Ensaios in Vitro - Biologia Molecular, Cultivo Celular, Scaffolds e Engenharia Tecidual
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Ensaios in vitroBiologia Molecular, Cultivo Celular, Scaffolds e Engenharia Tecidual
Marcus Conde DDS, PhDBolsista de Ps-Doutorado (DOCFIX PPGO UFPel)
Email: [email protected]
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASPROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ODONTOLOGIA
DISCIPLINA METODOLOGIA CIENTFICA APLICADA 2015/1
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Princpio de Cultivo Celular
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Princpio de Cultivo Celular
Essa tcnica foi desenvolvida como um mtodo para estudar o comportamento de clulas
animais fora do organismo, em um meio ambiente controlado (Manual Fiocruz).
Ross Granville Harrison
O isolamento e cultivo de clulas de animais tornou-se uma tcnica laboratorial
rotineira na dcada de 1950 mas o conceito de manter linhagens de clulas vivas
separadas do seu tecido-fonte original foi descoberto no sculo XIX.
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Princpio de Cultivo Celular
Frascos de plstico tem a superfcie tratada qumica
(Agentes oxidantes) ou fisicamente (UV) para que
apresentem cargas negativas favorveis ao processo de
ancoragem das clulas
Formao da Monocamada Celular
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Princpio de Cultivo Celular
Clulas Aderentes x Clulas No-Aderentes
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Princpio de Cultivo Celular
Reagentes para manuteno do cultivo celular
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Princpio de Cultivo Celular
Reagentes para manuteno do cultivo celular
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Princpio de Cultivo Celular
37C
95% Umidade
5% CO2
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Princpio de Cultivo Celular
37C
95% Umidade
5% CO2
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Reagentes para manuteno do cultivo celular
Meio de Cultivo
Soro Fetal Bovino
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Tipos de cultivo
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Princpio de Cultivo Celular
Isolar o Tecido
Desagregar
Semear Explants
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Uma cultura primria estabelecida a partir do crescimento de clulasoriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregao mecnicaou enzimtica;
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As clulas que conseguirem sobreviver ao processo de desagregao eaderirem garrafa formaro a primeira monocamada de clulas daqueletecido. (Manual Fiocruz)
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Cultivo Primrio - Vantagens
Clulas Primrias possuem as caractersticas do tecido de origem
Manuteno das caractersticas Fenotpicas e Genotpicas
Utilizadas na produo de vacinas
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Cultivo Primrio - Desvantagens
Clulas Primrias possuem um tempo de vida curta
Apoptose Morte celular programada Botes apoptticos
Contaminao, Adeso, Agentes Exgenos - So menosresistentes
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Cultivo Primrio - Desvantagens
Clulas Primrias possuem um tempo de vida curto
Apoptose Morte celular programada Botes apoptticos
Contaminao, Adeso, Agentes Exgenos - So menosresistentes
Clulas-Tronco Necessidade de Caracterizao
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Passagens Celulares
Confluncia Celular e Inibio por Contato
Conde, Chisini e Schultze, 2015Ferrua e Nedel, 2013
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Passagens Celulares
Tripsina Ao proteoltica nas junes clula-clula e clula substrato
EDTA Agente Quelante (Ca2 e Mg-)
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Passagens Celulares
Sub-cultivo ou Repique Celular
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No decorrer de sub-cultivos das culturas primrias, pode haver a seleo declones, capazes de sobreviver e se multiplicar por 50 ou mais passagens.
Esses clones do origem s chamadas linhagens celulares, tambmdenominadas de linhagens estabelecidas ou contnuas. (ManualFiocruz)
Devem ser congelados com poucas passagens para posteriorutilizao
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Culturas Finitas
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Culturas Contnuas Imortalizao Celular
Clulas de tecidos humanos raramente se tornam imortais
Modificaes genticas que permitem mutaes nos genesresponsveis pelo controle do ciclo celular
Podem ser obtidas diretamente de tecidos submetidos mutao Clulas Tumorais
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Culturas Contnuas Imortalizao Celular
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Contagem das clulas
As clulas foram contadas utilizando 0.4%
de azul de tripano (1:1) em cmara de
Neubauer (Gibco, Invitrogen, Grand Island,
NY, USA).
