Effets biologiques de solutions de proteines ... · actuellement un grand interet du fait du role...

/. Embryo/, exp. Morph. Vol. 33, 4, pp. 1051-1066, 1975 1051Printed in Great Britain

Effets biologiques de solutions deproteines chromatiniennes non histoniques sur unsysteme embryonnaire en differentiation in vitro

Par C. MATHIEU,1 A.M. DUPRAT,2 M. H. DUPUY,1

P.FERRER,1 J. P. ZALTA1 ET J. C. BEETSCHEN2

Institut de Biochimie et de Genetique cellulaires du C.N.R.S. etLaboratoire de Biologie generate, Universite Paul-Sabatier, Toulouse, France

SUMMARYBiological effects of solutions of non-histone chromatin-associated proteins

on cell differentiation in vitro

Nuclear non-histone (NNH) proteins, both chromatin-associated and otherwise, have beenprepared in defined conditions, either from nuclei or from washed chromatin. When these NNHproteins are homospecific, they produce inhibitory effects on morphological differentiationof embryonic Urodelan Amphibian cells cultivated in vitro. When they are heterospecific,on the contrary, they have no action on the differentiation of those cells. It is concludedthat the effects of the non-histone proteins on cell differentiation depend upon therelationship between the animal species which is used to provide the proteins and that usedto provide the reactive material.

INTRODUCTION

L'etude de proteines chromatiniennes non histoniques (PCNH) presenteactuellement un grand interet du fait du role important, encore mal connu,qu'elles jouent dans la regulation de l'expression genique chez les Eucaryotes(McClure & Hnilica, 1972; Stein, Spelsberg & Kleinsmith, 1974). Par destechniques de reconstitution de chromatine et d'hybridation moleculaire, Paul& Gilmour (1968), Axel, Cedar & Felsenfeld (1973) ont montre l'existence d'unespecificite tissulaire de Faction des proteines chromatiniennes non histoniques(PCNH) sur la transcription. Kostraba & Wang (1970), Teng, Teng & Allfrey(1971), Spelsberg, Hnilica & Ansevin (1971), Kamiyama & Wang (1971) ontmis en evidence une stimulation des syntheses de RNA par les proteines nonhistoniques dans des systemes chromatiniens isoles. De plus, on sait d'apres lestravaux de Teng et al. (1970), Kleinsmith, Heidema & Carrol (1970), que certainesde ces proteines se lient plus fortement au DNA et que leur synthese varie aucours du cycle cellulaire (Stein & Baserga, 1970; Stein & Borun, 1972).

1 Adresse des auteurs: Institut de Biochimie et de Genetique du C.N.R.S., Universite Paul-Sabatier, 118, route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex, France.

2 Adresse des auteurs: Laboratoire de Biologie generate, Universite Paul-Sabatier, 118,route de Narbonne, 31077 Toulouse Cedex, France.

1052 C. MATHIEU AND OTHERS

Toutefois s'il semble maintenant que Ton puisse attribuer a certaines proteinesnon histoniques un role de controle dans l'expression genique, elles represententun systeme complexe dont l'analyse et l'etude des mecanismes d'action restenta faire. Les travaux precedemment cites realises sur des systemes chromatiniensmontrent le role des differentes proteines restructures au sein de la chromatine.Une des rares etudes in vivo de ces proteines est celle effectuee par Tuan, Smith,Folkman & Merler (1973) montrant qu'une fraction de proteines nucleaires nonhistoniques isolee d'un carcinome de rat provoque une activite mitotiqueimportante des cellules endotheliales de la cornee de lapin.

Pour notre part, etant donne qu'au cours d'une precedente experimentationnous avons mis en evidence un effet inhibiteur des PCNH issues d'un tissuheterologue sur la differenciation d'un systeme embryonnaire (Mathieu, Duprat,Zalta & Beetschen, 1972) il devenait interessant d'etudier les effets biologiquesde PCNH homospecifiques et heterospecifiques sur la differenciation de cescellules.

MATERIEL ET METHODES

Le foie nous a paru etre un materiel convenable pour extraire les proteineschromatiniennes non histoniques (PCNH) d'un tissu differencie. Nous les avonsdone isolees de cellules hepatiques d'Amphibien adulte (pleurodele, axolotl,grenouille), de Mammifere (rat), et de cellules de l'hepatome ascitique deZajdela.

Les noyaux sont obtenus selon une technique mise au point au laboratoire(Zalta, Zalta & Simard, 1971). Les PCNH sont isolees a partir de chromatine nonlavee, d'apres la methode de Wang (1967) modifiee par Kruh, Tichonicky &Wajcman (1969). Nous avons aussi procede a une extraction des PCNH a partirde chromatine lavee dans une solution tampon tris-HCl 0,05 M (pH 7,4).

Ces proteines constituent un groupe heterogene designe dans le texte par:PCNH totales. Leur dosage est effectue par la methode de Lowry, Rosebrough,Farr & Randall (1951), en utilisant la serumalbumine comme standard. Unpremier fractionnement par precipitations successives a differents pH selon latechnique de Wang (1967), a permis de separer les 4 fractions: f, RNP; f, PH:6;f, PH:5; et f, SO4(NH4)2 (Wang, 1967).

