos no serían sintetizados,

y por lo tanto no se daría la activación de la vía Notch canónicamente.

2) además se sabe que la expresión de los genes de la familia Hey puede mediarse

también a través de otras vías de señalización (de manera no canónica): en el caso de

Hey1, se ha demostrado que su transcripción puede ser mediada por la vía Bmp (213),

independientemente de la activación de la vía Notch; y en cuanto a la expresión de Hey2,



se ha encontrado su expresión independiente de la activación de Notch, inducida por

señales de Fgf (214). Sabiendo que las vías de señalización Bmp y Fgf, pueden ser

reguladas en el mesénquima desde el ectodermo (descrito más arriba); podría suceder

que sean estas vías las que se inactiven al retirar el ectodermo, y por tanto se inhiba la

expresión de los genes Hey en el mesénquima de las prominencias. Lo anterior puede ser

mediado también por un Wnt específico desde el ectodermo, si se tiene en cuenta que el

ectodermo es una fuente importantísima de expresión de alguna clase de dichos genes

Wnt (202)(203).

En la Figura 3.6. se plantea un modelo de expresión de los genes correspondientes a la

vía Notch tanto en el ectodermo como en el mesénquima, donde se explica en resumen

como podría ser la acción del ectodermo sobre la expresión de los genes del mesénquima.

Mientras todos los genes correspondientes a los componentes analizados están

expresándose en el ectodermo, en el mesénquima: Dll y Jag/Ser1 están influenciados de

alguna manera por la presencia del ectodermo; Hey1 puede estar mediado tanto por la

vía Notch (de manera canónica) o por alguna otra señal proveniente del ectodermo tal

como Bmp (213); Hey2 al igual que Hey1 puede estar mediado tanto por la vía Notch (de

manera canónica) o por alguna otra señal proveniente del ectodermo tal como Fgf; por otro

lado Hes4 y Hes5, no necesitan aparentemente señales provenientes del ectodermo, ni

señales mediadas canónicamente por Notch, en cambio sí podrían estar mediados por

Wnt/β-catenina desde el mesénquima.



81

Ilustración que resume la expresión de los genes de la vía Notch en las prominencias maxilar y

mandibular, y posiblemente las interacciones E-M que puedan promover la expresión de los genes en

el mesénquima. E: Ectodermo; M: Mesénquima.



3.5 Conclusiones

Existe evidencia de la existencia de una lámina basal subyacente al ectodermo de la PMx

y la PMn de embriones de pollo en estadío HH23, la cual podría mediar las señales

moleculares implicadas en el desarrollo de estas prominencias a través de la interacción

con la vía Notch.

N1 podría ser el encargado de activar la vía Notch en el mesénquima de las prominencias,

para la expresión de los genes Hes; puesto que es el único receptor presente en el

mesénquima, y además la expresión de Hey1 y Hey2 aparentemente sería dependiente

de la unión de los ligandos (canónica) mediada por Wnt desde el ectodermo, o no canónica,

posiblemente también mediada por Wnt desde el ectodermo.

Todos los componentes de la vía Notch que fueron estudiados, se expresan en el

ectodermo de las prominencias (PMx y PMn) de embriones de pollo en estadío HH23.

Además, este ectodermo cumple al parecer un rol fundamental en el mantenimiento de la

expresión de varios genes de la vía Notch en el mesénquima en los tejidos subyacentes.

83

4 Capítulo 4. Expresión de Hey1 al inhibir la liberación de NOTCHIC en las prominencias maxilar y mandibular.

Resumen

En los Capítulos anteriores se confirmó y detalló la expresión de la Vía Notch en las

prominencias (PMx y PMn). En el Capítulo 2 además se observó que el mantenimiento de

algunos genes en el mesénquima de las prominencias, puede deberse a la interacción no

canónica de Notch con otras vías. Adicional a esto, estudios realizados previamente

muestran que la activación de la vía Notch es un proceso complejo que puede involucrar

moléculas diferentes a las descritas en la vía canónica, lo que podría promover la expresión

de genes diana como Hey1; por lo anterior, en este Capítulo se quiso determinar si se

mantiene la expresión de Hey1 al inhibir la liberación de NOTCHIC en las prominencias

maxilar y mandibular; para esto se realizaron cultivos celulares y cultivos organotípicos de

prominencias (metodologías in vitro), a los cuales se les aplicó DAPT - un inhibidor de γ-

secretasa - el cual inhibe el clivaje de NOTCHIC; se realizó una RT-PCR para evaluar la

expresión de los diferentes componentes de la vía Notch tanto en los controles como en

los tratados. Además, esta inhibición también se realizó in vivo sobre embriones en estadío

HH21 y su expresión fue evaluada mediante una hibridación in situ en el estadío HH23.

Los resultados mostraron que tanto in vitro, como in vivo, mientras la prominencia

mantenga su estructura tridimencional, los genes diana de la vía, entre ellos Hey1, se

mantienen; lo que lleva a concluir que La expresión de Hey1 en la PMx y la PMn NO

depende exclusivamente de la vía canónica de Notch.



4.1 Introducción.

En el Capítulo 2 se describió la expresión de los genes de la vía de señalización Notch en

las prominencias maxilar y mandibular de embriones de pollo en estadío HH23,

encontrando esta expresión en ectodermo y mesénquima. En el Capítulo 3, se observó

que el mantenimiento de algunos componentes de la vía Notch en el mesénquima de las

prominencias (PMx y PMn) está asociado a la permanencia del ectodermo; pero también

se observó que la expresión de Hes4 y Hes5 en el mesénquima de estas prominencias no

dependería de la unión de los ligandos canónicos (Dll1 y Jag/Ser1).

En cuanto al funcionamiento no canónico de la vía Notch, es importante recordar que la

expresión de Hes puede darse: 1) por la unión de un ligando no canónico Delta-like (Dlk)

al receptor Notch (215)(216); o 2) por la interacción de componentes de otras vías como

Sonic Hedgegoh (Shh), Wnt/β-Catenina, con componentes corriente abajo de la vía Notch,

incluido la porción intracelular del receptor Notch (NICD o NotchIC) (212)(217); lo que

podría explicar los resultados observados en la presente investigación, donde se observó

que el mesénquima mantiene la expresión de Hes aún en ausencia de la expresión de los

ligandos canónicos de la vía Notch (Dll1 y J1) cuando se retiró el ectodermo (ver Figura 3.

4.) tal como se mencionó en el anterior Capítulo.

