Etude du comportement hors-equilibre du cortex cellulaire

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Etude du comportement hors-equilibre du cortexcellulairePierre Bohec

To cite this version:Pierre Bohec. Etude du comportement hors-equilibre du cortex cellulaire. Mcanique statistique[cond-mat.stat-mech]. Universit Paris-Diderot - Paris VII, 2012. Franais.

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UNIVERSIT PARIS-DIDEROT

THSE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE LUNIVERSIT PARIS-DIDEROT

cole Doctorale matire condense et interfaces (ED 518)

Laboratoire Matire et Systmes Complexes

tude du comportement hors-quilibredu cortex cellulaire

prsente

par

Pierre BOHEC

Soutenue le 5 mars 2012 devant le Jury compos de :

Jean-Marc Allain Matre de Confrences, cole polytechnique RapporteurDaniel Navajas Professeur, IBEC RapporteurSophie Cribier Professeure, UPMC ExaminatricePierre Nassoy Directeur de Recherche, CNRS ExaminateurPaolo Visco Charg de Recherche, CNRS ExaminateurFranois Gallet Professeur, Universit Paris-Diderot Directeur de thse

Table des matires

Avant-propos 1

1 La mcanique cellulaire : aspects biologique et physique 31.1 La cellule : une entit organise lchelle micromtrique . . . . . . . . 4

1.1.1 De lADN la production de protines . . . . . . . . . . . . . . 41.1.2 De lintrieur lextrieur de la cellule . . . . . . . . . . . . . . 41.1.3 LATP : le carburant de la cellule . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.1.4 Le cytosquelette : un rseau dynamique . . . . . . . . . . . . . . 51.1.5 Ladhsion cellulaire : un transmetteur de forces . . . . . . . . . 131.1.6 Le vivant est toujours hors-quilibre . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.2 La cellule : un matriau viscolastique hors-quilibre . . . . . . . . . . . 181.2.1 Description thorique dun matriau viscolastique hors-quilibre 181.2.2 De la microrhologie la mesure du spectre des forces . . . . . . 21

1.3 La microrhologie de la cellule eucaryote . . . . . . . . . . . . . . . . . 261.3.1 Origines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261.3.2 Les techniques exprimentales de microrhologie . . . . . . . . . 271.3.3 Un comportement en loi de puissance . . . . . . . . . . . . . . . 281.3.4 tat de lart de la mesure de spectre des forces actives et de la

violation du thorme de fluctuation-dissipation . . . . . . . . . . 32

2 Dispositif exprimental et mthodes 392.1 Approche exprimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402.2 Pince optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2.1 Histoire et principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 412.3 Montage exprimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.3.1 Montage de la pince optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.3.2 Cale pizolectrique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.3.3 Calibration du pige optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 462.3.4 chantillon exprimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

2.4 Acquisition dimages et dtection de particules . . . . . . . . . . . . . . 502.4.1 Camra rapide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502.4.2 Dtection de particules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512.4.3 Limitations exprimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

2.5 Calcul des transformes de Laplace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542.6 Calcul des moyennes et des erreurs statistiques . . . . . . . . . . . . . . 54

3 Rsultats exprimentaux et effets de la densit de ligand RGD 573.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583.2 Rsultats exprimentaux sur un exemple tmoin . . . . . . . . . . . . . . 58

3.2.1 Microrhologie passive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583.2.2 Microrhhologie active . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.2.3 Spectre des forces exerces sur la sonde . . . . . . . . . . . . . . 613.2.4 cart du systme lquilibre thermodynamique . . . . . . . . . 64

3.3 Effets de la variation de la concentration de ligand entre la sonde et le cortex 663.3.1 Nombre de liens bille-cellule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 663.3.2 Fluctuations passives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 673.3.3 Statistiques sur le dplacement quadratique moyen . . . . . . . . 683.3.4 Mesure de la fonction de rponse viscolastique . . . . . . . . . . 773.3.5 Calcul de la fonction de corrlation des forces . . . . . . . . . . . 793.3.6 De lquilibre thermodynamiques aux forces dorigines biologiques 84

3.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

4 Modification du mtabolisme cellulaire 914.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 924.2 Effets de la temprature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

4.2.1 Rsultats exprimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 924.2.2 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

4.3 Recherche des acteurs biologiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 974.3.1 Drogues agissant sur le cytosquelette . . . . . . . . . . . . . . . 974.3.2 Effet des drogues sur les mesures de microrhologie temprature

ambiante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 994.3.3 Effet des drogues sur les mesures de microrhologie temprature

physiologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1104.3.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

4.4 Mesures de microrhologie sur une mme cellule avant et aprs traitementpharmacologique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1174.4.1 Rsultats exprimentaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1174.4.2 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

4.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

5 Conclusion 125

Bibliographie 129

Annexes

A Quelques calculs 139A.1 Relation... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139A.2 Relation... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

B Protocoles 143B.1 Protocoles de prparation de lchantillon biologique . . . . . . . . . . . . . 143B.1.1 Prparation des billes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143B.1.2 Prparation des lamelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143B.1.3 Adhsion des billes sur les cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144B.2 Protocoles dutilisation des drogues inhibant des processus dans le cytosquelette144B.2.1 Appauvrissement de la cellule en ATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144B.2.2 Inhibition de la polymrisation de lactine . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144B.2.3 Inhibition des myosines II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144B.2.4 Utilisation du 2,3-Butanedione monoxime (BDM) . . . . . . . . . . . . . 145

C Articles 147

Avant-propos

La cellule vivante sous forme unicellulaire a pour but de survivre et de se reproduire.Quand elle se trouve sous forme dorganisme multicellulaire, son but est la survie et la re-production de cet organisme tout prix, ft-ce celui de la mort par apoptose. Afin dassurerleur rle, les cellules ont besoin de se mouvoir, de se dformer, de se diviser, dchangerdes informations avec leur environnement. Pour cela, la cellule possde un mtabolismelui permettant de produire et dutiliser un panel de protines. Tous ces processus nces-sitent un apport de matire et dnergie que le mtabolisme de la cellule va transformeret consommer travers une multitude de ractions chimiques. Il en rsulte que la celluleest, du point de vue de la physique statistique, un systme perptuellement hors-quilibre.En effet, contrairement dautres systmes hors-quilibre convergeant vers lquilibre, levivant doit sans cesse se maintenir hors de lquilibre car lquilibre thermodynamique estsynonyme de mort.

La cellule est capable, en consommant lnergie issue de lhydrolyse de lATP, dexer-cer des forces qui prennent leurs origines dans des ractions biochimiques. Un lmentimportant de la cellule est le cytosquelette, compos principalement de microtubules et defilaments dactine, il en constitue larchitecture et lui donne lessentiel de ses propritsmcaniques. Il est compos de polymres rticuls et, du point de vue de la rhologie, aun comportement viscolastique. Au sein du cytosquelette, des processus tels que la poly-mrisation de lactine ou des microtubules permettent dexercer des forces. Des protines,de la famille des moteurs molculaires, ont pour rle spcifique de convertir lnergie sto-cke sous forme chimique en nergie mcanique. Lactivit mcanique hors-quilibre dela cellule est donc directement relie ces forces dorigine biochimique. Dans ce travail,nous avons tudi la distribution statistique des forces dorigine biochimique sexerant surune bille de taille micromtrique attache au cortex dactine par lintermdiaire de rcep-teurs de ladhsion cellulaire : les intgrines. Ltude des forces dorigine biologique estinsparable de la connaissance des forces dorigine thermique car cette chelle ( m) lacontribution des forces thermiques nest pas ngligeable. Les forces sexerant sur la sondeont deux origines possibles : biologique ou thermique.

Notre approche exprimentale est base sur la combinaison de deux techniques de mi-crorhologie, active et passive, ce qui nous permet de calculer la fonction dautocorrlationtemporelle des forces exerces sur une sonde accroche lactine corticale et de le com-parer la fonction dautocorrlation des forces thermiques estime via le thorme de

2

fluctuation-dissipation. La diffrence entre ces deux spectres nous donne une ide de lacontribution des forces dorigine biologique au mouvement de la bille et une mesure delcart du systme lquilibre thermodynamique.

Ce travail sinscrit dans un ensemble de recherches effectues au laboratoire Matire etSystmes Complexes (MSC). Ltude des proprits viscolastiques des cellules traversdiverses techniques de microrhologie (pinces optiques, microplaques, pince magntiques,endosomes magntiques) est une thmatique importante de lquipe Physique du Vivant.De mme la mesure des forces exerces par les cellules fait partie des axes de recherchesdans le laboratoire MSC avec des expriences utilisant des micropiliers ou des micro-plaques. Enfin, ltude gnrale de la dynamique des systmes hors-quilibre est aussi undes sujets principaux du laboratoire.

Le premier chapitre est compos dune introduction sur la biologie cellulaire se foca-lisant sur la structure et la fonction du cytosqulette, en particulier sur les origines biolo-giques des forces gnres et transmises par le cytosquelette et les protines associes. Ladeuxime partie de ce chapitre relie thoriquement, par un modle de Langevin gnralis,le spectre des forces exerces par un matriau viscolastique hors-quilibre sur une sondede taille micromtrique des grandeurs disponibles exprimentalement avec des mesuresde microrhologie active et passive : la fonction de rponse viscolastique et le dpla-cement quadratique moyen. La dernire partie de ce chapitre sattache faire une revuenon-exhaustive des mesures de viscolasticit des cellules. Nous finirons cette partie parune synthse des connaissances existantes sur les mesures de spectres de forces dans descellules ou des gels actifs mimant le comportement du cytosquelette.

Le deuxime chapitre dcrit le dispositif exprimental et les mthodes danalyse.Dans une premire partie du troisime chapitre, les rsultats typiques dun exemple

tmoin sont prsents afin de se familiariser avec les grandeurs mesures. La suite de cechapitre sera consacre aux rsultats obtenus lorsque lon fait varier la densit de liensentre la cellule et la bille-sonde.

Dans le dernier chapitre, nous exposerons les rsultats des mesures exprimentalesquand lactivit biologique du cytosquelette est modifie. Dans un premier temps nousdcrirons leffet de la temprature. Puis nous prsenterons les rsultats obtenus sur descellules ayant subi un traitement pharmacologique inhibant certains processus actifs du cy-tosquelette. Nous discuterons leffet de la dpltion de lATP, de la dpolymrisation delactine et de linhibition des moteurs molculaires de la famille des myosines.