Les PCNH totales et leurs fractions ont ete analysees par electrophorese selonla methode de Davis (1964) en gels d'acrylamide a 8,4%, 0,1 % de sodium-dodecyl-sulfate et 4 M uree. La solution-tampon d'electrophorese est composeede Tris 0,025 M et glycocolle 0,2 M a pH 8,3.

Le marquage des PCNH est realise suivant la technique de David (1972)modifiee pour l'adapter a notre materiel. Les PCNH sont iodees par l'lode 125a l'aide de lactoperoxydase fixee sur Sepharose 4B active par du bromure decyanogene (Cuatrecasas, 1970). La reaction s'effectue sous agitation a 18 °Cpendant 8 a 10 minutes; en fin de reaction on elimine l'enzyme fixee, par centri-fugation et Fiode non fixe aux proteines, par chromatographie sur Sephadex G15.

Effets de proteines chromatiniennes non histoniques 1053

Les cellules embryonnaires provenant de la plaque neurale et du chordo-mesoderme sous-jacent d'embryons de Pleurodeles waltlii, stade 14, de la tablechronologique de Gallien & Durocher (1957), et d'Ambystoma mexicanum austade correspondant, sont cultivees isolees selon une technique precedemmentdecrite (Duprat, Zalta & Beetschen, 1966). Les cellules determinees mais nonencore morphologiquement differenciees appartiennent a differentes categories:il s'agit essentiellement de cellules nerveuses, musculaires, epitheliales et pig-mentaires qui se differencient simultanement dans la meme chambre de culture.

Apres fixation par les liquides de Zenker, Helly, Champy ou les vapeursosmiees, des colorations cytologiques et cytochimiques appropriees nous ontpermis de mettre en evidence divers constituants cellulaires: colorations auviolet cristal de Benda, a la fuchsine d'Altmann (chondriome), au vert solided'Alfert et Geschwind a pH: 8,2 (proteines basiques) et a pH: 2,4 (proteinesacides), au vert de methyle-pyronine de Unna (RNA, DNA), au Feulgen (DNA),au Noir Soudan et Rouge Soudan III (lipides) et Bleu de Nil (lipides acides)(Gabe, 1968).

Pour l'etude ultrastructurale, le materiel cellulaire est fixe in situ au formolneutre a 5 % dans une solution-tampon-phosphate de Sorensen (pH: 7,4), post-fixe au tetroxyde d'osmium a 1 % dans la meme solution-tampon. Apres inclu-sion dans l'Epon, des coupes sont effectuees a l'aide d'un microtome Reichert,colorees selon la technique de Reynolds (1963) et observees au microscopeHitachi HU 11 sous 100 kV.

Techniques autoradiographiques

(1) Les experiences d'incorporation sont realisees en procedant a une incuba-tion des cellules pendant 1 h en presence des precurseurs radioactifs (CEA,Saclay): uridine tritiee (activ. specif.: 21 Ci/mM) pour le RNA; leucine tritiee(activ. specif.: 18 Ci/mM) pour les proteines, avec une activite finale pour chacundes precurseurs de 5 /*Ci/ml de milieu de culture.

Les lamelles de culture sont alors detachees de la chambre, le milieu radioactifelimine, les cellules fixees par le melange de Carnoy, puis lavees dans un milieufroid. Les lamelles sechees sont montees sur lames gelatinees.

(2) Pour l'etude de la penetration des PCNH dans les cellules, celles-ci sontincubees pendant des durees variant de 3 h 30 a 16 h en presence des PCNHiodees. Apres plusieurs lavages, elles sont fixees par une solution de formolneutre a 5 % dans le tampon phosphate de Sorensen (pH: 7,4), puis lavees dansplusieurs bains de solution-tampon pendant 48 h et post-fixees par le tetroxyded'osmium. Apres des deshydratations dans l'ethanol, les cellules sont inclusesdans l'Epon. Des coupes de 1500 A sont montees sur lames gelatinees.

L'emulsion Ilford L 4 est coulee directement sur les preparations en unecouche de 30 /mi d'epaisseur apres sechage, exposee a l'abri de la lumiere a 4 °Cet en atmosphere deshydratee pendant un temps approprie.

L'observation des autoradiographies est effectuee en microscopie photonique.


RESULTATS

Etude des effets des PCNH

Nous avons effectue trois types d'experiences:(1) Combinaisons homospecifiques: les cellules de pleurodele sont traitees

par des PCNH de pleurodele, de meme que les cellules d'axolotl sont traitees pardes PCNH d'axolotl.

(2) Combinaisons heterospecifiques: les cellules de pleurodele et d'axolotlsont traitees par des PCNH de rat et de grenouille.

(3) Combinaisons heterospecifiques croisees entre deux especes proches: lescellules de pleurodele sont traitees par des PCNH d'axolotl et les cellules d'axolotlsont traitees par des PCNH de pleurodele.

