electroforeza
-
Upload
cornelia-sescu -
Category
Documents
-
view
12 -
download
4
description
Transcript of electroforeza
1
ELECTROFOREZAELECTROFOREZA
© UMF Cluj - Radu Oprean 22005 - 2006
Principiul generalPrincipiul general
mişcarea diferenţiată a speciilor mişcarea diferenţiată a speciilor chimice încărcate electric (a ionilor) chimice încărcate electric (a ionilor) prin atracţie sau respingere întrprin atracţie sau respingere într--un un câmp electric, în funcţie de raportul câmp electric, în funcţie de raportul sarcinsarcinăă/ma/massăă
v = µv = µee · E· E
unde µunde µee este mobilitatea electroforetic este mobilitatea electroforetică ă a a speciei chimice. speciei chimice.
© UMF Cluj - Radu Oprean 32005 - 2006
Factori care afecteazFactori care afectează ă mobilitatea particulelor mobilitatea particulelor
mmăărimea şi semnalul sarcinii rimea şi semnalul sarcinii analituluianalituluinatura suportuluinatura suportuluisuprafaţa interioară a porilor suprafaţa interioară a porilor suportuluisuportuluitensiunea aplicattensiunea aplicatăănatura şi concentraţia electrolitului natura şi concentraţia electrolitului suport (soluţiilor tampon)suport (soluţiilor tampon)forţa ionică a soluţiei de forţa ionică a soluţiei de analitanalit şi şi pHpHacesteiaacesteiatemperatura şi vâscozitatea soluţieitemperatura şi vâscozitatea soluţiei
2
© UMF Cluj - Radu Oprean 42005 - 2006
Tehnici electroforeticeTehnici electroforetice
Electroforeza în mediu liber (frontală)Electroforeza în mediu liber (frontală)Electroforeza în mediu stabilizant (zonală) Electroforeza în mediu stabilizant (zonală) –– întrîntr--un mediu fixat pe un suport porosun mediu fixat pe un suport poros
electroforeza la tensiune joaselectroforeza la tensiune joasă ă sau înaltă în medii:sau înaltă în medii:inerte (a inerte (a ccăăror interacţiune cu particulele care ror interacţiune cu particulele care migreazmigrează ă este neglijabileste neglijabilăă))care participcare participă ă activ în separare (activ în separare (intercaţioneazăintercaţioneazăcuparticolelecuparticolele care migreaz care migreazăă))
imunoelectroforezaimunoelectroforezaelectroforeza de afinitate electroforeza de afinitate electroforeza cu focalizare izoelectricelectroforeza cu focalizare izoelectricăăelectroforeza cuplatelectroforeza cuplată ă cu cromatografia cu cromatografia (electroforeza în strat subţire)(electroforeza în strat subţire)izotacoforezaizotacoforeza (electroforeza de afinitate)(electroforeza de afinitate)
© UMF Cluj - Radu Oprean 52005 - 2006
Electroforeza zonalElectroforeza zonală ă (ZE)(ZE)
Catod
Anod
rA
rB
m
m
pH =
con
st.
