Efeitos de diferentes sistemas de cultivo in vitro sobre o ...

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Braz. J. vet. Res. anim. Sci., São Paulo, v. 44, suplemento, p. 134-143, 2007

Efeitos de diferentes sistemas de cultivo in vitrosobre o crescimento de folículos pré-antrais

isolados de ovários de fetos bovinos

1 - Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária eZootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo-SP2 - Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal daFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista,Jaboticabal-SP

Andréa Cristina BASSO1

Joaquim Mansano GARCIA2

Cesar Roberto ESPER2

Correspondência para:Rua Abdo Muanis 1101, apto 74.Cep: 15090-140. Bairro NovaRedentora. São José do Rio Preto-SP;e-mail: [email protected]

Recebido para publicação: 22/11/2005Aprovado para publicação: 26/03/2007

Resumo

O objetivo deste estudo foi aplicar diferentes sistemas de cultivo invitro para folículos pré-antrais de fetos bovinos da raça Nelore noúltimo trimestre de gestação e para identificar o sistema mais eficientedurante o crescimento dos folículos isolados. Para isso, folículos pré-antrais foram isolados mecanicamente e submetidos ao cultivoindividual, por 9 dias, em meio não suplementado ou suplementadocom soro fetal bovino (SFB), albumina sérica bovina (BSA) ousuplemento definido sintético substituto do soro KnockoutSR(KNO). Avaliou-se ainda, o efeito do gel de colágeno ou monocamadade fibroblastos fetais bovinos como substrato para o cultivo in vitro.A avaliação do aumento de diâmetro folicular foi realizada no dia dacolheita (0 hora) e a cada 72 horas de cultivo. A associação entre meiosuplementado com SFB e uso de gel de colágeno como substratoforam significativamente mais efetivos sobre o aumento do diâmetrofolicular quando comparados aos demais tratamentos. Quandofragmentos de tecido ovariano foram submetidos ao cultivo in vitro,não houve preservação da ultraestrutura folicular por mais de 3 diasde cultivo, em qualquer dos tratamentos utilizados. Ainda não estáestabelecido um sistema de cultivo adequado que sustente adiferenciação e multiplicação das células da granulosa e que mantenhao contato das mesmas com o oócito para prover moléculas e fatoresque supram a demanda metabólica. Entendemos que esta pesquisaapresentou avanços promissores na busca pelo estabelecimento umsistema de cultivo in vitro de folículos pré-antrais em bovinos.

Palavras-chave:Folículo pré-antral.Cultivo in vitro.Feto.Bovino.

Introdução

Muitos estudos sobre a fisiologiaovariana concentram-se nos estádiosterminais do desenvolvimento folicular edemonstram os vários mecanismosendócrinos, parácrinos e autócrinos queregulam o crescimento folicular.1,2,3,4 Poroutro lado, as pesquisas sobre os fatores quecontrolam o início do desenvolvimento dofolículo primordial ao longo da fase pré-antral ainda são limitadas, principalmente noque se refere às espécies monovulares, comobovinos e humanos, os quais necessitam de

vários meses para que os folículosprimordiais cheguem ao estádio antral. Maisrecentemente, os estudos têm se voltado parao entendimento dos fatores que controlama foliculogênese inicial com auxílio deprotocolos para cultivo in vitro de folículospré-antrais de diferentes espécies, comoroedores5, suínos6, bovinos7, humanos8 epequenos ruminantes9. Nestas espécies, osesforços resultaram em nascimentos de prolea partir de folículos desenvolvidos ematurados in vitro. Entretanto, desenvolverin vitro folículos pré-antrais, requermonitoramento constante dos fatores

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envolvidos no seu crescimento durante todoo período de cultivo.10

Durante a transição folicular doestádio primordial para o secundário, já foidemonstrado em estudos anteriores 11 aocorrência de uma série de modificaçõescitoplasmáticas no oócito, as quaisrepresentam processos precursores damaturação. Nesse sentido, a aquisição eestocagem de várias formas de RNA eproteínas são indispensáveis para o futurodesenvolvimento folicular.12 O Soro FetalBovino (SFB) e a Albumina Sérica Bovina(BSA) são comumente adicionados aosmeios de cultivo como suplemento deproteínas com o objetivo de melhorar aeficiência do sistema, embora variaçõesdestas fontes protéicas produzam efeitosdivergentes durante o cultivo.13

