Estudo dos efeitos biológicos de diferentes soluções utilizadas ...

HILDA IRENE GENTIL BASTOS

ESTUDO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DE DIFERENTES SOLUÇÕES UTILIZADAS COMODIFERENTES SOLUÇÕES UTILIZADAS COMO CONSERVANTES EM AVULSÃO DENTÁRIA:

UMA ANÁLISE IN VITRO

2008

Mestrado em OdontologiaAv. Alfredo Baltazar da Silveira 580 cobertura

22790-710 - Rio de Janeiro, RJTels.: (0xx21) 2199-2200 ramal:2204

HILDA IRENE GENTIL BASTOS

ESTUDO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DE DIFERENTES SOLUÇÕES UTILIZADAS COMO CONSERVANTES EM AVULSÃO DENTÁRIA: UMA

ANÁLISE IN VITRO

Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Estácio de Sá visando a obtenção do grau de

Mestre em Odontologia (Endodontia).

ORIENTADOR:

Prof. Dr. Gláucio Diré Feliciano

UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ

RIO DE JANEIRO

2008

ii

DEDICATÓRIA

Este trabalho é dedicado ao meu Deus.

Ao meu Deus e Senhor da minha vida,

a Ti que és meu refúgio em horas difíceis,

sua fidelidade é o meu escudo e sei

que estás comigo em todos os momentos.

A Ti dedico toda a minha vida.

Faça de mim um instrumento para

sua obra e para a sua glória.

Amém.

iii

AGRADECIMENTOS

A Jesus Cristo, único Senhor e Salvador da minha vida.

Aos meus pais, Ricardo e Vera, pelo apoio e pelo amor e por terem

tornado tudo possível.

Ao meu amor, Gustavo, por suportar todas as minhas angústias, pelo

seu carinho e amor incondicional sempre, pelo seu colo e seu abraço nos

momentos que preciso, por me ajudar a caminhar os caminhos do Senhor e por

ser como é.

Ao professor e grande exemplo, Gláucio Diré, por ter sido meu

orientador no sentido real da palavra, a este gênio que tive o prazer de

conhecer agradeço por sempre ter me atendido tão prontamente, por ter feito o

possível e impossível para me ajudar, por ter agido como um anjo em

momentos difíceis e por ter me passado um pouco de seu vasto conhecimento.

Aos meus sogros, Edson e Creyse, e às minhas cunhadas, Louise e

Débora por serem minha segunda família, participando das derrotas e das

vitórias da minha vida me apoiando.

Aos meus parentes especiais que tanto ajudam e participam e

participaram da minha vida (Obrigada Ricardinho, Tia Luzia, Cátia, Tio Valdo,

iv

Vô Benedicto e Vó Irene e In memoriam, Vô Zezé e Vó Hilda, Tia Floripes e

Lucy e os demais).

Aos professores e amigos da Universidade Federal Rural do Rio de

Janeiro, Ronald Bastos Freire, Hélcio Borba, Cleide, Aline, obrigada por terem

tornado possível o meu trabalho e por todo o apoio e material cedido.

Aos colegas do Mestrado por terem se tornado verdadeiros amigos.

A equipe do Mestrado, professores e em especial ao Professor Hélio

Pereira Lopes, grande fonte de conhecimento, e à Angélica, por terem me

ajudado a crescer como profissional.

A Dra. Helena Rosa Campos Rabang por ter me ensinado tanto já na

especialização e participado de modo efetivo na minha formação profissional.

Aos amigos por escutarem os lamentos e comemorarem as vitórias

(Obrigada Meg, Poli e os demais).

v

ÍNDICE

Resumo:..............................................................................................................vi

Abstract:.............................................................................................................vii

Lista de Figuras:................................................................................................viii

Introdução:.........................................................................................................11

Revisão de Literatura:........................................................................................13

Proposição:........................................................................................................36

Materiais e Métodos:..........................................................................................37

Resultados:........................................................................................................41

Discussão:.........................................................................................................51

Conclusões:.......................................................................................................60

Referências Bibliográficas:................................................................................61

Anexos:..............................................................................................................72

vi

RESUMO

O tratamento recomendado em avulsão dentária é o reimplante dentário

imediato e quando isto não for possível, deve-se colocá-lo em uma solução

conservadora capaz de manter a viabilidade das células do ligamento

periodontal e restabelecer a fisiologia do mesmo que é de fundamental

importância para um prognóstico favorável. O meio de conservação ideal deve

ser de fácil disponibilidade no momento do acidente, deve possuir pH e

osmolaridade adequados e deve ainda ser capaz de manter a vitalidade e

correto funcionamento celular com o mínimo de toxicidade bem como ser

capaz de evitar a presença e proliferação de microorganismos. Dentre os

diversos meios que têm sido utilizados com sucesso encontramos a solução

salina balanceada de Hank, o leite e o própolis. O presente trabalho tem como

objetivo avaliar quantitativamente e qualitativamente os efeitos citotóxicos de

soluções conservantes, entre elas o própolis, água de coco, leite de coco,

HBSS, solução fisiológica com antibióticos e leite, utilizadas em casos de

avulsão dentária através da observação microscópica de alterações celulares

sofridas em macrófagos. Neste estudo, a exposição dos macrófagos aos meios

conservantes utilizados para avulsão dentária, possibilitou a partir da análise

em microscopia de luz, avaliar a citotoxicidade, a partir do comportamento

apoptótico das células submetidas aos referentes meios. A partir da análise dos

resultados obtidos, podemos sugerir que o leite de coco pode ser considerado

o melhor meio a ser utilizado como conservante em caso de avulsão dentária.

Palavras-chave: leite de coco, macrófagos, avulsão dentária.

vii

ABSTRACT

In case of dental avulsion the recommended treatment avulsion is an

immediate reimplant. Yet when this is not possible, the tooth must be placed in

a storage media capable of maintaining the viability of the cells of the

periodontal ligament and restore their physiology, what is extremely important

for a favorable prognosis. The ideal storage media should be readily available

at the time of the accident, it must have an adequate pH and osmolality and

should still be able to maintain the vitality and the proper functioning of the cell

with minimal toxicity and be able to avoid the presence and proliferation of

microorganisms. Among the various medias that have been successfully used,

we may find HBSS, milk and propolis. This study aims to assess quantitatively

and qualitatively the cytotoxic effects of storage medias, including propolis,

coconut water, coconut milk, HBSS, saline with antibiotics and milk, used in

cases of tooth avulsion through the microscopic observation of the cellular

changes occurred in macrophages. In this study, the exposure of the

macrophages to the storage medias used in dental avulsion, allowed the

evaluation, through optical microscope, of the citotoxicitty based on the

apoptotic behavior of the cells, that were subjected to these medias. Based on

the analyses of the results, it may me suggested that the coconut milk was

considered the best storage media in case of dental avulsion.

Key words: coconut milk, macrophages, dental avulsion.

viii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Análise gráfica da viabilidade celular diante de soluções

conservantes......................................................................................................44

FIGURA 2 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água

de coco durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao

Azul de Trypan. Observam-se células mortas, degeneradas, presença de

corpos apoptóticos. A coloração azul indica a morte celular. Nikon, aumento de

400 x..................................................................................................................44

FIGURA 3 - : Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com

Própolis durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao

Azul de Trypan. Observam-se células vivas. Nikon, aumento de

400x...................................................................................................................45

FIGURA 4 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com


Azul de Trypan. Observam-se células vivas juntamente com células

degeneradas. O Própolis acarretou o aumento da célula por provável aumento

da permeabilidade da membrana celular. Nikon, aumento de

400x...................................................................................................................45

FIGURA 5 - Controle negativo. Observa-se que todas as células apresentam-

se mortas. Nikon, aumento de 100x.................................................................46

FIGURA 6 - Controle positivo. Observa-se que todas as células apresentam-se

vivas. Nikon, aumento de 100x..........................................................................46

ix

FIGURA 7 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água


Azul de Trypan. Observa-se apoptose. Nikon, aumento de 400x.....................47

FIGURA 8 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite


Azul de Trypan. Observa-se a presença de monócito. Nikon, aumento de

400x...................................................................................................................47

FIGURA 9 - Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite


Azul de Trypan. Observam-se células intactas com boa aparência, monócito

com morfologia adequada, com núcleo em forma de rim. Nikon, aumento de

400x...................................................................................................................48



Azul de Trypan. Observa-se necrose, células degeneradas, observa-se

apoptose com fragmentação nuclear. Nikon, aumento de 400x........................48



Azul de Trypan. Observa-se alteração citoplasmática; núcleo começando a se

fragmentar; apoptose. Nikon, aumento de 400x................................................49



Azul de Trypan. Pode-se perceber necrose da célula. Ocorrem cicatrizes na

x

célula, o que causa necrose. A necrose estimula o processo inflamatório.

Nikon, aumento de 400x....................................................................................49


solução fisiológica durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida

frente ao Azul de Trypan. Observa-se necrose celular e apoptose; figuras de

apoptose (superior esquerdo); estágios diversos de apoptose; estágio

avançado (inferior esquerdo). Nikon, aumento de 400x....................................50

11

INTRODUÇÃO

Com uma freqüência relativamente pequena entre as injúrias

traumáticas, variando de 1% a 16%, a avulsão dentária é definida como o

completo deslocamento do dente de seu alvéolo e pode ser considerada a pior

destas injúrias traumáticas podendo levar a perda do elemento dentário.

Quedas, colisões, acidentes automobilísticos, esportes e lutas são apenas

alguns exemplos de fatores etiológicos comuns a este tipo de lesão traumática

(ANDREASEN & ANDREASEN, 2001).

O tratamento recomendado neste caso é o reimplante dentário imediato

e quando isto não for possível, deve-se colocá-lo em uma solução

conservadora capaz de manter a viabilidade das células do ligamento

periodontal e restabelecer a fisiologia do mesmo que é de fundamental

importância para um prognóstico favorável (LUSTOSA-PEREIRA et al., 2006).