CHAPITRE 1La mcanique cellulaire : aspects

biologique et physique

Sommaire1.1 La cellule : une entit organise lchelle micromtrique . . 4

1.1.1 De lADN la production de protines . . . . . . . . . . . . . 41.1.2 De lintrieur lextrieur de la cellule . . . . . . . . . . . . . 41.1.3 LATP : le carburant de la cellule . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.1.4 Le cytosquelette : un rseau dynamique . . . . . . . . . . . . . 51.1.5 Ladhsion cellulaire : un transmetteur de forces . . . . . . . . 131.1.6 Le vivant est toujours hors-quilibre . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.2 La cellule : un matriau viscolastique hors-quilibre . . . . . 181.2.1 Description thorique dun matriau viscolastique hors-quilibre 181.2.2 De la microrhologie la mesure du spectre des forces . . . . . 21

1.3 La microrhologie de la cellule eucaryote . . . . . . . . . . . . 261.3.1 Origines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261.3.2 Les techniques exprimentales de microrhologie . . . . . . . . 271.3.3 Un comportement en loi de puissance . . . . . . . . . . . . . . 281.3.4 tat de lart de la mesure de spectre des forces actives et de la

violation du thorme de fluctuation-dissipation . . . . . . . . . 32

4 La mcanique cellulaire : aspects biologique et physique

1.1 La cellule : une entit organise lchelle micromtrique

La cellule est la plus petite unit de la matire vivante. Elle possde un mtabolismeautonome, dlimit par une membrane plasmique, lui permettant dchanger de lnergieet de la matire avec son environnement. On distingue deux types de cellules :

Les cellules procaryotes composes principalement de bactries ne possdant pas denoyau ;

Les cellules eucaryotes composant les vgtaux, les champignons et les animaux,munies dun noyau et de diffrents organites.

La structure typique de ces dernires est reprsente figure 1.1 gauche. Les celluleseucaryotes, entoures dune membrane constitue dune bicouche de lipides (figure 1.1droite), sont organises en plusieurs compartiments appels organites, eux-mme entoursdune membrane.

1.1.1 De lADN la production de protines

La cellule eucaryote a la particularit de possder un compartiment intracellulaire, ap-pel noyau (figure 1.2A et 1.2B), contenant linformation gntique code dans les fila-ments dADN. LADN dtient la recette de la synthse des protines qui sont un l-ment essentiel la vie de la cellule. En effet, cette succession dacides amins assure lamajorit des fonctions cellulaires comme la structure de la cellule, la motilit, lexpressiondes gnes... Lors de la transcription, lARN messager (portion dADN codant une pro-tine) est synthtis dans le noyau. Puis il traverse lenveloppe nuclaire pour tre dcodet synthtis dans le ribosome. Ces protines vont alors tre modifies dans le rticulumendoplasmique (figure 1.2C) et matures dans lappareil de Golgi (figure 1.2D). Tous cescompartiments baignent dans un liquide appel le cytosol qui constitue une rserve de pro-tines en solution aqueuse. Ces lments sont soutenus par le cytosquelette qui donne laforme la cellule. On nomme cet ensemble : le cytoplasme.

1.1.2 De lintrieur lextrieur de la cellule

La cellule possde une bicouche de lipides dlimitant le cytoplasme du milieu extracel-lulaire : la membrane plasmique (figure 1.1 droite). Elle est compose dune bicouche decholestrols et de phospholipides. Leur structure compose dune tte hydrophyle et dunequeue hydrophobe places en opposition assure la cohrence de la membrane. Cest unebarrire slective qui contrle les flux de molcules et dions entre lintrieur et lextrieurde la cellule grce en partie des protines de transport. On trouve dans la membrane desprotines transmembranaires impliques entre autres dans ladhsion cellulaire.

lextrieur de la cellule se trouve la matrice extracellulaire constitue de protinestelles que le collagne ou la fibronectine. Celles-ci sont scrtes par la cellule et sont encontact avec la membrane et lintrieur de la cellule grce la protine transmembranaireappele intgrine (section 1.1.5). La matrice extracellulaire et les protines transmembra-naires associes permettent de crer de fortes adhsions entre la cellule et son substrat.

1.1 La cellule : une entit organise lchelle micromtrique 5

Milieu extracellulaire

Cytoplasme

Cholesterol Protine transmembranaire(structure globulaire)

Protine priphrique

Glucides

Glycolipide

Bicouchephospholipidique

Protine transmembranaire(structure en hlice alpha)

Protine canal(protine de transport)

Protine globulaire

Filaments de cytosquelette

Phospholipide

Ttes hydrophiles

Chanes hydrophobes

FIGURE 1.1 gauche, les diffrents compartiments dune cellule animale typique. droite,schma dune membrane plasmique et de ses composants. [Wikipdia]

1.1.3 LATP : le carburant de la cellule

La production de protines se fait par une succession de ractions bio-chimiques n-cessitant un apport dnergie. Pour cela, la cellule dispose dun rservoir dnergie sousla forme de ladnosine triphosphate (ATP). La respiration cellulaire permet de synthtisercette molcule dans les mitochondries (figure 1.2C).

La raction dhydrolyse ATP ADP+ phosphate va librer une nergie denviron20kBT qui sera aussitt consomme par une des nombreuses ractions chimiques de lacellule.

1.1.4 Le cytosquelette : un rseau dynamique

Les composants du cytosquelette

Le cytosquelette dune cellule eucaryote (figure 1.3) est constitu de rseaux de fila-ments sans cesse renouvels par des ractions de polymrisation et de dpolymrisation. Ilconstitue larchitecture de la cellule et lui donne la plupart de ses proprits mcaniques.Il permet la cellule de sadapter son environnement et dispose les organites intracellu-laires. Les filaments du cytosquelette peuvent se lier entre eux ou la membrane plasmiquegrce des protines rticulantes. Ils relient, par lintermdiaire de protines transmem-branaires, lintrieur de la cellule la matrice extracellulaire ou dautres cellules. Ils sontcomposs de trois sortes de polymres forms partir de monomres protiques.

Les filaments dactineLes filaments dactine sont un assemblage de monomres dactine globulaire, de cations

divalents (par exemple lion calcium) et de nuclotides (lATP ou lADP). Ces monomrespolymrisent en protofilaments qui senroulent pour donner une forme hlicodale aux fi-laments dactine [70]. Chaque monomre dactine a une structure asymtrique qui conduit la formation de filaments polariss. Cette polarisation engendre une diffrence dans lacintique de polymrisation entre les deux extrmits (le bout barbu polymrise plus viteque le bout pointu [77, 75]). Le filament dactine a un diamtre denviron 7 nm et une


FIGURE 1.2 En A, le noyau en bleu observ par microscopie de fluorescence. En B, le noyauobserv au microscope lectronique transmission [Marc Ravallec-INRA]. En C, le rseau mem-branaire du rticulum endoplasmique est observ ainsi que plusieurs mitochondries (microscopelectronique transmission) [Stamatis Varsamos - Ifremer]. En D, lappareil de Golgi, reconnais-sable lempilement caractristique de ses constituants, les saccules, est visible ici entre deux mi-tochondries. On distingue galement les vsicules de Golgi qui se dtachent des saccules. (Imageprise au microscope lectronique transmission) [Marc Ravallec-INRA]. Images trouves surhttp://www.cnrs.fr/cw/dossiers/doscel/accueil2.htm.

http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/doscel/accueil2.htm


longueur de persistance de 17 m [43] (ce qui est lordre de grandeur de la taille dunecellule).

Lactine peut sorganiser en un rseau de mailles sous la membrane plasmique, le cor-tex ( 50 nm2 m dpaisseur [12]) ou dans les lamellipodes ( 110160 nm dpais-seur [1]). On la trouve aussi sous forme de filaments parallles [88] dans les filopodes oules fibres de stress. Les filopodes et les lamellipodes sont des protrusions membranairesqui permettent la cellule de se dplacer. Le cortex dactine est une structure contractiledense qui supporte la membrane et maintient la cellule sous tension grce aux moteursmolculaires qui lui sont associs. La fibre de stress est une structure trs organise et lie lextrieur de la cellule par des adhsions focales. Elle peut gnrer de grandes forces,elle stabilise la structure cellulaire et permet la cellule de recevoir des informations surson environnement [39].

Les microtubulesLes microtubules sont des polymres composs d-tubuline et de -tubuline associes

chacune une molcule de GTP. Ils ont la forme dun tube dun diamtre denviron 25 nmqui leur donne une structure rigide avec une longueur de persistance de 1 mm [43]. Ilspolymrisent partir du centrosome, organe de nuclation des microtubules. linstar desfilaments dactine, les microtubules ont une structure polaire qui implique une dynamiquede polymrisation diffrente chaque extrmit. Le bout plus va polymriser plus vite quele bout moins enchss dans le centrosome. Les microtubules forment un rseau en toilequi influence la distribution spaciale du noyau, des organites et des autres composants ducytosquelette. Ils jouent un rle important lors de la mitose ainsi que dans le transport devsicules intracellulaires.

Les filaments intermdiairesLes filaments intermdiaires sont une famille de plusieurs types de polymres qui dif-

frent selon leur type cellulaire et leur localisation intracellulaire. Ce sont des structuresstables compares aux filaments dactine et aux microtubules. Les filaments intermdiairesforment des rseaux qui stendent travers le cytoplasme et autour du noyau, permettantle maintien de lintgrit cellulaire et le soutien de lenveloppe nuclaire.

De lnergie bio-chimique la gnration de forces

Une proprit essentielle du cytosquelette est sa structure dynamique qui implique lagnration de forces et de mouvements. Celle-ci va permettre aux muscles de se contrac-ter, la cellule de se mouvoir et deffectuer des processus biologiques tels que la divisioncellulaire ou la mitose. Ces forces sont aussi essentielles pour des phnomnes actifs lintrieur de la cellule comme le transport de protines ou le mouvement dorganelles. Lacellule dispose dun panel de protines qui la place dans une situation hors-quilibre grce des ractions bio-chimiques. Lnergie chimique de lATP va tre utilise comme com-bustible et transforme en travail mcanique et en mouvement dirig. Mais cette chelle


FIGURE 1.3 gauche, le cytosquelette dune cellule animale. En bleu, le noyau. En vert, les mi-crotubules. En rouge, les filaments dactine [Wikipdia]. droite, le schma montre les diffrentesstructures du cytosquelette.

(de lordre du nanomtre), les protines vont voluer dans un environnement o les mou-vements dus aux fluctuations thermiques ne sont pas ngligeables. Nous allons prsenterplusieurs stratgies employes par la cellule pour contrler ces mouvements fluctuants,exercer des forces et crer des mouvements dirigs.