NOTCHIC es de gran importancia, puesto que transmite la señal desde la membrana al

núcleo celular y además se comporta como un coactivador una vez se une a los factores

CSL (218)(219). Para que NOTCHIC pueda migrar desde la membrana para cumplir su

función (promover la transcripción de genes diana), se requiere que la enzima γ-secretasa

realice el clivaje de esta porción (13).

El inhibidor de γ-secretasa N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl

ester (DAPT) ha sido usado para evaluar la función de Notch puesto que inhibe el clivaje

de NOTCHIC (84)(220). En diferentes órganos la inhibición de la vía Notch mediante el uso

de DAPT produce efectos importantes: se observa que DAPT atenúa la hiperplasia venosa

debido a la inhibición del clivaje de la porción intracelular del receptor N1

(NOTCHIC1)(220); también al inhibir NOTCHIC con DAPT, hay diferenciación neuronal de

células madre embrionarias; y adicionalmente se reduce la diferenciación de células

85

mesenquimales condroprogenitoras, disminuyendo la condrogénesis y los niveles de

expresión de los genes Hey y Hes (221).

Con respecto a Hey, a pesar de que en el Capítulo anterior se planteó que su expresión

posiblemente es dada por la presencia del ectodermo y al parecer mediada por la

activación canónica de la vía Notch (debido a que la ausencia de ligandos determinaría la

ausencia de expresión de Hey); también se discutió que esta señal podría ser promovida

no canónicamente por medio de vías que son controladas desde el ectodermo (Bmp y Fgf)

(213)(214); tomando en cuenta lo anterior; entonces no se sabe si la expresión de Hey en

las prominencias puede ser promovida por un mecanismo diferente a la activación

canónica, (entre los que podría estar la unión de receptores Notch a ligandos no canónicos,

a componentes de la lámina basal, o a componentes de otras vías, entre otros), por lo que

se propuso como una primera instancia determinar si se mantiene la expresión de al menos

uno de los genes de la familia Hey, al inhibir la liberación de NOTCHIC (proceso de la

activación canónica) en las prominencias maxilar y mandibular completas.



4.2 Metodología.

4.2.1 Incubación y extracción de embriones.

Huevos fertilizados fueron incubados en incubadora GQF 1502 sportsman (GQF MFG Co.

Inc. GA. USA). Durante 4 días (96 horas) aproximadamente, para alcanzar el estadío HH23

(15), tal como se mencionó en el Capítulo 2. El número de embriones por experimento se

observa en la Tabla 4.1

Tabla 4. 1. Número de embriones por experimento.

Metodología # Embriones #Réplicas

Cultivo celular (Caracterización) 15 5

RT-PCR (Cultivo celular, Concentración de DAPT) 15 3

RT-PCR (Cultivo celular, Toxicidad de DAPT) 15 5

RT-PCR (Cultivo organotípico de prominencias) 30 3

Inmunofluorescencia (Cultivo celular) 15 3

Hibridación in situ 6 3

4.2.2 Cultivo celular.

Utilizando pinzas relojeras y agujas de insulina, se cortaron y extrajeron las prominencias

(PMx y PMn) de embriones de pollo (N=15) (como se explica en el Capítulo 3).

Se disecaron las prominencias en fragmentos pequeños para posterior proteólisis con

Tripsina® (15090046) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) (1ml por 15 minutos a

37.5oC en incubadora de CO2).

Para bloquear la acción de la Tripsina, se agregaron 2 ml de medio de cultivo DMEM (12-

604F) (Lonza Group. Basilea, Suiza) enriquecido con suero fetal bovino 10% GibcoTM

(16000044) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA).

Se centrifugó y se descartó el sobrenadante; se adicionó por cada 800.000 células 250 ml

de medio de cultivo (DMM): DMEM (12-604F) (Lonza Group. Basilea, Suiza), enriquecido

87

con suero fetal bovino 10% GibcoTM (16000044) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) y

penicilina-estreptomicina 1% GibcoTM (15140122) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA,

USA).

Se sembró en frascos de cultivo, o cajas de 6 o 24 pozos, dependiendo el procedimiento

a realizar (Figura 4.1.). Se incubó en incubadora de CO2 a 37OC. Todo el proceso se realizó

en una cabina de flujo NU-S425 Lab gard class II Type2 (NuAire. MD, USA) para evitar

contaminación con agentes patógenos (222).

Para ensayos de inmunofluorescencia se realizó el cultivo sobre cubreobjetos redondos

previamente tratados con poli-L-Lisina (P8920) (SIGMA-ALDRICH (Merck KGaA). MO,

USA), tal como sugiere la casa comercial.

Figura 4. 1. Tipo de envase usado para el cultivo, dependiendo del experimento a realizar.

En la ilustración se observan los tipos de envases usados para cada uno de los cultivos celulares que

se realizaron. A. Frasco de 5ml para cultivo celular, este envase se usó para la caracterización del

cultivo celular. B. Caja de 6 pozos para realizar cultivo celular, esta caja se usó para realizar los

ensayos de toxicidad cuando se usa el tratamiento con DAPT. C. Caja de 24 pozos para realizar cultivo

celular, se usó en dos experimentos diseñados para observar el efecto del tratamiento con DAPT en

la expresión de Hey1 y NOTCHIC: el primero, para determinar de la concentración ideal de DAPT (para

inhibir Hey1) y el segundo, para la realización de inmunofluorescencia de NOTCHIC en cultivo celular.



4.2.3 Ensayos para determinar concentración ideal de DAPT.

Después de 24 horas de realizado el cultivo en cajas de 24 pozos se retiró el medio y se

adicionó medio de cultivo fresco.

Se agregó el tratamiento de DAPT alcanzando diferentes concentraciones finales (20-100

µM), y como controles se usaron células tratadas con el vehículo (DMSO al 20µM en DMM)

y células cultivadas únicamente con DMM (Figura 4.2).

La caja se incubó durante 24 horas, para posterior proteólisis con Tripsina® (15090046)

(Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) y conteo celular. Una vez pasaron las 24 horas se

procedió a realizar extracción de RNA, para posterior RT-PCR.

Se observa el diagrama de una caja de 24 pozos, en donde se usaron 21 pozos para realizar el cultivo

celular, la tabla muestra los colores correspondientes a las diferentes concentraciones finales de

DAPT usadas (paleta de violetas); en color durazno los pozos en los que únicamente se usó el vehículo

(DMSO) 20µM disuelto en medio de cultivo (DMM), y en rosa en los que solamente se aplicó DMM,

estos dos últimos son controles.

Figura 4. 2. Diseño experimental para la determinación de concentración ideal de

DAPT para inhibir Hey1 en el cultivo celular.

