Unidad III: Enzimas

Temario:

- Enzimas.

- Concepto de catalizador.

- Enzimas michaelianas y alostéricas.

- Concepto de cofactores.

- Inhibición enzimática.

- Regulación de la actividad enzimática.

Enzimas: Generalidades

- Son catalizadores biológicos

- Aceleran la velocidad de las reacciones químicas

-Disminuyen la Energía de activación (Ea)

- No alteran el equilibrio de la reacción

-La mayor parte de la energía necesaria para aumentar la velocidad de

reacción proviene de las interacciones débiles (PdH, hidrofóbicas e

iónicas) entre el sustrato y la enzima

-La mayoría de las enzimas son de composición proteica

(excepción: ribozimas= ARN catalíticos)

Durante una reacción, el sustrato debe adquirir la energía necesaria

para llegar al estado de transición (nivel de máxima energía), esta

energía es llamada energía de activación (Ea), las enzimas

disminuyen esta barrera energética acelerando así la velocidad de

las reacciones.

Relación entre Ea, Temperatua y Constante de vel. específica

Ecuación de Arrhenius

V= k x [S]n k: Constante de vel. específica

K= cte x e-Ea/RT

log k= log cte – Ea/2,3 x RT

Tomando dos valores de Temperatura:

log k2/k1= Ea/2,3 x R (T2-T1)/T2 x T1

Finalmente de aquí se deduce la expresión para la Ea en función de la T y el valor de Q10

Q10= relación entre constantes de vel. específica cuando la T varia en 10 grados.

Enzimas: Generalidades-Las enzimas poseen una temperatura y pH óptimos para su

funcionamiento.

-A altas temperaturas las enzimas pueden desnaturalizarse, perdiendo así

su conformación y por ende su función (recordar la estrecha relación

estructura-función de las proteínas)

-El pH tiene efecto sobre la carga iónica de los residuos de aa de las

enzimas, y cambios en la carga de los aa afectan las interacciones entre

enzima-sustrato.

-La mayoría de las enzimas de nuestro organismo trabajan a 37ºC y pH

6.9-7.7

-Las enzimas digestivas tienen otros rangos de pH óptimos, las enzimas

del jugo gástrico actúan a pH 1.5-2, las del jugo pancreático a pH más

alcalino (9).

Enzimas: Generalidades

La actividad enzimática se obtiene determinando la velocidad de

una reacción catalizada bajo condiciones definidas.

Velocidad= conversión de sustrato en producto, en función del tiempo.

-La velocidad es independiente del volumen de reacción

La actividad de una enzima se expresa en unidades internacionales (UI)

1UI=1mol de P formado/min

-Actividad específica (AE): se considera la cantidad de enzima presente.

AE=actividad/mg proteína

-La AE es útil para determinar el grado de pureza de la enzima, a mayor AE

mayor pureza.

Enzimas: Generalidades

-Las enzimas poseen especificidad de reacción y especificidad de sustrato.

-La especificidad está determinada por la estructura del sitio activo.

-El sitio activo está formado por el lugar de fijación del sustrato y por el

centro catalítico.

-La especificidad de reacción está determinada por los residuos de aa del

centro catalítico de la enzima.

-La especificidad de sustrato está dada por el tamaño, estructura, carga,

hidrofobicidad y polaridad del lugar de fijación.

-Hay enzimas que catalizan un solo tipo de reacción (ej. Catalasas), otras

enzimas poseen especificidad de sustrato más amplia y catalizan varios

tipos de reacciones (ej. Serina proteasas)

Coenzimas y cofactoresEnzimas:

-Totalmente proteicas

- no totalmente proteicas u holoenzimas.

Coenzima: Es la parte no proteica de algunas enzimas necesaria para su función. Se unen por enlaces covalentes y no covalentes. Pueden ser moléculas orgánicas sencillas como el ácido lipoico, o mas complejas como FAD, FMN, NAD +, derivados de la vitamina B.

Holoenzima: apoenzima + coenzima

Apoenzima: es el nombre que se da a las enzimas que necesitan de una coenzima para estar activas.

Las coenzimas se dividen en 2 clases:

Coenzimas solubles: se fijan a la enzima, experimentan un cambio químico durante la catálisis y son liberadas.

Grupos prostéticos: están unidos fuertemente al enzima durante todo el ciclo catalítico.

Cofactores: iones metálicos necesarios para la actividad de algunas enzimas.

Cinética enzimática

Enzimas Michaelianas.Son aquellas que muestran una dependencia hiperbólica entre la velocidad inicial de la reacción (Vo) y la concentración de sustrato.

La ecuación de Michaelis-Menten describe la cinética de muchas de las reacciones catalizadas por enzimas. Esta ecuación deriva de un modelo matemático que plantea que:

• el sustrato S se une al enzima E formando el complejo enzima-sustrato ES, que luego se descompone para dar la enzima libre y el producto P.

