Prof. Didier Salmon MSc Cristiane S. Lessa ENZIMAS ( PARTE 2) Dezembro 2015 Bioquímica para...
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Prof. Didier SalmonMSc Cristiane S. Lessa
ENZIMAS(PARTE 2)
Dezembro 2015
Bioquímica para Enfermagem
07/12/15
2
Relembrando...• O que são enzimas?
– Catalisadores biológicos• Natureza das enzimas
– Aminoácidos• Estrutura das enzimas
– primária, secundária, terciária e quaternária• Como as enzimas funcionam
– cofatores, coenzimas e grupo prostético• Classificação das enzimas
– Óxido-redutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, ligases
• Importância das enzimas – Industria, medicina...
Cinética EnzimáticaO que é cinética ?
É o estudo da velocidade das reações
químicas
O que é cinética enzimática?
É o estudo da velocidade das reações
químicas catalisadas por enzimas
- Quantidade de produto formado por unidade de tempo
-Quantidade de substrato transformado por unidade de tempo
Pode ser medido por:
ou
Cinética de Michaelis -MentenAtividade enzimática pode ser medida pela velocidade da
reação catalisada, onde:
Km = [ ] do substrato que é
correspondente à ½ Vmax
Vmax = equivale ao ponto de
saturação das moléculas de
enzima pela [ ] de substrato presente
e quantidade de produto formado
Cinética de Michaelis -Menten
Velocidade da reação é proporcional a [ ] S
Vmax - Substrato satura todasas moléculas de enzima
= [ ] S
Metade das enzimas
disponíveis se encontram
‘preenchidas’ por substratos
[ ] crescentes
do substrato
Vmax alcançada
Nível de saturação máxima
O nível de saturação é atingido pois as enzimas possuem
sítios catalíticos limitados e neste ponto estão todos preenchidos
Cinética de Michaelis -Menten1913 – Leonor Michaelis e Maud Menten hipotetizam um modelo dado
pela equação:
V0 – Velocidade InicialEstado estacionário – [ES] constanteEntão Formação de [ES] = Degradação de [ES]
Vo = K2 [ES] [Et]=[E] + [ES]
V de Formação de ES = K1 [E] [S] V de degradação de ES = K –1[ES] + K2 [ES]
Já que Formação de [ES] = Degradação de [ES]
K1 ([Et]-[ES]) [S] = K –1[ES] + K2 [ES] K1[S][Et] - K1[S][ES] = (K –1+ K2) [ES]
[ES] = [Et] [S] [S] + (K –1+ K2) / k1)
Km
é a constante de velocidade da reação
𝓀1
𝓀1 𝓀2𝓀−1
Cinética de Michaelis -Menten
O estado de transição ES formado poderá adquirir estabilidade e catalisar a conversão em produto com a constante de velocidade
ou dissociar em E+S, pela constante de velocidade
Quando houver a formação do produto e o equilíbrio químico for alcançado, o complexo ES pode ser refeito, quando constante de velocidade
𝓀2𝓀−1
𝓀−2
[ES] = [Et] [S] Se, V0 = k2 [ES] Km + [S]
Então: V0 = k2 [Et] [S] Km +[S]
Em V máxima [Et] = [ES]
Então V max = k2 [Et]
Sendo assim, 𝑽𝒐=𝑽𝒎𝒂𝒙 [𝑺 ]𝑲𝒎+[𝑺 ] Equação de Michaelis Menten da reação com um
único substrato, catalisada por uma enzima.
Gráfico de Lineweaver- BurkDupla recíproca
Uma alteração algébrica da equação de Michaelis-Menten para determinar valores de Km e Vmax antes do avanço tecnológico
É a forma mais comum, e simples, de mostrar os dados cinéticos
Figura 8.12 Bioquímica (Stryer)
=
Valores de Km e algumas enzimasEnzima Substrato Km (μM)
Quimiotripsina Acetil –L-triptofanamida
5000
Lisozima Hexa-N-acetilglicosamina
6
Β-galactosidase Lactose 4000Piruvato Carboxilase Piruvato
HCO3-ATP
400100060
Hexocinase (cérebro) ATPD-glicose
0.40.05
Reações em que há 2 substratos envolvem a transferência de átomos ou grupos funcionais de um substrato para o outro
Reações enzimáticas com mais de um substrato
Reações sequenciais - todos os substratos devem estar ligados à enzima para que
ocorra a liberação de qualquer produto
Na reação com dois substratos, há a formação do complexo ternário e são classificados
como ordenados ou aleatórios.