89

4.2.4 Ensayos de toxicidad celular para tratamiento con DAPT.

Después de 24 horas de realizado el cultivo en cajas de 6 pozos se retira el DMM y se

adicionaron 3mL de DMM fresco. Se agregó el tratamiento de DAPT alcanzando una

concentración final de 20μM a 3 muestras como se ve en la Figura 4.3; como control se

usaron células cultivadas con el vehículo (DMSO/DMM 20µM). Se incubó la caja durante

24 horas para posterior observación y conteo celular.

Figura 4. 3. Diseño experimental para la determinación de toxicidad celular de DAPT a

una concentración de 20µM.

Se observa el diagrama de una caja de 6 pozos usados para realizar el cultivo celular, la tabla la

aplicación de DAPT y sus respectivos controles, en color rosa los pozos en los que únicamente se

aplicó medio de cultivo (control) y en lila a los que se les agregó DAPT al 20µM.

4.2.5 Conteo celular con azul de tripán.

Para contar las células se retiró el medio y se agregó 1ml de Tripsina® (15090046)

(Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) por 1 minuto, se procedió a hacer conteo celular

en hemocitómetro.



Se realizó la preparación para conteo mezclando 10ul de suspensión celular con 10ul de

azul tripán.

Se contó en hemocitómetro el número de células teñidas y no teñidas, y se calculó el

porcentaje de viabilidad con la ecuación que se muestra en la Figura 4.4. Las células

teñidas con azul se cuentan como células muertas (debido al aumento de permeabilidad

en la membrana celular), y las blancas y brillantes como vivas.

Figura 4. 4. Ecuación para realizar el cálculo de viabilidad celular con Azul de Tripán.

Ecuación para contar las células con hemocitómetro, hace la aproximación al número de células (en

este caso el número de células vivas) por 1mL de en el cultivo celular.

4.2.6 Disección y cultivo organotípico de las prominencias maxilar

y mandibular.

La disección de las prominencias (PMx y PMn) se realizó bajo los criterios presentados en

el Capítulo 3 (Numeral 3.2.4.).

Para hacer realizar el cultivo organotípico, dentro de una cabina de flujo NU-S425 Lab gard

class II Type2 (NuAire. MD, USA) se agregó 1mL de medio para cultivo (DMEM (12-604F)

(Lonza Group. Basilea, Suiza), enriquecido con suero fetal bovino 10% GibcoTM

(16000044) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) y penicilina-estreptomicina 1%

GibcoTM (15140122) (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA), todo precalentado a 37oC)

a las prominencias extraídas (N=5 por cada pozo).

Se pusieron 300uL de la mezcla en cada pozo (caja de cultivo de 24 pozos) y se incubaron

durante 24h.

91

4.2.7 Tratamientos con DAPT en cultivo organotípico de

prominencias (PMx y PMn) in vitro.

Después de 24 horas de realizado el cultivo en cajas de 24 posos se retiró el medio y se

adicionó DMM fresco (300µL por pozo). En tres pozos se agregó el tratamiento de DAPT

a una concentración final de 20 µM y en 3 pozos se agregó DMSO al 20µM. Se procedió

a realizar extracción de RNA para posterior RT-PCR.

4.2.8 Inmunofluorecencia sobre cultivo celular.

Se realizó la inmunofluorecencia para células adheridas a cubreobjetos (Anexo E), según

el protocolo descrito por la casa Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA, usando una

concentración de 1:1000 de anticuerpo primario Anti Cleaved Notch1 (Val1744) (D3B8)

Rabbit mAb #4147 (Cell Signaling Technology, Inc. MA, USA) y 1:1000 de anticuerpo

secundario AlexaFluor® 488 Goat Anti-Rabbit IgG H&L (ab150077) (Abcam pcl.

Cambridge, Reino Unido). Para marcación nuclear se usó DAPI (1:5000).


se le agregó TRIzolTM (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) a las muestras y fueron

homogenizadas usando un sonicador Q125 (Qsonica NY, USA), con las siguientes

condiciones: 20% de amplitud y 3/1 pulsos por 12 segundos.













4.2.11 PCR.







Tabla 4. 2. Temperaturas de anillamiento utilizadas para cada uno de los genes.

Tabla 4. 3. Cebadores usados para cada uno de los genes.











104bp X95283.1



GAPDH 64

Notch1 60

Notch2 60

Delta1 60

Jagged1 60

Hey1 61

Hey2 60

Hes4 60

Hes5 60


93











con 2% de agarosa SeaKem LE Agarose (Lonza group Basilea, Suiza), disuelta en buffer

TBE1X. Las condiciones de corrido fueron: 100mv por 40 minutos.

4.2.12 Tratamientos de DAPT in vivo.

Bajo los criterios de Castro-Larios, descritos en su tesis (68). Se mezcló DAPT al 1000mM

disuelto en DMSO con aceite de oliva, llegando a una concentración final de DAPT 40uM;

esta mezcla se aplicó en las prominencias de embriones de pollo (in ovo) en estadío HH21

y se extrajeron estos embriones en estadío HH23. Para los controles se usó el vehículo

(aceite de oliva 40µL). Ninguno de los embriones tratados murió durante el proceso.

4.2.13 Hibridación In Situ.

La hibridación in situ se realizó bajo los criterios presentados en el Capítulo 2, realizando

el experimento con 3 embriones tratados con DAPT y 3 embriones control (aceite de oliva).



4.3 Resultados.

4.3.1 Estandarización del cultivo primario derivado de


4.3.1.1 Caracterización de cultivos celulares.

Lo primero que se observó en esta caracterización fue que el cultivo se desarrolló en

monocapa; además, se observaron los cambios que presentaban las células en el tiempo

(Figura 4.5): A las 6 horas se encontró que las células ya estaban adheridas a la caja

(Figura 4.5A), con una confluencia del 60%. Se realizó cambio de medio de cultivo puesto

que se encontraba de color amarillo ámbar (disminución del pH por aumento de

proliferación). A las 72 horas se empezaron a ver agrupaciones celulares concéntricas

(Figura 4.5B); A la semana (168 horas) las células comenzaron a mostrar signos de

apoptosis como vesículas y desprendimiento de la caja de cultivo (Figura 4.5C). Pasadas

2 semanas (336 horas) la confluencia disminuyó y se encontraron pocas células adheridas

(Figura 4.5D). Este experimento se realizó 5 veces obteniendo resultados equivalentes

entre sí.

Basados en esto, se tomó la decisión de realizar los tratamientos entre las 6 y las 72 horas,

cuando las células se encuentran con una confluencia mayor al 60%.

