Etude du protocole du TP2Généralités sur les intégrines

Etude du protocole du TP2Généralités sur les intégrines

Sylvie Monferran

Etude du protocole du TP2 Etude du protocole du TP2

• 4 manips / 3 jours qui se chevauchent

• TP: projet de recherche… autonomie

• Compte-rendu sous forme d’un article scientifique

– Résumé: à faire à la fin– Introduction: sur les intégrines– Matériels et méthodes: principe de chaque expérience– Résultats et discussion: critique des résultats– Conclusion et perspectives

Adhérence cellulaireAdhérence cellulaire

Adhérence intercellulaireAdhérence homotypique: interaction entre cellules du même type cellulaireAdhérence hétérotypique: interaction entre cellules de type cellulaire différents

Adhérence cellulaire à la matrice extracellulaire

Nature Review in Molecular Cell Biology

Extracellular matrix

Molécules d’adhérence cellulaireMolécules d’adhérence cellulaire

Frenett et al, N Engl J Med, 1996

Ca2+ dépendantes: cadhérines, sélectines, intégrinesCa2+ indépendantes: CAM

Intégrines: récepteurs de la matrice extracellulaireIntégrines: récepteurs de la matrice extracellulaire

Lame basale Matrice interstitielle

Famille des intégrinesFamille des intégrines

Hynes, Cell, 2002

8 sous-unités 18 sous-unités 24 intégrines

Liaison à un ligand matriciel Liaison à un CAM

Spécificité des ligands des intégrinesSpécificité des ligands des intégrines

beta1   Ligands

  alpha1 Collagens, Laminins

  alpha2 Collagens, Laminins

  alpha3Laminins, Fibronectin, Thrombospondin

  alpha4 Fibronectin, VCAM

  alpha5 Fibronectin

  alpha6 Laminins

  alpha7 Laminins

  alpha8 Fibronectin, Tenascin

  alpha9 Tenascin

  alpha10 Collagens

Structure des intégrinesStructure des intégrines

Chaîne Chaîne

Domaine I/A (vWA)

Membrane plasmique

Sept domaines répétés en hélices

Liaison à un cation(Ca2+)

MIDASZone d’interaction

avec le ligand

Humphries, Biochemical Society, 2000

Domaine transmembranaire:Ancrage dans la membrane plasmique

Domaine cytoplasmique:Interaction avec protéines de signalisation et du cytosquelettevia la sous-unité

Domaine extracellulaire:Interaction avec le ligand

Activation des intégrinesActivation des intégrines

Hynes, Cell, 2002

-Activation par l’extérieur de la cellule: liaison au ligandSignalisation outside-in

Conformation inactive(recourbée)

Conformation active:Liaison avec le ligand

Activation des intégrinesActivation des intégrines

-Activation par l’intérieur de la cellule: liaison à des partenaires protéiquesSignalisation inside-out

Qin, Plos biology, 2004

Tadokoro, Science, 2003

Liaison des CHO exprimant IIb3 à PAC-1

PAC-1: anticorps mimant la liaison de l’intégrine IIb3 au ligand

LIBS6: anticorps activant l’intégrine IIb3 par l’extérieur

Signalisation des intégrinesSignalisation des intégrines

Hood et Cheresh, Nat Rev Cancer, 2002

Activité enzymatique

Kinases: FAK, PKC

GTPases Rho: Rac, ras

Protéines adaptatrices

GRB2, CAS

Protéines effectrices

MLCK

= MAPK

Sos

RASGTPGDP

P

P

= MEKK

Signalisation des intégrines: la FAKSignalisation des intégrines: la FAK

Structure et activation: KO FAK: Léthalité embryonnaire à J8Défaut de migration des cellules du mésoderme

Ilic et al, Nature, 1995

Vidéomicroscopie sur des « fibroblastes » d’embryons de J8

FAK +/+ FAK -/-

Activation de FAK aux points de contact cellule/matrice extracellulaire:

Cônes de croissance chez le Xénope

Robles and Gomez, Nat Neuroscience, 2006

Liaison au cytosquelette d’actinesauf l’intégrine 64 qui se lie aux filaments intermédiaires

Liaison au cytosquelette d’actinesauf l’intégrine 64 qui se lie aux filaments intermédiaires