La polymrisation de lactineLes filaments dactine sont sans cesse renouvels par des ractions de polymrisation (fi-

gure 1.4 gauche) et de dpolymrisation qui dpendent de la concentration en monomresdactine disponibles dans le cytoplasme. Ces ractions ne sont pas symtriques, cest--dire quelles se font plus rapidement au bout barbu du filament (barbed end) quau boutpointu (pointed end) [77, 75]. lquilibre, les ractions de polymrisation (ou de dpo-lymrisation) de lactine ont la mme constante de dissociation (rapport entre les taux depolymrisation et de dpolymrisation) chaque extrmit (figure 1.4 droite Sans ATP ).Mais in vivo, lnergie lie lATP met les filaments hors-quilibre. En effet, lorsquun mo-nomre dactine polymrise, il est accompagn dune molcule dATP. Cet ATP va shy-drolyser alatoirement dans le filament et le complexe actine-ATP va devenir actine-ADP.Or lassociation actine-ADP a une constante de dissociation plus leve que lassociationactine-ATP. Lextrmit pointue tant moins active, lactine va rester plus longtemps sousforme de filament et augmenter ses chances de se transformer en actine-ADP. Lquilibre(lorsque le taux de polymrisation est gal au taux de dpolymrisation) du bout pointu vatre dplac vers la dpolymrisation (et inversement pour lautre extrmit). Il en rsulteque pour certaines valeurs de la concentration en monomres lextrmit barbue va crotre


et lautre dcrotre (figure 1.4 droite Avec ATP ). Le tapis-roulant fournit une bonneimage de la cellule qui recycle, en les repolymrisant au bout barbu, les monomres ayantquitt le bout pointu. Dailleurs ce phnomne en anglais se nomme treadmilling [116].

Barbed end

Pointed end

Barbed end

Pointed end

Sans ATP Avec ATP

Zone de

treadmilling

Concentration en monomres

d'actine

0d

poly

mr

isat

ion

pol

ym

ris

atio

n

Tau

x d

e

ATPG-actin

Stable actin oligomer

activation

assembly

ATP- boundactin

ADP- bound actin

P

barbed end

pointed end

FIGURE 1.4 gauche, la polymrisation de lactine. droite, graphe montrant lvolution dutaux de polymrisation de lactine en absence et en prsence dATP. Pour certaines valeurs de laconcentration dactine en prsence dATP, le bout barbu polymrise et le bout pointu dpolymrise :cest le treadmilling.

Il nest pas vident que ce processus de tapis-roulant puisse gnrer des forces. Onpeut pourtant le comprendre en faisant appel au modle du Brownian ratchet [74] danslequel le filament dactine pousse une charge pouvant tre la membrane plasmique. Si lefilament touche la charge (figure 1.5a1), comment un autre monomre peut-il sintroduireentre la charge et le filament afin de polymriser ? Cette charge, de petite taille et doncsoumise aux forces thermiques, va fluctuer dans la direction oppose au filament qui lagne. Ces fluctuations vont permettre de laisser passer un monomre entre le filament et lacharge (figure 1.5a). Ainsi, la polymrisation va pouvoir exercer une force sur la charge. Unmodle driv [69] utilise les fluctuations thermiques, non pas pour dplacer la charge maispour courber le filament et crer un espace entre lui et la charge (figure 1.5b). Ce modlesappelle lElastic brownian ratchet car lnergie lastique stocke lors de la courbure vapermettre de pousser la charge.

Le phnomne de treadmilling, lorigine du mouvement de la bactrie listeria [103],est utilis par certaines cellules eucaryotes pour se dplacer au moyen dun lamellipode [114,102]. Cependant dans une cellule ce processus est plus complexe notamment car il existedes protines associes lactine.

Les protines associes lactineDans le rseau dactine, en plus des processus actifs de polymrisation, on trouve des

protines rgulatrices qui vont favoriser ou non la polymrisation, permettre la rticulationentre plusieurs filaments, fragmenter les filaments [82]... Certaines protines ont pour rle


FIGURE 1.5 Les schmas des modles du brownian ratchet et de lelastic brownian ratchet sontextraits de [52]. Le mouvement brownien contribue la gnration de forces soit en faisant fluctuerla charge (figure a), soit en courbant le filament dactine (figure b) permettant un monomre depolymriser.

de cooprer avec la polymrisation afin dexercer des forces. Elles peuvent elles-mmestre considres comme des moteurs indpendants produisant un travail mcanique. Ondistingue plusieurs familles de protines :

Les protines de rticulation telles que la fimbrine ou l-actinine permettent auxfilaments dactine de sorganiser en faisceaux parallles qui sont une architectureprsente dans les filopodes ou les fibres de stress. Grce dautres protines commelARP2/3 ou la filamine, lactine peut former des gels denses rticuls que lontrouve dans le cortex dactine.

Les protines de nuclation dont la fonction est dinitier la polymrisation. Parexemple, le complexe ARP2/3 est lorigine de jonctions qui permettent un nou-veau filament de polymriser avec un angle de 70C par rapport au filament-pre [99]. ce titre, ARP2/3 est la fois une protine de nuclation et de rticulation.

Les protines de squestration rgulent la quantit de monomres dactine dansle cytoplasme. Par exemple, la profiline favorise le remplacement de lADP parlATP [104] sur les monomres. Ceci permet au nouveau complexe dactine-ATPde sinsrer lextrmit barbue dun filament.

Les protines de fragmentation parmi lesquelles la cofiline qui produit une aug-mentation de la dpolymrisation [15] en se liant aux complexes dactine-ADP et


acclre ainsi le phnomne de treadmilling. Les protines de coiffe (CApping Proteins) peuvent sattacher au bout barbu afin

dempcher la polymrisation. Les protines de stabilisation comme la tropomyosine qui senroule autour des

filaments pour les stabiliser et les rigidifier. Les moteurs molculaires, principalement les myosines, qui sont lobjet du para-

graphe 1.1.4.Un exemple de coopration de ces protines avec la polymrisation de lactine est la

croissance du lamellipode qui a une fonction essentielle dans la motilit cellulaire. Onpeut voir sur la figure 1.6 comment les diffrents acteurs cits prcdemment travaillentensemble pour permettre au gel dactine de pousser sur la membrane et de crotre unevitesse denviron 1 m/min [109].

FIGURE 1.6 Modle de croissance de lactine dans le lamellipode. Extrait de [76].

Nous avons vu que la coopration entre les protines associes lactine et la polymri-sation aidait la gnration de forces. Nanmoins, on peut comprendre avec un modle [95]comment deux filaments rticuls exercent eux seuls des forces et mettent un systmehors-quilibre. Le cytosquelette est dans ce cas compos de filaments dactine qui peuvent


sattacher les uns aux autres grce des protines (par exemple l-actinine). La rticula-tion est transitoire et les protines se lient et se dlient de faon dynamique (figure 1.7A).Considrons deux murs amovibles, sur chacun est attach un filament dactine et autourdes protines rticulantes sont en solution. Les filaments et les murs sont soumis lner-gie thermique qui aura tendance les loigner mais peut permettre aux deux filaments de serencontrer. Une protine rticulante va pouvoir les lier. Ensuite, les fluctuations thermiquesfourniront dautres sites de chevauchement et donc de possibles nuclations (figure 1.7B).Cette dynamique va gnrer des contractions et ainsi des forces sur les murs. Si lon consi-dre que ces deux filaments sont attachs lun lautre par lintermdiaire dun autre fila-ment (figure 1.7C) et que celui-ci dpolymrise alors on se retrouve dans le cas prcdento les deux filaments rticulent. Donc la dpolymrisation peut aussi tre lorigine deforces dans le cytosquelette.

Volume V

Cytoskeletonfilaments (actin

and microtubules) Cross-linkersand bundlers

Increased cross-linking

Contraction(mechanical work)

Contraction(mechanical work)

Depolymerization

A CB

FIGURE 1.7 La dynamique des protines rticulantes (cross-linkers) est suffisante pour crer desforces dans le cytosquelette. Extrait de [95].

La polymrisation des microtubulesDe faon similaire lactine, les tubulines polymrisent et dpolymrisent constamment

pour former un rseau dynamique de microtubules. La polarit joue un rle sur les vitessesde polymrisation chaque bout. De plus, les complexes -tubuline-GTP peuvent shy-drolyser en un complexe -tubuline-GDP. Celui-ci affaiblit les liaisons du microtubule etpeut crer des catastrophes, cest--dire des priodes de dpolymrisation rapide. Ces dy-


namiques entranent des phnomnes de treadmilling. Le rseau de microtubules peut alorsexercer des forces sur la cellule. Enfin, des protines sont associes au microtubule ou latubuline et permettent de rguler la polymrisation, de les attacher la membrane, etc.

Les moteurs molculairesDans le cytosquelette, il y a un type de protines dont le rle est explicitement de trans-

former lnergie de lATP en travail mcanique : les moteurs molculaires. Il en existeplusieurs familles dont les moteurs spcialiss dans le transport le long des filaments ducytosquelette : les myosines qui travaillent au niveau des filaments dactine et les dynineset kinsines associes aux microtubules.

Les myosines sont des moteurs molculaires qui utilisent lhydrolyse de lATP pourse dplacer le long des filaments dactine. Il existe plusieurs formes de myosines [87, 18](des myosines I aux myosines XV, figure 1.8) ayant diffrentes fonctions dans la cellule.Par exemple les myosines V et VI sont impliques dans le transport de vsicules dans lecytoplasme et les myosines I sattachent la membrane plasmique et exercent une forcesur un filament dactine [65]. Mais les myosines II sont de loin les plus tudies car ellessont directement impliques dans la contraction musculaire. De plus, elles sont connuespour tre abondantes dans le cortex cellulaire, zone qui nous intressera par la suite. Lesmyosines II sont constitues de deux ttes globulaires ayant un site de fixation lactineet pouvant accueillir une molcule dATP, une queue permettant aux myosines de se fixerentre elles et de crer des myofilaments. La production de force se fait en cinq tapes (fi-gure 1.9). Au dbut, la myosine est attache au filament dactine mais elle nest pas lie un ATP. Au moment o une molcule dATP rencontre la myosine, celle-ci se dtachedu filament. Lhydrolyse de lATP en ADP-phosphate va changer la conformation de lamyosine en dplaant sa tte de 11 nm [33]. Ensuite la myosine va se raccrocher lactineen librant le phosphate. Puis elle va retrouver sa configuration initiale en librant lADP.En agissant comme un bras de levier, elle va exercer une force sur lactine. Les myosinestirent toujours dans le mme sens en se dplaant vers le bout barbu. Afin de crer desforces contractiles, elles sassocient et tirent simultanment sur des filaments aux extrmi-ts opposes. In vitro, la force moyenne exerce par une myosine est gale 3-4 pN [33].