Les concentrations utilisees sont comprises entre 30 /.ig et 100 ̂ g/ml de milieude culture. Des concentrations inferieures a 30 /tg/ml sont sans action apparentesur le comportement et revolution des cellules traitees; par contre, des concen-trations superieures a 100 /*g/ml entrainent une degenerescence rapide de tousles types de, cellules traitees qui traduit une cytotoxicite non specifique.

Ainsi done, nous avons retenu pour nos experiences ulterieures une concentra-tion moyenne de 50 /*g/ml qui permet une survie normale des cellules.

Plusieurs modes de traitement des cellules par la solution de PCNH ont eteutilises. Quand le traitement par des PCNH homospecifiques ou heterospeci-fiques debute lors de leur mise en culture, le pourcentage de cellules qui s'etalentsur le fond de la chambre par rapport au nombre total de cellules mises enculture est tres faible. Pour ces raisons nous avons adopte un deuxieme mode detraitement, qui consiste a trailer les cellules immediatement apres leur etalement,soit avant que la differentiation morphologique n'apparaisse, soit apres quecelle-ci a debute. La duree du traitement varie de quelques heures (1,3, 6, 8,16 h)a plusieurs jours (traitement continu). Ce travail a necessite 50 series experi-mentales comportant environ 1000 cultures traitees et autant de cultures temoins.Chaque culture est constitute de plusieurs centaines de cellules parmi lesquelles10 % approximativement sont des neurones (Duprat, 1910 a, b). Ces derniersne sont reconnaissables qu'apres differenciation morphologique.

I. Effets des proteines homospecifiques sur des cellules embryonnaires de pleurodele

(a) Lorsque des cellules morphologiquement indifferenciees de pleurodele sonttraitees par des PCNH totales de pleurodele la differenciation des cellulesattachees est fortement perturbee ou totalement inhibee. Le traitement empechetoute differenciation de neuroblastes alors qu'il ne fait que retarder de deux atrois jours celle des myoblastes (Fig. 3). D'autre part, si le traitement debutelorsque les cellules ont deja amorce leur differenciation morphologique, lesprolongements axoniques des neurones degenerent rapidement (Figs. 4, 5), leretard a la differenciation myofibrillaire etant dans ce cas pratiquement inexistant.Excepte pour une duree de traitement de 1 h qui n'affecte pas revolution des


Photographies effectuees sur le vivant en contraste de phase.Fig. 1. Cellule musculaire temoin de Pleurodele, differenciee en culture in vitro.Fig. 2. Myoblaste de Pleurodele traite avant sa differenciation morphologique pardes proteines acides d'hepatome ascitique de Rat (50 /ig/ml).Fig. 3. Myoblaste de Pleurodele, traite avant l'apparition de sa differenciationmorphologique par des proteines acides de foie de Pleurodele (50/tg/ml); la striationmyoftbrillaire est apparue.Fig. 4. Neurone temoin de Pleurodele presentant un axone en cours de formation.Fig. 5. Terminaison axonique d'un neurone de Pleurodele, traite par des proteinesacides de foie de Pleurodele (50 /Wg/ml). Le traitement qui a debute alors que ladifferenciation morphologique du neurone etait deja amorcee, entraine la degener-escence de la cellule.

ax, axone; cc, corps cellulaire; my, myofibrilles striees; N, noyau; v, vacuoles.


diverses categories cellulaires, les resultats obtenus sont comparables quelle quesoit la duree du traitement (3 h, 6 h, 8 h, 16 h ou plusieurs jours).

(b) De nombreux auteurs (cf. Stein et al. 1974) ont montre que les PCNH sonttres heterogenes et presentent une specificite tissulaire et une specificite lieea l'espece.

Le grand nombre et la quantite de proteines de faibles poids moleculairesobserves sur les electrophoregrammes de PCNH issues de foie d'axolotl et depleurodele rendent difficile la comparaison entre ces deux especes. Les electro-phoregrammes ne paraissant pas presenter de differences fondamentales, il estpossible que la specificite des effets observes soit liee a des fractions mineures quine peuvent etre clairement mises en evidence par la technique electrophoretiqueutilisee.

Des differences apparaissent plus nettement quand on compare les electro-phoregrammes de PCNH de foie d'Urodeles et ceux de foie de Rat. Des essaispreliminaires de fractionnement chimique (cf. Materiel et techniques) et l'etudedes quatre fractions obtenues montrent que l'effet sur la differentiation morpho-logique est lie a une seule fraction: f. SO4(NH4)2. Comme les electrophoreses engels de polyacrylamide permettent de le constater, cette fraction est encore tresheterogene, la plus grande partie des bandes observees sur les electrophore-grammes des PCNH totales s'y retrouvent.

(c) Controles. Pour s'assurer qu'il s'agit d'une action par les proteines elles-memes, nous avons verifie que, utilisee seule, la solution-tampon Tris HC10,05 Ma pH: 8,5 dans laquelle les proteines sont solubilisees est inactive sur le materielbiologique. Un dosage du DNA dans la solution des PCNH totales par latechnique de Giles & Myers (1965) par reaction avec la diphenylamine permet deconclure, dans les limites de la sensibilite de la technique, a la non-contaminationpar le DNA. Un dosage du RNA a l'orcinol de cette meme solution a montreune contamination variable de RNA (12 a 14 %).