O desenvolvimento in vitro defolículos pré-antrais de camundongos14,bovinos 7 e suínos 15 foram conduzidos comgel de colágeno e mostraram eficiência namanutenção da estrutura tridimensional dosfolículos. Folículos primordiais e primários,isolados de ovários humanos e cultivadosem gel de colágeno apresentaramcrescimento apenas nas primeiras 24 horas16 denotando a escassez de recursos para amanutenção da viabilidade folicular.Tentativas têm sido feitas para determinarem qual estádio do desenvolvimento osfolículos pré-antrais tornam-se dependentesde FSH, bem como qual seria a dose a serutilizada in vitro para obtenção de resultadosefetivos. Adriaens, Cortvrindt e Smitz17

obtiveram embriões viáveis a partir deoócitos de folículos pré-antrais decamundongo cultivados in vitro, com 10mUI/ml de FSH recombinante em todo operíodo de cultivo, desde a fase pré-antral.

Considerando o domínio destasbiotecnologias, haveria a possibilidade de seexplorar os estoques de oócitos inclusos emfolículos pré-antrais a fim de se fornecermaterial para técnicas de reprodução assistidamais complexas e tratamento de infertilidadeclínica 18, bem como no melhoramentogenético de animais de produção 19. Diantedas dificuldades em se estabelecer

protocolos eficientes para a produção deoócitos viáveis a partir de folículos pré-antrais de animais como os bovinos, amaioria dos estudos é de caráter investigativoe ainda não têm aplicação prática.20

O objetivo deste trabalho foi verificaro efeito de três diferentes suplementaçõesprotéicas em combinação com um substratoà base de colágeno ou uma monocamadade fibroblastos, sobre a taxa de crescimentoin vitro de folículos pré-antrais de fetosbovinos, durante 216 horas de cultivo.

Material e Método

Colheita dos Ovários e IsolamentoFolicular

Ovários de fetos bovinos no últimotrimestre de gestação (idade gestacionalavaliada segundo os critérios de Nichols21

foram colhidos assepticamente emabatedouro, armazenados em meio TCM-199 (M5017 – Sigma Chemical Co), sulfatode amicacina, 20 mM de tampão Hepes(H3784, H6147, Sigma Chemical Co), 5 mMde Bicarbonato de Sódio (1.06329.1000,Merk), 0,23 mM de Piruvato de Sódio(44094 - Biochemical) e 0,5% de BSA, a 35ºC,para transporte até o laboratório.

Cada par de ovários foi processadopara o isolamento folicular descrito emestudos prévios 11, utilizando um cortadorde tecidos “Tissue Chopper” (The MickleLaboratory Engineering CO, Gomshal,Surrey, England). Os folículos isoladosforam selecionados com o auxílio de ummicroscópio invertido (Fluorovert, Leitz,Germany), transferidos para gotas de meiode lavagem, classificados e destinados aostratamentos para cultivo in vitro.

Cultivo in vitro dos FolículosIsolados

O meio de cultivo base utilizado emtodos os tratamentos realizados foi o M199(M5017 - Sigma Chemical Co), acrescido de80 μg/mL de Amicacina, 25 mM deBicarbonato de Sódio, 16 mg/mL de ITS(I1884, Sigma Chemical Co), 0,1 mg/mLde L-ácido ascórbico (A 4544, Sigma