+
-
© UMF Cluj - Radu Oprean 62005 - 2006
Focalizarea izoelectricFocalizarea izoelectrică ă (IEF)(IEF)
3
© UMF Cluj - Radu Oprean 72005 - 2006
IzotacoforezaIzotacoforeza (ITP)(ITP)
ElectroforezaElectroforezaccapilarapilară ă (CE)(CE)
© UMF Cluj - Radu Oprean 92005 - 2006
InstrumentaţiaInstrumentaţia
electrod electrod
tampontampon
sursă de curent
probă
capilarăachiziţie şi
prelucrare datedetector
4
© UMF Cluj - Radu Oprean 102005 - 2006
Separarea Separarea analiţiloranaliţilor
© UMF Cluj - Radu Oprean 112005 - 2006
Caracteristicile electroforezei Caracteristicile electroforezei capilarecapilare
selectivitate diferitselectivitate diferită ă faţă de metodele faţă de metodele cromatograficecromatograficeprecizie şi sensibilitate mai redusă precizie şi sensibilitate mai redusă faţă de HPLCfaţă de HPLCposibilitposibilităăţi limitate în domeniul ţi limitate în domeniul preparativpreparativvolume mici de probvolume mici de probăăconsum redus de solvenţi şi tamponconsum redus de solvenţi şi tamponinstrumentaţie simplăinstrumentaţie simplădezvoltarea rapiddezvoltarea rapidă ă a metodelora metodelor
© UMF Cluj - Radu Oprean 122005 - 2006
Fluxul electroosmotic (EOF)Fluxul electroosmotic (EOF)
Ionii pozitivi sunt atraşi de sarcinile Ionii pozitivi sunt atraşi de sarcinile negative ale capilarei (negative ale capilarei (SiOSiO--) şi ) şi creeazcreează ă o diferenţă de potenţial în o diferenţă de potenţial în imediata vecinimediata vecinăătate a peretelui, tate a peretelui, potenţial numit potenţial numit zetazeta (ζ). (ζ). La aplicarea unei tensiuni la capetele La aplicarea unei tensiuni la capetele capilarei, cationii din dublul strat capilarei, cationii din dublul strat electric sunt atraşi spre catod. electric sunt atraşi spre catod. AceastAceastă ă mişcare antrenează cu ea mişcare antrenează cu ea întreaga soluţie.întreaga soluţie.
5
© UMF Cluj - Radu Oprean 132005 - 2006
ProfilProfiluriuri dde e eluţieeluţie
Flux electroosmoticFlux electroosmotic
Profil Profil paraboliparabolicc
© UMF Cluj - Radu Oprean 142005 - 2006
MobilitMobilitateaatea eelectrolectroforeticforeticăă
qq:: sarcina net sarcina netă ă a speciei chimicea speciei chimiceηη:: vvîîscoscozitateazitatea solusoluţţieiieirr:: rarazaza efectiefectivvăă (Stokes) (Stokes) a speciei a speciei
solvatatesolvatate
r . . . 6q
ep ηπµ =
© UMF Cluj - Radu Oprean 152005 - 2006
MigraMigrarearea eelectrolectroffororeetiticcăă
µµepep:: mobilitmobilitateaatea eelectrolectroffororeetiticcăăE:E: ccââmpmp eelectrilectriccV:V: voltavoltajj apliaplicatcatL:L: llungimeaungimea totaltotalăă aa capilcapilareiarei
LV
. E . v epep µµ ==
6
© UMF Cluj - Radu Oprean 162005 - 2006
ViteVitezaza de de migramigrarere
( ) ( )LV
. E . v eoepeoep µµµµ +=+=
în prezenţa fluxului electroosmoticîn prezenţa fluxului electroosmotic
© UMF Cluj - Radu Oprean 172005 - 2006
Variabilele care influenţează Variabilele care influenţează EOF (1)EOF (1)
•• forforţţa ionica ionică ă mare mare genereazgenerează ă un curent un curent puternic puternic şşi i îîncncăălzirelzire
•• poate conduce la picuri poate conduce la picuri distorsionate dacdistorsionate dacă ă conductivitatea diferconductivitatea diferă ă de de cea a probeicea a probei