Cependant ce RNA peut etre elimine par hydrolyse. La solution de PCNHa alors ete incubee pendant 1 h a 37 °C en presence de RNase (RNase A(Worthington) + RNase T (Sigma)) fixee sur sepharose (Cuatrecasas, 1970). Dansces conditions les PCNH ainsi debarrassees du RNA (et sans contaminationpar la RNase), produisent les memes effets biologiques, ce qui laisse penser quele RNA qui la contamine n'est probablement pas en cause.

La fraction active f: SO4(NH4)2 provoque les memes effets que les PCNHtotales. 11 etait important de controler si cette fraction n'etait pas contamineepar des histones. Or cette fraction precipitee a un pH de 1,2 s'est revelee etretoujours biologiquement active. II semble done peu probable que le precipiteactif soit constitue d'histones. Par ailleurs des experiences de combinaisons entreles PCNH et des histones sont en cours. Les premiers resultats obtenus dans desconditions de concentrations ou les histones seules n'agissent pas, laissentpenser que les effets observes ne sont pas ceux de complexes PCNH-histones,bien que cette eventualite ne puisse etre totalement exclue.


II. Effets des proteines heterospecifiques sur descellules embryonnaires de pleurodele

Lorsque des cellules de pleurodele sont cultivees (selon les modalites experi-mentales decrites) dans un milieu contenant des PCNH totales extraitesd'hepatome ascitique ou de foie de rat, espece zoologiquement tres eloignee,ou meme de foie de grenouille, espece plus proche, nous constatons que leurdifferenciation morphologique se deroule normalement sans aucun retard parrapport aux cellules temoins (Fig. 2). Des resultats semblables sont encoreobtenus si les cellules de pleurodele sont traitees par les PCNH de foie d'axolotl,espece beaucoup plus voisine du pleurodele que les precedentes, mais apparte-nant cependant a une famille differente.

III. Extension de Vetude de Vaction des proteines heterospecifiqueset homospecifiques a des cellules embryonnaires d'axolotl

Afi.n de savoir si l'effet perturbateur sur la differenciation etait lie a desproprietes particulieres des PCNH de pleurodele, nous avons etudie Faction deces proteines sur des cellules embryonnaires d'axolotl. Dans ce cas, ces cellulesse sont differenciees normalement. D'autre part, traitees dans des conditionsidentiques par les PCNH de foie de rat ou de grenouille, ces cellules d'axolotlse differencient comme le font les cellules de pleurodele en presence de proteinesheterospecifiques et les observations precedentes peuvent leur etre appliquees(schema 1). Au contraire les cellules embryonnaires d'axolotl traitees par lesPCNH de foie d'axolotl presentent les memes perturbations de leur differencia-tion que les cellules de pleurodele traitees par les PCNH de pleurodele.

Ainsi done, seules les PCNH extraites defoie de pleurodele perturbent profonde-ment la differenciation des cellules de pleurodele et seules les PCNH extraitesde foie d'axolotl perturbent la differenciation des cellules d'axolotl.

Par consequent, il semble que l'effet inhibiteur des PCNH sur la differencia-tion morphologique des cellules embryonnaires d'Amphibiens soit bien liea l'espece utilisee a la fois comme source de proteines et comme materielreactif (schema 1).

PCNH de foie de: Neuroblastes de:_ - -»- Pas d'effet

Pleurodele r *- Pleurodele •<^"""""""

\? ^ > Inhibition de la croissances' ""V ^*^^ des axones

Axolotl *• i»- Axolotl «<rC.Pas d'effet

Effets des proteines homospecifiques

Effets des proteines heterospecifiques

Schema 1. Experiences sur deux especes d'amphibiens.


IV. Effets cytologiques

Sous l'action du traitement, quel que soit le type de proteines utilisees,homospecifiques ou heterospecifiques, des alterations morphologiques identiquesse manifestent. Elles sont de deux sortes; les unes peuvent etre aussi bien obser-vees sous l'action de divers autres traitements: telles sont les modifications dela morphologie mitochondriale (Fig. 7) l'heterogeneite nucleaire ou l'alterationnucleolaire (Fig. 8); les autres semblent particulieres aux PCNH, telle l'appari-tion d'inclusions cytoplasmiques fortement contrastees, dans les myoblastesprincipalement (Fig. 9).

Une etude ultrastructurale nous a permis de detecter un effet sur les mitochon-dries qui pour certaines, presentent une disparition presque totale des cretesmitochondriales (Fig. 12); de meme le reticulum endoplasmique des cellulestraitees est fortement dilate et plus particulierement dans la zone perinucleaire(Figs. 10, 11).

Dans le cas des PCNH homospecifiques, les effets cytologiques apparus sousl'action de la fraction active seule sont moins marques que ceux provoques parles PCNH totales. De plus, que les PCNH soient directement extraites selon lamethode de Wang ou a partir de chromatine isolee de noyaux ouverts dans lasolution tris-HCl, ces deux types d'effets biologiques sont les memes.