Les dynines et kinsines sont des moteurs se dplaant sur les microtubules qui ont unrle dans le transport dorganites et de vsicules ainsi que dans la sparation des chromo-somes lors de la division cellulaire. La plupart des dynines se dplacent vers lextrmitmoins des microtubules contrairement la majorit des kinsines. Ces dernires sont ca-pables dexercer des forces de 5 pN et de marcher sur les microtubules en faisant despas de 8 nm [110].

1.1.5 Ladhsion cellulaire : un transmetteur de forces

Afin dassurer leurs fonctions, la plupart des cellules ont besoin de crer des contactsentre elles ou avec la matrice extracellulaire. Ces contacts sont indispensables pour formerdes tissus et ils constituent des points dancrage permettant la cellule de se mouvoir. Deplus, par lintermdiaire de ces interactions, la cellule va pouvoir recevoir des informations


FIGURE 1.8 La famille des myosines. Malgr leur diversit et leurs rles diffrents, les myosinesont toutes une tte globulaire et une queue. La gnration de force se fait grce un changementde conformation induit par lATP qui agit comme un bras de levier. Extrait de http://manual.blueprint.org/.

tte de la myosine

filament d'actineAATP

ADP

Pi

ADP Pi

B C

D E

ADP

hydrolyse de l'ATP

Force

FIGURE 1.9 Les cinq tapes qui permettent la myosine II de gnrer des forces. Aid de [2].

sur son environnement mcanique et les traduire en signaux bio-chimiques. Il sagit duphnomne de mcanotransduction. Dune certaine manire, la cellule possde un sensdu toucher qui va influencer des fonctions cellulaires importantes telles que la migration,la diffrenciation ou la mort cellulaire. Les molcules dadhsion sont donc capables de

http://manual.blueprint.org/http://manual.blueprint.org/


transmettre au cytosquelette les contraintes appliques par le monde extrieur. Inversement,elles peuvent aussi transmettre des forces exerces par le cytosquelette lenvironnement.Nous allons dailleurs utiliser par la suite ces proprits pour sonder la dynamique du cy-tosquelette. On distingue principalement deux types de protines associes ladhrence :

La famille des cadhrines implique dans la jonction entre cellules ; La famille des intgrines (figure 1.10) qui cre des liaisons entre la cellule et la

matrice extracellulaire. Seule cette dernire, utile la poursuite de notre tude, seradcrite.

Les intgrines sont des protines transmembranaires ce qui signifie quelles possdentun domaine intracellulaire qui interagit avec le cytosquelette, un second domaine confindans la membrane et un dernier lextrieur de la cellule qui interagit avec la matrice ex-tracellulaire. Elles sont composes de deux units, l-intgrine et la -intgrine qui selient des sites spcifiques de la matrice extracellulaire. Il existe plusieurs types dint-grines pouvant sattacher diffrents composants de la matrice extracellulaire tels que lecollagne ou la fibronectine.

La fibronectine est un dimre possdant deux squences damino-acide RGD (arginine(ARG) ; glycine (GLY) ; acide aspartique (ASP)) qui sont des sites importants pour la fixa-tion des intgrines. Elle est reconnue par au moins dix types dintgrines diffrents [51].Plusieurs sites de la fibronectine peuvent tre reconnus par les intgrines, et le RGD seulest reconnu par cinq types dintgrines (31, 81, V 1, V 3, V 6) [51].

Du ct intracellulaire, lintgrine est relie aux filaments dactine par lintermdiairede plusieurs protines (-actinine, talin, filamine, paxiline...) [60]. Les intgrines peuventse rassembler en cluster et former un complexe appel adhsion focale qui permet de crerun ancrage fort la matrice extracellulaire. Des fibres de stress riches en moteurs molcu-laires peuvent sy attacher afin dexercer de grandes forces de traction.

1.1.6 Le vivant est toujours hors-quilibre

La taille dune cellule est comprise entre 10 et 100 m. La cellule est donc une in-croyable machinerie organise au niveau submicronique. En physique des liquides, on alhabitude de voir le mouvement brownien dominer cette chelle. Et pourtant, lagitationthermique nempche aucunement la coordination des protines permettant la cellule dese diviser, de se mouvoir, dinteragir avec son environnement et de sauto-organiser pourcrer des organes. Au contraire, comme nous avons pu le voir pour le brownian ratchet, lebruit thermique va mme assister la gnration de force et de mouvement.

Comment le vivant fait-il pour gnrer des forces et des mouvements dirigs dans cedsordre molculaire ? Le vivant utilise des processus actifs qui consomment de lnergieet qui le placent par consquent dans la famille des systmes thermodynamiques hors-quilibre. La cellule produit des protines motrices qui lui permettent de convertir lnergiestocke sous forme chimique en un travail mcanique. Mais contrairement aux moteursmacroscopiques qui effectuent leur cycle de faon dterministe, les moteurs molculairesont un mouvement stochastique. Pour avoir un mouvement dirig, ces derniers ont besoinde deux lments : une source dnergie et une asymtrie qui va dterminer la direction


RGD

RGDRGD

RGD

Milieu extracellulaire

Milieu intracellulaire

Matrice extracellulaire

(fibronectine)

FIGURE 1.10 Schma dune intgrine compose de deux sous-units et . Dans la rgionextracellulaire, lintgrine peut se lier au peptide RGD. Dans la rgion intracellulaire, lintgrineest relie au cytosquelette dactine via diffrentes protines telles que l-actinine ou la taline...Adapt de Wikipdia et daprs [11]

du mouvement. Par exemple, pour les myosines, lnergie vient de lhydrolyse de lATP etlasymtrie est donne par la polarit des filaments dactine.

Mais un systme asymtrique seul, lquilibre (i.e. sans source dnergie extrieure)peut-il crer un travail rcuprable par un systme vivant ? Marian Smoluchowski [36] etplus tard Richard Feynman [32] avaient imagin une machine (figure 1.11) permettant deconvertir les fluctuations thermiques en un travail mcanique. Le dispositif est form dunaxe qui possde une extrmit une roue palette et de lautre ct une roue dente as-socie un clapet. Le clapet permet la brisure de symtrie car la roue ne peut tourner quedans un sens. La machine, de toute petite taille, est plonge dans un bain. Les palettes su-bissent les chocs des particules browniennes qui en tapant sur les palettes peuvent entranerla rotation de la roue dans un seul sens, lautre sens tant gn par le clapet. Si on accrocheune masse une poulie relie laxe de rotation, le systme serait-il capable de la soule-ver ? Non, car il ne faut pas oublier le mouvement brownien du clapet qui, lui aussi, subitdes chocs molculaires suceptibles de dbloquer la roue. En fin de compte, aucun sens derotation ne sera privilgi ; la roue ne tournera pas en moyenne. Il est donc impossible decrer un moteur utilisant lnergie thermique sinon la deuxime loi de la thermodynamiqueserait brise. Par contre, Feynman dmontre quil est possible de soulever la masse si onloigne le systme de lquilibre en imposant une diffrence de temprature entre la palette


et la roue dente. Dans ce cas, lapport dnergie externe vient du transfert de chaleur entreles deux sources de tempratures diffrentes.

Une cellule doit exercer des forces pour rester vivante, elle est donc obligatoirementun systme thermodynamique hors-quilibre. Dans le cas contraire, la cellule devient unematire inerte. Peut-t-on vrifier que la cellule vivante est un systme hors-quilibre ?Quelle est la diffrence entre une cellule hors-quilibre et son quivalent physico-chimique lquilibre ? Cest--dire, peut-on mesurer lcart entre lactivit biologique dune celluleet lactivit des forces thermiques agissant dans son milieu ? Et enfin comment mesurer lesforces stochastiques gnres par le mtabolisme cellulaire ?

FIGURE 1.11 La machine imaginaire de Feynman. Schma extrait du site http://flakesandclusters.com/whatisgoodinlife.

http://flakesandclusters.com/whatisgoodinlifehttp://flakesandclusters.com/whatisgoodinlife


1.2 La cellule : un matriau viscolastique hors-quilibre

Du point de vue de la biologie, la mcanique du cytosquelette joue un rle importantdans beaucoup de processus cellulaires. Du point de vue de la physique, le cytosqueletteest un rseau de polymres actifs qui en font un matriau viscolastique hors-quilibre.Ltude de la mcanique du cytosquelette a donc un double intrt : avancer dans la com-prhension des mcanismes qui rgissent une grande quantit de processus biologiqueset utiliser la cellule comme modle pour tester et faire voluer la physique des systmesthermodynamiques hors-quilibre.

La cellule est sans cesse soumise des contraintes mcaniques venant de son environ-nement. Ces contraintes peuvent tre exerces par une autre cellule, par la matrice extrace-lullaire ou mme par un fluide (cest le cas par exemple pour lcoulement sanguin). Danstous les cas, la cellule sadapte grce aux forces gnres par le cytosquelette. De plus,cet environnement modifie les fonctions cellulaires. Il a par exemple t montr que la ri-gidit du substrat avait un effet sur la diffrenciation des cellules souches [27] ainsi quesur ladhsion et la migration cellulaire [61]. Les proprits mcaniques du cytosqueletteont donc une place importante dans la physiologie cellulaire. Leur comprhension pour-rait avoir des implications en mdecine telles que lutilisation thrapeutique des cellulessouches. Il est ncessaire de pouvoir mesurer les caractristiques mcaniques des cellules.Ltude de leur rhologie devient alors indispensable pour quantifier leur comportementmcanique.

La structure complexe du cytosquelette, form de polymres enchevtrs, o diffrentstypes de protines se lient dynamiquement et exercent des forces, confre la cellule uncomportement viscolastique hors-quilibre. Une cellule va se comporter la fois commeun liquide visqueux et un solide lastique. Ceci nous amne dfinir un cadre thoriquepermettant de dcrire toutes les caractristiques mcaniques dune cellule vivante. Cetteapproche, utilisant un modle de Langevin gnralis, nous permet de dfinir les gran-deurs intressantes pour la description de la mcanique cellulaire et ainsi de calculer uneexpression du spectre des forces agissant dans la cellule. Lutilisation de techniques demicrorhologie nous donne la possibilit de mesurer ces grandeurs ex vivo.