Scade potenScade potenţţialul ialul zetazeta şşi i EOF cândEOF când este crescut este crescută ă forforţţa ionica ionicăă
ForForţţa ionica ionică ă sau sau concentraconcentraţţia ia solusoluţţiei iei tampontampon
•• cea mai folositcea mai folosită ă metodmetodă ă de modificare a EOFde modificare a EOF
•• poate modifica sarcina poate modifica sarcina sau structura sau structura solutuluisolutului
EOF scade la EOF scade la pHpH micmicEOF creEOF creşşte la te la pHpH maremare
pHpH--ululsolusoluţţiei iei tampontampon
•• scscăăderea poate conduce derea poate conduce la scla scăăderea rezoluderea rezoluţţiei iei şşi i eficieneficienţţeiei
•• cu crecu creşşterea poate rezulta terea poate rezulta o o îîncncăălzirelzire
Modificarea proporModificarea proporţţionalională ă a EOFa EOF
Câmpul Câmpul electricelectric
ObservaObservaţţiiiiRezultatRezultatVariabilaVariabila
© UMF Cluj - Radu Oprean 182005 - 2006
Variabilele care influenţează Variabilele care influenţează EOF (2)EOF (2)
••scade EOF prin protejarea scade EOF prin protejarea sarcinii peretelui sarcinii peretelui şşi crei creşşte te vâscozitateavâscozitatea
Se adsorb pe peretele Se adsorb pe peretele capilarei prin interaccapilarei prin interacţţiuni iuni hidrofobehidrofobe
Polimeri Polimeri neutri neutri hidrofilihidrofili
••detergendetergenţţii ii anionicianionici pot pot crecreşşte EOFte EOF••detergendetergenţţii cationici pot ii cationici pot scscăădea sau chiar inversa EOFdea sau chiar inversa EOF••poate modifica poate modifica selectivitateaselectivitatea
Se adsorb pe peretele Se adsorb pe peretele capilarei prin interaccapilarei prin interacţţiuni iuni hidrofobe sau ionicehidrofobe sau ionice
DetergenDetergenţţii
••modificmodificăări complexeri complexe••poate modifica poate modifica selectivitateaselectivitatea
Scade potenScade potenţţialul ialul zetazeta şşi i vâscozitatea (de obicei vâscozitatea (de obicei scad EOF)scad EOF)
Modificatori Modificatori organiciorganici
••folositoare folositoare îîn cazul n cazul controlului automat de controlului automat de temperaturtemperaturăă
ModificModifică ă vâscozitatea cu vâscozitatea cu 22--3%3% // ooCC
TemperaturaTemperatura
ObservaObservaţţiiiiRezultatRezultatVariabilaVariabila
7
© UMF Cluj - Radu Oprean 192005 - 2006
Tipuri de CETipuri de CE
+
- -+ VeoVep
+ -
+ -Veo
XVmic
+ -VeoX
ElectroforezElectroforeză ă capilarcapilară ă zonalzonalăă(CZE)(CZE)
ElectroforezElectroforeză ă capilarcapilară ă pe gel pe gel (CGE)(CGE)
Cromatografie electrocineticCromatografie electrocinetică ă micelarmicelarăă (MEKC)(MEKC)
Electrocromatografie capilarElectrocromatografie capilară ă (CEC)(CEC)
© UMF Cluj - Radu Oprean 202005 - 2006
Electroforeza capilarElectroforeza capilară ă zonalzonală ă (CZE)(CZE)
+- -+ Veo
Vep
fluxul electroosmotic (EOF)fluxul electroosmotic (EOF)
dubldublulul strat electricstrat electric
ionii se deplaseazionii se deplasează ă în tamponîn tampon
VVxx = = VVeoeo + + VVepep
© UMF Cluj - Radu Oprean 212005 - 2006
Electroforeza capilarElectroforeza capilară ă zonalzonală ă (CZE)(CZE)
8
© UMF Cluj - Radu Oprean 222005 - 2006