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Ensaios de Citoxicidade
um ensaio in vitro;
um teste inicial e no pode ser extrapolado de imediato para sereshumanos;
Determina preliminarmente o comportamento do material;
o teste inicial mais comumente selecionado;
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Ensaios de Citoxicidade - Vantagens
Controle das condies experimentais; temperatura, umidade,nutrientes
Baixo custo; quando comparado a estudos in vivo
Resultados rpidos; 7, 15, 30 dias
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Ensaios de Citoxicidade - Desvantagens
O teste no consegue simular as condies in vivo;
Dificuldade em extrapolar os dados obtidos;
A falta de cautela pode confundir o pesquisador;
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DNA Watson e Crick
A estrutura da molcula de DNA foi
descoberta conjuntamente pelo norte-
americano James Watson e pelobritnico Francis Crick em 7 deMaro de 1953,
Prmio Nobel de Fisiologia ouMedicina em 1962, juntamente com
Maurice Wilkins.
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Dentro da gentica moderna, o gene uma sequncia de nucleotdeos do DNA que pode
ser transcrita em uma verso de RNA.
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Segmento de DNA que leva produo de uma
cadeia polipeptdica e inclui sequncias que no
so traduzidas (ntrons) que se intercalam aos
segmentos codificadores individuais (xons),
que so traduzidos.
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Alberts B. Molecular Biology of the Cell 5th Edition
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Alberts B. Molecular Biology of the Cell 5th Edition
RNA polimerase a principal enzima do complexo
enzimtico responsvel pela transcrio do DNA
em RNA.
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Alberts B. Molecular Biology of the Cell 5th Edition
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Reao em cadeia da polimerase (em ingls
Polymerase Chain Reaction - PCR) um
mtodo de amplificao (de criao de
mltiplas cpias) de DNA (cido
desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo
vivo
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Consiste em reproduzir o processo de transcrio do RNA in vitro
Se baseia na aplicao de repetidos ciclos (marcados pela troca de temperatura)
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Isolamento do material gentico (RNA ou DNA)
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Isolamento do material gentico (RNA ou DNA)
O Isotiocianato de Guanidina utilizado como um desnaturante na purificao e extrao de
mRNA, cidos nuclicos e protenas, agindo como potente inibidor de RNAse, protegendo
os transcritos da degradao durante a extrao dos tecidos.
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Isolamento do material gentico (RNA ou DNA)
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1l das amostra
Quantificao RNA total obtido
Quantificao do material gentico isolado
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uma enzima que polimeriza molculas de DNA a partir de molculas de RNA,
exatamente o oposto do que geralmente ocorre nas clulas, nas quais produzido RNA a
partir de DNA.
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MATERIAIS E MTODOS
RT-PCR DSPP, DMP1, MEPE e GAPDH (Genenormalizador)40 ng RNA utilizado na reao RT-PCR (One-step Superscript TMIII Platinum, Invitrogen)
- denaturao, 94 C por 45s;
- anelamento, 55 C por 45s GAPDH;
50 C por 45s DSPP, DMP1, MEPE
- extenso, 72 C por 60s, 35 ciclos;
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O isolamento da transcriptase reversa permitiu a adaptao da tecnologia da PCR, que
destinada a amplificao a partir de moldes de DNA, para permitir a amplificao a partir
de moldes de RNA, chamada RT-PCR (transcrio reversa - PCR)
A tcnica de RT-PCR amplamente utilizada para verificar a expresso gnica.
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MATERIAIS E MTODOS
Transcriptase Reversa Reao dePolimerase em Cadeia (RT-PCR)
-Os produtos do PCR foram separados emeletroforese (gel de agarose 1.5%).