Tanto o tempo do dente fora do alvéolo quanto o tipo do meio de

conservação utilizados podem afetar o prognóstico a longo prazo do dente

reimplantado. Quanto maior o tempo em que o dente avulsionado permanecer

em meio seco, pior o prognóstico. Por este motivo, os mais diversos meios de

conservação tem sido estudados (ANDREASEN, 1993; CHAMORRO et al.,

2008).

O meio de conservação ideal deve ser de fácil disponibilidade no

momento do acidente, deve possuir pH e osmolaridade adequados e deve

ainda ser capaz de manter a vitalidade e correto funcionamento celular com o

mínimo de toxicidade bem como ser capaz de evitar a presença e proliferação

de microorganismos. Dentre os diversos meios que têm sido utilizados com

12

sucesso encontramos a solução salina balanceada de Hank, o leite e o própolis

(TROPE, 2002; MARTIN & PILEGGI, 2004; LUSTOSA-PEREIRA et.al., 2006).

A manutenção da morfologia celular após a exposição aos meios

conservantes é outro item que deve ser verificado com cuidado. Soluções que

apresentam alto nível de toxicidade podem danificar a regulação e correto

funcionamento celular que irá afetar diretamente na capacidade de

regeneração do local traumatizado após o acidente (CHAMORRO et al.; 2008).

Diante destas observações, acredita-se ser oportuno o estudo in vitro de

algumas soluções conservantes comumente utilizadas e outras recentemente

utilizadas e testadas, bem como uma mistura daquelas que obtiveram sucesso

em estudos anteriores para que se possa observar o nível de toxicidade destas

substâncias e sua interferência ou não no correto funcionamento celular o que

pode até mesmo levar à morte da célula.

13

REVISÃO DE LITERATURA

1) Traumatologia, avulsão e reabsorção dentária

Lesões traumáticas em dentes permanentes anteriores são acidentes

freqüentes que afetam muitas crianças na idade escolar, de 7 a 14 anos de

idade, com intensa atividade física e sem noção de perigo. A maioria dos

traumas, sejam em adultos ou crianças, normalmente são causados por

quedas e colisões ou ainda acidentes automobilísticos, esportes e lutas e 13%

dos escolares examinados na faixa etária de 18 anos já foram expostos a

traumatismos dentários durante a adolescência. Fraturas dentárias parecem

mais comuns na dentição permanente enquanto luxações e especialmente

intrusões predominam na dentição decídua (ANDREASEN, 1970;

ANDREASEN, 1985; ANDREASEN & ANDREASEN, 2001; LUSTOSA-

PEREIRA et al, 2006). Estas lesões podem acometer pequenas partes da

coroa ou até causar o completo deslocamento do dente do seu alvéolo,

caracterizando um caso de avulsão dentária, que danifica tanto os tecidos de

suporte quanto a polpa dentária e que ocorre mais comumente entre 7 e 9 anos

de idade devido a maior elasticidade do osso alveolar que gera uma mínima

resistência às forças extrusivas. O papel do reparo do dente avulsionado após

reimplante irá depender do potencial de reparo de cada componente celular

dos tecidos envolvidos, do procedimento efetuado ao reimplante e de fatores

específicos do indivíduo. A incidência de casos de avulsão varia de 1% a 16%

de todas as injúrias traumáticas à dentição permanente e é considerada a pior

dentre as injúrias dento-alveolares. O dente mais freqüentemente avulsionado

é o incisivo central superior. O tratamento recomendado é o reimplante dentário

14

imediato que é o ato de recolocar o dente avulsionado no seu alvéolo; e

quando isto não for possível, deve-se colocá-lo em uma solução conservadora

capaz de manter a viabilidade das células do ligamento periodontal e

restabelecer a fisiologia do mesmo. Considera-se como reimplante imediato

quando a permanência do dente fora do seu alvéolo é de até 30 minutos.

Sendo assim, o reimplante tardio tem se tornado uma realidade clínica para os

dentistas considerando o momento que o paciente chega ao profissional para

atendimento. Quando o dente avulsionado é imediatamente reimplantado ou

colocado em uma solução capaz de preservar as fibras periodontais presas à

raiz, as chances de sucesso no reimplante aumentam consideravelmente. O

reimplante restaura a estética e a função oclusal logo após a injúria e o dente

reimplantado pode manter sua função por alguns anos (CHO & CHENG, 2002;

MARTIN & PILEGGI, 2004; LUSTOSA-PEREIRA et al., 2006; ÖZAN et. al.,

2007; POI et al., 2007; CHAMORRO et al., 2008). Avulsão, portanto, resulta em

completo deslocamento do dente do alvéolo. Em adição, o suprimento

neurovascular é severamente comprometido, o que usualmente resulta em

perda da vascularização da polpa. A nutrição da polpa é conseguida através de

uma arteríola de 50 µm de diâmetro que penetra através do forame apical. Esta

arteríola é envolta por várias camadas de células musculares que a protegem

de ruptura. Entretanto, qualquer movimento dentário maior que duas vezes o

diâmetro do vaso, pode causar seu rompimento. Isto poderia resultar em

necrose pulpar em ápices abertos e fechados. Após avulsão, o sucesso pós-

reimplante é dependente do tratamento imediato seguinte à injúria. A

revascularização pulpar é iniciada após quatro dias e geralmente está completa

15

após quatro a cinco semanas em dentes imaturos reimplantados. A

revascularização é rara em dentes maduros que tenham um forame apical

estreito (ANDREASEN, 1993; MARTIN & PILEGGI, 2004; LIN et al., 2007).

Uma das conseqüências da avulsão dentária e posterior reimplante é a

reabsorção radicular e sua ocorrência depende de fatores como período extra-

alveolar, solução conservadora, contaminação microbiana e estágio da

formação radicular. Em 1925, a American Dental Association definiu

reabsorção como a perda de produtos ou tecidos do próprio corpo. A

reabsorção radicular iniciada por uma área de superfície mineralizada ou

exposta pode ser prolongada por irritação mecânica do tecido, infecção da

dentina e canal radicular e por certas doenças sistêmicas. Junto com estímulo

adicional de células de reabsorção, esta se torna progressiva e pode levar à

destruição da raiz. As maiores seqüelas que levam ao fracasso após

reimplante são a reabsorção radicular inflamatória, anquilose e reabsorção por

substituição. A presença de um ligamento periodontal intacto e viável na

superfície radicular é o fator mais importante para assegurar a cicatrização do

ligamento periodontal sem reabsorção radicular. As reabsorções dentárias

representam o principal fator limitador envolvido na determinação do

prognóstico das transplantações e reimplantações dentárias (TRONSTAD,

1988; ANDREASEN, 1993; KEUM et al., 2003; MARTIN & PILLEGI, 2004;

CONSOLARO, 2005; LUSTOSA PEREIRA et al., 2006; MANFRIN et al., 2007;

ÖZAN, 2007).

Os tecidos mineralizados dos dentes permanentes não são normalmente

reabsorvidos. Eles são protegidos no canal radicular pela pré-dentina e

16

odontoblastos e na superfície radicular pelo pré-cemento e cementoblastos. A

pré-dentina, o pré-cemento e o tecido osteóide ajudam a proteger os tecidos

mineralizados da ação reabsortiva. Nos traumatismos ocorrem deslocamentos

focais de pré-dentina e da camada odontoblástica. Se a pré-dentina ou pré-

cemento se tornam mineralizados ou se o pré-cemento é danificado

mecanicamente ou perdido, células multinucleadas irão colonizar a superfície

mineralizada ou desprotegida e a reabsorção vai ocorrer. Este tipo de

reabsorção pode ser referida como reabsorção radicular inflamatória. Esta

pode ocorrer na parede do canal radicular (reabsorção interna) e na superfície

da raiz (reabsorção externa) e pode ser transitória ou progressiva. Assim, em

dentes permanentes humanos não existem reabsorções dentárias normais,

sendo sempre patológicas (TRONSTAD, 1988; CONSOLARO, 2005).

Em dentes que sofreram deslocamento, a reabsorção radicular externa

pode se tornar extensa. Extrusão ou intrusão do dente bem como

subseqüentes procedimentos de reposição, inevitavelmente causarão dano à

raiz resultando em áreas desnudas da superfície da raiz que serão

quimiotáticas para células de reabsorção de tecido duro. A reabsorção radicular

irá seguir-se. Em adição, o deslocamento do dente leva ao rompimento de

vasos sangüíneos no forame apical e à necrose pulpar isquêmica.

Microorganismos irão depois ocupar o canal radicular através da junção

esmalte-dentina e túbulos dentinários expostos e uma infecção se estabelecerá

em um período de 2-3 semanas. Neste momento, a reabsorção radicular

induzida por áreas desnudas da superfície radicular pode ter exposto dentina

radicular tubular. Produtos bacterianos dos canais radiculares infectados irão

17

ocupar as lacunas de reabsorção na superfície radicular através dos túbulos

dentinários e sustentar a reabsorção radicular (TRONSTAD, 1988;

ANDREASEN, 1993; TROPE, 2002). Além disso, em dentes luxados, a

reabsorção radicular é iniciada por trauma mecânico, resultando em remoção

de cementoblastos, pré-cemento e às vezes cemento em áreas da superfície

radicular. Com a perda do cemento, a resposta inflamatória resultará em

reabsorção óssea e radicular. O processo de reabsorção é depois mantido por

estímulo microbiano vindo dos canais radiculares infectados que provê o

estímulo contínuo necessário das células de reabsorção. Após poucas

semanas, a condição pode ser reconhecida radiograficamente como áreas

radiolúcidas perirradiculares, usualmente envolvendo áreas da raiz e do osso

alveolar adjacente. Se isto progredir, o processo de reabsorção poderá destruir

o dente completamente em poucos meses. Em casos de avulsão o dano inicial

à camada de cemento após o trauma é limitado. Entretanto, se as células

remanescentes do ligamento periodontal na raiz permanecerem secas, estas

irão ocasionar uma resposta inflamatória em toda a superfície radicular que

resulta em dano à camada protetora de cemento. A reabsorção inflamatória

pode se desenvolver uma semana após o reimplante e segue um trajeto

progressivo, a menos que seja feito o tratamento endodôntico. Este tipo de

reabsorção está relacionado ao dano associado às camadas mais internas do

ligamento periodontal na superfície radicular e à presença de tecido pulpar

necrótico infectado (ANDREASEN, 1993; TROPE, 2002).