V. Effets sur les syntheses de RNA et de proteines

Afin de savoir si le traitement par les PCNH homospecifiques entraine desperturbations des syntheses globales des RNA et des proteines cellulaires,nous avons fait des incorporations d'uridine et de leucine tritiees. Avant quen'apparaisse la differentiation morphologique, les cellules sont traitees pendant24 a 48 h par les PCNH homospecifiques a la concentration active ou par les PCNHheterospecifiques a la meme concentration, puis incubees pendant 1 h en presenced'uridine tritiee et de PCNH homospecifiques ou heterospecifiques. Les cellulestemoins sont incubees en meme temps en presence d'uridine tritiee seulement.Une analyse statistique du marquage, portant pour chacune des series traitee ettemoin sur 200 noyaux repartis en quatre cultures, est effectuee. L'utilisation dutest de Mann-Whitney nous a permis de montrer qu'il n'y a pas de differencesignificative entre les taux d'incorporation dans les cellules traitees et dans lescellules temoins. De meme, on ne decele pas de difference significative entre lemarquage des cellules traitees par les PCNH homospecifiques et celui des cellulestraitees par les PCNH heterospecifiques (Tableau 1).

II n'y a pas non plus de difference significative dans le marquage des cellulestraitees et temoins incubees en presence de leucine tritiee.

VI. Etude de la penetration des PCNH

Dans le but de mieux analyser les effets observes, il est fondamental de savoirsi les PCNH penetrent dans la cellule. Les autoradiogrammes de cellules traitees


Photographies effectuees sur Je vivant en contraste de phase.

Fig. 6. Cellule temoin de Pleurodele presentant un noyau d'aspect homogene et unchondriome constitue de filaments courts et flexueux.Fig. 7. Cellule de Pleurodele traitee par des PCNH de foie de Pleurodele (50 /tg/ml),chondriome constitue de filaments longs et anastomoses.Fig. 8. Noyau de cellule de Pleurodele traitee par des PCNH de foie de Pleurodele(60/<g/ml); chromatine en amas tres contrasted, morphologie nucleolaire alteree,epaississements importants de la membrane nucleaire.Fig. 9. Inclusions cytoplasmiques apparues dans une cellule de Pleurodele traitee pardes PCNH de foie de Pleurodele (50 /^g/ml). Chondriome en filaments tres allonges.

ch, chondriome; chr, chromatine; /, inclusions cytoplasmiques; mn, membranenucleaire; N, noyau; n, nucleole; pv, plaquettes vitellines.

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Fig. 10. Cellule de Pleurodele traitee par une solution de PCNH heterospecifiques(les solutions de PCNH homospecifiques ou heterospecifiques produisent les memeseffets). Reticulum endoplasmique tres dilate.Fig. 11. Cellule de Pleurodele traitee par une solution de PCNH. Reticulum endo-plasmique granulaire tres dilate.Fig. 12. Mitochondries d'une cellule de Pleurodele traitee. Disparition d'une partiedes cretes mitochondriales.Fig. 13. Mitochondries d'une cellule de Pleurodele non traitee. Reticulum endo-plasmique normal.

RE, reticulum endoplasmique; m, mitochondrie; TV, noyau.


Tableau 1. Incorporation de [3H]uridine par des cellules traitees et temoins

Moyenne des observationseffectuees par noyau surchaque culture temoin (xlti)

Nombre d'observations

Cultures temoins

36,48

50

Cultures traitees PCNHMoyennes des observationseffectuees par noyau surchaque culture traitee (x2>i)


34,04

50

Cultures traitees PCNHMoyennes des observationseffectuees par noyau surchaque culture tiaitee (x3i)


36,18

50

36,74

50

homospecifiques33,42

50

heterospecifiques35,58

50

43,86

50

38,00

50

32,16

50

35,10

50

35,52

50

34,32

50

L'utilisation du test de Mann-Whitney nous permet de constater que, pour un seuilefficace de 5 %, les limites etant ta = 10 et t'a = 26, nous avons:

Comparaison temoin-pleurodeletx = 14; t2 = 22; ta < tx < t2 < t'a (10 < 14 < 22 < 26).

La difference entre tx et /2 n'est pas suflfisamment grande pour qu'il faille raisonnablementl'imputer a une difference entre les fonctions de repartition de Xx et X2 (Duprat & Mathieu,1969).

II semble done que Je traitement n'a pas eu d'effet sur les cellules.

Comparaison temoin-ascitetx = 12; t2 = 24; tot < tx < t2 < t'a (10 < 12 < 24 < 26).

Dans ce cas encore, la difference entre tx et t2 n'est pas suffisante pour etre imputee a unedifference entre les fonctions de repartition de Xx et X3. Le traitement ne semble pas avoird'effet sur les cellules.

Comparaison ascite-pleurodelet1 = tt = 18; ta < tu h < t'a.

10 < 18 < 26.Le traitement ne semble pas avoir d'effet sur les cellules.

pendant des durees de 3 h 30, 4 h, 5 h, 16 h par les PCNH iodees homospeci-fiques ou heterospecifiques ont revele un marquage significatif essentiellementlocalise dans le cytoplasme (Mathieu et ah, en preparation).