OrdOrdineainea de de migramigrarere pentrupentru cationcationii(+), (+), neutriineutrii (o) (o) şi şi anionanionii ((--))
Efectul cumulativ al mobilitEfectul cumulativ al mobilităăţii ţii electroforetice şi EOF către catodelectroforetice şi EOF către catod
Efectul netEfectul net
µµ++
µµeoeo
µµ--
++00––
© UMF Cluj - Radu Oprean 232005 - 2006
ElectroforezElectroforeză ă capilarcapilară ă pe gel pe gel (CGE)(CGE)
Ionii mai voluminoşi se deplasează Ionii mai voluminoşi se deplasează mai lentmai lent
+ -
Efectul Efectul retardantretardant al geluluial gelului
© UMF Cluj - Radu Oprean 242005 - 2006
Cromatografie electrocineticCromatografie electrocinetică ă micelarmicelarăă (MEKC)(MEKC)
+-
t0
µeoµep, MCµeo µMC
tR tMC
9
© UMF Cluj - Radu Oprean 252005 - 2006
MMeetodetode de de ddeetectecţţiiee
foartefoarte sensiblsensiblăănecesitnecesită ă o o derivatizarederivatizare
a probeia probeipreţ ridicatpreţ ridicat
1010--1414 –– 1010--1616
1010--1818 –– 1010--2020FluorimFluorimeetrie (trie (cu cu surssursă ă laser laser -- LIFLIF))
sensibsensibililnecesitnecesită ă o o derivatizarederivatizare
a probeia probei
1010--77 –– 1010--991010--1515 –– 1010--1111FluorimFluorimeetrietrie
universuniversalalddeetecttectoorrulul cu şircu şir de de
diode permdiode permiittee obţinerea obţinerea spectrelorspectrelor
1010--55 –– 1010--881010--1313 –– 1010--1515SpectroSpectroffotomotomeetrie trie UV_VisUV_Vis
AvantaAvantajeje/ / inconvinconveenientnientee
LimitLimitee de de ddeetectecţie ţie ((moli/Lmoli/L)*)*
LimitLimitee de de ddeetectecţieţie((molmolii))
MMeetodtodaa
* pentru un volum injectat de 10 nl
© UMF Cluj - Radu Oprean 262005 - 2006
MMeetodetode de de ddeetectecţţiie (2)e (2)
universuniversalalnecesitnecesită ă modificarea modificarea
aparaturiiaparaturii
1010--77 –– 1010--881010--1515 –– 1010--1616ConductConductoommeetrietrie
sensibsensibililutil pentru specii util pentru specii
redoxredoxnecesitnecesită ă modificarea modificarea
aparaturiiaparaturii
1010--1010 –– 1010--11111010--1818 –– 1010--1919AmpAmpeeromromeetrietrie
AvantaAvantajeje/ / inconvinconveenientnientee
LimitLimitee de de ddeetectecţie ţie ((moli/Lmoli/L)*)*
LimitLimitee de de ddeetectecţieţie((molmolii))
MMeetodtodaa
* pentru un volum injectat de 10 nl
© UMF Cluj - Radu Oprean 272005 - 2006
MMeetodetode de de ddeetectecţţiie (3)e (3)
sensiblsensiblăă şişi ofofererăăinformainformaţiiţii structuralestructurale
interfainterfaţăţă îîntrentre CE CE şişiMS MS complicomplicatcatăă
1010--88 –– 1010--991010--1616 –– 1010--1717SpectromSpectromeetrie de trie de masmasăă
AAltelte metodemetode::radioactivitradioactivitateate, , lentilelentile termitermicce, e, rreefractomfractomeetrie, trie, dicrodicroiismsm circulacircularr
universuniversalalăăsensibilitsensibilitateate mai mai
scscăăzutzută ă decât alte decât alte metodemetode
10 10 –– 100 100 mai mai scscăăzutzută ă ca şi ca şi la metoda la metoda directdirectăă
DDeetectitectiaa indirectindirectăăUVUVfluorimfluorimeetritriccăăampampeeromromeetritriccăă
AvantaAvantajeje/ / inconvinconveenientnientee
LimitLimitee de de ddeetectecţie ţie ((moli/Lmoli/L)*)*
LimitLimitee de de ddeetectecţieţie((molmolii))
MMeetodtodaa
* pentru un volum injectat de 10 nl