Anquilose dento-alveolar ocorre após extensa necrose do ligamento

periodontal com formação de osso na área desnuda da superfície radicular.

18

Clinicamente, esta condição é vista mais freqüentemente como uma

complicação à injúrias com luxação, especialmente em dentes avulsionados

que estiveram fora da boca por um período longo o suficiente para as células

da superfície radicular secarem e morrerem. Se menos de 20% da superfície

radicular é envolvida, a reversão da anquilose pode ocorrer. Se não, o dente

anquilosado é incorporado no osso alveolar e se tornará parte do processo

normal de remodelação do osso. Conseqüentemente, ele gradualmente será

reabsorvido e substituído por osso, daí o termo reabsorção por substituição

(TRONSTAD, 1988). As células de reabsorção na reabsorção por substituição

são os osteoclastos normalmente envolvidos em remodelação óssea.

Entretanto, a reabsorção por substituição apesar de levar à completa

destruição do dente, não deve ser entendida como um processo de doença.

Isso ocorre como um “erro” pelas células envolvidas na remodelação do osso

não serem capazes de distinguir entre cemento, dentina e osso. Os

osteoclastos irão reabsorver o tecido dentário do mesmo modo como

reabsorvem osso e como não são capazes de formar dentina ou cemento, os

osteoblastos substituem as áreas reabsorvidas da raiz com osso. Se os

cementoblastos continuam a cobrir a superfície radicular danificada, o processo

de cicatrização irá ocorrer e o resultado será favorável. Por outro lado, se

osteoblastos cobrem a superfície radicular, as condições para cicatrização

serão desfavoráveis e ocorrerá anquilose. A anquilose pode ser demonstrada

histologicamente duas semanas após o reimplante (TRONSTAD, 1988;

TROPE, 2002).

19

Durante a avulsão e subseqüente reimplante ocorre a contusão do

ligamento periodontal com necrose celular resultando em processos de reparo

do ferimento onde o ligamento periodontal necrótico é removido por

macrófagos ou por cemento pela atividade osteoclástica. Esta última levará à

reabsorção de superfície ou inflamatória dependendo do estado da polpa, da

idade do paciente e do estágio de desenvolvimento radicular. A reabsorção

inflamatória pode ser demonstrada histologicamente uma semana após o

reimplante e na raiz é mais comum em dentes imaturos reimplantados e dentes

maduros jovens que em dentes maduros mais velhos. Quando grandes áreas

do ligamento periodontal são traumatizadas, a cicatrização competitiva da

ferida começa entre as células derivadas da medula óssea destinadas a formar

osso e células derivadas do ligamento periodontal programadas para formar as

fibras deste ligamento e cemento. O resultado dessa competição pode ser uma

anquilose de transição ou permanente. A ausência de restos epiteliais de

Malassez no ligamento periodontal ressecado por períodos extra-alveolares

prolongados podem levar à ocorrência de anquilose porque ele é responsável

por manter o espaço periodontal (ANDREASEN, 1993; LUSTOSA-PEREIRA et

al., 2006).

ANDREASEN (1970) estudou a etiologia e patogênese das injúrias

dentais traumáticas através da coleta de dados de 1298 pacientes de um

hospital (908 homens e 390 mulheres). Um total de 3026 dentes traumatizados

foram tratados, incluindo 787 dentes decíduos e 2239 dentes permanentes.

Traumatismos dentários repetidos foram encontrados em 24% dos casos.

Todos os traumas foram classificados de acordo com o tipo de injúria afetando

20

lábios, mucosa oral, estruturas de suporte dentárias e tecidos dentários duros.

O tipo de trauma parece estar relacionado à dentição, com traumas envolvendo

as estruturas dentárias de suporte predominantemente na dentição primária. A

origem do trauma foi distribuída em 9 grupos, de acordo com energia e

resiliência do impacto. A análise estatística revelou diferenças significativas nas

causas das injúrias entre os diferentes grupos de traumas. A relação entre

injúrias nos lábios e injúrias ao dente ou estruturas de suporte foram analisadas

separadamente. Parece através desta análise que o lábio pode atuar

absorvendo o impacto, reduzindo a chance de fratura coronária e aumentando

o risco de luxação e fratura do processo alveolar.

ANDREASEN & RAVN (1972) estudaram a epidemiologia das injúrias

traumáticas na dentição decídua e permanente em uma amostra da população

dinamarquesa que consistia de 487 crianças, sendo 251 meninos e 236

meninas, com idade entre 9 e 17 anos. 30% das crianças sofreram traumas na

dentição decídua, enquanto 22% sofreram traumas na dentição permanente.

Os meninos sofreram traumas mais freqüentemente na dentição permanente

quando comparado com as meninas, enquanto na dentição decídua foi achada

muito pouca diferença. Indivíduos mostrando traumas na dentição decídua não

exibiram uma freqüência significativamente maior de traumas na dentição

permanente quando comparado ao grupo sem história de trauma na dentição

decídua. A incidência anual de traumatismos foi determinada para a população

examinada. Entre os meninos, as maiores incidências ocorreram nas seguintes

faixas etárias: 2-4 anos e 9-10 anos. Nas meninas só foi vista uma alta

incidência no grupo etário de 2-3 anos.

21

ANDERSON et al. (2006) estudaram o grau de conhecimento de

escolares do Kwait, das medidas de emergência a serem tomadas em caso de

avulsão dentária. Ao todo 221 escolares foram entrevistados. Foram avaliados

os conhecimentos sobre princípios dos tratamentos em traumas, avulsão e

reimplante dentário, avulsão de dente permanente e decíduo, limpeza de dente

avulsionado antes do reimplante, período extra-alveolar e meio conservante.

Crianças acima de 10 anos apresentaram um conhecimento maior do manejo

de traumas, mas independente da idade, o sobre avulsão, reimplante, período

extra-alveolar e meio conservante foi baixo. Pode-se concluir a partir deste

estudo que o conhecimento em geral é baixo o que poderia afetar o

prognóstico em casos de traumatismos.

LUSTOSA-PEREIRA et al. (2006) avaliaram a eficácia do alendronato de

sódio em evitar a ocorrência de reabsorção dentária em dentes avulsionados.

Cinqüenta e quatro incisivos centrais superiores direitos de ratos foram

divididos em três grupos com períodos extra-alveolares de 15, 30 e 60 minutos.

O alendronato de sódio foi usado como substância tópica no tratamento da

superfície radicular. Os resultados indicaram que o alendronato de sódio foi

eficaz em reduzir a incidência de reabsorção radicular, mas não da anquilose

dentária. Não houve diferença significante entre os períodos extra-alveolares.

POI et al. (2007) avaliaram as alterações na cicatrização do ligamento

periodontal de dentes reimplantados após o uso de Emdogain®. O incisivo

central de 24 ratos Wistar foram extraídos e deixados a seco por 6 horas. Após

isso, a papila dentária e o órgão do esmalte de cada dente foi seccionada para

remoção pulpar por via retrógrada e o canal foi irrigado com hipoclorito de

22

sódio a 1%. Os dentes foram divididos em dois grupos: no grupo I, a superfície

radicular foi tratada com hipoclorito de sódio a 1% por 10 minutos (trocando a

solução após 5 minutos), enxaguada com solução salina por 10 minutos e

imersa em flúor fosfato de sódio acidulado a 2% por 10 minutos; no grupo II, as

superfícies radiculares foram tratadas do mesmo modo descrito, exceto pela

aplicação de Emdogain® ao invés do fluoreto de sódio. Os dentes foram

obturados com hidróxido de cálcio e reimplantados. Todos os animais

receberam antibioticoterapia. Os ratos foram mortos por overdose anestésica

10 e 60 dias após o reimplante. As peças contendo os dentes reimplantados

foram removidas, fixadas, descalcificadas e embebidas em parafina. Cortes

seriados de 6µ foram obtidos e corados com hematoxicilina e eosina para

análise histológica e histométrica. Observou-se que o uso de flúor fosfato de

sódio acidulado gerou mais áreas de reabsorção por substituição e o uso de

Emdogain® resultou em mais áreas de anquilose e não foi capaz de evitar

anquilose dento-alveolar. Pode-se concluir que nem o flúor fosfato de sódio

acidulado e nem o Emdogain® foram capazes de prevenir a reabsorção

radicular em reimplantes tardios de dentes de ratos.

2) Soluções conservadoras após avulsão

Na maioria dos casos clínicos, antes do reimplante os dentes

avulsionados têm sido armazenados na cavidade bucal ou outros meios, tais

como solução salina ou água de torneira. Uma vez que esses meios de

armazenagem diferem consideravelmente, em especial com relação à

concentração de eletrólito, pode-se presumir que a escolha do meio de

armazenagem possa influenciar a cicatrização pulpar e o desenvolvimento de

23

diferentes tipos de reabsorção radicular. Um meio ideal de armazenamento

seria aquele capaz de preservar a viabilidade e mitogenicidade do ligamento

periodontal danificado de modo a facilitar a nova ocupação da superfície

radicular desnuda prevenindo a reabsorção radicular. Em 1994, a

ASSOCIAÇÃO AMERICANA DE ENDODONTISTAS recomendou a solução

salina balanceada de Hank como o meio de escolha para dentes avulsionados.