Figura 4. 5. Cultivo celular primario derivado de prominencias maxilar y mandibular de


95

Cultivo celular primario realizado a partir de la disección de 15 prominencias de embriones de pollo

en estadío HH23, usando medio de cultivo DMEM suplementado con suero fetal bovino (10%) y

penicilina/estreptomicina (1%). Fotografías tomadas en cronología. A. Fotografía tomada a las 6

horas, se observan células estiradas y adheridas al plato de cultivo, aumento 20X B. Fotografía tomada

a las 72 horas, se observa aumento de confluencia, adherencia concéntrica al plato y mayor longitud

de las células, aumento 10X. C. Fotografía tomada a las 168 horas, se observa disminución de

confluencia e incremento de vesículas apoptóticas, aumento 10X. D. Fotografía tomada a las 336

horas, disminución celular, confluencia del 20%, aumento 10X.

4.3.1.2 Viabilidad celular.

En cuanto a la viabilidad celular, en cultivos realizados en cajas de 6 pozos para posterior

conteo celular y visualización, se encontró una viabilidad mayor al 70% (Tabla 4.5) en todos

los casos por lo que encuentra válido el uso del DAPT. A su vez, se observa un cambio de

morfología en las células que tienen el tratamiento (Figura 4.6B) con respecto a las que no

lo tienen (Figura 4.6A). Sin embargo, no se puede afirmar que las células hayan sufrido

algún tipo de diferenciación puesto que no se midió este cambio con marcadores

moleculares.

Tabla 4. 4. Porcentajes de viabilidad celular en cultivos tratados y no tratados con DAPT

al 20uM.

Nota: En azul se encuentra el número de la réplica, en verde los pozos no tratados y en rosa los

tratados. Los resultados indican el porcentaje de viabilidad calculado después del conteo en

hemocitómetro usando la técnica de azul de Tripán.

Réplica Pozo1 Pozo2 Pozo3 Pozo4 Pozo5 Pozo6

1 73 76 79 76 75 81

2 80 81 81 73 74 76

3 78 81 79 80 74 85

4 71 71 84 78 72 83

5 81 71 71 72 70 81



Figura 4. 6. Contraste de cultivos celulares con y sin tratamiento con DAPT.

Cultivos celular primarios realizado a partir de la disección de 15 prominencias maxilar y mandibular

de embriones de pollo en estadío HH23, usando medio de cultivo DMEM suplementado con suero

fetal bovino (10%) y penicilina/estreptomicina (1%). Observación a las 72 horas. A. Cultivo celular

control (únicamente el vehículo), la morfología celular es alargada, confluencia del 90%. Aumento 10X

B. Cultivo celular tratado (DAPT 20uM), morfología cilíndrica alargada, confluencia del 90%.

Aumento10X.

4.3.2 Efecto del tratamiento con DAPT en la expresión de Hey1 y

NOTCHIC.

4.3.2.1 Efecto en la expresión de Hey1; determinación de la concentración

ideal de DAPT.

Al realizar una electroforesis de los cDNAs obtenidos de células tratadas a diferentes

concentraciones de DAPT (20µM-100µM) y sus respectivos controles; se observó que a

cualquier concentración de DAPT desaparece la expresión de Hey1, mientras que en los

controles esta expresión es evidente (Figura 4.7).

97

Electroforesis derivada de RT-PCR dirigida a cultivos de células provenientes de las prominencias

(PMx y PMn) de embriones de pollo en estadío HH23, a las que se les aplicó diferentes

concentraciones de DAPT (20µM, 40µM, 60µM, 80µM y 100µM); se tomó como control un cultivo al

que se le agregó DMSO (20µM) y uno únicamente con medio de cultivo (DMEM). El gen calibrador fue

GAPDH y se usó un marcador de peso (Ladder) de 100bp. DMM: Control únicamente con medio

DMEM; L: Ladder; G: GAPDH; H1: Hey1

Lo anterior muestra que incluso la mínima concentración de DAPT (20µM) sirve para inhibir

la transcripción de Hey1 en los experimentos mostrados a partir del siguiente numeral

(4.3.3).

4.3.2.2 Efecto en la expresión de NOTCHIC.

Adicionalmente, en los cultivos celulares sobre vidrios (previamente tratados con poli-L-

Lisina), a los cuales se les aplicó DAPT a la menor concentración (20µM), y posteriormente

se les realizó una inmunofluorescencia dirigida a NOTCHIC clivada, podemos observar

que no hay expresión de NOTCHIC clivada (Verde) en las células que fueron tratadas,

(Figura 4.8 D-F).




Inmunofluorescencia anti-NOTCHIC (Anti-NICD) clivada en cultivo celular derivado de prominencias

maxilar y mandibular de embrión de pollo en estadío HH23. Se tomó como referencia la marcación

con DAPI en los núcleos (azul). A. Expresión del marcador nuclear fluorescente DAPI en células

control. Aumento 10X B. Expresión de NOTCHIC clivada en células control. Aumento 10X. C. Merge

(Superposición de imágenes), en verde se observa marcación de NOTCHIC clivada y en cian el

NOTCHIC expresado en el núcleo. D. Expresión del marcador nuclear fluorescente DAPI en células

con tratamiento de DAPT al 40uM. Aumento 10X. E. Expresión de NOTCHIC clivada en cultivo celular

tratado con DAPT AL 40Um. Aumento (ausente) 10X. F. Merge, (Superposición de imágenes),

ausencia de marcación NOTCHIC clivada en verde y en cian (también ausente) el-NOTCHIC expresado

en el núcleo. WT: Wild type; DAPT: Tratamiento con DAPT a 20uM.

4.3.3 Expresión de Hey1 y otros componentes de la vía Notch al

inhibir el complejo γ-secretasa en las prominencias.

Al analizar las bandas de la electroforesis de los retrotranscritos de las prominencias

tratadas con DAPT, se observó una disminución en la expresión de N1, Dll1, Jag/Ser1,

Hes5 (asteriscos, Figura 4.9) e incluso Hey1 (punta de flecha, Figura 4.9), pero no

desaparece totalmente su expresión; lo que contrasta con lo ocurrido con los cultivos

Figura 4. 10. Expresión de NOTCHIC (NICD) clivado al realizar tratamientos con DAPT.

99

celulares donde al inhibir el complejo γ-secretasa sí desapareció totalmente la expresión

de Hey1 a cualquier concentración de DAPT, incluso una menor a la del cultivo

organotípico (20µM) (Figura 4.7.). También se observó que una de las isoformas de Hes5

(S5) desapareció en las prominencias tratadas con DAPT.