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Chemical Co), 0,23 mM Piruvato de Sódio,2 mM de Hipoxantina (M9377, SigmaChemical Co) e 1 UI/mL de FSHrecombinante humano (Puregon/300UI,Serono). De acordo com o tratamentoutilizado, acrescentou-se ao meio: 0,3% deBSA, 7,5% de SFB (Cultlab, Campinas-SP-Brasil) ou 7,5% de substituto sintético KNO(KnockoutTMSR - 10828028 - Gibco BLR).Ao grupo controle (CON), nenhuma fonteprotéica foi acrescida. Em combinação aossuplementos protéicos utilizados, forampreparados previamente dois substratosdiferentes, os quais, serviam de auxiliares namanutenção da estrutura tridimensional dosfolículos ao longo do cultivo. No primeirosubstrato, utilizou-se uma camada decolágeno (COL) de cauda de rato. Osegundo substrato, constituído por umamonocamada de fibroblastos (FB) extraídosde fetos bovinos, de maneira semelhante aoprimeiro foi adicionado em placas de 96fossas (Limbro, 76-032-05, Flow Lab, Inc.Virginia, USA). As fossas recobertas com orespectivo substrato foram preenchidas com80 mL do meio de cultivo de acordo como tratamento e de 60 mL de óleo mineral, afim de minimizar possível contaminação e aevaporação do meio. Finalmente, as placasforam incubadas em uma atmosferaumidificada, com 5% de CO2 em ar etemperatura de 38,5ºC, por 15 minutos,antes de receberem os folículos isolados.

Os folículos isolados consideradosviáveis (exibindo oócito central rodeado porcamadas de células granulosas intactas emembrana basal preservada) foramselecionados em três diferentes classes detamanhos, sendo elas: menores que 60 mmde diâmetro (TAM 1), entre 60 e 80 mm(TAM 2) e maiores que 80 mm de diâmetro(TAM 3). As médias de tamanho foliculariniciais foram semelhantes entre os 8tratamentos e mensurados com auxílio deocular micrométrica (Olympus WH10X-H/22, Japan) acoplada ao microscópioinvertido com contraste de fase (OlympusIX70 - Japan). Os folículos foramtransferidos individualmente para as placasde 96 fossas procedendo-se o cultivo in vitro

de acordo com os diferentes tratamentos:T1 (SFB+COL), T2 (BSA+COL), T3(KNO+COL), T4 (CON+COL), T5(SFB+FB), T6 (BSA+ FB), T7 (KNO+ FB),T8 (CON+ FB). No dia inicial de cultivo,realizou-se a primeira avaliação do diâmetrofolicular, para determinar o diâmetrofolicular inicial (AV1) em micrômetros. Doisterços do volume de meio foramsubstituídos por igual volume de meiofresco, a cada 72 horas. As avaliaçõesposteriores foram realizadas às 72 (AV2), 144(AV3) e às 216 horas (AV4) de cultivo. Operíodo total de cultivo foi de 9 dias.

Análise EstatísticaPara avaliar a variação do crescimento

folicular ao final do período de cultivo, asmedidas do diâmetro folicular, no momentoda colheita (AV1) e ao final do cultivo (AV2).O experimento constou de 10 repetições(n=1726). A eficiência dos parâmetrostestados foi considerada pela variação dodiâmetro folicular ao final das 216h de cultivo(AV4-AV1), para isso foi realizada uma análisede variância entre os tratamentos e as médiasforam confirmadas pelo Teste de Duncan(SAS System) ao nível de significância de P< 0,05.

Para avaliar a manutenção dodesenvolvimento folicular ao longo doperíodo de cultivo, as medidas do diâmetrofolicular em 3 diferentes intervalos tempode cultivo foram consideradas (DF1, DF2 eDF3), sendo que DF1 = AV2 – AV1, DF2= AV3 – AV2 e DF3 = AV4 – AV3.Também foram considerados os tamanhosmédios dos folículos no dia inicial de cultivo(TAM1, TAM2, TAM3). Os diferentestratamentos foram comparadosconsiderando os efeitos dos diferentesfatores estudados: fonte protéica (FP),substrato (SB), tamanho inicial (TAM) e suasinterações, sobre as diferenças de diâmetrofolicular (DF1, DF2 e DF3), como variáveisdependentes. As variáveis e suascombinações foram submetidas à Análise deVariância por Comparações Múltiplas(LSMeans – SAS System) e as médias foramajustadas para os seus Quadrados Mínimos

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e confirmadas pelo Teste de Tukey-Kramer(P < 0,05).