Foi encontrada uma forte relação entre o armazenamento a seco e o

armazenamento em meios não-fisiológicos como a água de torneira e a

cicatrização periodontal e reabsorção radicular (ANDREASEN, 1993). Parece

que a revascularização pulpar depende das condições de armazenagem. Se os

dentes avulsionados são armazenados úmidos, a revascularização acontece

em aproximadamente um terço dos casos armazenados até três horas. A

revascularização após armazenagem a seco ocorre, de modo geral, em cerca

de metade dos casos, quando o período de armazenagem é menor que cinco

minutos. Depois, a freqüência de revascularização cai para aproximadamente

um terço, no período de seis a vinte minutos e depois continua a diminuir com o

aumento dos períodos em que o dente fica a seco. Além disso, tem sido notado

que a revascularização ocorre unicamente em dentes com um diâmetro apical

do forame que excede a um milímetro (ANDREASEN, 1993; CHAMORRO et

al., 2008).

Tanto o tempo do dente fora do alvéolo quanto o tipo do meio de

conservação utilizados podem afetar o prognóstico a longo prazo do dente

reimplantado. O objetivo do tratamento do paciente que sofreu avulsão dentária

é o reimplante imediato, mas como nem sempre isto é possível, colocar o dente

24

em soluções que preservam a vitalidade das células do ligamento periodontal

ajuda a prevenir a reabsorção radicular inflamatória e a reabsorção por

substituição. O ligamento periodontal remanescente na raiz após injúria, é

dependente de um suprimento de metabólitos vitais, caso contrário a

destruição celular começa. Para preservar o metabolismo celular ótimo, o

suprimento deve ser renovado após 60 minutos do tempo da injúria. Se as

células sobreviverem, elas irão promover a reprodução de novas células as

quais podem se diferenciar e recompor os tecidos de suporte (TROPE, 2002;

MARTIN & PILEGGI, 2004; LIN et al., 2007).

Soluções conservadoras como leite, por exemplo, favorecem o sucesso

do procedimento de reimplante, enquanto deixar o dente em um ambiente seco

compromete o prognóstico significativamente. Dentes reimplantados com 30

minutos apresentam uma taxa de sucesso melhor que aqueles com um período

extra-oral maior e com duas horas à seco, não é encontrada nenhuma célula

do ligamento periodontal vital. Muitos métodos têm sido sugeridos para

preservar a vitalidade das células do ligamento periodontal que variam desde

colocar o dente embaixo da língua do paciente até meios como leite, solução

salina ou mesmo a mais apropriada solução salina balanceada de Hank. A

saliva se mostrou pior que o leite por causa da sua baixa osmolaridade e alto

risco de contaminação bacteriana, apesar de conservar a vitalidade das células

do ligamento periodontal por até 2 horas. Água da torneira, saliva e soro

fisiológico são todos ineficazes em manter a viabilidade das células do

ligamento periodontal. Esses meios não são recomendados pelas suas

propriedades hipotônicas (água de torneira e saliva) e alta incidência de

25

contaminação bacteriana que levam à rápida morte das células do ligamento

periodontal. Alguns estudos têm começado a sugerir o uso do Própolis como

um meio conservador do dente avulsionado (TROPE, 2002; MARTIN &

PILEGGI, 2004; ANDERSON et al., 2006). O Própolis é um produto resinoso da

colméia da abelha com propriedades antibacterianas e anti-inflamatórias, anti-

oxidantes, anti-fúngicas, anti-virais e reparadoras de tecidos, entre outras.

Radicais de oxigênio e tensão de oxigênio modulam atividade de osteoblastos

e osteoclastos. Dano oxidativo pode promover reabsorção da superfície

radicular por efeitos tóxicos nas células do ligamento periodontal danificadas

mecanicamente ou no cemento ou pelo aumento da atividade de reabsorção

das células clásticas. Tem sido sugerido que colocar o dente avulsionado em

um meio contendo um ou mais antioxidantes pode aumentar o sucesso do

reimplante. O própolis tem uma grande capacidade anti-oxidante. Os

componentes mais importantes do própolis são os flavanóides que são

poderosos anti-oxidantes. Antibióticos mostram efeitos favoráveis tanto tópica

quanto sistemicamente em evitar a reabsorção após o reimplante. A Penicilina

diminui a ocorrência de reabsorção e a tetraciclina possui propriedades que

atuam contra a reabsorção em adição aos seus efeitos antimicrobianos. O

tratamento da superfície radicular com solução de fluoreto estanoso a 1% e

tetraciclina também reduz a reabsorção. Como o própolis possui atividade

antimicrobiana, isso faz dele um meio conservador favorável. O leite tem sido

estudado extensivamente e tem ganhado aceitação como um meio capaz de

manter a viabilidade das células do ligamento periodontal provavelmente por

sua osmolaridade fisiológica que não é excessivamente danosa a estas

26

células, pH neutro e presença de nutrientes. Seu conteúdo de gordura afeta

esta viabilidade, sendo o leite com baixo teor de gordura mais apropriado. É um

meio prático e encontrado próximo a maioria dos locais dos acidentes (TROPE,

2002; ANDERSON et al., 2006). A ASSOCIAÇÃO AMERICANA DE

ENDODONTISTAS (1995) aceita o leite como solução conservadora para

transporte de dente avulsionado. A solução salina balanceada de Hank (HBSS)

é a solução salina padrão usada largamente em pesquisa biomédica para

permitir o crescimento de vários tipos celulares. Ela não apresenta toxicidade,

apresenta osmolaridade ideal, o pH é balanceado e contém muitos nutrientes

essenciais, preservando a vitalidade dos fibroblastos por 72 horas. Uma

solução conservadora para transporte dental usando HBSS foi desenvolvida e

comercializada com o nome Save-A-Tooth (Save-A-Tooth Inc., Pottstown, PA,

EUA), mas ainda não se encontra disponível em farmácias ou drogarias no

Brasil. Viaspan é um meio conservador usado no transporte de órgãos mas

possui um tempo de validade de somente alguns meses que juntamente com

seu alto custo tornam seu uso raro. Um recipiente chamado Dentosafe® foi

introduzido e distribuído em escolas da Alemanha e Áustria. (TROPE, 2002;

POHL et al., 2005; MARTIN & PILEGGI, 2004; LUSTOSA-PEREIRA et.al.,

2006; ÖZAN et. al., 2007; LIN et al., 2007).

BLOMLOF (1981) estudou diferentes tipos de meios conservantes em

casos de avulsão dentária. As células do ligamento periodontal sobreviveram

bem no leite, 50% das células se apresentaram vitais após 12 horas de

exposição, enquanto nenhuma célula viável foi encontrada após 3 horas de

27

armazenamento em saliva. Breve armazenamento em saliva seguido de

armazenamento em leite foi melhor que o armazenamento somente em saliva.

BLOMLOF et al. (1983) avaliaram as condições periodontais após 8

semanas tendo sido expostos dentes de macacos tratados endodonticamente

ao leite e à saliva por 2 ou 6 horas. Os dentes estocados em leite por 2 e 6

horas e os dentes estocados em saliva por 2 horas mostraram um reparo

periodontal quase tão bom quanto os dentes reimplantados imediatamente. Os

dentes estocados em saliva por 6 horas ou deixados à seco mostraram

extensiva reabsorção por substituição. O leite, portanto, pode ser recomendado

como um meio conservante para dentes avulsionados.

MARINO et al. (2000) avaliaram a capacidade do leite longa vida servir

como solução conservante para dentes avulsionados através da manutenção

da viabilidade de células do ligamento periodontal expostas a este meio. As

células foram colocadas em placas com meio de cultura por 24 horas e depois

o meio foi substituído por leite pasteurizado (refrigerado), leite longa vida ou

Save-A-Tooth. As placas foram incubadas a 37ºC por 1, 2, 4 ou 8 horas. Após

8 horas a viabilidade das células do ligamento periodontal no leite pasteurizado

e no leite longa vida foi significantemente maior que no Save-A-Tooth. Não

houve diferença estatística significante entre os leites. Esses resultados

sugerem que o leite longa vida, que tem a vantagem de não necessitar

refrigeração, é tão efetivo quanto o leite pasteurizado e mais efetivo que o

Save-A-Tooth.

SCHWARTZ et al. (2002) examinaram o efeito da temperatura de alguns

meios de conservação de dentes em períodos variáveis de tempo de

28

acondicionamento sobre o ligamento periodontal e reparo pulpar após

reimplante dentário em macacos. Incisivos laterais inferiores com formação

radicular completa foram extraídos e deixados a seco a 22, 4 e -18º; em

solução salina a 37, 22, 4 e -18º; ou em saliva a 37º por 60 ou 120 minutos

antes do reimplante. Os animais foram sacrificados 8 dias após o reimplante e

os 125 dentes reimplantados foram examinados histometricamente. Os

parâmetros histológicos foram: ligamento periodontal normal, reabsorção de

superfície, reabsorção inflamatória, reabsorção por substituição, profundidade

de bolsa periodontal, mudanças periapicais inflamatórias e extensão da

vitalidade pulpar. Acondicionamento em saliva a 37ºC mostrou quantidade

similar de ligamento periodontal normal comparado à solução salina em 60 e

120 minutos. A solução salina por 60 ou 120 minutos não mostrou diferença na

extensão do ligamento periodontal quando o meio foi comparado a 37, 22 e

4ºC. Entretanto, o meio a -18ºC mostrou significante menos perda de ligamento

periodontal que meios em outras temperaturas. O meio seco por 60 minutos

mostrou significante menor reabsorção dentária a 4ºC quando comparada a

22ºC. O meio seco a -18ºC mostrou significante menor perda de ligamento

periodontal que o meio a 4ºC. O tempo em meio seco de 120 minutos, não

mostrou diferença entre 22,4 e -18ºC. Conclui-se que a temperatura (acima de

0ºC) do meio de conservação é de importância somente para o meio seco e em

situações de curtos períodos de tempo extra-alveolares até 60 minutos e não

120 minutos, quando extensa destruição do ligamento periodontal já ocorreu.

Sugere-se que a temperatura de 4ºC pode resultar em menor evaporação do

ligamento periodontal e menos danos às suas células. A cicatrização pulpar em

29

todos os casos foi limitada à entrada do canal e nenhum padrão foi encontrado

entre o meio de conservação, tempo e temperatura.