Electroforesis derivada de RT-PCR dirigida a diferentes genes de la vía Notch, en prominencias maxilar

y mandibular cultivadas in vitro. Se usó GAPDH como gen calibrador y marcador de peso de 100bp a

1000bp. Como tratamiento se aplicó DAPT disuelto en DMSO a 40uM en DMEM (DAPT 40uM), Control:

Control L: Ladder; G: GAPDH; N1: Notch1; N2: Notch2; D1: Delta1; J1: Jag/Ser1; H1: Hey1; H2: Hey2;

S4: Hes4; S5: S5.

Figura 4. 11. Expresión de genes de la vía Notch en el cultivo organotípico de las

prominencias tratadas con DAPT.



Los resultados de los tratamientos con DAPT in vivo de las prominencias (Figura 4.10.)

muestran, que de manera similar a lo obtenido in vitro (Figura 4.9.), la expresión del gen

transcrito Hey1 disminuye en el embrión tratado con DAPT (Figura 4.10C.): en la plácoda

trigeminal está casi ausente y en la prominencia mandibular, donde estaba muy bien

definida la expresión (dominio distal), aparece difusa (cabezas de flecha, Figura 4.10).

Hibridación in situ para el gen diana Hey1 realizada a embriones de pollo en estadío HH23,

disminución de la expresión de la expresión de Hey1 en plácoda trigeminal y en polo posterior de la

prominencia mandibular (Cabezas de flecha). A. Ilustración que muestra la expresión de Hey1 en

embrión de pollo en estadío HH23, control. B. Expresión de Hey1 en embrión de pollo en estadío HH23,

control. C. Expresión de Hey1 en embrión de pollo en estadío HH23 tratado con DAPT. PT: Plácoda

trigeminal; PMx: Prominencia Maxilar; PMn: Prominencia mandibular; AB2: segundo arco branquial.

Figura 4. 12. Expresión de Hey1 en embrión de pollo al realizar tratamiento in vivo con

DAPT.

101

4.4 Discusión.

En los resultados obtenidos al realizar el cultivo celular para observar los efectos de DAPT,

se observa que NOTCHIC clivado es totalmente inhibido en las células a las que se les fue

aplicado DAPT a 20µM; este resultado puede tener relación con lo mostrado en la Figura

4.7., en donde a cualquier concentración de DAPT utilizada (incluso desde 20µM), la

expresión de Hey1 no es evidente.

También con relación a la expresión de NOTCHIC, se observa que su expresión en las

células que no fueron tratadas con DAPT está tanto en el núcleo como en el citoplasma,

lo que se debería a que la porción de NOTCHIC ya clivada esté migrando por el citoplasma

hacia el núcleo.

En los resultados presentados en este Capítulo, también vemos una variación de la

expresión de algunos genes de la vía Notch dependiente de si son tratadas las células en

cultivo celular, en cultivo organotípico o in vivo; por ejemplo, los resultados de la pérdida

de función realizada en cultivo celular (Figura 4.7) muestran que hay pérdida de la

expresión de NOTCHIC clivada y subsecuentemente de Hey1; mientras que los resultados

de la perdida de función realizada en el cultivo organotípico de las prominencias completas

– que conservan su estructura tridimensional - muestran una reducción, mas no una

inhibición completa de la expresión de los genes diana Hey1 y Hes5, y un mantenimiento

de la expresión de los genes Hey2 y Hes4. Vale la pena señalar, que la disminución de la

expresión de Hey1 en el cultivo organotípico (Figura 4.9) es equiparable a la obtenida en

los tratamientos in vivo (Figura 4.10) en el presente estudio, que a su vez coincide con lo

obtenido por Castro-Larios, donde al realizar la perdida de función in vivo en embriones de

pollo en estadío HH18-HH21, observó una disminución en la expresión del gen diana Hey1,

mas no una inhibición absoluta (68) .

En cuanto a la expresión de Hey1 después de los tratamientos con DAPT, donde

únicamente se observó una disminución parcial en el cultivo organotípico (cuando

mantienen la conformación tridimensional), versus en cultivo celular (monocapa); aunque

se ha señalado que la aplicación de DAPT a 10µM es suficiente para disminuir

significativamente la liberación de NOTCHIC (223), y en el presente estudio se observa

ausencia de NOTCHIC al aplicar DAPT a 20µM; algunos autores han reportado que el



tratamiento con DAPT en algunas oportunidades no es suficiente para inhibir de manera

completa la actividad de la vía Notch en los tejidos (224), ya que la expresión de los genes

diana de la vía Notch puede ser influenciada no canónicamente por otras vías, tal como

Wnt (225). Lo anterior concordaría con los resultados del presente estudio, y explicarían el

porqué del mantenimiento de la expresión de algunos genes -entre ellos Hey1- en las

prominencias (PMx y PMn) luego del “bloqueo de la vía” (inhibición del clivaje de la porción

intracelular del receptor Notch).

Con respecto al conjunto de genes diana de la vía Notch, en estudios en modelo murino,

donde utilizaron DAPT como bloqueador de la vía, se observa que mientras Hey1 y Hes5

disminuyen su expresión a las 8 horas del tratamiento, hay una disminución poco

significativa de la expresión de Hey2 pasadas ya las 22 horas de tratamiento; los autores

proponen una regulación positiva del receptor de Fgf3 sobre Hey2 para su mantenimiento,

y a su vez una expresión de Hey1 y Hes5 vía canónica (clivaje del receptor) de Notch (148).

Esto coincide con los resultados obtenidos donde, mientras la expresión de Hey1 y Hes5

disminuye, la expresión de Hey2 permanece; por lo que la expresión de Hey2 podría estar

regulada de manera no canónica por otras vías, tal como Fgf. Si lo anterior fuera el caso,

que Fgf sea el causante del mantenimiento de la expresión de Hey2, su importancia

radicaría, de acuerdo con lo observado por otros autores, en que a través de dicho

mecanismo controlaría la diferenciación de las CCN en las prominencias (214).

Adicionalmente se observó que la expresión de una de las isoformas de Hes5 desapareció,

lo que podría ser importante puesto que las isoformas de Hes5 se han visto implicadas

diferencialmente en la formación y diferenciación celular en diferentes procesos en el

desarrollo del pollo (173)(226); además estas isoformas pueden regular otros genes de la

vía como Hes6 que también contribuyen a la diferenciación celular (226)(227).

De la expresión de Hes4 no se encontraron estudios en la literatura que reporten su

actividad no canónica en las prominencias; sin embargo, en el actual estudio se observó

que no hay una influencia del bloqueo de la γ-secretasa sobre la expresión de este gen, lo

que implicaría que la expresión de este gen podría estar dada por un mecanismo diferente

al clivaje del receptor Notch vía unión ligando canónico.