1.2.1 Description thorique dun matriau viscolastique hors-quilibre

Modle de Langevin gnralis

Une faon commode de dcrire thoriquement un matriau viscolastique hors-quilibre,est dcrire lquation du mouvement dun objet dans ce milieu. Cette particule, de taillemicroscopique, sera soumise des forces stochastiques dorigine thermique et biologiqueet une force dissipative. Lvolution temporelle de la vitesse de la particule peut tremodlise en introduisant lquation de Langevin gnralise [71],

md~vdt

+mt

~(t t

)~v(t )

dt = ~f (t)+~Fext (t) , (1.1)

1.2 La cellule : un matriau viscolastique hors-quilibre 19

m est la masse de la particule. ~v(t) est la vitesse de la particule. ~f (t) est la force stochastique sexerant sur la particule. Dans le cas prsent, elle

a deux origines possibles : les forces thermiques ~fth(t) et les forces dorigine biolo-gique ~factif(t). Certains auteurs estiment que les forces thermiques et non-thermiquesne sont pas corrles et crivent : ~f (t) = ~fth(t)+ ~factif(t) [67]. ~factif(t) est la gran-deur qui mne le systme hors de lquilibre thermodynamique et que nous voulonscaractriser.

~Fext(t) est une force extrieure ventuellement exerce par lexprimentateur sur laparticule.

le terme t m~ (t t ) ~v(t )dt est la force dissipative ~Fdisspative exerce par le mi-

lieu viscolastique sur la particule qui prend en compte une rponse retarde. le terme md~vdt est la force dinertie de la particule qui est ngligeable.

La force dissipativeLa force de frottement subie par une bille de rayon r et se dplaant la vitesse ~v en

immersion dans un fluide newtonien de viscosit est donne par la relation de Stokes :

~Fvisqueux =6r~v.

La force de rappel subie par une bille de rayon r se dplaant dune distance~x en immersiondans un milieu lastique incompressible de module dYoung E, scrit :

~Felastique =2Er~x.

Dans le cas dun milieu viscolastique, cause de ses proprits lastiques, le frotte-ment ne stablit pas instantanment comme dans le cas du frottement visqueux. En effetlnergie fournie va dabord tre emmagasine par la dformation lastique pour ensuitetre dissipe par le frottement visqueux. Il y a donc des effets de retard sur lapplication dela force de frottement. On tient compte de ces effets en crivant que la force dissipative linstant t dpend de la vitesse de lobjet aux instants antrieurs. On crit alors que la forcedissipative retarde est la rponse linaire de la perturbation ~v pour une particule plongedans un milieu suppos linaire, isotrope 1, incompressible de susceptibilit :

~Fdissipative (t) =t

m(t t

)~v(t )

dt . (1.2)

La quantit ~ (t) est un noyau mmoire dcrivant les proprits viscolastiques du milieuet, en vertu du principe de causalit, ~ (t) = 0 si t < 0. Cette fonction contient la rponseviscolastique du matriau pour une gomtrie de contact donne entre lobjet et le milieu.

Lexpression de la force de frottement est gnrale mme si la particule nest pas enimmersion totale dans le milieu. Ceci nest pas le cas pour lexpression de la force de rappel

1. Dans le cas dun milieu anisotrope, la relation 1.2 est tensorielle : ~Fdissipative =(

xx xyyx yy

)~v.


et de la force visqueuse qui ont un terme reprsentant la rponse visqueuse ou lastique(respectivement la viscosit et le module dYoung) et un coefficient dcrivant le contactgomtrique entre la particule et le milieu (respectivement 6r et 2r). Dans le cas olobjet nest pas totalement immerg, la force dissipative a une expression diffrente cause de la gomtrie dimmersion. On peut nanmoins crire une relation de rponselinaire sous la forme de lquation 1.2, les coefficients gomtriques sont alors cachsdans ~Fdissipative et .

Le spectre des forces

La force f (t) est la contribution des forces dorigine thermique et des forces doriginebiologique. Cest le rsultat du choc des molcules du milieu viscolastique sur lobjetainsi que du travail des processus bio-mcaniques dcrits dans la partie 1.1. tant donnquil est impossible dexpliciter la force f (t), nous allons la considrer comme une variablealatoire. Ainsi pour dcrire lvolution temporelle de la force fluctuante f (t), nous avonsrecours au calcul de valeur moyenne et de fonction de corrlation temporelle,

f (t) f (t + )t . (1.3)

Lquation 1.1 dvolution de la particule en labsence de force extrieure et dinertie, etprojete dans une direction ( ou ) scrit :

mt

(t t

)v(t )

dt = f (t) . (1.4)

Cette quation intgro-diffrentielle linaire peut tre analyse en utilisant les propritsdes transformes de Laplace 2. On dfinit la transforme de Laplace dune fonction g(t) os est homogne une frquence :

L {g}(s) =

0

g(t)exp(st)dt = g(s).

En utilisant le fait que la transforme de Laplace dun produit de convolution est le produitdes transformes de Laplace 3, on peut rcrire lquation 1.4 :

m (s) v(s) = f (s) . (1.5)

Introduisons les transformes de Laplace des fonctions dautocorrlation des vitesses etdes forces fluctuantes appeles spectre des forces :

S f (s) = L { f (t + ) f (t)t} et Sv(s) = L {v(t + )v(t)t}.

2. Habituellement, on fait une analyse harmonique avec des transformes de Fouriers pour ce type dqua-tion. Mais ici, les fonctions ne sont pas intgrables sur R.

3. En effet le terme de gauche de lquation 1.4 est un produit de convolution entre (t) et v(t). Onpourrait rcrire cette quation : f (t) = m v(t).


En prenant lquation 1.5 au carr, on trouve daprs lannexe A.1 :

S f (s) = m22 (s) Sv(s). (1.6)

On obtient une relation qui donne accs au spectre des forces fluctuantes sexerant surla particule, condition de connatre la fois la rponse viscolatique du milieu 2 (s)et le spectre des vitesses en labsence de forces extrieures Sv(s). Nous allons voir quela fonction (t) est relie la fonction J (t) qui est une grandeur mesurable grce lamicrorhologie active. Le spectre des vitesses Sv(s) est une fonction disponible partirdune mesure de microrhologie passive.

1.2.2 De la microrhologie la mesure du spectre des forces

Pour commencer, nous allons voir comment la rhologie permet de caractriser lesmatriaux viscolastiques et quelles grandeurs permettent de les quantifier. Puis nous d-crirons les principes de la microrhologie permettant de faire de la rhologie sur des cel-lules. Enfin, nous relierons le spectre des forces S f (s) des grandeurs disponibles avec desexpriences de microrhologie.

Rhologie et microrhologie

La rhologie est ltude macroscopique de la dformation et de lcoulement de lamatire sous leffet dune contrainte . Elle permet de dfinir des grandeurs caractrisant lecomportement mcanique de la matire. Nous allons rester dans le domaine de la rhologielinaire en considrant de faibles dformations pour des matriaux isotropes, homogneset incompressibles (coefficient de Poisson = 1/2). Par exemple, lorsque lon appliqueune force F sur un solide lastique de longueur l0 et de section S, celui-ci va emmagasinertoute lnergie et stirer de l. Ce solide sera caractris par le module dYoung E reliantproportionnellement la contrainte = F/S la dformation = l/l0 :

= E. (1.7)

De mme en gomtrie de cisaillement (figure 1.12), un solide lastique est caractris parle coefficient de cisaillement G tel que =G (dans le cas de matriau incompressible E =3G). Enfin, un fluide visqueux soumis un cisaillement va dissiper lnergie et scouler.Le fluide sera caractris par la viscosit reliant proportionnellement la contrainte autaux de dformation :

= . (1.8)

Un matriau viscolastique renferme ces deux comportements, il emmagasine puis dissipelnergie fournie. Il est dcrit par le module viscolastique de relaxation G(t) :

(t) =t

G(t t

) ddt

t

dt . (1.9)


En forant le cisaillement dans un rgime sinusodal de dformation tel que (t)=R(0eit)on dfinit le module dynamique de cisaillement G(),

G() =()()

= G()+ iG(), (1.10)

o G() est la partie relle appele module de stockage ou lastique et G() la partieimaginaire appele module de perte ou visqueux.

Le module viscolastique de relaxation tablit la relation entre la dformation appliqueet la contrainte dun matriau. Ce qui nous intresse davantage est la relation inverse entrela contrainte applique et la dformation. La rponse du matriau viscolastique est alorsdfinie par la fonction de fluage (t) telle que :

(t) =t

(t t

) ddt

t

dt . (1.11)

En vertu du principe de causalit, on a (t) = 0 pour t < 0. Pendant une exprience dite defluage, la contrainte exerce sur le matriau est constante donc (t) = (t)/ . On montreque pour un solide purement lastique (t) = E1 et pour un liquide purement visqueux(t) = t/ .

Le module dynamique de cisaillement G() et la fonction de fluage contiennent lamme information et on peut tablir un lien entre les deux grce la transforme de Fou-rier [7] :

G() =1

i()o () =

+

(t)eitdt. (1.12)

FIGURE 1.12 Schma de principe du cisaillement [Wikipdia].

En gnral, les rhologues travaillent sur des volumes importants (> 1 cm3) afin desonder des proprits mcaniques moyennes. La microrhologie permet de mesurer larhologie de petits volumes de matire ce qui est intressant pour ltude des matriauxdorigine biologique. Il est alors possible dtudier toutes sortes de matriaux htrognes


(e.g. nouveaux matriaux synthtiques, cytoplasme de cellules vivantes) dans des gom-tries confines. La microrhologie offre la possibilit de travailler sur des objets aussi petitset aussi complexes que les cellules vivantes.

Depuis plusieurs annes, les chercheurs dveloppent des techniques de microrhologieactive et passive. Certaines permettent de mesurer la rhologie de la cellule de manireglobale (microplaque, micropipette), dautres de manire locale. La microrhologie localencessite la plupart du temps lutilisation dune sonde de taille micromtrique. Ces sondespeuvent tre des billes attaches spcifiquement ou non au cytosquelette ou alors des l-ments mme de la cellule (endosomes, phagosomes, granules...).

Le principe de la microrhologie active est proche de la rhologie classique, o lex-primentateur exerce sur la sonde une force et mesure son dplacement. La sonde peuttre partiellement ou totalement immerge dans la cellule. Dans tous les cas, pour calculerla grandeur caractrisant le matriau (module viscolastique G() ou fonction de fluage(t)) il faut connatre la gomtrie de contact avec le milieu et en dduire un coefficientgomtrique permettant de passer de la reprsentation position force dformationcontrainte.