• E, S y ES se encuentran todos en equilibrio rápido de forma de alcanzar rápido una [ES] estable

• la descomposición de ES en E + P es el paso limitante de velocidad

Es el estudio de la velocidad a la que transcurre una reacción catalizada enzimáticamente en función de la [S].

Vamos a estudiar dos tipos de enzimas:

• enzimas Michaelianas

• enzimas alostéricas

Vm (velocidad máxima): es la velocidad alcanzada cuando todas las moléculas de E se encuentran unidas a S, para esto la [S] tiene que ser muy alta (saturación).

Km (constante de Michaelis-Menten): es la [S] a la cual la enzima alcanza la mitad de su Vm (velocidad máxima)

• Km esta relacionado inversamente con la afinidad de la enzima por el sustrato.

• la Vm es directamente proporcional a la cantidad total de enzima: Vm= Kcat x [E]total

Kcat (constante catalítica o número de recambio): número de moléculas de sustrato convertidas en producto por molécula de enzima, por unidad de tiempo.

[S][E]t k3/Km [S] Vm/Km v:Km[S] Para

Vm/2 v:Km [S] Para

Vm v:Km[S] Para

k3)/k1(k2 Kmy [E]t k3 Vm :donde SKm

S Vmv

P E k3 S-E k2

k1 S E

¿Cómo se obtienen los parámetros cinéticos de un enzima?

En la gráfica de Michaelis-Menten la Vo tiende a la Vm de modo asintótico, por lo que de esta gráfica no podemos obtener un valor preciso para Vm y por lo tanto tampoco para Km.

Para solucionarlo se realizan transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten, una de las más usadas es la representación de Lineweaver-Burk (doble recíproca), que se obtiene tomando la recíproca de la ecuación de Michaelis-Menten y reordenando los términos:

1/v = Km /Vm. 1[S] + 1/Vm

Inhibición enzimática

La inhibición enzimática puede ser de 2 tipos:

• reversible

• irreversible.

Ki: constante de inhibición. Cuanto menor es Ki (constante de disociación) más eficiente es la inhibición de la actividad enzimática.

Formas de inhibición reversible:

1. Competitiva

2. Acompetitiva

3. No competitiva (mixta)

Inhibición competitiva

Esta dada por sustancias cuya estructura química es similar a la del sustrato y compiten con el mismo por el centro activo del enzima. A altas [S] el inhibidor puede ser desplazado.

↑ Km = Vm

Ki: es la constante de disociación del complejo EI

Etanol y metanol compiten en la reacción de la alcohol deshidrogenasa

Inhibición no competitiva (mixta)

Los inhibidores no competitivos se unen tanto a la E libre como al ES, en un sitio de la enzima diferente al que se une S.

↓ Vm= Km

La inhibición de la malato deshidrogenasa que cataliza la transformación del L-malato en oxalacetato es inhibida no competitivamente por el hidroximalonato, que reacciona con el complejo Enzima NAD + .

Inhibición acompetitiva

El inhibidor acompetitivo se une al complejo ES pero no al enzima libre, en un sitio diferente al que se une el sustrato.

↓ Vm porque parte del complejo ES se transforma en ESI inactivo

↓ Km porque se afecta la disociación del S, entonces hay un aumento aparente de la afinidad

Ki: es la constante de disociación del complejo ESI

Inhibición competitiva Inhibición acompetitiva Inhibición no competitiva

↑ Km = Vm

↓ Vm

↓ Km

↓ Vm= Km

Miren con atención los gráficos, no le crean siempre al señor Lehninger. Dónde esta su error???

Antiinflamatorios: las prostaglandinas son mediadores del proceso de inflamación. Se sintetizan a partir del ácido araquidónico por medio de una reacción de oxidación (catalizada por la ciclooxigenasa) y una de ciclación. Los compuestos que inhiben a la ciclooxigenasa presentan actividad antiinflamatoria.

•Aspirina: acetila una Ser con lo que se bloquea el ingreso del araquidonato al centro activo.

• AINEs: inhiben de manera reversible, bloquean el canal para araquidonato

Tratamiento del alcoholismo: el etanol es metabolizado en 2 pasos sucesivos, 1º se convierte en acetaldehído por la alcohol deshidrogenasa y luego en ácido acético por la aldheído deshidrogenasa. Los compuestos que inhiben la aldehído deshidrogenasa son usados en el tratamiento del alcoholismo.

Inhibición irreversible

Dada por compuestos que se combinan con o que destruyen un grupo del enzima que es esencial para su actividad, también pueden formar una asociación no covalente, pero muy estable

Regulación de la actividad enzimáticaEn una vía metabólica de múltiples pasos la velocidad global del proceso esta limitada por el paso más lento. Por lo tanto para regular una vía metabólica la mejor estrategia es regular las enzimas que catalizan estos pasos limitantes de velocidad.Mecanismos para regular la actividad enzimática (in vivo)

• la expresión de la enzima en respuesta a variaciones del medio o de la situación metabólica.