103

Adicionalmente, en el presente estudio ocurre un fenómeno de disminución en la

transcripción de los genes que codifican para los ligandos Dll1 y Jag/Ser1, y el receptor

N1; teniendo en cuenta el funcionamiento de la vía de señalización Notch(69), los únicos

genes cuya transcripción debería disminuir serían los de los genes diana, puesto que son

aquellos donde recae la acción de la unión ligando-receptor y posterior clivaje de NOTCHIC

(131); no obstante, en algunos estudios se observa que al aplicar DAPT disminuye la

expresión del receptor N1 (228)(229)(230) coincidiendo con los resultados obtenidos en el

presente estudio, donde se reduce la expresión de éste receptor al aplicar DAPT; sin

embargo la razón para dicha disminución después del tratamiento, se desconoce.

Teniendo en cuenta que la transcripción de los genes que codifican para los ligandos

Jag/Ser1 y Dll1 es regulada por la vía Notch a través de la transcripción canónica de los

genes Hes (231)(232)(233), cuya transcripción, de acuerdo con lo encontrado en el

presente estudio, en el caso del gen Hes5, que también disminuye; se plantea que a través

de la señal de Hes5 podría ser regulada la transcripción de los ligandos Jag/Ser1 y Dll1,

a manera de autoregulación. Adicionalmente se observó en el anterior Capítulo (Figura

4.10), que en el mesénquima de las prominencias no hay expresión de ni de Dll1 ni de

Jag/Ser1 incluso habiendo expresión de Hes5, y tomando en cuenta lo que se dijo

anteriormente, puede que el mantenimiento de la señal de Dll1 y Jag/Ser1 por medio de

Hes5 se dé en el ectodermo, mientras que en el mesénquima se de a partir de otras

señales como la de Wnt/β-Catenina reportada por algunos autores, que observaron que al

inhibir Wnt/β-Catenina se produce disminución (mas no una inhibición total) de la expresión

de uno de estos ligandos (Jag/Ser1) (234)(235).

En cuanto a la expesión de Hey1 en las prominencias (tanto in vitro como in vivo), este gen

diana sería el único (de los analizados en el presente estudio) que necesita de señales

ectodérmicas (o de la lámina basal), y adicionalmente depende parcialmente de la γ-

secretasa (vía canónica). Lo anterior quiere decir, que en el mesénquima de las

prominencias (PMx y PMn), Hey1 podría depender de señales del ectodermo (o de la

lámina basal), tanto por la vía Notch (de manera canónica), como por alguna otra señal

regulada desde el ectodermo tal como Bmp (213), entre otras.



En la siguiente ilustración (Figura 4.11) se observa un modelo que explicaría como podía

ser la dinámica de la vía Notch y cómo podría estar regulada la expresión de los

componentes de la vía Notch en las prominencias (PMx y PMn). En el ectodermo de las

prominencias están presentes todos los componentes de la vía Notch que podrían

interactuar entre sí. Allí Hes5 regularía la expresión de Jag/Ser1 en el ectodermo mientras

que en el mesénquima estaría regulada por una señal no proveniente de la vía Notch

(posiblemente Wnt). Concomitantemente, Hey1 (en fucsia) podría ser regulada por

diferentes señales provenientes del ectodermo (de manera canónica y nó canónica), o de

la membrana basal.


mandibular de embriones de pollo en estadío HH23.

105

Modelo de la expresión de los genes de la vía Notch, en el mesénquima de las prominencias maxilar

y mandibular. A. Ilustración donde se observa la interacción E-M para cada uno de los genes de la vía

Notch Notch, Hey1 resaltadoen fuccia; la expresión de Hey1 podria ser inducida desde el ectodermo

y ser parcialmente dependiente de γ-secretasa. B. Ilustración que muestra en forma de tabla la

expresión de los genes de la vía Notch y su relación con el mantenimiento del ectodermo (EC) y con

la actividad de γ-secretasa (G-Sec).



4.5 Conclusiones.

Es importante la conformación tridimensional de las prominencias (organotípica o in vivo),

para mantener la expresión de Hey1.

Al parecer la expresión de Hey2 y los genes de la familia Hes no dependen exclusivamente

del clivaje de NOTCHIC.

La expresión del gen que codifica para la expresión de Notch1 podría depender

parcialmente del clivaje de NotchIC.

La expresión de Dll1 y Jag/Ser1 podría depender parcialmente del clivaje de NotchIC y la

subsecuente expresión de Hes5 en el ectodermo de las prominencias; sin embargo en el

mesénquima, no dependería de Hes5, más podría depender de un mecanismo ajeno a la

activación canónica de Notch.

Finalmente se puede concluir que la expresión de Hey1 en la PMx y la PMn NO

depende exclusivamente de la vía canónica de Notch.

107

4.6 Sugerencias

Adelantar los experimentos de la instancia 2: Realizar ensayos de perdida de función en

los diferentes tejidos que componen las prominencias, para así puntualizar más la dinámica

de la vía Notch en las prominencias.

Realizar ensayos donde se realice la perdida de función de γ-secretasa y se mida la

proteína correspondiente a los ligandos de la vía Notch, para comprobar hay disminución

de la transcripción de estos ligandos, y si esta podría afectar la expresión de Hey1 en el

mesénquima.

Bloquear específicamente cada componente de la vía, para ver el efecto en las

prominencias, tal vez usando miRNAs.

Detallar mucho mejor la relación de la vía Notch con otras vías como por ejemplo

Endotelina en el patronamiento dorsoventral de las prominencias maxilar y mandibular; y

Wnt/β-catenina en interacciones E-M al igual que Bmp y Fgf.

Estudiar la importancia de la vía Notch con respecto al efecto fenotípico (en la morfología),

pero también en la diferenciación celular.



A. Anexo A. Protocolo de extracción de RNA total.



Chomczynski, P. y Mackey, K. en 1995.

Antes de comenzar se verificó que el área de trabajo estuviera lo suficientemente limpia,

para que este factor no interfiriera (degradación del RNA) en la extracción; por esta razón,

inicialmente se lavó la zona usando Extran® disuelto en agua destilada a una

concentración del 1%. Enseguida se desinfectó con alcohol (Etanol al 70%) y finalmente

con agua DEPC estéril para eliminar la mayor cantidad de RNasas en el lugar de trabajo.

Las puntas para micropipeta usadas fueron puntas con filtro, previamente esterilizadas y

expuestas a rayos UV por un intervalo no menor a 20 minutos, al igual que los tubos que

tuvieron contacto con las soluciones.