La microrhologie passive est une mthode exclusivement locale o on enregistre latrajectoire de la sonde soumise aux forces stochastiques sexerant dans le milieu (suivide particules). Cette technique suppose que le systme soit lquilibre afin dappliquerle thorme de fluctuation-dissipation et den dduire la rponse linaire du milieu (sec-tion 1.2.2). Seulement, le vivant nest pas lquilibre. Nous allons voir comment utiliserces techniques de microrhologies pour sonder les forces stochastiques du cytosquelettemenant la cellule hors de lquilibre thermodynamique.

La mesure de microrhologie active

Un faon de caractriser la viscolasticit du milieu en contact avec la particule est demesurer sa rponse linaire lorsquest exerce une force ~Fext(t). Pour dcrire lvolutionde la particule en prsence dune force extrieure ~Fext(t), on rcrit lquation 1.1 sansinertie :

mt

~(t t

)~v(t )

dt = ~f (t)+~Fext (t) . (1.13)

Dans cette quation, il y a deux inconnues : les forces stochastiques f (t) composes desforces thermiques et biologiques, et la fonction (t) reprsentant la rponse du milieuviscolastique. Pour connatre cette dernire, il faut faire une approximation et consi-drer f Fext. Cette forte approximation est justifie par le fait que f pN alors queFext 10100 pN.

En pratique, il est plus commode de mesurer le dplacement dun objet en rponse laforce extrieure fixe et connue par lexprimentateur. Donc plutt que davoir une relationforce vitesse relie par (t) on prfre crire une relation position force relie parJ(t). En exerant la force Fext dans une direction (avec Fext(t 0) = 0), on peut projeter


lquation 1.13 dans cette direction et crire les relations quivalentes :t

0

m(t t

)v(t )

dt = Fext (t) x(t) =t

0

J(t t

) dFextdt

t

dt . (1.14)

La fonction J(t) 4 est causale (J (t) = 0 si t < 0) et au mme titre que (t), elle contientla mesure de la rponse viscolastique du milieu pour une gomtrie de contact donneentre lobjet et le milieu. On peut trouver une relation explicite entre les transformes deLaplace (s) et J(s). En utilisant les proprits 5 des transformes de Laplace, les relationsde lquation 1.14 deviennent :

(s) =F(s)sx(s)

et J(s) =x(s)

sF(s)= (s) = 1

ms2J(s). (1.15)

La rponse x(s) la force F(s) nous donne la rponse du milieu caractris par la fonctionJ(s) ou (s).

La mesure de microrhologie passive

En labsence de forces extrieures, la particule de taille micromtrique soumise desforces stochastiques aura un mouvement alatoire et trs irrgulier. En pratique, les diff-rentes positions (x(t),y(t)) de la sonde sont accessibles par un suivi de trajectoire. Afin dequantifier les fluctuations, nous pouvons calculer le dplacement quadratique moyen (meansquare displacement ou encore MSD) de la bille x2 ()t dans chaque direction o test une moyenne temporelle :

x2 ()t = (x(t + ) x(t))2t . (1.16)

La valeur de x2 ()t nous permet de quantifier la distance moyenne explore pendant letemps . Dans lannexe A.2 nous dmontrons que le spectre des vitesses Sv(s) de lqua-tion 1.6 est reli la transforme de Laplace du dplacement quadratique moyen par larelation :

2Sv(s) = s2x2(s). (1.17)

Combinaison de microrhologie passive et active et spectre des forces

En combinant les mesures de microrhologie passive et active, on peut avoir accs auspectre des forces exerces sur la sonde S f (s). Lexpression 1.6 de S f (s) sexprime alorsen fonction de x2(s) et J(s) daprs les quations 1.17 et 1.15 :

S f (s) =x2(s)

2s2J(s)2. (1.18)

4. On peut remarquer une similitude entre la dfinition de J(t) et celle de la fonction de fluage (t) (qua-tion 1.11). Ici, il nous manque un facteur gomtrique pour connatre cette fonction donc nous travaillons avecla relation position force plutt que dformation contrainte. Le formalisme utilis par la suite, utilisantla fonction J(t), est un calcul rigoureux qui saffranchit de lignorance des conditions de contact.

5. L {g}= sL {g} sg(0+).


La mesure du dplacement quadratique moyen x2() ou de la rponse viscolastiquedu milieu J(t) est fortement dpendante de la gomtrie des contacts entre la particule etle milieu. De plus, cause de la complexit dun milieu tel que la cellule, des anisotropiespeuvent apparatre dans les mesures suivant les directions (x et y). Il est donc trs importantdeffectuer les mesures de x2() et J(t) sur un mme objet, autant que possible au mmemoment et en projetant sur la direction de la force applique par lexprimentateur. Ainsi,cette mthode nous permet de nous affranchir du paramtre gomtrique qui est par ailleursun lment trs difficile estimer.

Spectre des forces lquilibre et relation de fluctuation-dissipation

Il y a un cas particulier o les forces stochatiques f (t) sexerant sur la particule sontcomposes uniquement des forces thermiques fth : cest la situation dquilibre thermo-dynamique. Dans ce domaine de la physique statistique lquilibre, le thorme defluctuation-dissipation tablit que la rponse linaire dun systme en quilibre une per-turbation extrieure est la mme que sa rponse une fluctuation spontane. Le mouvementdune particule micromtrique immerge dans un fluide visqueux newtonien lquilibreporte le nom de mouvement brownien. Le dplacement quadratique moyen x2() duneparticule brownienne est proportionnel au temps avec un coefficient appel constante dediffusion D, soit x2() = 2D une dimension. Albert Einstein en 1905 a t le premier dcrire thoriquement ce mouvement. Il en tira la relation dEinstein qui relie le coeffi-cient de diffusion D lnergie thermique kBT 6 et la rponse du milieu (aussi appelefriction) :

D =kBT

. (1.19)

Cette relation est valable pour les liquides visqueux. On peut gnraliser le thorme defluctuation-dissipation pour un milieu viscolastique [63]. En multipliant la transformede Laplace 7 de lquation 1.1 par la vitesse v(t = 0), en supposant que f (t) = fth(t), enngligeant linertie (s (s)) et en prenant la moyenne densemble on obtient [92] :

v(0)v(s)= mv(0)2+ v(0) fth(s)

m(s). (1.20)

lquilibre, la force stochastique dorigine thermique nest pas corrle avec la vitesse fthv = 0 et le thorme dquipartition de lnergie montre que pour un mouvementunidirectionnel :

12

mv(0)2= 12

kBT. (1.21)

De surcrot, une dmonstration similaire lannexe A.2 permet de voir que 2v(0)v(s)=s2x2(s). On obtient la relation dEinstein gnralise un milieu viscolastique de fonc-

6. kB = 1,381 1023 J/K est la constante de Boltzmann.7. En utilisant la proprit sur les transforme de Laplace des drives : L {g}= sL {g} sg(0+).


tion de rponse (t) ou de faon quivalente J(t) dans une direction ( ou ) :

x2eq(s) =2kBT

ms2(s)= 2kBT J(s) x2eq() = 2kBT J(). (1.22)

Le thorme de fluctuation-dissipation montre une proprit remarquable des systmes vis-colastiques lquilibre : le dplacement quadratique moyen x2eq() accessible par uneexprience de microrhologie passive est directement reli la fonction de rponse J()du systme. On peut aussi dfinir avec la relation 1.18 le spectre des forces lquilibreS f eq(s) ou spectre des forces thermiques :

S f eq(s) =kBT

s2J(s). (1.23)

Ainsi la mesure de J(s) seule nous permet de calculer, en connaissant la temprature dumilieu, le spectre des forces thermiques. Nous allons utiliser cela pour dfinir un indicedcart lquilibre thermodynamique dun systme hors-quilibre.

Mesure de lcart lquilibre dun systme viscolastique hors-quilibre

Dans le cas dun systme hors-quilibre, nous pouvons faire une analogie avec lqua-tion 1.23 du spectre des forces thermiques et dfinir formellement une temprature effectiveTeff qui dpend de la frquence pour crire le spectre des forces :

S f (s) =kBTeff(s)s2J(s)

=x2(s)

2s2J(s)2. (1.24)

La mesure de la fonction de rponse J(t) avec la technique de microrhologie active nousdonne la contribution des forces dorigine thermique sexerant sur la particule. De plussi on ajoute la mesure de microrhologie passive, nous avons accs toutes les forcessappliquant sur la sonde. En faisant le rapport des deux spectres de force S f (s) et S f eq(s)on dfinit lindice (s) dcart lquilibre :

(s) =S f (s)

S f eq(s)=

Teff(s)T

. (1.25)

Si lindice (s) = 1 alors les forces agissant sur lobjet sont dorigine thermique, on dit quele systme est lquilibre thermodynamique. Si (s) > 1 alors ces forces peuvent avoirdeux contributions, lune thermique, et lautre non-thermique due lactivit biologiquemenant le systme en dehors de lquilibre.

1.3 La microrhologie de la cellule eucaryote

1.3.1 Origines

Bien que les tudes de microrhologie cellulaire et tissulaire aient beaucoup progressces dix dernires annes, les premires mesures sur des tissus datent du XIXe sicle. En

1.3 La microrhologie de la cellule eucaryote 27

1847, Guillaume Wertheim publiait un mmoire sur llasticit des tissus du corps hu-main [119]. Il y remarquait que si on les rangeait suivant leur lasticit croissante on obte-nait lordre suivant : os, tendons, nerfs, muscles, veines, artres [91]. Au dbut des annesvingt, Alfred Heilbronn dveloppait la premire technique de microrhologie cellulaire eninsrant des particules magntiques dans des protoplasmes et en observant leurs mouve-ments dans un champ magntique [115, 44]. En 1950, Crick utilisait la mme mthodepour mesurer la viscolasticit du cytoplasme de fibroblastes [23, 22]. Maintenant il existede nombreuses techniques bien dcrites dans plus dune dizaine de revues [118, 46, 4, 58,92, 20, 112, 122, 108, 17, 121].