AdhérenceMigration

Delon et al, Current Opinion in Cell Biology, 2007

Points focaux d’adhérence: plus de 50 protéines identifiées

Protéines liant l’actine et permettant la stabilisation des filaments d’actine pré-existants

Taline, parvine…

Nucléation de nouveaux filaments d’actine Arp 2/3, formine…

Actine/myosine

Fonction des intégrinesFonction des intégrines

Prolifération cellulaire

Survie cellulaire

Contrôle de latranscription

Matrice extracellulaire

Hynes, Cell, 2002

Migrationcellulaire

Réorganisation du cytosquelette

Intégrine 31 empêche la migration des kératinocytes murins (MK)

Margadant, JCS, 2009

Test de migration

Explants de peau

Epiderme

Derme

Pathologies associées aux intégrines (1)Pathologies associées aux intégrines (1)

• LAD (leukocyte adhesion deficiency): -défaut de recrutement aux sites d’infection des monocytes ou des neutrophiles -mutations dans le gène codant pour la sous-unité 2 des intégrines: LAD I-inhibition de l’expression de 2: LADI-ou expression d’une forme de 2 qui n’est pas présente à la membrane plasmique ou ne peut pas conduire le signal :LAD I variant

Bunting, Curr Opinion Hematol, 2002

Pathologies associées aux intégrines (2)Pathologies associées aux intégrines (2)

• Cancers:- Changement de localisation subcellulaire

ex: l’intégrine 64 (marquage en jaune) dans une lignée de carcinome squameux

Bello, Neurosurgery, 2001

-Changement du répertoire des intégrines (inhibition des intégrines qui maintiennent les cellules attachées à la membrane basale et expression des intégrines qui permettent invasion, ..)

Ex: l’intégrine v3 exprimée dans les glioblastomes (GBM) mais pas dans le cerveau sain (NB)

Intégrine v3

Cerveau sain

Glioblastome

Rabinovitz, JCB, 1999

Régulation des voies de signalisation des intégrines par d’autres récepteurs

Régulation des voies de signalisation des intégrines par d’autres récepteurs

Guo, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004

Guo, Cell, 2006

IPSignalisation 4

Acini mammaire

Signalisation croisée entre l’intégrine 64 et le R de l’EGF type II (ErbB2, neu)

Signalisation croisée entre l’intégrine 64 et le R de l’EGF type II (ErbB2, neu)

Signalisation 4

Implantation orthotopique

Implantation ectopique

prolifération invasion

Inhibition directe des intégrinesInhibition directe des intégrines

Activité des intégrines

Molécules peptidomimétiques

Expression des intégrinesInterférence d’ARN

Tucker, Curr Oncol Rep, 2006

Activité des intégrines

Anticorps bloquants

Inhibition indirecte des intégrinesInhibition indirecte des intégrines

Inhibition des voies de signalisationInhibiteurs pharmacologiques dirigés contre la protéine cible

Pseudo substrat Ligand compétitif ATP Substrat non hydrolysable

Ex: PKC

• Déterminer le type d’intégrines exprimé par une cellule

Expression totale– Western-Blot

Expression à la surface externe des cellules

– Cytomètrie de flux– Immunofluorescence– Biotinylation des protéines de surface, puis Immunoprécipitation puis

Western Blot

Test indirect

– Test d’adhésion en présence d’inhibiteurs pharmacologiques des intégrines (anticorps bloquants, agents peptidomimétiques)

Méthodologie pour étude des intégrinesMéthodologie pour étude des intégrines

Méthodologie pour étude des intégrinesMéthodologie pour étude des intégrines

•Déterminer quelle est la voie de signalisation activée par une intégrine

– Etude de l’expression/activité des protéines en aval des intégrines en utilisant des inhibiteurs pharmacologiques ou des ARNi dirigés contre les intégrines ou en activant les intégrines

– Caractérisation des molécules de signalisation (co-précipitations, Western-Blot)

Méthodologie pour étude des intégrinesMéthodologie pour étude des intégrines

• Déterminer la fonction d’une intégrine

– Test d’adhésion sur protéines matricielles

DO

Substrat

16 h

4°CCellule

s

2-6 h

37°CFixatio

n

Schéma expérimental :

Coloration

+/-Anticorps/Inhibiteurs

des intégrines

Système Cre-LoxSystème Cre-Lox