Resultado

Análise da Percentagem deCrescimento Folicular ao Final doPeríodo de Cultivo In Vitro

O diâmetro médio dos folículossubmetidos ao cultivo in vitro foi de 74,65 ±2,47 mm. A análise das curvas decrescimento mostrou diferenças no aumentode diâmetro dos folículos entre ostratamentos (Figura 1). Ao considerarmosas médias gerais do aumento do diâmetrofolicular ao final das 216h, mostrados na

tabela 1, observamos as diferenças entre osoito tratamentos utilizados quanto àspercentagens de crescimento folicular aofinal do cultivo. Folículos de diferentestamanhos iniciais, em todos os tratamentos,tiveram alterações no seu diâmetro ao longode 216h de cultivo in vitro. No entanto,nenhum dos tratamentos proporcionoucrescimento folicular que evidenciasse o inícioda formação de antrum. Os tamanhosfoliculares iniciais foram significativamentesemelhantes para os 8 tratamentos realizados.Os resultados mostrados na tabela 1 e nafigura 2 demonstram que SFB+COL(T1=20,71%) proporcionou um aumentosignificativo (p < 0,05) sobre o diâmetro

Figura 1 - Padrão de crescimento de folículos pré-antrais de fetos bovinos cultivados in vitro, isoladamente, emmeio M199 com SFB e colágeno (T1); com BSA e colágeno (T2); com Knockout e colágeno (T3), semsuplementação protéica e com colágeno (T4); com SFB e monocamada de fibroblastos (T5); com BSA emonocamada de fibroblastos (T6); com Knockout e monocamada de fibroblastos (T7) ou semsuplementação protéica e com monocamada de fibroblastos (T8), ao longo de 216h de cultivo in vitro

Tabela 1 – Valores médios de aumento de diâmetro (mm) de folículos pré-antrais de fetos bovinos submetidos adiferentes tratamentos. Jaboticabal, 2005

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Figura 2 - (A) Micrografia sob Microscopia de Inversão de um folículo secundário após o isolamento. Nota-se maisde duas camadas de células granulosas cuboidais ao redor do oócito (seta) e membrana basal totalmentepreservada (a). À 0h, este folículo apresentou 90 μm de diâmetro. 40X. Barra = 13 μm. (B) Após 216hde cultivo no meio M199 com SFB e colágeno, o folículo estava com 120 μm de diâmetro, apresentavaproliferação das células granulosas e prolongamentos das células da membrana basal (seta). Houvepreservação da estrutura tridimensional do folículo. 40X. Barra = 35 μm

Figura 3 - (A) Micrografia sob Microscopia de Inversão de um folículo secundário após o isolamento. Nota-se maisde duas camadas de células granulosas cuboidais ao redor do oócito (seta). À 0h, este folículo tinha105 mm de diâmetro. 40X. Barra = 13 μm. (B) Após 216h de cultivo em meio M199 com BSA ecolágeno apresentou 100 μm de diâmetro e visível retração e escurecimento do oócito (seta), comcondensação das células granulosas e espaçamento entre elas. 20X. Barra = 30 μm

Figura 4 - (A) Micrografia sob Microscopia de Inversão de folículo secundário após o isolamento. Nota-se mais deduas camadas de células granulosas cuboidais ao redor do oócito (seta). À 0h, apresentava 90 mm dediâmetro. 40X. Barra = 13 μm. (B) Após 216h de cultivo em meio M199 com SFB monocamada defibroblastos estava alongado, com 75 μm de diâmetro médio, aspecto de degeneração, oócito retraídoe células escurecidas (a). 20X. Barra = 25 μm

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folicular em comparação aos outrostratamentos: BSA+COL (T2=4,40%),CON+COL (T4=1,88%), SFB+FB (T5=-3,81%), BSA+FB (T6=2,53%), KNO+FB(T7=-3,01%) e CON+FB (T8=0,27%),porém não apresentou diferença significativaao tratamento com KNO+COL(T3=10,01%). Todos os tratamentos cujosubstrato foi o colágeno mantiveram amorfologia folicular até o final do cultivo(Figura 3). Por outro lado, observamos queos tratamentos com monocamada defibroblastos não foram eficientes para amanutenção da viabilidade folicular, levandoainda à redução do diâmetro (Figura 4).