Reações enzimáticas com mais de um substrato
Reações sequenciais – realizar as reações uma-depois-da-outra
Reações enzimáticas com mais de um substrato
Reações duplo deslocamento – um ou mais produtos são
dissociados antes da ligação de todos os substratos à enzima
Motivo? Há um intermediário enzimático
O cofator PLP (pirodoxalfosfato)
orienta a transaminação entre os grupos
Inibidores
Ligação de pequenas moléculas e íons específicos
Reduzir ou parar a atividade enzimática
Controle de sistemas biológicos
Causam a inibição específica de determinada enzima, permitindo aplicações farmacológicas no combate às infecções bacterianas
ex. Sulfonamidas (sulfadoxina, sulfisoxazol, sulfacetamida...)
• Pneumonia a pneumocystis (Pneumocystis jirovici, P. carinii)
• Infecções oportunistas em pacientes HIV +
• Infecção do trato urinário
• Shigelose (Desinteria)• Algumas infecções por
protozoários (Plasmodium falciparum)
InibidoresIrreversíveis
Reversíveis
Competitiva
Acompetitiva
Não-competitiva
Mista
InibidoresIrreversíveis
Dissocia-se lentamente da enzima-alvo
União estável com a enzima (covalente ou
não-covalente)
Ligam-se covalentemente ou destroem um grupo funcional da enzima
essencial à atividade da enzima ou então formam
uma associação não covalente estável
O ataque da Serina (Ser) à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível
InibidoresIrreversíveis
Ex. substâncias β-lactâmicas como a penicilina modificam
covalentemente a enzima transpeptidase, impedindo a síntese da
parede bacteriana e sendo rompida devido à
pressão osmótica - morte das bactérias
β-lactâmicos
InibidoresIrreversíveis
Ex 2. O ácido acetilsalicílico presente em diversos fármacos
modifica de forma covalente a enzima
cicloxigenase, reduzindo a síntese das moléculas
responsáveis pela sinalização durante a
inflamação
InibidoresIrreversíveis
PGE2
⊺
o sítio ativo é incapaz de fixar o substrato
Ácido acetilsalicílico doa grupo acetil (CH3-
CH2), se ligando à região Ser da enzima
Alteração estrutural da enzima
InibidoresIrreversíveis - SUICIDAS
Classe especial de inibidores irreversíveis
Compostos não reativos até que se liguem ao sítio ativo de uma enzima específica
Passa pelas primeiras etapas químicas da reação enzimática, mas em vez de ser transformado em produto normal, é convertido em um composto muito reativo que se combina irreversivelmente com a enzima.
Também chamados de inativadores com base no mecanismo, pois sequestram o mecanismo normal da reação para inativar a enzima.