MARTIN & PILEGGI (2004) realizaram um ensaio com Colagenase-

Dispase para investigar o potencial de um novo meio de conservação dental , o

Própolis, manter a viabilidade das células do ligamento periodontal em dentes

avulsionados. Setenta dentes recém-extraídos foram divididos em cinco grupos

experimentais e dois grupos controles. Este estudo comparou duas diferentes

concentrações de Própolis (50% e 100%) ao HBSS, soro fisiológico e leite. O

número de células viáveis foi contado com um hemocitômetro e analisado.

Análise estatística mostrou que os grupos do Própolis mantiveram

significativamente mais células do ligamento periodontal viáveis quando

comparados ao leite, soro fisiológico ou HBSS mostrando ser uma melhor

alternativa. O Própolis a 100% não foi significativamente diferente do Própolis a

50%, indicando que a concentração não mostrou diferença na toxicidade para

as células do ligamento periodontal. HBSS, soro fisiológico e leite não foram

significativamente diferentes entre si.

POHL et al. (2005) estudaram a cicatrização após avulsão e reimplante.

Foram avaliados 28 dentes permanentes em 24 pacientes. Logo após a

avulsão, 6 dentes foram colocados em um recipiente contendo um meio de

cultura e denominado Dentosafe® por 1-53 horas e o ligamento periodontal não

estava comprometido, 16 dentes foram deixados em situação não-fisiológica

temporariamente e 6 dentes em condições não-fisiológica por longos períodos.

Em 14 dentes, terapia regenerativa anti-reabsorção (TRA) com aplicação local

de glicocorticóides e derivado da matriz de esmalte e administração sistêmica

30

de doxiciclina foi usada. Em todos os dentes foi realizado tratamento

endodôntico extra-oral com inserção de pino via retrógrada. Os dentes foram

observados por cerca de 31 meses. Observou-se que a influência

predominante na cicatrização foi o acondicionamento fisiológico imediato do

dente avulsionado. Logo, para um bom prognóstico, o dente avulsionado deve

ser acondicionado imediatamente em um meio celular compatível. Estes meios

deveriam ser distribuídos em lugares de riscos de acidentes e o TRA só

apresenta potencial de melhorar o prognóstico quando o ligamento periodontal

não está comprometido.

FAGADE (2005) fez uma revisão de literatura com o objetivo estudar os

vários meios utilizados em transplantes e reimplantes. Entre os meios

propostos na literatura encontram-se: Solução salina balanceada de Hank

(HBSS), plasma do próprio paciente, soro fisiológico, água de torneira, saliva e

leite pasteurizado. Os mais favoráveis foram: HBSS, plasma do próprio

paciente, meio de cultura Eagle, leite pasteurizado e soro fisiológico.

ÖZAN et al. (2007) avaliaram a efetividade do própolis como um meio

conservante temporário para a manutenção da viabilidade das células do

ligamento periodontal em dentes avulsionados. Células do ligamento

periodontal foram obtidas de terceiros molares e cultivadas em DMEM. Os

quatro grupos comparados foram: solução de própolis a 10%, solução de

própolis a 20%, leite longa vida com baixo conteúdo de gordura, solução

balanceada de Hank além da água de torneira como controle negativo e DMEM

como controle positivo. As placas foram incubadas a 37ºC por 1, 3, 6, 12 e 24

horas. Os resultados indicaram que o própolis a 10% em 3, 6, 12 e 24 horas foi

31

significativamente melhor que HBSS e leite. Em 1 hora não houve diferença

significativa entre eles. Em 1 hora o própolis a 20% foi pior que o HBSS ao

contrário de 3 e 6 horas. O própolis a 20% foi significativamente melhor que o

HBSS e o leite. Em 12 e 24 horas, o própolis a 20% foi melhor somente que o

HBSS. Quando as soluções de própolis foram comparadas, não houve

diferença significante em 1, 3 e 6 horas. Em 12 e 24 horas o própolis a 10% foi

significativamente melhor que a 20%. Em geral, o própolis a 10% foi o meio

mais efetivo e se concluiu que o mesmo pode ser recomendado como um meio

adequado para transporte do dente avulsionado.

CHAMORRO et al. (2008) investigaram in vitro o grau de apoptose de

células do ligamento periodontal após diferentes condições de armazenamento.

Células de ligamento periodontal humanas foram colocadas em meio de cultura

em placas durante 24 horas. As células foram depois expostas por uma hora

ao leite, solução salina balanceada de Hank (HBSS), solução Soft Wear para

lentes de contato e Gatorade® à temperatura ambiente ou congeladas. O meio

de cultura foi usado como controle negativo. O grau de apoptose foi avaliado

após 24, 48 e 72 horas do tratamento através de imunoflurescência direta.

Foram contadas o número total de células e o número total de células

apoptóticas. Os resultados indicaram que em 24 e 72 horas, o ligamento

periodontal tratado com Gatorade® e com solução para lentes de contato

mostraram as mais altas porcentagens de células apoptóticas quando

comparados com os outros grupos à temperatura ambiente. Finalmente,

células tratadas congeladas mostraram significativamente mais baixos níveis

de apoptose quando comparadas com tratamentos em temperatura ambiente.

32

Como conclusão, os resultados indicaram que apoptose desempenha o papel

principal na morte celular em células tratadas com Gatorade® e soluções para

lentes de contato em comparação com as outras soluções de armazenamento

e que o armazenamento por congelamento pode inibir a morte programada das

células.

GOPIKRISHNA et al. (2008) investigaram o potencial de um novo meio

de conservação após avulsão dentária, a água de coco, em comparação com o

própolis, solução salina balanceada de Hank (HBSS) e leite na manutenção da

viabilidade das células do ligamento periodontal (PDL). Setenta dentes

humanos recém-extraídos foram divididos em 4 grupos experimentais e 2

grupos controles. Os controles positivo e negativo corresponderam a 0 minutos

e 8 horas de tempo em ambiente à seco. Os dentes dos grupos experimentais

foram estocados secos por 30 minutos e depois imersos em um dos 4 meios

(água de coco, própolis, HBSS e leite). Os dentes foram depois tratados com

dispase grau II e colagenase por 30 minutos. O número de células viáveis do

ligamento periodontal foi contado com um hemocitômetro e analisadas. A

análise estatística mostrou que a água de coco apresentou maior quantidade

significativa de células do ligamento periodontais viáveis comparada com

própolis, HBSS ou leite. A água de coco pode, portanto, ser usada como um

meio conservante de transporte para dentes avulsionados.

3) Reações celulares perante determinadas substâncias

A função da célula normal requer um equilíbrio entre as exigências fisiológicas

e as limitações da estrutura celular e da capacidade metabólica; o resultado é

um estado estável ou homeostasia. As células podem alterar seu estado

33

funcional em resposta a um moderado estresse e manter seu estado estável.

Estresses fisiológicos mais excessivos ou estímulos patológicos adversos

(lesão) resultam em adaptações, lesão reversível ou lesão irreversível e morte

celular. As adaptações ocorrem quando estresses fisiológicos ou patológicos

induzem um novo estado que altera a célula, porém preserva sua viabilidade

em resposta a estímulos externos, como hiperplasia, hipertrofia, atrofia e

metaplasia. A lesão celular reversível denota alterações celulares patológicas

que podem ser restauradas à normalidade se o estímulo for retirado ou se a

causa da lesão não foi grave. A lesão irreversível ocorre quando o estímulo

excede a capacidade da célula se adaptar e denota alterações patológicas

permanentes que causam a morte celular. Existem dois padrões morfológicos e

mecânicos de morte celular: necrose e apoptose (HORTELANO et al., 2001;

AMARANTE-MENDES, 2003; TABAS, 2005; MITCHELL et al., 2006). A

necrose é o tipo de morte celular mais comum, envolve grande edema celular,

desnaturação e coagulação de proteínas, degradação de organelas celulares e

ruptura de células, perda da integridade das membranas plasmáticas,

desorganização citoplasmática e dissolução nuclear. Em geral, um grande

número de células no tecido adjacente é afetado. A apoptose ocorre quando a

célula morre devido à ativação de um programa de “suicídio” controlado

internamente, que envolve um distúrbio orquestrado de componentes celulares;

ocorre uma ruptura mínima do tecido adjacente. Morfologicamente, ocorre a

condensação e a fragmentação da cromatina com degradação do DNA

genômico em fragmentos oligonucleossomais, perda do volume e aumento da

granulosidade celular, manutenção da estrutura das organelas, formação de

34

“pregas” na membrana plasmática e conseqüente fragmentação celular em

corpos apoptóticos. Em diferentes populações celulares, observa-se uma

grande similaridade no fenótipo da apoptose, mesmo em situações fisiológicas

bastante distintas. Este fenótipo é resultante, principalmente, da ação em

cascata de membros de uma família peculiar de cisteíno-aspartato proteases,

denominada Caspases. Estas se dividem em dois grupos, sendo as executoras

responsáveis pela execução do processo em si. Através das Caspases, vão ser

gerados os fragmentos oligonucleossomais característicos da apoptose. As

células podem morrer por apoptose ou mecanismos não-apoptóticos

(HORTELANO et al., 2001; AMARANTE-MENDES, 2003; TABAS, 2005;

MITCHELL et al., 2006). Caso o sinal de estresse seja muito violento, o que

ocorre em geral em situações patológicas, uma dada célula não tem escolha, a

não ser sofrer uma morte necrótica, impossível de ser controlada genética ou

farmacologicamente, e rapidamente perder a integridade de sua membrana

celular, liberando o seu conteúdo citoplasmático e induzindo uma resposta

inflamatória no tecido comprometido. Por outro lado, quando o estresse é mais

ameno, o sinal gerado irá ser analisado pelo conjunto de mitocôndrias, as quais

atuam como um sensor e possuem a responsabilidade de decidir se esta célula

irá continuar a viver ou deverá ser eliminada por mecanismos apoptóticos.