DISCUSSION

Le present travail permet de mettre en evidence deux types d'effets:(1) Des effets non specifiques, tel celui sur l'attachement des cellules et ceux

se traduisant par les diverses anomalies cytologiques.66-2


En effet si le traitement des cellules par des PCNH homospecifiques etheterospecinques commence lors de la mise en culture, lagrande majorite d'entreelles ne s'attachent pas, contrairement a ce qui se passe dans les cultures temoins.Lorsque le traitement debute apres etalement des cellules sur leur support, unepartie (50 %) s'en detache dans les 24 h qui suivent. Ces observations suggerentdone un effet des PCNH sur le processus d'attachement des cellules. De raemeles anomalies cytologiques sont communes aux deux types de proteines, hetero-specifiques et homospecifiques.

11 importe d'insister sur le fait que lorsque les cellules se differencient, letraitement n'altere pas de facon profonde leur dififerenciation (myoblastes parexemple), les efifets non specifiques n'empechant pas la differenciation morpho-logique normale des cellules. L'effet specifique nous parait alors interessanta discuter.

(2) Cet effet specifique sur la differenciation se manifeste apres l'attachementdes cellules. Les PCNH homospecifiques perturbent profondement l'apparitionet le deroulement de la differenciation morphologique des cellules alors que lesPCNH heterospecifiques sont sans effet. La differenciation des neuroblastes esttotalement inhibee; dans les myoblastes, la differenciation myofibrillaireapparait generalement, mais avec du retard par rapport a celle des myoblastestemoins. Comme cela a ete montre par immunofluorescence et apres actioncombinee de divers inhibiteurs des syntheses de RNA et de proteines (Duprat,19706; Duprat, Romanovsky, Hurichova & Macha, \915a,b), ce dernier typecellulaire possede des m-RNA de longue duree qui dirigeraient la synthesedes proteines de structure du systeme contractile. Par contre il semble qu'unesynthese continue de RNA soit indispensable pour assurer la differenciation descellules nerveuses. Nous insistons done sur le fait que, chez les Amphibienstout au moins, l'inhibition de la differenciation morphologique des neuroblastesen culture, par des PCNH extraites de cellules hepatiques, est liee a l'especeutilisee a la fois comme source de ces proteines et comme materiel reactif.Lorsque les PCNH sont issues d'un systeme biologique zoologiquement eloigne(Mammifere) ou plus proche (Anoure), ou meme relativement voisin dusysteme reactif (autre Urodele), Faction inhibitrice ne se manifeste pas, bienque les effets cytologiques observes dans tous ces cas soient identiques a ceuxnotes sous Faction des PCNH homospecifiques.

Une analyse electrophoretique des solutions de PCNH etudiees, montreque, pour un meme tissu, elles different d'une espece a l'autre. Toutefois cesdifferences sont moins marquees entre especes tres voisines, comme le pleurodeleet l'axolotl, qu'entre classes zoologiques differentes comme celle des Amphibienset des Mammiferes.

En outre, les divers controles effectues ont tous ete negatifs, ce qui permet desupposer que le facteur biologiquement actif est lie aux proteines non histoniqueset non a des histones; en particulier ces dernieres ne presentent pas de specificite(Duprat & Mathieu, 1975). De plus Faction d'un complexe PCNH-histone ne


peut etre exclue, compte-tenu des resultats concernant les effets des histonessur le systeme cellulaire utilise (Duprat & Mathieu, 1975).

II importait de savoir s'il etait possible de mettre en evidence une alterationde la biosynthese des acides nucleiques et des proteines sur ce systeme biologique,par les PCNH. Le fait que la striation myofibrillaire apparaisse dans les myo-blastes qui, par ailleurs, presentent de profondes alterations cytologiques duesau traitement, laisse penser que, tout au moins dans ce type cellulaire, la traduc-tion n'est pas inhibee. Les RNA messagers deja synthetises dans ces cellulessont apparemment traduits normalement puisque Ton voit se former et s'organ-iser les filaments d'actine et de myosine. Une etude autoradiographique del'incorporation de leucine tritiee par des cellules traitees et temoins nousa egalement permis de constater une intensite de marquage identique dans lesdeux cas. II semble done que les PCNH ne perturbent pas le processus detraduction lui-meme.

Comme nous n'avons pas constate de difference significative dans le tauxd'incorporation d'uridine tritiee par des cellules traitees et temoins, il sembledone que le traitement par des PCNH homospecifiques et heterospecifiquesn'entraine pas de perturbations dans les syntheses globales des RNA.Cependant, ces recherches ne represented qu'une approche dans l'etude de labiosynthese des RNA et celle des proteines car, si Faction des PCNH homo-specifiques se traduit par une perturbation dans la synthese d'unnombre discretd'especes de RNA ou de proteines, il n'est pas possible de la mettre en evidencepar la technique utilisee. De meme les resultats concernant l'etude de la pene-tration mettent en evidence une localisation du marquage au niveau cyto-plasmique. Mais on ne peut affirmer, malgre la localisation essentiellementcytoplasmique de ces PCNH, qu'une fraction non decelable par autoradio-graphie ne penetre neanmoins dans le noyau et soit suffisante pour entrainer lesperturbations que nous constatons. D'autre part, etant donne que les PCNHiodees provoquent les memes effets que les PCNH non iodees, on peut enconclure que l'iodation dans les conditions pratiquees n'est pas denaturante,tout au moins quant aux effets observes.

