Enzimas (Parte II) Bioquímica para Enfermagem Prof. Dr. Didier Salmon MSc. Daniel Lima.
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Enzimas (Parte II)Bioquímica para Enfermagem
Prof. Dr. Didier SalmonMSc. Daniel Lima
Cinética Enzimática• Estudo da velocidade da reação e dos fatores que a influenciam• Pode ser medido por:
– Quantidade de produto formado por unidade de tempo– Quantidade de substrato consumido por unidade de tempo
V = -ΔS/Δt = ΔP/Δt
Cinética Enzimática
Cinética Enzimática
2[S][S]
3[S]4[S]5[S]
tempo
[pro
duto
]
[S]Ve
loci
dade
da
reaç
ão
V0 e Vmáx
• V0 sobe linearmente a medida que se aumenta a concentração de substrato, e então começa a se nivelar e se aproximar de um ponto máximo onde a velocidade não aumenta, mesmo em concentrações maiores de substrato.
Velocidade da reação é proporcional a S Substrato satura todas
as moléculas de enzima
V0 e Vmáx
• Após curto tempo - estabilidade dinâmica com relação a [E] e [ES] é alcançado
E + ES E + PK1
K -1
K2
K -2
Hipótese: etapa limitante
Substrato Único
S
Substrato Único• Estado estacionário - [ES] constante
– Ou seja: formação do complexo = sua degradação• V0 é determinado pela quebra de ES formando o produto
– V0 = k2[ES]
• [ES] difícil de determinar. Alternativa! [Et]=[E] + [ES]
• As velocidades de formação e quebra de ES são determinadas pelas etapas governadas pelas constantes k1 (formação) e k-1 + k2 (quebra em reagentes e produtos)– V de Formação de ES = K1 [E] [S]– V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]
Substrato Único• Uma vez que a degradação de ES é igual a sua formação, temos:
– k1 ([Et]-[ES]) [S] = k–1[ES] + k2 [ES], ou seja:– k1[S][Et] - k1[S][ES] = (k–1+ k2) [ES]
– Dessa forma: [ES] = [Et][S] [S] + (k-1 + k2)/k1
• Se V0=k2[ES]– V0 = k2. [Et] [S]
[S] + Km
[Et]=[E] + [ES]
Km
Equação de Michaelis-Menten• Na Vmax, [ES] = [Et], assim:
– Vmax = k2[Et]– Substituindo na equação anterior
V0 = k2. [Et] [S] [S] + Km
temos,
V0 = Vmax [S] [S] + Km
Propriedade Importante• Quando V0 = Vmax, temos: 2
Vmax = Vmax [S] , 2 [S] + Km
Km + [S] = 2 [S],Km = 2 [S] – [S]Km = [S]
• Ou seja, o Km é igual a concentração do substrato quando a velocidade inicial é metade da velocidade máxima
Km = [S]
Km
• Característico de cada enzima.• Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato.
Equação de Lineweaver-Burk
V e [Enzima]
• A velocidade da reação é proporcional à concentração da enzima
• Facilita a determinação da concentração de uma enzima
• Dosagens (transaminases, LDH, amilase, fosfatase alcalina) v0
[E]
Mais de um substrato...• Ex: ATP + d-glicose → ADP + d-glicose-6-fosfato
Mais de um substrato...• Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou
grupos funcionais de um substrato para o outro:Sequencial (formação do complexo ternário)
Pingue-pongue ou duplo deslocamento
Inibidores• A atividade das enzimas pode ser diminuída ou parada por várias
substâncias chamadas de inibidores.
• Existem inibidores naturais, fazendo parte dos constituintes da célula, e outros estranhos ao organismo que podem provocar alterações do metabolismo celular.
• Aqueles encontrados nas células são fundamentais para a fisiologia pois
permitem às células um controle preciso da velocidade de algumas reações chave, permitindo uma resposta integrada à mudança das condições fisiológicas.
• Inhibição específica de certas enzimas permita as aplicações farmacológicas – Ex: sulfonamidas: usadas para combater as infecções bacterianas
Sulfonamidas• Inibidores competitivos da diidropteroato sintetase (dhps), enzima
importante envolvida no metabolismo dos folatos (síntese de DNA e RNA) de muitos organismos menos o homem.
• Os folatos nos serem humanos são fornecidos pela dieta.
• Toxicidade seletiva para bactérias.