Neste caso, as mitocôndrias sofrem um desacoplamento da cadeia respiratória

o que ocasionará a liberação sobretudo do citocromo c para o citosol, o qual

ativará a cascata de caspases que irão executar o programa de

empacotamento celular conhecido como apoptose. Em certas situações onde

as células apoptóticas não foram eliminadas por fagocitose, pode ocorrer

35

necrose celular chamada necrose secundária ou pós-apoptose. Neste caso, as

membranas das células apoptóticas se rompem com liberação de componentes

intra-celulares, como proteases, que induzem resposta inflamatória e dano

tecidual. Em macrófagos, o fenótipo apoptótico mostra uma seqüência de

alterações em vários parâmetros, como perda de adesão celular e assimetria

da membrana plasmática, desorganização do citoesqueleto e fragmentação

internucleossomal do DNA, juntamente com ativação das caspases.

Propriedades físico-químicas gerais da célula são modificadas durante a

apoptose (HORTELANO et al., 2001; AMARANTE-MENDES, 2003; TABAS,

2005; MITCHELL et al., 2006).

36

PROPOSIÇÃO

O presente trabalho tem como objetivo avaliar quantitativamente e

qualitativamente os efeitos citotóxicos de soluções conservantes, entre elas o

própolis, água de coco, leite de coco, HBSS, solução fisiológica com

antibióticos e leite, utilizadas em casos de avulsão dentária através da

observação microscópica de alterações celulares sofridas em macrófagos.

37

MATERIAIS E MÉTODOS

1) Preparo do meio de cultura

O presente trabalho foi realizado no laboratório de toxicologia da

Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Foram utilizados macrófagos

obtidos de ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus). Os animais utilizados neste

trabalho foram obtidos da empresa Biocampo 2000 Produtos Biológicos Ltda

(Bom Jardim, Rio de Janeiro). Primeiramente foi realizado o preparo do meio

mínimo essencial de Eagle (MEM) cujo pH é 7. Foram pesados 9,60 g de MEM

(GIBCO 145000-083) e colocado em um copo de Erlenmeyer. Foi colocada

água desmineralizada até completar 900 mL. Dissolveu-se com uma barra e

um agitador magnético. Ajustou-se o pH com bicarbonato de sódio e o volume

até 100 mL com água destilada. Foi realizada filtração positiva do meio Eagle

através de membrana estéril de porosidade 0,22 µm. Foram pesados 100 mg

de penicilina G benzatina e 100 mg de sulfato de estreptomicina. Obteve-se no

final 121 mg/l de penicilina e 230 mg/l de estreptomicina (ambos da marca

comercial Sigma-Aldrich, St Louis, USA). Os antibióticos foram adicionados ao

meio de cultura como medida adicional de segurança, de modo a evitar

eventuais contaminações. Foi utilizada uma concentração de 1 ml do antibiótico

para cada 50 ml do meio (concentração de 50 vezes).

2) Obtenção de macrófagos

Após a obtenção do meio de cultura, os animais foram sacrificados por

inalação de vapores de clorofórmio. Após a morte dos animais, foi realizada a

aplicação do meio de cultura no peritônio dos ratos. O edema obtido através

desta manobra atrai macrófagos. Os macrófagos foram aspirados com seringa

38

e transferidos para tubos cônicos estéreis com meio de cultura. Estes tubos

foram condicionados em gelo. Alíquotas do conteúdo foram transferidas para

uma lâmina para observação das células. Para a análise microscópica, foi

usada a lâmina de Neubauer. A contagem foi realizada através de um

hemocitômetro. Ao final obteve-se 25 ml de solução com macrófagos. Foram

observadas 0,8 x 105 células/ml. Foram obtidas 2 x 107 células dos ratos em 5

minutos. Foi adicionado soro fetal bovino a 20%, que contém adesinas que

facilitam a adesão dos macrófagos na placa. Foram colocadas alíquotas do

meio de cultura contendo os macrófagos nos poços das placas para cultivo. As

placas foram colocadas em um dessecador com ambiente de CO2 (água

destilada, bicarbonato de sódio (Na2HCO3) e ácido sulfúrico) criando um

ambiente de anaerobiose. O dessecador (Sciencor® Scientific, São Paulo,

Brasil) foi deixado em estufa a 37ºC. Foram utilizadas 3 microplacas de teste

para cultura celular com 6 orifícios (Zellkultur Testplatte da Biochrom AG,

Berlim, Alemanha).

3) Procedimento experimental

Em uma segunda etapa, partimos para a exposição dos macrófagos aos

meios conservantes utilizados quando da avulsão dentária. Os meios

conservantes utilizados foram: água de coco (1), leite (2), HBSS (3), leite de

coco (4), própolis (5), solução fisiológica contendo antibióticos (6), controle

positivo usou-se o meio de cultura com soro fetal bovino, controle negativo

usou-se o meio de cultura contendo Antimicina A (substância letal).

A água de coco foi obtida de coco fresco quebrando-o com facão. O leite

utilizado no experimento foi da marca Elegê desnatado (Eleva Alimentos S/A,

39

Rio Grande do Sul, Brasil). Como conservante 3 foi empregada a solução

salina balanceada de Hank. O conservante 4 foi o leite de coco comercial(Bom

Coco, Rio de Janeiro, Brasil). O conservante 5 foi o própolis spray (Makrovit,

Rio de Janeiro, Brasil). O conservante 6 consistiu de 10 ml de PBS estéril

(solução salina tamponada) juntamente com 0,2 ml do meio contendo

antibiótico (100 mg de penicilina G benzatina e 100 mg de sulfato de

estreptomicina, ambos da marca comercial Sigma-Aldrich, St Louis, USA). Para

o controle negativo, foi utilizada a Antimicina A (Sigma-Aldrich, St Louis, USA)

que atua inibindo a oxidação celular, inibe o citocromo (complexo I, NADH

desidrogenase) e portanto não há produção de ATP na respiração mitocondrial

dos macrófagos, causando a morte celular. A dose tóxica da Antimicina A

(C20H40N2O4) é de 2 µg/ml e a dose letal é 200DL50.

As placas tiveram seus meios recolhidos e colocados em tubos de

ensaio e os conservantes colocados nos poços numerados de 1 a 6 na própria

placa respectivamente com os seus números pré-estabelecidos. Estas placas

foram numeradas de 1 a 3 na parte superior e de 4 a 6 na parte inferior. Uma

destas placas foi colocada por 30 minutos e a outra por 60 minutos no

dessecador e deixada na estufa a 37ºC. A terceira placa continha os controles

que foram colocados em 3 poços cada um e deixados por 120 minutos.

Passados os tempos respectivos de 30, 60 e 120 minutos, os conservantes

foram recolhidos e as placas lavadas com PBS rapidamente. O Azul de Tripan

(SP Labor, São Paulo, Brasil) a 0,5%, foi adicionado em todos os poços e

deixado por 1 minuto. Os poços foram lavados com água e posteriormente foi

adicionado Metanol (Lab House, Belo Horizonte, Brasil) e Panótico (Lab

40

House, Belo Horizonte, Brasil) para fixar o corante. Após coradas e fixadas, as

placas foram observadas ao microscópio. Como avaliação foi considerada que

células pouco coradas ou mais claras apresentaram-se vivas e as mais

coradas ou bem azuladas estavam mortas.

41

RESULTADOS

No presente trabalho foi possível obter resultados que permitiram uma

análise quantitativa e qualitativa. Quantitativamente obteve-se uma

determinada porcentagem de células vivas em cada poço da placa a ser

submetido a cada solução. Estes valores foram submetidos ao teste estatístico

não paramétrico Kruskal-Wallis. Após esta análise foi feita uma observação

qualitativa através das imagens obtidas ao microscópio óptico que possibilitou

a observação das alterações celulares de forma direta.

Primeiramente foram observados os 6 poços da placa de 30 minutos.

Observou-se que no intervalo de 30 minutos o poço contendo água de coco

apresentou 17% de células vivas; o poço contendo leite apresentou 69% de

células vivas; o poço contendo a solução de Hank (HBSS) apresentou 40% de

células vivas; o poço contendo leite de coco apresentou 93% de células vivas;

o poço contendo o própolis apresentou 71% de células vivas; e o poço

contendo solução salina com antibióticos apresentou 83% de células vivas

(tabela 1).

Nos primeiros 30 minutos, pôde-se observar que a água de coco

apresentou um resultado insatisfatório com grande número de células mortas,

mostrou características de apoptose, fragmentação de DNA através da

fragmentação nuclear que induz a morte natural (figura 1). O leite preservou a

conformação celular dos macrófagos que se apresentaram intactos e bem

visíveis com uma porcentagem de células vitais razoáveis. A solução de Hank

(HBSS) proporcionou uma quantidade mediana de células vitais. O leite de

coco apresentou um resultado surpreendente, com 93% das células vitais e

42

com conformação celular adequada. O própolis nos primeiros 30 minutos

apresentou quantidade considerável de células vitais e arquitetura celular

adequada com a normalidade (figura 2). A solução salina contendo antibióticos

apresentou nos primeiros 30 minutos uma grande quantidade de células vitais.

Logo após, foram observados os 6 poços da placa de 60 minutos.

Observou-se que em 60 minutos o poço contendo água de coco apresentou-se

com 34% de células vivas (aumento da amostra em relação aos 30 minutos

provavelmente obtido pelo campo de visualização diferenciado), O poço

contendo leite se apresentou com 64% das células vitais, o poço contendo

HBSS com 37% das células vitais, o poço contendo leite de coco com 90% das

células vitais, o própolis com 37% das células vitais e a solução fisiológica com

antibióticos com 46% das células vitais (tabela 1).