El operador, se lavó las manos con agua y jabón siguiendo el protocolo sugerido por la

OMS, NO con soluciones alcohólicas. Se usaron guantes y mascarilla durante todo el

procedimiento.

1. Homogenización del RNA.

La lisis se realizó dependiendo de la muestra. Para las prominencias completas y sus

tejidos separados se agregó 1mL de TRIzolTM (Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) por

cada 50 a 100 mg de tejido, en un tubo para microcentrífuga de 1.5 mL, y usando sonicador

Q125 (Qsonica NY, USA) con 20% de amplitud y 3/1 pulsos por 12 segundos se

homogenizó la muestra.

Para células se removió el medio de cultivo, se agregó 200µL de TRIzolTM (Thermo Fisher

Scientific Inc. MA, USA) y se homogenizó la muestra con ayuda del sonicador. Se retiró la

mezcla y se puso en tubos de microcentrífuga de 1.5 mL.

109

2. Separación de la muestra por fases.

Para separar la muestra por fases, se agregó 0.2 mL de cloroformo por 1mL de TRIzolTM

(Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) usado en la lisis de cada muestra, se incubaron

las muestras a temperatura ambiente por 2-3 minutos y finalmente se centrifugaron por 15

minutos a 12000 x g y 4oC.

La mezcla se separó en 3 fases, la fase inferior de rojo fenol-cloroformo, una interfase y

una fase superior acuosa que contiene el RNA. Se transfirió la fase acuosa a otro tubo de

microcentrífuga de 1.5 mL.

3. Precipitación del RNA.

Se agregó 0.5 mL de Isopropanol a la fase acuosa, por cada 1 mL de TRIzolTM (Thermo

Fisher Scientific Inc. MA, USA) usado en la lisis. Se incubó por 10 minutos y se centrifugó

por 10 minutos a 12000 x g y 4oC.

El RNA total se precipitó en un pequeño pellet en el fondo del tubo. Se descartó el

sobrenadante con una micropipeta.

4. Lavado de RNA.

Se resuspendió el pellet en 1 mL de etanol al 75% por cada 1mL de TRIzolTM (Thermo

Fisher Scientific Inc. MA, USA) usado en la lisis.

Se agitó la muestra con ayuda del vortex y se centrifugó por 5 minutos a 7500 x g a 4oC.

Se descartó todo el sobrenadante con una pipeta y se dejó secar el pellet por 5 a 10

minutos.

5. Solubilización de RNA.

Una vez el pellet está seco, se resuspendió en agua ultrapura libre de RNasas y DNasas,

y se incubó por 15 minutos a 55-60oC. Con el espectrofotómetro NanoDropTM 2000/2000c

(Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA) se cuantificaron las muestras generando un ratio

aproximado de 2.0 para la relación 260/280, aceptado como RNA “puro”, y relación

260/230 en un rango de 1.8 a 2.2.

Las concentraciones finales para proceder con la retrotranscripción fueron superiores a 13

ng/µL.



B. Anexo B. Protocolo de retro-transcripción y PCR (RT-PCR).

Antes de comenzar se verificó que el área de trabajo estuviera lo suficientemente limpia,

para que este factor no interfiriera (degradación de ácidos nucleicos) en el procedimiento;

por esta razón, inicialmente se lavó la zona usando Extran® disuelto en agua destilada a

una concentración del 1%. Enseguida se desinfectó con alcohol (Etanol al 70%) y

finalmente con agua DEPC estéril para eliminar la mayor cantidad de RNasas y DNasas

en el lugar de trabajo.

Las puntas para micropipeta usadas fueron puntas con filtro, previamente esterilizadas y

expuestas a rayos UV por un intervalo no menor a 20 minutos, al igual que los tubos que

tuvieron contacto con las soluciones.

El operador, se lavó las manos con con agua y jabón según el protocolo sugerido por la

OMS. Se usaron guantes y mascarilla durante todo el procedimiento.

1. Retrotranscripción

Para realizar la retrotranscripción se usó el protocolo sugerido por la casa comercial

Thermo Fisher Scientific Inc. MA, USA para el uso del kit SuperScript™ IV First-Strand

Synthesis System.

Para cada muestra en un tubo de PCR (0.2mL) se mesclaron los siguientes componentes

logrando un volumen final de cDNA (ADN de cadena sencilla) de 20 µL:

• Primer (Oligo DT): 1 µL

• dNTPs 10mM: 1µL

• Agua DEPC: 1 µL

• RNA total (>13 ng/µL): 10 µL

Se mezclaron los componentes con ayuda de un vortex y se precipitaron con spin. Se

incubaron por 5 minutos a 65oC. Una vez terminada la reacción, las muestras se colocaron

en hielo por 5 minutos.

111

En otro tubo se preparó la mezcla de los siguientes componentes para cada una de las

muestras, con el fin de realizar las síntesis de cDNA.

• 5X SSIV buffer: 4 µL

• DTT 100 mM: 1µL

• RNase OUT: 1µL

• Super Script IV: 1µL

Una vez terminó la incubación en hielo de la primera mezcla (Primer+dNTPs+Agua

DEPC+RNA total), se agregó ésta mezcla (5X SSIV buffer,DTT 100 mM, RNase OUT,

Super Script IV) y se incubó por 10 minutos a 50oC y por 10 minutos a 80oC.

Finalmente se aplicó 1µL de RNase H a cada muestra y se incubó por 20 minutos a 37oC,

logrando la purificación de cDNA.

Se cuantificó el cDNA usando el espectofotometro NanoDropTM 2000/2000c (Thermo

Fisher Scientific Inc. MA, USA), generando un ratio aproximado de 1.8-2.0 para la relación

260/280, aceptado como cDNA “puro”, y relación 260/230 en un rango de 1.8 a 2.2.

Las concentraciónes finales para proceder con la PCR fueron aproximadamente de

200ng/µL. De ser superiores, se realizó la dilución en agua ultrapura libre de DNasas y

RNasas hasta alcanzar esta concentración.

2. PCR

Se siguió el protocolo sugerido por la casa comercial para el kit GoTaq® PCR Systems.

En tubos de 0.2 mL se mezclaron los componentes a continuación, obteniendo un volumen

final de 25 µL:

• 5x GoTaq Flexi Buffer: 5 µL

• Primer (Cebador) Forward: 1.5 µL

• Primer (Cebador) Reverse: 1.5 µL

• MgCl2: µL

• Mix dNTPs 10 mM: 2 µL

• Agua: 11.375 µL

• TemplatecDNA): 2 µL



• GoTaq DNA polimerasa: 0.125 µL

Nota: Para el control negativo se usó agua destilada en lugar de Template.