Análise do Crescimento Folicularao Longo do Período de Cultivo, emDiferentes Intervalos de Tempo (DF1,DF2, DF3)

Ao considerarmos os efeitos de cadatratamento sobre o aumento do diâmetro

folicular nos diferentes períodos de tempo(DF1, DF2, DF3) que, de acordo com aanálise anterior, o T1 (SFB+COL)proporcionou maior aumento (P<0,05) dediâmetro folicular em relação às demaiscombinações estudadas em ambos osperíodos de tempo analisados (Tabela 2).Podemos perceber ainda que, qualquer dasfontes protéicas utilizadas em associação aocolágeno apresentou resultados superiores(P<0,05) em relação às mesmas quandoutilizadas em associação à monocamada defibroblastos. Observamos ainda que o KNOteve efeitos mais efetivos sobre ocrescimento folicular (T3) em relação ao BSA(T2) e ao meio sem suplementação alguma(T4) (P<0,05).

O tamanho inicial dos folículossubmetidos ao cultivo (Tabelas 3 e 4) nãointerferiu na proporção de aumento dediâmetro em nenhum dos intervalos detempo avaliados (DF1, DF2 e DF3),

Tabela 2 - Efeito das combinações entre as diferentes fontes protéicas e os diferentes substratos sobre o aumento dediâmetro (μ) de folículos pré-antrais de fetos bovinos cultivados in vitro, em diferentes intervalos detempo (DF1=0h a 72h, DF2=72h a 144h, DF3=144h a 216h). Jaboticabal, 2005

Tabela 3 - Efeito das combinações entre as diferentes fontes protéicas e os diferentes tamanhos iniciais (TAM1 = <60 μm, TAM2 = 60 a 80 μm, TAM3 = > 80 μm) de folículos pré-antrais de fetos bovinos sobre oaumento de diâmetro (μm) em diferentes intervalos de tempo (DF1=0h a 72h, DF2=72h a 144h,DF3=144h a 216h). Jaboticabal, 2005

Tabela 4 - Efeito das combinações entre os diferentes substratos (COL ou FB) e os diferentes tamanhos folicularesiniciais (TAM1 = < 60 μm, TAM2 = 60 a 80 μm, TAM3 = > 80 μm) sobre o aumento de diâmetro(μm) de folículos pré-antrais de fetos bovinos, em diferentes intervalos de tempo (DF1=0h a 72h,DF2=72h a 144h, DF3=144h a 216h). Jaboticabal, 2005

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independentemente do tratamento aplicado(p > 0,05).

Discussão

Este estudo confirmou o potencialde recuperação de grandes quantidades defolículos pré-antrais isolados de ovários defetos bovinos pelo Tissue Chopper, comojá demonstrado anteriormente 11,22 aocontrário do que aconteceu em estudos queutilizaram digestão do tecido ovariano comenzimas como a colagenase 22,23. A escolhada idade fetal como sendo o último trimestrede gestação corroboram com os resultadosde Carambula et al.24, sobre a recuperaçãode grande quantidade de folículos primáriosfetais. Além disso, a presença da membranabasal intacta ao redor do folículo aumentaaproveitamento de uma variedade de fatorese hormônios presentes no meio de cultivo.25

A preservação da morfologia folicular emdiferentes estádios do desenvolvimentopossibilita a adesão entre os componentescelulares e possibilita a aplicação de sistemasde cultivo in vitro.

Pelas observações microscópicas aolongo do cultivo e seguindo os critérios deavaliação dos estudos de Figueiredo et al.22,observamos que os folículos commorfologia preservada pelo tratamentoapresentavam manutenção da sua estruturatridimensional e preservação da viabilidadedo oócito. Isto se confirmou pelapermanência da membrana basal intacta, aqual mantinha compactadas as camadas decélulas granulosas ao redor do oócito,mesmo que não houvesse aumento dediâmetro folicular em alguns tratamentos.Folículos considerados morfologicamentedegenerados não apresentaram danos namembrana basal, no entanto, o oócito estavacondensado e contraído, o que alterava suacoloração, além disso, suas células granulosasapresentavam núcleos densos e escuros.