Após 60 minutos, pôde-se observar que a água de coco continuou

apresentando resultado insatisfatório, com apoptose, degeneração celular e

fragmentação de DNA (figura 7). O leite gerou uma pequena diminuição na

quantidade de células (macrófagos) vivas, mas não houve uma alteração

considerável, o padrão celular permaneceu dentro da normalidade. O HBSS

gerou também pequena diminuição na quantidade de células vivas, mas

manteve as mesmas características dos 60 minutos. O leite de coco se

manteve ainda com alta porcentagem de células vivas (90%) e surpreendente

manutenção das características celulares (figuras 8 e 9). O própolis e a solução

fisiológica com antibióticos demonstraram uma queda muito grande na

porcentagem de células vivas o que os torna de pouca utilidade após 60

minutos de exposição (figuras 10, 11, 12 e 13).

43

Tabela 1- Efeito dos diversos conservantes em macrófagos. Porcentagem de

células vitais após cada exposição.

Meios conservantes 30 min 60 min

_____________________________________________________________________

Controle positivo (soro fetalbovino) 100% 100% Água de coco 17% 34% Leite 69% 64% HBSS 40% 37% Leite de coco 93% 90% Própolis 71% 37% Soro fisiológico e antibióticos 83% 46% Controle negativo (Antimicina A) 0% 0%

A análise estatística mostrou diferença estatística significativa (p<0,05)

somente entre o controle positivo e a água de coco tanto após 30 minutos

quanto após 60 minutos e entre a água de coco e o leite de coco após 30

minutos. Entre os demais intervalos de tempo e as demais substâncias não

houve diferença estatística significativa.

44

viabilidade celular diante de soluções conservantes

0

20

40

60

80

100

120

1 2

tempo

célu

las

viva

s

Série1Série2Série3Série4Série5Série6Série7Série8

Figura 1: Análise gráfica da viabilidade celular diante de soluções conservantes. Séries: 1- Água de coco; 2- Leite; 3- HBSS; 4- Leite de coco; 5- Própolis; 6- Solução salina com antibióticos; 7- Controle positivo; 8- Controle negativo. Intervalo de tempo 1- 30 minutos e 2- 60 minutos.

Figura 2: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água de coco durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observam-se células mortas, degeneradas, presença de corpos apoptóticos. A coloração azul indica a morte celular. Nikon, aumento de 400 x.

45

Figura 3: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com Própolis durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observam-se células vivas. Nikon, aumento de 400 x.

Figura 4: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com Própolis durante 30 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observam-se células vivas juntamente com células degeneradas. O Própolis acarretou o aumento da célula por provável aumento da permeabilidade da membrana celular. Nikon, aumento de 400x.

46

Figura 5: Controle negativo. Observa-se que todas as células apresentam-se mortas. Nikon, aumento de 100x.

Figura 6: Controle positivo. Observam-se que todas as células apresentam-se vivas. Nikon, aumento de 100x.

47

Figura 7: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com água de coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observa-se apoptose. Nikon, aumento de 400x.

Figura 8: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite de coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observa-se a presença de monócito. Nikon, aumento de 400x.

48

Figura 9: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com leite de coco durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observa-se célula intacta com boa aparência, monócito com morfologia adequada, com núcleo em forma de rim. Nikon, aumento de 400x.

Figura 10: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observa-se necrose, células degeneradas, observa-se apoptose com fragmentação nuclear. Nikon, aumento de 400x.

49

Figura 11: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observa-se alteração citoplasmática; núcleo começando a se fragmentar; apoptose. Nikon, aumento de 400x.

Figura 12: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com Própolis durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Pode-se perceber necrose da célula. Ocorrem cicatrizes na célula, o que causa necrose. A necrose estimula o processo inflamatório. Nikon, aumento de 400x.

50

Figura 13: Fotomicrografia de macrófagos de ratos Wistar tratados com solução fisiológica durante 60 minutos e submetidos ao ensaio de sobrevida frente ao Azul de Trypan. Observa-se necrose celular e apoptose; figuras de apoptose (superior esquerdo); estágios diversos de apoptose; estágio avançado (inferior esquerdo). Nikon, aumento de 400x.

51

DISCUSSÃO

No presente estudo foram avaliadas quanto à capacidade de

manutenção da viabilidade celular de macrófagos, seis soluções (água de

coco, leite, HBSS, leite de coco, própolis e solução fisiológica contendo

antibióticos) utilizadas como conservantes após avulsão dentária.

SIM et al. ( 2008) descreveram que a água de coco contém elevados

níveis de ribosídeos zeatínicos capazes de expressar atividade proteolítica

possivelmente relacionada com a esterilidade da mesma. GOPIKRISHNA et al.

(2008) relataram que a água de coco é biologicamente pura e estéril, com rica

presença de aminoácidos, proteínas, vitaminas e minerais e a análise

estatística do trabalho mostrou que a água de coco foi capaz de manter

significativamente mais células do ligamento periodontal viáveis quando

comparado com o própolis, HBSS e leite e que a água de coco pode ser usada

como um meio de transporte adequado para dentes avulsionados. No presente

estudo experimental, entretanto, encontrou-se uma pequena quantidade de

células viáveis quando expostas à solução de água de coco. Nos tempos de 30

e 60 minutos, a quantidade de células viáveis encontradas não foi maior que

34% das amostras dos poços. Houve grande ocorrência de células mortas,

degeneradas e presença de corpos apoptóticos indicando a indução de

apoptose pela água de coco em macrófagos. Este fato contra-indicaria a água

de coco como meio de transporte para dentes avulsionados como descrito por

GOPKRISHNA et al. (2008). Quanto ao fato da água de coco ser

biologicamente pura e estéril, isto poderia ser especulado. Durante sua

manipulação, a água de coco pode ser facilmente contaminada e como descrito

52

por PRABAKARAN et al. (2008) é um meio de fácil proliferação de Bacillus

thuringiensis var. israelensis bem como apresenta uma excelente condição

biológica para o desenvolvimento de outros tipos de microorganismos

contaminantes.

Em outro estudo, ABARA et al. (2007) descreveram o efeito protetor

hepático da água de coco mostrando que a ingestão de leite de coco e água de

coco aumentaram os valores das taxas de proteína e proteína/RNA e um

decréscimo de atividade da alanina e aspartato amino transferase (ALT e AST).

Estes efeitos aumentaram a indução do metabolismo de enzimas resultando

em aumento de depuração e eliminação de cafeína pelo corpo reduzindo o

efeito tóxico no fígado. Em adição, ISMAIL et al. (2007), demonstraram que a

ingestão de água de coco otimizou um melhor equilíbrio hidro-eletrolítico em

comparação com as demais bebidas comerciais. Possivelmente o efeito

depurador poderia estar relacionado com a estimulação das células de Kupffer,

as quais poderiam expressar uma maior produção de óxido nítrico e de

proteína quimiotáxica de monócitos. De acordo com a análise dos resultados

encontrados no presente trabalho, os níveis de apoptose observados parecem

estar relacionados com o aumento da atividade depurativa conforme,

SANDHYA & RAJAMAHAN (2006), descreveram um aumento das taxas de

conversão de colesterol em ácidos biliares e aumento da excreção destes

ácidos e esteróis neutros observados em ratos tratados com água de coco, a

partir de estudos histopatológicos, que revelaram menor acúmulo de gordura

nos tecidos avaliados. Eles observaram que o tratamento com água de coco

resultou em aumento plasmático de L-arginina, nos níveis urinários de nitrito e

53

na atividade da oxido-nítrico sintase. Estes resultados indicam os efeitos

benéficos da água de coco analisando os níveis séricos e os parâmetros

lipídicos tissulares. Conforme sugerido por SOMERS et al. (2008), a

calcineurina está relacionada com a produção da óxido-nítrico sintase induzida,

sabendo-se que a água de coco induz o aumento da síntese protéica e da

taxas proteína/RNA, este fato poderia estar relacionado com o aumento da

atividade da óxido-nítrico sintase juntamente com o nível de L-arginina, que

potencialmente poderiam ser mecanismos considerados responsáveis pelo

efeito apoptótico nos macrófagos isolados conforme observado em nosso

estudo in vitro. HAN et al. (2008) sugerem que o aumento na síntese de óxido-

nítrico sintase induzida seja um fator indutor de apoptose. De acordo com

BHUSHAN et al. (2007), o triterpenediol (TPD), isolado de Boswellia serrata

induz a um aumento de espécies reativas de oxigênio bem como de óxido

nítrico tanto pela sinalização de cascata extrínseca e intrínseca. NAKAMURA et

al. (2008) relataram que lipopolissacarídeos (LPS) isolados de raízes de

algumas plantas estudadas, de acordo com a concentração dependente,

expressaram potente efeito inibidor na expressão de óxido-nítrico sintase.

Poderia se sugerir que o efeito apoptótico relacionado com a água de coco

seria resultado do balanço de TPD/LPS em relação à expressão da óxido-

nítrico sintase nos macrófagos estudados.

Quanto ao própolis, HUANG et al. (2007) descreveram que o isolamento

e caracterização da propolina G do própolis Taiwanês demonstrou pela

primeira vez que este componente é um potente indutor de apoptose em

células cancerígenas do cérebro e que este componente e seu extrato

54

mostraram um efeito protetor contra estresse oxidativo em neurônios corticais

de rato. Complementando, INOKUSHI et al. (2006) descreveram que o própolis

brasileiro possui um efeito neuroprotetor contra dano à retina in vitro e in vivo, e

que a inibição do estresse oxidativo induzido pelo própolis pode ser

parcialmente responsável por estes efeitos neuroprotetores.

O própolis é uma substância resinosa usada pelas abelhas para reparo e

manutenção de suas colméias. Ele possui mais de 180 componentes incluindo

flavanóides, ácidos fenólicos e seus ésteres que apresentam efeitos anti-

inflamatórios, antibacterianos, antivirais, imuno-modulatórios, antioxidantes e

antiproliferativos. O própolis mostrou inibir a divisão celular e a síntese de

proteína, entretanto, o exato mecanismo por trás do efeito anti-tumoral não está

claramente descrito. De acordo com GUNDUZ et al. (2005) o efeito apoptótico

do própolis poderia estar relacionado com a inibição da expressão de

telomerases. HERNANDEZ et al. (2007) sugeriram que amostras de própolis

apresentaram uma forte atividade anti-proliferativa em células cancerígenas.