Se usaron las secuencias de Cebadores que se observan en la siguiente tabla:











104bp X95283.1










Los parámetros usados para la PCR fueron los siguientes, se usó C1000 Touch™ Thermal

Cycler (Bio-Rad Laboratories, Inc. CA, USA)

Paso Temperatura (oC) Tiempo (minutos) # de ciclos

Denaturación inicial 95 4 1

Denaturación 95 0.5

Anillamiento * 0.5 35

Extención 72 1

Extención final 72 3 1

*Temperaturas de anillamiento:


113



con 2% de SeaKem LE Agarose (Lonza group Basilea, Suiza) disuelta en buffer TBE1X.

Las condiciones de corrido fueron: 100mv por 40 minutos.

Las bandas se extrajeron por medio del del kit Zymoclean Gel DNA Recovery D4007 (Zymo

Research CA, USA) y la secuenciación se realizó por metodología Sanger (realizada en el

Servicio de Secuenciación y Análisis Molecular (SSiGMol) del instituto de genética de la

Universidad Nacional de Colombia), fueron entregadas en formato FASTA y se visualizaron

través del programa BioEdit.


GAPDH 64

Notch1 60

Notch2 60

Delta1 60

Jagged1 60

Hey1 61

Hey2 60

Hes4 60

Hes5 60



C. Anexo C. Imágenes de análisis realizado para cada uno de los Cebadores (Jag/Ser1 y Dll1).

Inicialmente se verificaron las condiciones de la PCR por medio del software UCSC In-

sílico PCR (online); en las Figura C.1. se observan los resultados para los cebadores

dirigidos a Dll1. En la Figura C.2 los resultados correspondientes a los cebadores dirigidos

a Jag/Ser1.

Figura C. 1. Resultado de análisis por medio del software UCSC In-sílico PCR (online) para los cebadores dirigidos a Dll1.

Se observa la correcta temperatura de anillamiento a 60 grados aproximadamente (cuadro naranja)

coincidiendo con las condiciones de la PCR realizada, y además se observa un amplificado de 847bp

(Cuadro azul) para este par de cebadores.

115

Figura C. 2. Resultado de análisis por medio del software UCSC In-sílico PCR (online) para los cebadores dirigidos a Jag/Ser1.

Se observa la correcta temperatura de anillamiento alrededor de los 60 grados (cuadro naranja)

coincidiendo con las condiciones de la PCR realizada, y además se observa un amplificado de 756bp

(Cuadro azul) para este par de cebadores.

Hallando explicación para las bandas adicionales, mas no para las bandas cortas se

decidió realizar el análisis de los cebadores por medio del software Basic Local Alignment

Search Tool (BLAST) (Online). Obteniendo los resultados que muestran la Figura C.3. y la

Figura C.4. los cuales coinciden con lo encontrado en UCSC In-sílico PCR (online) pero

muestran los pesos de los amplificados las bandas obtenidas con mayor intensidad (Figura

2.3.).



Figura C. 3. Amplificados de DNA para Dll1.

Amplificados derivados de la PCR donde se usan los cebadores dirigidos a Dll1 (cuadro naranja). Se

observa que los amplificados pueden tener un tamaño de 108bp u 847bp (cuadros azules),

coincidiendo con lo obtenido en el presente estudio.

Figura C. 4. 1. Ampificados de DNA Para Jag1/Serrate1

Amplificados derivados de la PCR donde se usan los cebadores dirigidos a Jag/Ser1 (cuadro naranja).

Se observa que los amplificados pueden tener un tamaño de 104bp u 756bp (cuadros azules),

coincidiendo con lo obtenido en el presente estudio.

117

D. Anexo D. Preparación de embriones para cortes en secciones histológicas.

Se siguieron los pasos mostrados en la Tabla D.1. y una vez se terminan los lavados de

los embriones en parafina, se procede a incluirlos en bloques cuyo molde fue fabricado

manualmente con papel aluminio. Finalmente, se hacen los cortes en secciones

histológicas sagitales

Tabla D. 1. Lavados para incluir al embrión en parafina.

Paso Número

de lavados

Solución usada Concentración

(%)

Tiempo por cada lavado

(minutos)

1 2 Etanol 50 15

2 2 70 15

3 2 85 30

4 2 95 30

5 2 100 30

6 2 Isopropanol 100 15

7 3 Xilol ---- 12

8 3 Parafina ---- 30



E. Anexo E. Inmunofluorecencia sobre células y sobre secciones histológicas.

Se realizó un protocolo para inmunofluorecencia durante dos días; Para las secciones

histológicas el primer día se desparafinaron las secciones histológicas (60oC durante una

hora) y se realizaron los lavados que se muestran en la Tabla E.1.; Para los cultivos

realizados sobre cubreobjetos únicamente se retiró el medio y se procedió a fijar las

células.

Tabla E. 1. Lavados previos a inmunofluorecencia sobre secciones histológicas.

Paso Número de

lavados

Solución usada Concentración

(%)

Tiempo por cada lavado

(minutos)

1 2 Xilol ---- 5

2 1 Isopropanol 100 2

3 1 Etanol 100 2

4 1 95 2

5 1 85 2

6 1 70 2

7 1 50 2

Una vez desparafinadas las secciones histológicas, (si son células se inicia desde este

paso) se realizaron 3 lavados de 5 minutos con TBST 1X y se fijaron los embriones con

PFA4% durante 10 minutos,

Para permeabilizar, se lavaron las secciones 3 veces con TTBST 1X durante 5 minutos, y

2 veces con TBS 1X durante 5 minutos.

Se aplicó solución de bloqueo - suero fetal bovino/TBST al 10% - y se incubó durante 3

horas a temperatura ambiente y finalmente se incubaron las secciones histológicas en

anticuerpo primario (1:1000) durante toda la noche a 4oC.

119

El segundo día se retiró el anticuerpo primario y se hicieron 3 lavados de 5 minutos con

TBST1X, seguidos de 5 lavados de 5 minutos con solución de bloqueo.

Se incubaron las láminas en anticuerpo secundario (1:1000) durante 3 horas a temperatura

ambiente y se realizaron 3 lavados con TBST 1X por 5 minútos.

Finalmente, se realizaron 5 lavados de 5minútos en solución de boloqueo y se aplicó medio

de montaje con DAPI (1:5000).

Se almacenaron las láminas a 4oC y protegidas de la luz para posterior observación en el

estereomicroscopio de fluorescencia Axio Zoom V16 (Carl Zeiss AG. Oberkochen,

Alemania).

.



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Expresión de Hey1 al realizar la pérdida de función de ...

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