Muitos estudos demonstraram quefolículos primordiais e pequenos folículosprimários não apresentam crescimento invitro satisfatório por mais de sete dias decultivo 2,22,23,25,26, até mesmo quando se utiliza

matrix extracelular como o colágeno. Deforma similar aos resultados de Itoh e Hoshi27

não observamos formação de antrum ao finaldo período de cultivo em gel de colágeno,demonstrando a necessidade dos folículospré-antrais bovinos de serem mantidos porum período muito longo em cultivo, o queainda parece ser difícil de ser alcançado.

Nossos estudos demonstraramtambém que, folículos de diferentestamanhos iniciais em todos os tratamentos,tiveram alterações no seu diâmetro ao longode 216h de cultivo in vitro, porém, nenhumdos tratamentos proporcionou crescimentofolicular satisfatório para se iniciar aformação de antrum. Também ficou patenteque as taxas de crescimento folicular foramsemelhantes entre os tratamentos ao longodo período de cultivo (DF1, DF2, DF3) e,embora não significativos, nossos resultadosconfirmam outros estudos por demonstrarque a taxa de crescimento foi mais alta noinício do cultivo tendo uma gradual reduçãocom o passar do tempo.28,29 Além disso, omelhor sistema de cultivo dentre os nossostratamentos resultou em taxa de crescimentoinferior ao estudo de Saha et al.29,provavelmente devido a não utilização defatores de crescimento, como por exemplo,o EGF.

Em concordância aos resultadosdesta pesquisa, estudos têm demonstrado asuperioridade da suplementação com SFBsobre a manutenção do crescimento folicular,tanto em camundongos30, como em bovinos31. Por outro lado, existem dados enfatizandoa eficiência de fontes energéticas, comopiruvato e glutamina, sobre a sobrevivênciafolicular, pelo aumento da percentagem defolículos morfologicamente viáveis.32

Neste experimento, obteve-se umbaixo crescimento folicular em comparaçãoa outros estudos 26,29,33 e somente ostratamentos com uso de colágeno comosubstrato tiveram aumento considerável dodiâmetro folicular, ainda assim, apenas aquelesuplementado com SFB apresentou taxa decrescimento significativamente maior(20,71%) (P<0,05). Quando dasuplementação com KNO, também houve

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aumento de diâmetro (10,01%), porém nãosignificativo considerando p<0,05. Emboranão tenha havido crescimento satisfatório dosfolículos em cultivo, concordamos comoutro estudo 29 sobre a maior eficiência docolágeno na preservação da estruturatridimensional dos folículos, bem comosobre a melhor ação do SFB para apreservação da morfologia folicular ao longodo cultivo. Ainda utilizando colágeno,mesmo o grupo controle, sem qualquersuplementação protéica, foi mais efetivosobre a preservação da viabilidade folicularquando comparado com os tratamentosconduzidos com monocamada defibroblastos fetais.

O cultivo com fibroblastos, emborainativados com Mitomicina C, exerceu efeitosnegativos sobre a viabilidade folicular àmedida que acidificavam o meio de cultivoe induziam a degeneração folicular. Taisresultados diferem daqueles realizados emsistemas de co-cultivo, porém sem a adiçãode soro. 27 Esse fator, provavelmente,diminuiu os efeitos do metabolismo dascélulas somáticas sobre os folículos emcultivo e inibiu os possíveis efeitos positivosda liberação de fatores de crescimento, bemcomo do provimento de matrix extracelular,oriundos das células somáticas. Tais estudosmostraram que o co-cultivo de pequenosfolículos pré-antrais por 30 dias com célulasdo mesênquima ovariano bovino, oufibroblastos fetais bovinos, ou ainda comcélulas granulosas, poderiam resultar emformação de antrum. 27 Neste sentido, faz-senecessário estabelecer outros sistemas de co-cultivo com células somáticas a fim de avaliarquais seriam seus reais efeitos sobre osfolículos pré-antrais in vitro. Os resultados dosnossos estudos mostraram aindaque diferentes fontes protéicas podem seradicionadas ao meio de cultivo deescolha para potencializar odesenvolvimentofolicular. A pesquisa de Ali e Sirard12