De acordo com CHEN et al. (2004a) o própolis é rico em propolinas A, B, C, D,

E e F, as quais foram capazes de induzir apoptose em células humanas com

fenótipo de melanoma; este efeito estaria relacionado com os elevados níveis

de propolinas.

CHEN et al. (2004b) demonstraram que duas prenilflavononas, a

propolina A e B induziram apoptose em células melanômicas humanas bem

como significante inibição da atividade da xantina oxidase. O isolamento e a

caracterização da propolina C do própolis de abelha permitiu se avaliar que

este composto é um excelente indutor de apoptose em células melanômicas

55

humanas. ONCAG et al. (2006) revelaram que o própolis apresenta uma

excelente atividade antibacteriana, sugerindo que o mesmo possa ser usado

como medicação intra-canal alternativa.

SABIR et al. (2005) sugeriram que o capeamento pulpar direto com

flavonóides do própolis em ratos podem retardar a inflamação pulpar e

estimular a formação de dentina reparadora.

De acordo com HAYACIBARA et al. (2005) os componentes

cariostáticos do própolis tipo 3 e 12 são apolares e H-fr é a fração de escolha

para identificar novos agentes anti-cariogênicos.

BOTUSHANOV et al. (2001) descreveram que o própolis é uma

substância produzida pelas abelhas com pronunciado efeito anti-inflamatório. É

um ingrediente para muitas drogas e adicionado às pastas de dente como um

componente profilático para doenças periodontais onde estas pastas de dentes

mostraram uma excelente remoção de placa, efeito inibidor e anti-inflamatório

da placa. Artepillina C possui atividade antibacteriana e quando aplicada em

células tumorais malignas de humanos e camundongos in vitro e in vivo,

artepillina C exibiu um efeito citotóxico e o crescimento das células tumorais foi

claramente inibido. Os efeitos citotóxicos da artepillina C foram mais

documentados em carcinomas e melanomas. Apoptose, paralização de

mitoses e necrose foram identificadas através de observação histológica após

injeção intra-tumoral de artepillina C. Foi indicado por KIMOTO et al. (1998)

que a artepillina C ativou o sistema imune e possui direta atividade anti-

tumoral. Ela é um ingrediente ativo do própolis brasileiro e quando aplicada às

células leucêmicas humanas in vitro exibiu potente efeito citotóxico e induziu

56

marcados níveis de apoptose em todas as células. Os maiores efeitos

ocorreram nas células T. Houve indução nas células de formação de corpos

apoptóticos e fragmentação do DNA. A síntese de DNA nas células leucêmicas

foi claramente inibida e a desintegração celular foi confirmada

microscopicamente. Os resultados sugerem que artepellina C, um ingrediente

ativo do própolis brasileiro apresenta efeitos anti-leucêmicos.

Pinocenbrim é o flavonóide mais abundante no própolis e tem sido

comprovado apresentar propriedades anti-oxidantes, anti-bacterianas e anti-

inflamatórias. De acordo com GAO et al. (2008), Pinocembrim poderia também

regular a expressão de protína p53 e inibir a liberação do citocromo c da

mitocôndria para o citosol.

AVCI et al. (2007) verificaram os efeitos apoptóticos e citotóxico do

CAPE (caffeic acid phenethyl ester). CHEN et al. (2007) sugeriram que

propolina A e propolina B podem ativar apoptose mitocôndria-mediada, sendo

potentes anti-oxidantes.

MISHIMA et al. (2005) documentaram que extrato de própolis brasileiro

inibiu o crescimento de células leucêmicas humanas, o que foi em parte

atribuído à indução de apoptose associada à diferenciação granulocítica.

GOPIKRISHNA et al. (2008) demonstraram uma grande quantidade de

células do ligamento periodontal viáveis após exposição ao própolis por 30

minutos. No presente trabalho apesar da análise quantitativa no mesmo

intervalo de tempo nos indicar resultados semelhantes, a análise qualitativa já

indica ocorrência de apoptose.

57

ÖZAN et al. (2007) testaram a capacidade do própolis na manutenção

da vitalidade das células do ligamento periodontal em diferentes intervalos de

tempo encontrando uma alta taxa de células viáveis até 3 horas após

exposição o que não condiz com o presente trabalho.

MARTIN & PILEGGI (2004) demonstraram uma significante maior

capacidade de manutenção da viabilidade das células do ligamento periodontal

quando expostas ao própolis ao se comparar com leite, solução salina ou

HBSS tendo sido o tempo de exposição de 45 minutos.

No presente trabalho, embora inicialmente (nos primeiros 30 minutos), a

análise quantitativa de apoptose não tenha sido significativa, a análise

morfológica qualitativa indica a capacidade do própolis induzir apoptose em

macrófagos. Após 60 minutos a quantidade de células mortas como

conseqüência da apoptose aumentou drasticamente.

Quanto ao leite, ele é aceito pela Associação Americana de

Endodontistas (1995) como meio de transporte para dentes avulsionados.

ÖZAN et al. (2007) concordam com trabalhos anteriores que indicam o

leite como meio adequado de manutenção da viabilidade das células do

ligamento periodontal, sendo indicado o leite com baixo teor de gordura.

MARTIN & PILEGGI (2004) obtiveram resultados semelhantes a

trabalhos anteriores com o leite como meio de transporte para dentes

avulsionados, não apresentando diferença estatística significante com relação

ao HBSS.

MARINO et al. (2000) demonstraram que o leite longa vida, que tem a

vantagem de não requerer refrigeração, é tão efetivo quanto o leite

58

pasteurizado e mais efetivo que o meio Save-A-Tooth como meio de transporte

de dentes avulsionados na manutenção da viabilidade das células do ligamento

periodontal. Em estudo semelhante, PEARSON et al. (2003) comparando

alguns tipos comerciais e diferentes formulações de leite quanto à capacidade

de manutenção da viabilidade das células do ligamento periodontal, concluíram

que o Enfamil, uma formulação para bebês rica em suplementos, se mostrou

mais efetivo que as demais formulações pelo menos após 4 horas de

exposição.

BLOMLOF et al. (1980) demonstraram que o leite é capaz de promover

melhor conservação do ligamento periodontal que a saliva ou a solução salina

em macacos. Novamente BLOMLOF (1981) demonstrou que as células do

ligamento periodontal em humanos sobreviveram adequadamente em leite,

com 50% das células vitais após 12 horas de armazenamento e a combinação

de breve armazenamento em saliva e subseqüente armazenamento em leite,

foi melhor que somente em saliva. BLOMLOF et al. (1983) demonstraram que

após exposição do ligamento periodontal ao leite por 2 ou 6 horas este sofreu

um adequado reparo semelhante aos que foram submetidos ao reimplante

imediato. RAM & COHENCA (2003) atentam para o fato do leite ser um meio

recomendado e fácil de ser achado em qualquer local.

No presente trabalho, o grupo tratado com o leite apresentou uma

quantidade significativa de células vitais em 30 minutos e este resultado se

manteve após 60 minutos o que indica que o leite é um meio estável na

manutenção da vitalidade celular com uma variação de tempo de exposição,

além disso, a conformação celular se apresentou adequada de um modo geral.

59

Quanto à solução salina (ou soro fisiológico), RAM & COHENCA (2003)

indicam que esta seria a terceira opção após a solução salina balanceada de

Hank (HBSS) e o leite, mas não é tão facilmente encontrado como o leite. De

acordo com MARTIN & PILEGGI (2004) a solução salina demonstrou piores

resultados que o própolis.

De acordo com TANOMARU et al. (2003) a solução salina não interferiu

na atividade inflamatória demonstrando que não houve indução de apoptose,

diferentemente do observado no presente estudo.

Quanto à solução salina balanceada de Hank (HBSS), KHADEMI et al.

(2008) demonstraram que tanto o ovo quanto o HBSS apresentaram melhores

resultados na manutenção das células do ligamento periodontal que o leite e a

água, o que diferiu do presente trabalho pois a quantidade de macrófagos vitais

foi maior após exposição ao leite que ao HBSS tanto após 30 quanto após 60

minutos.

Quanto ao leite de coco, de acordo com NNELI & WOYIKE (2008), foi

relatado que o leite de coco exerceu um efeito citoprotetor maior em

comparação com a água de coco, em nível de mucosa gástrica de ratos, em

nosso estudo, pudemos observar que, de fato, o grupo de células tratado com

o extrato de leite de coco apresentou uma maior viabilidade ao longo dos

diferentes tempos de tratamento quando comparado com o grupo tratado com

a água de coco.

De acordo com PRYARDARSHANI & CHANDRIKA (2007), o leite de

coco apresenta carotenóides, os quais exibem efeito anti-oxidante e exercem

uma possível atividade anti-apoptótica.

60

CONCLUSÕES

De acordo com a metodologia empregada neste trabalho, podemos

sugerir, com base nos resultados obtidos, que com relação à análise

quantitativa, houve diferença significante somente entre o grupo controle

positivo e o grupo de células expostas à água de coco tanto após 30 como

após 60 minutos e entre o grupo de células expostas à água de coco e ao leite

de coco após 30 minutos. Com relação à análise qualitativa, o grupo de células

exposto à água de coco apresentou apoptose e grande quantidade de células

mortas; o grupo de células expostas ao própolis e à solução fisiológica com

antibióticos apresentaram uma grande quantidade de células com vitalidade

nos primeiros 30 minutos porém em 60 minutos demonstraram um grande

declínio na quantidade de células vitais, o que as torna de pouca utilidade nos

casos que necessitam de períodos mais longos de conservação; o leite embora

tenha mantido menor quantidade de células vitais que as duas últimas

soluções, em 60 minutos manteve os mesmos padrões, se mostrando mais

estável. O grupo exposto à solução salina balanceada de Hank apresentou

níveis baixos de células vitais em ambos os intervalos e o leite de coco foi a

melhor solução em 30 e 60 minutos tanto na manutenção da vitalidade celular

quanto na manutenção da conformação celular.

61

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