1.3.2 Les techniques exprimentales de microrhologie

Dans les annes 2000, les recherches ont volu et ont vu apparatre de nouvelles tech-niques exprimentales permettant de sonder la rhologie globale ou locale dune cellule.Elles utilisent des sondes attaches spcifiquement ou non au cytosquelette. Pour cou-pler spcifiquement une sonde au cytosquelette, diffrents ligands recouvrent celle-ci etpeuvent cibler des structures particulires de la cellule. Par exemple, des microbilles sontenduites de peptides ou danticorps se liant chimiquement aux intgrines [113] ou auxcadhrines [78] travers la membrane. Ainsi, par lintermdiaire de ces protines trans-membranaires, la bille sera relie physiquement au cytosquelette. Ces sondes peuvent treextracellulaires mais aussi intracellulaires. Par exemple, il est possible dinjecter directe-ment des billes fluorescentes dune taille de quelques centaines de nanomtres directementdans le cytoplasme [107, 38]. Des sondes biologiques sont utilises comme des phago-somes [31, 9, 25], des granules prsents naturellement dans la cellule [117, 123, 124] oudes endosomes magntiques [120, 83]. Lobservation de leur dplacement lapplicationdune force nous donne des indications sur la dformation du matriau. Quand ces forcessont exerces par lexprimentateur on parle de microrhologie active, quand elles sontintrinsques la cellule on parle de microrhologie passive.

Pour la microrhologie active (figure 1.13), les forces peuvent tre gnres sur dessondes magntiques (billes, phagosomes et endosomes magntiques) en utilisant un champmagntique (pinces magntiques [10], magntocytomtrie [62, 113, 30]) ou sur des sondesdilectriques (billes, granules) en focalisant une onde lectromagntique mise par un la-ser (pinces optiques). On peut galement exercer des forces dorigine mcanique sur lescellules par aspiration (micropipettes [45]), avec un microlevier (microscopes force ato-mique [106]) ou avec des microplaques [26]. Les grandeurs viscolastiques dduites dela mesure active dpendent du type de rgime 8. Une mesure en rgime sinusodal, o undplacement oscillant est impos la sonde impliquant une dformation priodique du mi-lieu, permettra destimer le module viscolastique G(). Une mesure en rgime de fluage,o une force constante est exerce sur la sonde, imposant une contrainte constante au mi-

8. On reste bien sr dans le cas de petites dformations et de rgimes linaires.


lieu, donnera accs la fonction de fluage (t) 9.La microrhologie passive (figure 1.14) peut, en faisant lhypothse que le milieu est

lquilibre, calculer les grandeurs (t) et G() (partie 1.2.2). Mais, comme on la vu,le cytosquelette dune cellule est capable de gnrer des forces dorigine biochimique.Enfin, des techniques de microrhologie passive deux points [24] ont t dveloppespour saffranchir du couplage entre la sonde et le milieu et de ses htrognits locales.Cette fois ce nest plus la fonction dautocorrlation 10 de la position dune particule quiest calcule mais la corrlation entre deux particules.

1.3.3 Un comportement en loi de puissance

Il est trs difficile de comparer les rsultats de microrhologie cellulaire de toutesles mthodes exprimentales. Le calcul des grandeurs viscolastiques est dpendant dela sonde utilise et du couplage entre la cellule et la sonde. Une cellule vivante est un ma-triau trs htrogne, actif et son comportement dpend dune multitude de paramtresplus ou moins contrlables. De plus, diffrents laboratoires utilisent diffrents types cellu-laires et sondent chacun diffrentes parties de la cellule. Nanmoins, ont t observs descomportements gnraux pour les modules viscolastiques G() et les fonctions de fluage(t).

Des modles simples, drivs du modle de Maxwell ou de Kelvin-Voigt, reposant surlassociation de ressorts et damortisseurs visqueux ont t utiliss pendant longtemps pourdcrire la mcanique cellulaire. Le comportement lastique de la cellule tait alors attribuaux filaments du cytosquelette alors que le cytosol contribuait plutt au comportementvisqueux. Ces modles signifient que la cellule a un nombre fini de temps de relaxation.Toutefois, les progrs techniques ont permis daccder une meilleure rsolution tempo-relle et cette vision des systmes, ayant un nombre fini de temps de relaxation, a t miseen dfaut [26] (figures 1.15a et 1.15c). En effet, il est maintenant bien tabli que la fonctionde fluage (t) et le module viscolastique G() = G()+ iG() se comportent commedes lois de puissance respectivement du temps et de la frquence 11 :

(t) = 0(

tt0

), (1.26)

G() = G0

(0

)et G() = G0

(0

). (1.27)

9. Des hypothses gomtriques sont ncessaires car les grandeurs G() et (t) effectuent le lien entre lacontrainte et la dformation et non entre la force et le dplacement. Pour les sondes locales extracellulaires,il est ncessaire de connatre le degr denfoncement, pour les sondes locales intracellulaires il faut connatrele couplage sonde-milieu.

10. La fonction dautocorrlation Rx() est relie au dplacement quadratique moyen x2() :x2()= 2(Rx(0)Rx()) o Rx() = x(t + )x(t)t x(t)2t .

11. Les fonctions de rponse J(t) et (t) (1.2.2) relies (t) par lintermdiaire dun coefficient gom-

trique suivent aussi une loi de puissance : J(t) = J0(

tt0

).


Magntocytomtrie

Pince optique

Pince magntique

Microscope force atomique

Microplaque

Micropipette

FIGURE 1.13 Schma des diffrentes techniques de microrhologie active (adapt de [46]).

Microrhologie passive intracellulaire

Microrhologie passive extracellulaire

Microrhologie passive deux points

FIGURE 1.14 Schma des diffrentes techniques de microrhologie passive. Notons que si lessondes en prsence sont magntiques ou dilectriques, ces systmes peuvent tre adapts la mi-crorhologie active (adapt de [46]).


Il est important de noter que daprs lquation 1.12 ces deux grandeurs sont quivalentes,

si (t) = 0(

tt0

)alors |G()|=

t00(1+ )

, (1.28)

o (1+ ) =

0 exx dx est la fonction dEuler [7]. Le cas o = 1 signifie que le

matriau a un comportement purement visqueux, = 0 un comportement lastique. Si0 < < 1 la rponse du matriau est viscolastique.

Le travail effectu par Balland et al. [26] tente de trouver un comportement gnral encomparant deux expriences de microrhologie diffrentes sur des cellules identiques. Il estalors trouv un mme exposant 0.2 (figure 1.15e) entre la fonction de fluage mesureavec des microplaques et le module viscolastique mesur laide dune pince optiquefaisant osciller la position dune bille attache spcifiquement lactine. Ce comportementen loi de puissance est interprt comme un assemblage infini de modles de Kelvin-Voigtqui confre la cellule une infinit de temps de relaxation (figure 1.15f).

e

f

FIGURE 1.15 Mesure de la fonction de fluage obtenue par tirement uniaxial dune cellule grce des microplaques. Figures a et c : modle simple (figure c) associant plusieurs ressorts et amor-tisseurs visqueux. La fonction de fluage correspondant ce modle est trace sur la figure a. Lemodle semble sajuster parfaitement sur la figure a mais lorsquon tudie plus finement le com-portement grce aux chelles logarithmes (figure d) on voit une dviation aux temps courts (adaptde [26, 7]). Figures b et e : ajustement de la fonction de fluage avec une loi de puissance en chellelinaire (figure b) et en chelle logarithme. On voit que cette fois le comportement de la fonctionde fluage est bien dcrit toutes les chelles de temps par une loi de puissance. Figure f : modleexpliquant le comportement en loi de puissance par un assemblage infini en srie de modles deKelvin-Voigt. (adapt de [26, 7]).

Une comparaison plus complte des diffrences entre les expriences de microrholo-gie a t mene par Hoffman et al. [48]. Ils trouvent, en comparant toutes les mthodes


cites prcdemment (figures 1.13 et 1.14), que les exposants se regroupent autour dedeux intervalles distincts 1 [0.240.29] et 2 [0.130.17]. Ils interprtent cela en re-marquant que toutes les donnes des sondes intracellulaires peuvent, aprs renormalisation,se confondre avec une fonction de puissance 1 alors que pour la mesure extracellulaire laloi de puissance est 2 (figure 1.16 gauche). Lexposant 2 serait une signature de lactinecorticale qui est un rseau dense sous-membranaire rticul. Lexposant 1 correspond une rponse de lespace intracellulaire qui est plus fluide que lactine corticale dans la-quelle la rticulation lui confre un comportement plus lastique. En les comparant avec lalittrature, Hoffman et al. observent ce comportement pour dautres techniques de micro-rhologie sur diverses cellules (figure 1.16 droite). Enfin pour pouvoir exploiter les mesuresde microrhologie passive et en tirer la valeur du module viscolastique, ils saffranchissentdes forces biologiques en appauvrissant lATP de la cellule. Trs peu destimations de cesforces biologiques ont t effectues jusqu maintenant, nous proposons dans la partiesuivante de prsenter ces mesures.

a b

1

(rad s1)100 101 102 103 104 105

|G* ()

| G0

1

|G* ()

| G0

1

(rad s1)100 101 102 103 104 105101102

3/4

3/4

1

2

1

2


Microrhologie passive extracellulaire

Microrhologie passive deux points

Magntocytomtrie

Pince optique

Pince magntique

Microscope force atomique

MicroplaqueMicroplaque

Magntocytomtrie (Fluage)Magntocytomtrie


FIGURE 1.16 Comparaison de la dpendance frquentielle du module viscolastique pour diff-rentes techniques. Le module viscolastique |G()| peut suivre deux lois de puissance 1 ou 2.Aux hautes frquences |G()| 0,75 est la rponse typique dun gel de polymres dactine rticu-ls [73]. Les mesures de microrhologie passive de la figure a sont faites sur des cellules appauvriesen ATP permettant denlever les contributions des forces dorigine biologique. (adapt de [46, 48]).


1.3.4 tat de lart de la mesure de spectre des forces actives et de la viola-tion du thorme de fluctuation-dissipation

Le seul moyen de caractriser lactivit des forces biologiques dans la cellule est dutili-ser les deux approches de microrhologie : lactive qui mesure le dplacement dune sondeinduite par une force extrieure et la microrhologie passive qui mesure les fluctuationsdune particule soumise aux forces dorigine biologique et thermique. Lapproche activenous permet de mesurer la part des forces thermiques sexerant sur la sonde et la combi-naison des deux techniques de microrhologie nous donne lensemble des forces la faisantfluctuer.