demonstrou que a substituição de SFB por

BSA aumentou a produção de blastocistos,e o uso de Polivinilpirrolidona proporcionouresultados ainda melhores na obtenção deembriões. Contrariamente, nossos resultadosdemonstraram que o BSA foi menos efetivosobre o aumento de diâmetro folicular emrelação ao SFB e que, o KnockoutTMSR,pode ser um substituto do soro, embora seusefeitos tenham sido significativamenteinferiores (p<0,05).

Este é um dos primeiros estudos quedefine o aumento no diâmetro de folículospré-antrais isolados de ovários de fetosbovinos da raça Nelore cultivados in vitro.Sob estas condições de cultivo não houvediferenças sobre a taxa de crescimentofolicular ao longo de nove dias de cultivo,entre a utilização de folículos primáriosiniciais, primários avançados ou secundários,submetidos a qualquer dos tratamentos eavaliados em diferentes períodos de cultivo(p < 0,05).

Assim, concluiu-se que a utilização deuma camada de gel de colágeno foi maiseficiente para a manutenção da viabilidadefolicular, bem como para o aumento dodiâmetro folicular, quando comparado aouso de monocamada de fibroblastos fetaisinativados. O cultivo in vitro de folículos pré-antrais isolados de ovários de fetosbovinos é mais efetivo sobre o aumentodo diâmetro folicular quando se utilizasoro fetal bovino comparado a outrasfontes de macromoléculas como BSAou KnockoutSR. Estes resultadosrepresentam mais um passo encorajadorpara o estabelecimento de um sistemade cultivo in vitro de folículos pré-antraisbovinos.

Agradecimentos

Agradecimentos à FAPESP, pelosuporte financeiro recebido por meiode bolsa de doutorado (01/09988-1)e auxílio à pesquisa (02/10168-1).

Effects of different systems of in vitro culture on the isolated preantral

follicles from fetal bovine ovaries

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Abstract

The objective of this study is to use different in vitro culture systemsof preantral follicles from Nelore breed bovine fetuses in the lastgestation quarter. The evaluation of treatments considered the timeof growth of isolated follicles. Preantral follicles were mechanicallyisolated and submitted to the individual culture, for 9 days, in mediano supplemented or supplemented with fetal calf serum (FCS),bovine serum albumin (BSA) or synthetic defined supplementsubstitute of serum KnockoutSR (KNO). We have also evaluatedthe effects of collagen gel or fetal calf fibroblast monolayer assubstratum for in vitro cultures. The increase on the follicular diameterwas followed in the first day (0 h), at the 72 h, 144 h and 216 h.Considering cultures of isolated follicles, the results have shown thatthe association between media supplemented with FCS and collagengel was significantly more efficient on the increase of the folliculardiameter than other treatments. It is not still established a system ofappropriate cultivation that sustains the differentiation andmultiplication of the granular cells and that maintains the contact ofthe same ones with the oocyte to provide molecules and factors thatsupply the metabolic demand. We also understand that our resultsalso represent another promising step on the search for the ultimatesystem of in vitro culture of preantral follicles from bovines.

Key words:Preantral.Follicle.In vitro culture.Calf. Bovine.

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17 ADRIAENS, I.; CORTVRINDT, R.; SMITZ, J.Differential FSH exposure in preantral follicle culturehas marked effects on folliculogenesis and oocytedevelopmental competence. Human Reproduction, v.19, n. 2, p. 398-408, 2004.

18 GOSDEN, R.; NAGANO, M. Preservation of fertilityin nature and ART. Reproduction, v. 123, p. 3–11,2002.

19 SCHWERIN, M. Molecular genome analysis inlivestock at the beginning of the new millennium.Reproduction in Domestic Animals, v. 36, p. 133-138, 2001.