InibidoresIrreversíveis - SUICIDAS
Alfa1-antitripsina
Tripsina (elastase)
Ex. A proteína alfa1-antitripsina se liga à
região tripsina da enzima elastase,
inativando-a
É conhecido como SUICIDA, pois a
proteína, uma vez associada à elastase, é
degradada junto à enzima
Elastase – causa dano aos alvéolos
Quando há deficiência da proteína, haverá
um quadro de enfisema pulmonar
InibidoresReversíveis - Competitiva
Inibidores reversíveis – rápida dissociação do
complexo enzima-substrato
Enzima liga-se ao substrato (complexo ES)
OUao inibidor (complexo
EI)
Nunca se liga em ambos ao mesmo
tempo
• Estrutura semelhante à do substrato
• Liga-se ao Sítio Ativo da enzima• Aumento da [substrato] diminui a inibição • Vmax NÃO se altera• Km da enzima AUMENTAna presença do inibidor
Inibidores Reversíveis - Competitiva
0 1 2 3 4 5 6 70
5
10
15
Sem inibidor
Com inibidor
Substrato (mM)
V 0(m
ol.L
-1.m
in-1
)
Substrato (mM) V0 (sem inibidor) mmol.L-1.min-1
V0 (com inibidor) mmol.L-1.min-1
0.2 5 3 0.4 7.5 5 0.8 10.0 7.5 1.0 10.7 8.3 2.0 12.5 10.7 4.0 13.6 12.5 6.0 13.5 13.5
v
V
V/2
1/V Km Km s -1/Km -1/Km
1/s
Com inibidorSem inibidor
InibidoresReversíveis - Acompetitiva
Inibidor se liga SOMENTE quando há o complexo enzima-substrato formado
Sítio de ligação formado somente após a ligação do
substrato à enzima
Não é alterada com adição de mais
substrato
• Vmax menor na presença do inibidor• Reduzido valor de Km
• Para manter o equilíbrio entre E e ES, maior quantidade de S se liga à E
• Vmax não pode ser alcançada, mesmo com altas [ ] do substrato
InibidoresReversíveis - Acompetitiva
InibidoresReversíveis -
Não-competitiva
Inibidor e substrato ligam-se ao mesmo tempo à enzima, em
sítios de ligação diferentes •Inibidor não tem semelhança
estrutural com o substrato•NÃO se liga no sítio ativo da enzima•Aumento da [substrato] não diminui a inibição •Km da enzima NÃO se altera •A VMAX DIMINUI na presença do inibidor
Inibidores
v
V
V V/2 1/V
V/2 1/V
km s -1/Km 1/s
1/v
Km 1/Km [1/s]
V 1/V
[s]
Com inibidorSem inibidor
Reversíveis - Não-competitiva
InibidoresReversíveis - Mista
Padrão complexo
Produzido quando um único inibidor dificulta
a formação do complexo enzima-
substrato
Redução da renovação do número de enzimas
Enzimas Regulatórias
Enzimas Regulatórias
Podem aumentar ou diminuir a atividade catalítica com base em
substâncias modulatórias associadas à enzima
Podem ser:
1. Ativadas por deleção de segmentos peptídicos
(irreversíveis)
2. Enzimas alostéricas (ligações
reversíveis)
3. Alterações covalentes
Enzimas Regulatórias
Conversão da L-treonina a L-leucina é catalisada pela
sequência de cinco enzimas, cujo produto final leva à regulação da primeira
enzima
O resultado final é a regulação da velocidade em que os produtos são gerados
e que varia conforme a necessidade da célula
Inibição por retroalimentação
Enzimas Alostéricas
Enzimas AlostéricasNem todas as enzimas seguem o padrão definido pela equação de
Michaelis-Menten
São as enzimas alostéricas, que apresentam múltiplos sítios ativos e compostos por diversas subunidades (oligoméricas)
Pequenas moléculas
regulatórias (efetores) podem
ligar-se e modificar a atividade
catalítica destas enzimas
Atividade enzimática pode ser alterada pelos efetores
por dois caminhos: aumento ou diminuição da Vmax ou aumento ou diminuição da
Km
Relação entre V0 e [S] diferente da cinética de Michaelis-Menten
Enzimas Alostéricas
Michaelis-Menten Enzimas alostéricas
Apresentam perfil sigmoide (aspecto em S) com relação à velocidade em que a reação ocorre e a concentração
do substrato
Enzimas Alostéricas
Podem ser tanto inibidor quanto
ativador da enzima
Enzimas Alostéricas
A atividade enzimática é regulada pela ligação de substâncias aos sítios regulatórios da enzima.
Essa ligação altera a
conformação da enzima e o
formato do sítio ativo
Essas ligações podem tanto inibir quanto
ativar
Modificação Covalente
Fosforilação é o tipo mais comum de modificação
covalente
Há gasto de ATP
Na proteína podem haver diversos
sítios fosforiláveis
Exemplos de enzimas regulatórias Fosfofrutokinase –1 (PFK-1):
ALOSTERIA MODIFICAÇÃO COVALENTE
ALOSTERIA
Glicogênio Fosforilase
O que a desregulação do sistema pode ocasionar?
Como a velocidade da reação pode ser afetada?
pH Presença de inibidores/ativadores
Temperatura Modificações químicas: adenilação,
fosforilação...Concentração de
substratosConcentração da enzima
Concentração de cofatores