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Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose
As molculas iniciam o processo de migrao induzido pelo diferencial de corrente eltrica
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Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose
Os produtos do PCR iro migrar pelo gel de forma diferente, de acordo com seu peso molecular
Molculas mais leves migram mais rpido pelo gel
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Separao dos produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose
Os produtos do PCR iro migrar pelo gel de forma diferente, de acordo com seu peso molecular
Molculas mais leves migram mais rpido pelo gel
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Smith et al.,2008Ferracane e Smith, 2010
Reparo limitado da funo e esttica
dos tecidos afetados
CONTEXTO
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ENGENHARIA TECIDUAL
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ENGENHARIA TECIDUAL
Campo interdisciplinar que funde princpios e inovaes da Engenharia e das Cincias Biolgicas
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Langer and Vacanti (1993)Nr (2006)Demarco (2011)
EngenhariaTecidual
Scaffolds
Clulas-Tronco
MolculasBioativas
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ENGENHARIA TECIDUAL NA ODONTOLOGIA
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Anormalidades congnitas necessitam reconstruo tecidual;
Maioria dos tecidos no regeneram aps as injrias;
Aqueles que regeneram espontaneamente (ex. pele, osso) podem no
regenerar se o defeito grande;
Transplantes so limitados pela escassez de doadores;
Implantes tem um histrico de sucesso, mas tambm uma srie de
problemas;
Vrias so as justificativas para a pesquisada engenharia tecidual na odontologia
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Esmalte
Os tecidos dentais possuem pouca ou nenhumacapacidade regenerativa
Dentina
Polpa
Cemento
Lig. periodontal
No possui capacidade reparativa
No possui capacidade reparativa
Pode produzir dentina reacional e reparativa
Baixa capacidade reparativa/cementoblastos
Baixa capacidade reparativa/cementoblastos
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Scaffold
O scaffold proporciona substrato em 3 dimensespara desenvolvimento das clulas, atuando comomatriz para a regenerao tecidual (DEMARCO et al., 2011)
A seleo do material e tcnica para a confecode um scaffold de extrema importncia nodesenvolvimento e terapias regenerativas dapolpa dental.
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SCAFFOLDS
Polmeros Sintticos
PLLA
PGA
PLGA
Poly Caprolactona
Polmeros Naturais
Colgeno Tipo I
Quitosana
cido Hialurnico
Base de Clcio Materiais Alternativos
Hidrogis Anffilos
Seda
HA/TCP
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Propriedades Fsicas dos Scaffolds
Tamanho dos Poros
Espessura das Fibras
Forma dos Poros
Para que possam mimetizar a MEC, os scaffolds
devem possuir um tamanho mdio de poros que
permitam o crescimento, migrao e
diferenciao celular
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Modelo de estudo atual
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Terceiros molares hgidos
Pacientes jovens
Corte com disco diamantado
Refrigerao (1X PBS)
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Semeadura das clulas
- 5 x 104 (20l) - semeadas nas matrizes (placa
de cultura - 24 poos).
- 45 min - incubadora (37o C, 5% CO2).
- 500L de DMEM - adicionado a cada poo de
cultura, e as matrizes foram incubadas a 37o C.
- DMEM - trocado a cada 2 dias (7, 14, 21, 28
dias).
- Clulas de 4a a 6a passagem.
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Proliferao celular (WST-1)
(5 x 104) semeadas nas matrizes e cultivadas durante
7, 14, 21 e 28 dias;
WST-1 adicionado ao meio na diluio 1:10 e
incubados durante 1 hora (37C em 5% CO2).
meio de cultura/WST-1 (100L) - transferidos para
placa de 96 poos de para leitura do nvel de
densidade tica (450nm)
one-way ANOVA seguido do teste de Tukey
(Sigmastat 2.0 software, SPSS, Chicago, IL, USA),
p
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Modelo de estudo in vivo
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Modelo de estudo in vivo
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Cordeiro MM, Dong Z, Kaneko T, Zhang Z, Miyazawa M, Shi S, etal. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliateddeciduous teeth. J Endod. 2008;34(8):962-9.
Sakai VT, Zhang Z, Dong Z, Neiva KG, Machado MA, Shi S, SantosCF, Nr JE. SHED Differentiate into Functional Odontoblasts andEndothelium. J Dent Res. 2010 Apr 15.
Casagrande L, Demarco FF, Zhang Z, Araujo FB, Shi S, Nr JE.Dentin-derived BMP-2 and odontoblast differentiation. J DentRes. 2010 Jun;89(6):603-8.