La plupart des travaux effectues sur les PCNH montrent qu'une partie decelles-ci jouent un role de controle positif dans la modulation de l'expressiongenique. De plus l'addition de PCNH a un systeme acellulaire chromatinien desynthese de RNA in vitro, conduit a une stimulation de celle-ci et la compositionen nucleotides de ce RNA differe selon que les PCNH appartiennent ou nona la meme espece que le DNA entrant dans le systeme de synthese considere(Wang, 1968; Kostraba & Wang, 1972, 1973; cf. Stein et al. 1974).

Selon les travaux de Kruh et al. (1969) il existerait dans les cellules differ-enciees des proteines nucleaires acides qui empecheraient, de maniere specifique,la traduction de messagers en se combinant a eux avant que la traduction nedebute.

En conclusion, l'effet specifique que nous constatons ne peut etre actuellement66-2


explique avec ce systeme biologique mais nous pouvons emettre plusieurs hypo-theses quant au niveau cellulaire ou cet effet s'exercerait.

(1) Soit au niveau de l'expression des genes. Si les proteines penetrent dansle noyau il suffit peut-etre d'une tres faible quantite de PCNH pour modifier latranscription des genes. Dans ce cas, ces PCNH exerceraient un controlenegatif.

(2) Soit au niveau de la traduction. Etant donne les resultats de la penetration,cette derniere hypothese semble plus probable. Dans ce cas il est interessant desouligner l'existence d'un effet inhibiteur sur la differenciation des cellulesa messagers a vie courte (neuroblastes) alors que celui-ci ne se manifeste pasdans le cas de cellules a messagers a vie longue (myoblastes); ceci suggere uneaction des PCNH au niveau du 'processing' des m-RNP qui ne pourraient alorss'exprimer. D'autre part, la technique d'extraction des PCNH utilisee negarantit pas que les proteines qui agissent ne se situent pas au niveau desm-RNP.

Par ce travail, nous avons done pu mettre en evidence le fait remarquablequ'un tissu adulte tel que le tissu hepatique produit des PCNH inhibant ladifferenciation d'autres types cellulaires dans la meme espece animale, alors queces PCNH stimulent la differenciation du tissu hepatique embryonnaire (Duprat,Houssaint, Suignard & Zalta, 1975).

Ce travail a ete realise dans le cadre de contrats du C.N.R.S. (A.T.P. 4310 sur la differen-ciation cellulaire et E.R.A. n° 327) et de 1'INSERM (n° 711019). C. Mathieu est Chargeede Recherches INSERM.

TRAVAUX CITES

AXEL, R., CEDAR, H. & FELSENFELD, G. (1973). Synthesis of globin ribonucleic acid from duckreticulocyte chromatin in vitro. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A. 70, 2092-2032.

CUATRECASAS, P. (1970). Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations ofagarose and polyacrylamide beads. / . biol. Chem. 245, 3059-3065.

DAVID, G. S. (1972). Solid state lactoperoxidase: a highly stable enzyme for simple, gentleiodination of proteins. Biochem. biophys. Res. Commun. 48, 464-471.

DAVIS, B. J. (1964). Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins.Ann. N.Y. Acad. Sci. 121, 404-427.

DUPRAT, A. M. (1970#). Recherches sur la differenciation de cellules embryonnaires d'Uro-deles en culture in vitro. Annls Embryol. Morph. 3, 411-423.

DUPRAT, A. M. (19706). Action de la puromycine et d'une substance analogue sur la differen-ciation de cellules embryonnaires d'Amphibiens cultivees /// vitro. J. Embryol. exp. Morph.24, .119-138.

DUPRAT, A. M., HOUSSAINT, E., SUIGNARD, G. & ZALTA, J. P. (1975). Specificite tissulairedes effets de proteines chromatiniennes non histoniques sur la differenciation d'organesembryonnaires en culture in vitro. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris D 280, 1143-1146.

DUPRAT, A. M. & MATHIEU, J. R. (1969). Analyse statistique de l'etude autoradiographiquedes effets de faibles concentrations de puromycine sur 1'incorporation d'acides amines dansdes cellules embryonnaires d'Amphibiens cultivees in vitro. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci.,Paris D 268, 823-825.

DUPRAT, A. M. & MATHIEU, C. (1975). Etude comparative des effets morphologiquesd'histones et de proteines chromatiniennes non histoniques sur des cellules embryon-naires en differenciation in vitro. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris D 280, 483-486.

Effets de proteines chromatiniennes non histoniques 1065DUPRAT, A. M., ROMANOVSKY, A., HURICHOVA, D. & MACHA, J. (1975a). Immuno-

flourescence studies on the appearance of myosin and actin during in vitro differentia-tion of amphibian myoblasts. Experientia (sous presse.)