Mesure du spectre des forces hors-quilibre

Loi de puissance du dplacement quadratique moyenLe comportement en loi de puissance de la rponse mcanique dun matriau lqui-

libre implique que le dplacement quadratique moyen dune particule dans ce milieu soitaussi une loi de puissance (quation 1.22),

si J() = J0(

0

)alors x2eq()= 2kBT J0

(0

). (1.29)

Le dplacement quadratique moyen dune sonde dans un liquide visqueux lquilibre estune fonction linaire du temps, on parle de mouvement diffusif : x2eq() 1 ce quicorrespond J() 1. Pour une sonde plonge dans un milieu lastique, le dplacementquadratique moyen est une constante : x2eq() 0 ce qui correspond J() = cst. Ledplacement quadratique moyen dune sonde dans un milieu viscolastique lquilibresera le cas intermdiaire o x2eq() avec 0 < < 1, on parle alors de mouvementsous-diffusif. Il en rsulte que si > 1, le matriau ne peut pas tre lquilibre, on parlede mouvement sur-diffusif. Le cas limite = 2 est un mouvement ballistique.

Dpendance frquentielle du spectre des forcesLau et al. [55] ont t les premiers comparer les mesures de microrhologie active et

passive. Ils ont compar les mesures des fluctuations de billes phagocytes dans des cellulespithliales cancreuses F9 et des macrophages J774A de Caspi et al. [16] et les mesuresde microrhologie active de Fabry et al. [28] sur le mme type cellulaire. Le dplacementquadratique moyen des sondes a un comportement sur-diffusif x2() 1.5 (figure 1.17gauche) qui est la signature dun systme hors de lquilibre thermodynamique. Fabry etal. ont utilis un champ magntique pour appliquer un couple (magntocytomtrie) surune microbille ferrimagntique recouverte de RGD et attache au cytosquelette via les in-tgrines. Ce couple se traduit par un dplacement de la bille qui induit une dformationpriodique du milieu en contact avec la bille. Ils peuvent ainsi calculer le module visco-


lastique G() de la cellule. En utilisant une expression similaire 12 lquation 1.18, Lauet al. trouvent que le spectre des forces sexerant dans la cellule est une loi de puissanceS f (s) s2. Cette valeur de lexposant a t interprte comme le spectre dun crneau deforce.

Daprs lquation 1.18, pour un comportement en loi de puissance de la rponse deJ() et du dplacement quadratique moyen x2() on sattend un comporte-ment en loi de puissance du spectre des forces 13 :

S f (s) =x2(s)

2s2J(s)2 s21 s . (1.30)

Selon la dcouverte de Lau et al., =2, on aurait une relation directe : = 2 +1. Enfait ce rsultat est critiquable car les deux mesures sont prises deux endroits de la cellule(intracellulaire pour la mesure passive et extracellulaire pour la mesure active).

1 10 100 (rad/s)

10-18

10-17

10-16

10-15

10-14

10-13

()

(J2s/m

3)

F9J774A.1

-2

r2

>2

(m

2)

10.000.01 0.10 1.00 (s)

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

100

F9

J774A.1

1.5

FIGURE 1.17 gauche, dplacement quadratique moyen dun couple de billes phagocytes(microrhologie deux points) dans des cellules pithliales cancreuses F9 et des macrophagesJ774A [16]. Cette fonction suit la loi de puissance x2() 1.5. Ce comportement sur-diffusif(exposant plus grand que 1) indique un effet des forces non-thermiques. droite, la mesure activede Fabry et al. [28] de magntocytomtrie, permet de tracer le spectre des forces thermiques (droiteen pointill) sexerant dans les cellules F9 et J774A. Cette mme mesure, couple aux mesuresdes fluctuations de la figure de gauche permet de tracer le spectre des forces actives et thermiquessexerant dans ces cellules. (adapt de [55]).

Le travail de Bursac et al. [14] tente de vrifier cette relation en sondant lactine cor-ticale avec des microbilles ferrimagntiques recouvertes de RGD. Bursac et al. utilisent

12. Lexpression est S f () 6a|G()|2C() o C() est la transforme de Fourier de la fonction dau-tocorrlation de la position. C() est relie au dplacement quadratique moyen. Lutilisation de C() leurpermet de rester en transforme de Fourier, chose intressante car G() est calcule directement dans les-pace frquentiel de Fourier.

13. Une loi de puissance dans lespace temporel implique une loi de puissance dans lespace frquentieldonc si J(t) = A( tt0 )

alors sa transforme de Laplace est de la forme J(s) = A(1+ )( ss0 )1 .


ces sondes pour lapproche active et passive sans toutefois faire les deux mesures de rho-logie exactement sur le mme objet. Ils calculent le dplacement quadratique moyen dessondes pour des cellules soumises diffrentes drogues capables dinhiber certains pro-cessus biologiques ainsi qu diffrentes tempratures (figure 1.18A). Ils utilisent : le DB-cAMP, drogue diminuant la contractilit cellulaire, le jasplakinolide qui stabilise lactine,ils appauvrissent la cellule en ATP et font des mesures 23C, 37C et 41C. Les fluctua-tions des billes oscillent entre des priodes de confinement et des priodes de mouvementdirig. Il en rsulte lexistence de deux rgimes : aux temps courts, le dplacement qua-dratique moyen a un comportement sous-diffusif, aux temps longs il a un comportementsur-diffusif. Ces deux rgimes existent quel que soit le processus biologique inhib parles drogues. En outre, ces drogues ont un effet sur lamplitude des fluctuations. Sur la fi-gure 1.18B, Bursac et al. ont trac lexposant local 14 du dplacement quadratique moyenpour les cellules de contrle 23C et pour les cellules appauvries en ATP. De plus, la me-sure active de magntocytomtrie G() permet de calculer 15 le dplacement quadratiquemoyen prdit lquilibre via le thorme de fluctuation-dissipation. Ils comparent doncles exposants prdits lquilibre et ceux rellement mesurs (figure 1.18B), ce qui permetde faire une premire estimation de lcart lquilibre. Aux temps courts, ces mesuresapprochent lquilibre mais aux temps longs elles divergent par rapport aux prdictions duthorme de fluctuation-dissipation. La carence en ATP maintient le systme lquilibresur des temps plus longs.

Enfin, sur la figure 1.18C, la prdiction de Lau et al. qui lie les exposants x2() et J() est vrifie. Seulement, les couples de points ( , ) ne salignent pas sur ladroite = 2 +1, suggrant une autre valeur de lexposant du spectre des forces = 2.5au lieu de 2. Les deux tudes de Lau et al. et Bursac et al. ont le dfaut dutiliser des sondesdiffrentes, aucune conclusion ne peut en tre tire quant lamplitude des fluctuations desforces.

Mesure de lamplitude du spectre des forces

Activit des gels dacto-myosinesLintrt de ltude des forces actives des cellules est de comprendre le rle et le com-

portement des moteurs molculaires. Au lieu de travailler sur des organismes cellulairescomplexes, il peut tre enrichissant afin de mieux les comprendre, dobserver le comporte-ment de modles simples tels que les gels dactines. Ces gels peuvent tre rendus actifs parajout de myosines II et cette activit est contrle par la prsence ou labsence dATP. Mi-zumo et al. [68] mesurent les proprits mcaniques dun gel actif dactine laide de billesmagntiques dont ils enregistrent ensuite les fluctuations. Ils peuvent ainsi comparer 16 les

14. Lexposant local est la pente locale en chelle logarithme-logarithme.

15. x2() = F1(

2kBTaiG()

)o F1 dsigne la transforme de Fourier inverse.

16. Dans cet article [68], la partie imaginaire de la fonction de rponse du gel actif est compare auterme C()2kBT o C() est la transforme de Fourier de la fonction dautocorrlation de la position de laparticule. Dans ce cas le thorme de fluctuation-dissipation scrit = 2kBT Ceq().


105

106

104

103

102

101

100

2

1

102 101 100 101 102

0.01 0.1 1 10 100

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0.0

1.6

1.8

1.4

1.2

0.2

0.01.12 1.14 1.16 1.18 1.20 1.22 1.24

A

B C

FIGURE 1.18 Courbes : 22C (vert), 37C (orange), 41C (violet), DBcAMP (bleu), Jasplaki-nolide (rouge), ATP depletion (noir). Figure A : dplacement quadratique moyen de billes-RGDattaches au cytosquelette par lintermdiaire des intgrines. Figure B : exposant du dplacementquadratique moyen en fonction du temps t (rond) et exposant de la prdiction de celui-ci par lethorme de fluctuation-dissipation (carr). Figure C : exposant en fonction de +1 pour vrifierla relation de Lau et al. ( = 2 +1 [14]).

deux mesures laide du thorme de fluctuation-dissipation. Sur la figure 1.19A, la partieimaginaire de la fonction de rponse est confondue avec la fonction de corrlation des fluc-tuations, le gel est lquilibre. Mais, cinq heures plus tard (figure 1.19B), une diffrenceentre les mesures actives et passives est observe 17, le systme scarte de lquilibre auxtemps longs ( > 10 Hz). Au-del de cette frquence le systme apparat fig par rapport la dure du cycle des myosines et donc on nobserve pas dcart lquilibre.

Activit dans le cytoplasmeLa premire tude de spectre de lamplitude du spectre des forces dans une cellule en

utilisant exactement la mme sonde a t effectue par Robert et Wilhelm et al. [83]. Ils ont

17. On peut mettre lhypothse que le retard de 5 h est le temps ncessaire pour que le gel sorganisecompltement.


FIGURE 1.19 Figure A : comparaison des mesures actives et passives C()2kBT pour un geldactine et de myosine. Au dbut de lexprience les deux courbes se superposent, symptme dunsystme lquilibre. Figure B : Mme chose que la figure A, cinq heures plus tard. Au-dessousde 10Hz les contributions des myosines sont observables et le gel se retrouve hors de lquilibrethermodynamique. (daprs [68]).

quantifi le spectre des forces actives sur des endosomes magntiques (figure 1.20 droite).La particularit de leur exprience est de faire la suite la mesure de microrhologie pas-sive puis active. Ceci permet de saffranchir de lhtrognit et des disparits dans lacellule. Le dplacement quadratique moyen mesur sur des cellules saines montre un com-portement sur-diffusif sur lchelle de temps de 0.1 10s (figure 1.20A) et le spectre desforces actives est largement au-dessus de celui lquilibre calcul laide de la mesure demicrorhologie active. Il sagit ensuite didentifier les processus biologiques lorigine desforces actives. Pour cela, des cellules sont drogues avec du nocodazole, qui dpolymriseles microtubules ce qui permet dtudier leur rle dans la gnration de force. En effet, lesendosomes sont connus pour avoir un mouvement dirig le long des microtubules laidede moteurs molculaires, les kinsines et les dynines. Le dplacement quadratique moyensen trouve largement modifi

Etude du comportement hors-equilibre du cortex cellulaire

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