• Utilizados para tratar:– Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii) IO em pacientes HIV + – Infecção do trato urinário– Shigelose (Desinteria)– Algumas infecções por protozoários (Plasmodium falciparum)
Inibidores• Largo campo de aplicação para o combate de insetos
• Ex: enzimas digestivas de insetos como as α-amilases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas α-1,4 do amido, glicogênio e outros carboidratos. Essas enzimas são muito importantes para os insetos, especialmente para aqueles que se desenvolvem em grãos ricos em amido. (No feijão foram identificados 4 desses inibidores)
• Desenvolvimento de plantas mais resistentes ao ataque das pragas contribuindo para a redução do uso de inseticidas químicos.
Inibidores• Importância:
– Agentes farmacêuticos– Ferramentas no estudo de mecanismo de funcionamento das enzimas– Ferramenta nos estudos das vias metabólicas
Inibidores
Reversíveis
Irreversíveis Inib. Competitiva (freqüente)
Inib. Acompetitiva (quando o inibidor liga-se ao complexo ES , mas não a enzima livre)
Inib. Mista
Inib. Não-competitiva (caso particular de inib. Mista)
Inibidor Irreversível• 1-Reagentes específicos para grupo (R) • 2- Análogos de substrato • 3- Inibidor suicida
1
2
Inibidores Reversíveis
Semelhança estrutural entre S e I
Não há semelhança estrutural entre S e I
Não há semelhança estrutural entre S e I
• Inibidor competitivo – Estrutura
semelhante à do substrato
– Liga-se ao Sítio Ativo da enzima
– Aumento da [substrato] diminui a inibição
– A Vmax NÃO se altera
– Km da enzima AUMENTA na presença do inibidor
• Inibidor não competitivo – Não tem estrutura
semelhante à do substrato
– Não se liga ao Sítio Ativo da enzima
– Aumento da [substrato] não diminui a inibição
– A Vmax diminui na presença do inibidor altera
– Km da enzima não se altera
Inibição CompetitivaSubstrato (mM) V0 (sem inibidor)
mmol.L-1.min-1 V0 (com inibidor)
mmol.L-1.min-1 0.2 5 3 0.4 7.5 5 0.8 10.0 7.5 1.0 10.7 8.3 2.0 12.5 10.7 4.0 13.6 12.5 6.0 13.5 13.5
0 1 2 3 4 5 6 70
5
10
15
Sem inibidor
Com inibidor
Substrato (mM)
V 0(m
ol.L
-1.m
in-1
)
Inibição Competitiva Inibição Não-Competitiva
Inibição Incompetitiva• O inibidor se liga somente no complexo ES, em sítio próprio
Analgésicos – Inibidores de Prostaglandinas
• Ligação covalente– Inibidor irreversível (suicida) - Aspirina
• Interações sem ligação covalente – Inibidor competitivo e reversível – Ponstan
Regulação de perfusão renalAgregação plaquetáriaProtetora de mucosa gástrica
Inflamação
Inibidor competitivo e reversível da COX-1/2 Interação iônica
Dipirona sódica
Inibidor competitivo e reversível da COX-2
Meloxicam
Inibidores de Proteases do HIV• Gag e Pol são clivados pela protease do HIV em 9 pontos específicos para
produzir proteínas funcionais. – O precursor Gag vai originar proteínas estruturais– O precursor Pol vai originar enzimas como transcriptase reversa,
integrase e proteases.
Amprenavir
Ciclo de replicação do HIV
Sistema multienzimático sequencial
Enzimas Alostéricas
Enzimas Alostéricas• Analogia com proteínas alostéricas: Hemoglobina• Moduladores alostéricos (≠ de inibidores não-competitivos ou mistos!!)• Mudanças conformacionais entre forma ativa e inativa e parâmetros
cinéticos diferentes (≠ do Michaelis-Menten)
• Homotrópicas ou heterotrópicas
Enzimas Alostéricas• Reguladas por moduladores
alostéricos → envolvendo ou não o sítio ativo
• Várias subunidades • Inibição por retroalimentação
• Exemplo: Aspartato transcarbamilase• 12 cadeias polipeptídicas
• Azul: catalítica• Vermelho/Amarela:
regulatórias
Aspartato TranscarbamilaseSíntese de pirimidinas
Modulador Alostérico• Pode ser tanto um inibidor quanto um ativador.
Michaelis-Menten
Enzimas AlostéricasEnzima Homotrópica
Efeito moduladores
Efeito moduladores
Exemplos de Enzimas RegulatóriasPFK-1
Modificação Covalente Reversível
Exemplos de Enzimas RegulatóriasGlicogênio Fosforilase
Ativação Proteolítica
Fatores que afetam a Velocidade Enzimática
pH
Temperatura
Concentração de substratos
Concentração de cofatores
Presença de Inibidores e/ou ativadores
Modificações químicas: fosforilações, adenilações, etc
Concentração de enzima