• mecanismos de proteólisis, que pueden activar o inactivar una enzima de manera irreversible. Ej: enzimas digestivos

• modificaciones covalentes, que pueden activar o inactivar una enzima de manera reversible. Ej: fosforilaciones

• regulación alostérica (moduladores positivos y negativos de manera reversible)

• inhibición por retroalimentación es un mecanismo frecuente de regulación metabólica

• degradación de las enzimas, por proteasas en lisosomas o por proteosomas en el citosol, que determinan sus vidas medias, y en consecuencia, la actividad enzimática.

Mecanismos de proteólisisAlgunas enzimas son sintetizadas y almacenadas como un precursor inactivo (denominado proenzima o zimógeno) en un compartimiento celular, y se activan al ser clivadas por otra enzima en el lugar o momento en que deben actuar. Ej:

•Enzimas digestivas•Formación de cascadas de coagulación y fibrinolisis sanguíneas•Activación de hormonas proteicas (ej: insulina)

Zimógenos gástricos y pancreáticos:

Zimógeno Enzima activa Sintetizado en Activación

Pepsinógeno Pepsina Estómago Autocatálisis en medio ácido

Tripsinógeno Tripsina Páncreas Enteroquinasa

Quimotripsinó Quimotripsina Páncreas Tripsina -geno

Modificación covalenteFosforilación – defosforilación: La fosforilación puede activar o inactivar a la E. Existen diferentes proteín-quinasas y fosfatasas a su vez reguladas por diferentes mecanismos.

Adenilación-desadenilación: mecanismo menos frecuentes. Ej: Glutamina sintetasa que es menos activa en la forma desadenilada.

Uridilación y ADP ribosilación son otros mecanismos menos frecuentes de regulación por modificación covalente reversible.

Regulación alostérica•La actividad de la enzima se regula por la unión reversible de pequeñas moléculas, denominadas moduladores alostéricos, a lugares distintos del sitio activo del enzima.

Efecto homotrópico: cuando el propio sustrato ejerce efectos alostéricos.

Efecto heterotrópico: cuando el efector alostérico es distinto al sustrato.

• Los sitios de unión para efectores alostéricos pueden estar en subunidades regulatorias diferentes de las catalíticas.

•Es la forma en que se regula la actividad de los enzimas que catalizan los pasos limitantes de velocidad en una vía metabólica.

• Es un proceso rápido, y representa la primera respuesta de la célula a cambios en las condiciones.

• No cumplen con la cinética de Michaelis- Menten sino que las gráficas de velocidad de reacción vs [S] para un enzima alostérico son sigmoideas.

Interacción homotrópica.

Se observa cuando la reacción de una molécula de sustrato con un enzima multimérico afecta a la fijación de las siguientes moléculas de sustrato en los demás sitios activos. La afinidad de E por S varía con [S], y esto hace que aparezcan efectos cooperativos.• Cooperatividad positiva: ocurre cuando la reacción de una molécula de sustrato con un centro activo facilita la reacción de otra molecula de sustrato en otro centro activo de la enzima. • Cooperatividad negativa: ocurre cuando la reacción de una molécula de sustrato con un centro activo dificulta la reacción de otra molecula de sustrato en otro centro activo de la enzima.

K0,5 es la [S] necesaria para alcanzar el 50% de Vm y el exponente n el coeficiente de Hill. Para la mayoría de las enzimas alostéricas las [S] intracelulares están cerca de K0.5de modo que la actividad del enzima responde a ligeras variaciones en la [S]

si n > 1 hay cooperatividad positiva si n < 1 hay cooperatividad negativasi n = 1, la cinética es michaeliana.

n[S]nK

n[S] Vmv

0,5

Interacción heterotrópica (Efectores alostéricos)

Se describen por un modelo que plantea que el enzima puede estar en dos conformaciones denominadas estado T (tenso, inactiva) y estado R (relajado, activo), y la unión del efector alostérico cambia la fracción de enzima de un estado a otro.Los efectores alostéricos negativos (inhibidores) desplazan el equilibrio hacia la forma T de la enzimaLos efectores alostéricos positivos (activadores) favorecen la conformación R de la enzima. Estos juegan un rol importante en la regulación del metabolismo. Pueden modificar Vm o la afinidad por S.

Inhibición por retroalimentación

Es un mecanismo frecuente de regulación metabólica

ISOZIMASSon múltiples isoformas enzimáticas que catalizan la misma reacción, pero tienen distinta afinidad por los sustratos, distintas propiedades regulatorias y/o una composición en subunidades diferente.

Propiedades de glucoquinasa y hexoquinasa

Izoenzima Tejido Afinidad por glucosa

Inhibición por producto

Sensibilidad a insulina

Glucoquinasa

hígado Baja (Km10mM) No Si

Hexoquinasa

Todos Alta (Km0,1mM) Si No