DUPRAT, A. M., ROMANOVSKY, A., HURICHOVA, D. & MACHA, J. (19756). Immuno-flourescence studies on amphibian myoblasts differentiation. /. Embryol. exp. Morph.(sous presse.)

DUPRAT, A. M., ZALTA, J. P. & BEETSCHEN, J. C. (1966). Action de l'actinomycine D sur ladifferenciation de cellules embryonnaires de l'Amphibien Pleurodeles waltlii;en culture invitro. Expl Cell Res. 43, 358-366.

GABE, M. (1968). Techniques histologiques. Paris: Masson.GALLIEN, L. & DUROCHER, M. (1957). Table chronologique du developpement chez Pleuro-

deles waltlii Michah. Bull. biol. Fr. Belg. 91, 97-114.GILES, K. W. & MYERS, A. (1965). An improved diphenylamine method for the estimation

of deoxyribonucleic acid. Nature, Lond. 206, 93.KAMIYAMA, M. & WANG, T. Y. (1971). Activated transcription from rat liver chromatin by

non-histone proteins. Biochim. biophys. Acta 228, 563-576.KLEINSMITH, L. J., HEIDEMA, J. & CARROL, A. (1970). Specific binding of rat liver nuclear

proteins to DNA. Nature, Lond. 226, 1025-1026.KOSTRABA, N. C. & WANG, T. Y. (1970). Tissue variation of acidic nuclear proteins and their

biosynthesis during liver regeneration. Int. J. Biochem. 1, 327-334.KOSTRABA, N. C. & WANG, T. Y. (1972). Differential activation of transcription of chromatin

by non-histone fractions. Biochim. biophys. Acta 262, 169-180.KOSTRABA, N. C. & WANG, T. Y. (1973). Non-histone proteins and gene activation in regener-

ating rat liver. Expl Cell Res. 80, 291-296.KRUH, J., TICHONICKY, L. & WAJCMAN, H. (1969). Action des proteines acides du noyau sur

la synthese acellulaire de Phemoglobine et sur les RNA. Biochim. biophys. Acta 195, 549-562.

LOWRY, O. M., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L. & RANDALL, R. J. (195.1). Protein measure-ment with the Folin phenol reagent. J. biol. Chem. 193, 265-275.

MATHIEU, C, DUPRAT, A. M., ZALTA, J. P. & BEETSCHEN, J. C. (1972). Effets de proteinesnucleaires non histoniques sur des cellules embryonnaires d'Amphibiens cultivees in vitro.C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris 21 A, 292-294.

MCCLURE, M. E. & HNILICA, L. S. (1972). Nuclear proteins in genetic restriction. III. Thecell cycle. SubCell Biochemistry 1, 311-332.

PAUL, J. & GILMOUR, R. S. (1968). Organ-specific restriction or transcription in mammalianchromatin. /. molec. Biol. 34, 305-316.

REYNOLDS, E. S. (1963). The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain inelectron microscopy. / . Cell Biol. 17, 208-213.

SPELSBERG, T. C, HNILICA, L. S. & ANSEVIN, A. T. (1971). Proteins of chromatin in templaterestriction. III. The macromolecules in specific restriction of the chromatin DNA. Biochim.biophys. Acta 228, 550-562.

STEIN, G. & BASERGA, R. (1970). Continued synthesis of non-histone chromosomal proteinsduring mitosis. Biochem. biophys. Res. Commun. 41, 715-722.

STEIN, G. S. & BORUN, K. W. (1972). The synthesis of acidic chromosomal proteins duringthe cell cycle of Hela S-3 cells. / . Cell Biol. 52, 292-307.

STEIN, G. S., SPELSBERG, T. C. & KLEINSMITH, L. J. (1974). Non histone chromosomal proteinsand gene regulation. Science, NY. 183, 817-824.

TENG, C. T., TENG, C. S. & ALLFREY, V. G. (1970). Species-specific interactions betweennuclear phosphoproteins and DNA. Biochem. biophys. Res. Commun. 41, 690-696.

TENG, C. S., TENG, C. T. & ALLFREY, V. G. (1971). Studies of nuclear acidic proteins. Evidencefor their phosphorylation, tissue specificity, selective binding to deoxyribonucleic acid andstimulatory effects on transcription. / . biol. Chem. 246, 3597-3609.

TUAN, D., SMITH, S., FOLKMAN, J. & MERLER, E. (1973). Isolation of the non histone proteinsof rat Walker carcinoma. Their association with tumor angiogenesis. Biochemistry, N. Y.12, 3159-3165.

66-3


WANG, T. Y. (1967). The isolation properties and possible functions of chromatin acidicproteins. / . biol. Chem. 242, 1220-1226

WANG, T. Y. (1968). Restoration of histone-inhibited DNA-dependent RNA synthesis byacidic chromatin proteins. Expl Cell Res. 53, 288-291.

ZALTA, J., ZALTA, J. P. & SIMARD, R. (1971). Isolation of nucleoli. / . Cell Biol. 51, 563-568

(Recu le 11 decembre 1974, revise le 23 Janvier 1975)

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