20 McNATTY, K. et al. Growth and paracrine factorsregulating follicular formation and cellular function.Journal of Molecular Endocrinology, v. 163, p. 11-20,2000.

21 NICHOLS, C. W. The embryology of the calf: fetalgrowth weights, relative age and certain bodymeasurements. American Journal of VeterinaryResearch, v. 5, p. 135-141, 1944.

22 FIGUEIREDO, J. R. et al. Development of a combinednew mechanical and enzymatic method for the isolationof intact preantral follicles from fetal, calf and adultbovine ovaries. Theriogenology, v. 40, p. 789-799,1993.

23 WANDJI, J. J.; EPPIG, J. J.; FORTUNE, J. E. FSH andgrowth factors affect the growth and endocrine functionin vitro of granulosa cells of bovine preantral follicles.Theriogenology, v. 45, p. 817-832, 1996.

24 CARAMBULA, S. F. et al. Effect of fetal age andmethod of recovery on isolation of preantral folliclesfrom bovine ovaries. Theriogenology, v. 52, p. 563-571, 1999.

25 FIGUEIREDO, J. R. et al. Extracellular matrix proteinsand basement membrane: their identification in bovineovaries and significance for the attachment of culturedpreantral follicles. Theriogenology, v. 43, p. 845-858,1995.

26 FIGUEIREDO, J. R. et al. The physiological status of

the ovarian donor affects in vitro development of isolatedbovine preantral follicles. Theriogenology, v. 42, p.1303-1310, 1994.

27 ITOH, T.; HOSHI, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro.In Vitro Cell Development Biology, v. 36, p. 235-240,2000.

28 KATSKA, L.; RYNSKA, B. The isolation and in vitroculture of bovine preantral and early antral follicles ofdifferent size classes. Theriogenology, v. 50, p. 213-222, 1998.

29 SAHA, S. et al. In vitro culture of bovine preantralfollicles. Animal Reproduction Science, v. 63, p. 27-39, 2000.

30 NAYUDU, P. L.; OSBORN, S. M. Factors influencingthe rate of preantral and antral growth of mouse ovarianfollicles in vitro. Theriogenology, v. 95. p. 349-362,1992.

31 FIGUEIREDO, J. R. et al. Preservation of oocyte andgranulosa cell morphology in bovine preantral folliclescultured in vitro. Theriogenology, v. 41, p. 1333-1346,1994.

32 JEWGENOW, K. Role of media, protein andsupplements on maintenance of morphology and DNA-synthesis of small preantral domestic cat follicles duringshort-term culture. Theriogenology, v. 49, p. 1567-1577,1998.

33 GUTIERREZ, C. G. et al. Growth and antrumformation of bovine preantral follicles in long-termculture in vitro. Biology of Reproduction, v. 62, p.1322-1328, 2000.

34 BOLAND, N. I.; HUMPHERSON, P. G.; GOSDEN,R. G. Pattern of lactate production and steroidogenesisduring growth and maturation of mouse ovarian folliclesin vitro. Biology of Reproduction, v. 48, p. 798-806,1993.

35 PICTON, H. et al. Initiation of human primordialfollicle growth in vitro in ultra thin slices of ovariancortex. Human Reproduction, v. 14, p. 2-11, 1999.

36 WEBB, R. et al. Molecular mechanisms regulatingfollicular recruitment and selection. Journal ofReproduction and Fertility, v. 53, p. 33-48, 1999.

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INSTRUÇÕES AOS AUTORES

Obs.:Esclarecemos que nos trabalhos envolvendo experimentação animal, a critério dos senhores relatores, poderão ser solicitados certificados de aprovação dos Comitêsde Bioética. Os artigos submetidos à publicação, uma vez aprovados, estão condicionados ao pagamento de taxa em moeda nacional (R$) a ser estabelecida na épocade sua publicação, cujo cálculo levará em conta o total de páginas diagramadas que o artigo ocupar na revista.

Normas editoriais

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Os trabalhos para publicação deverãoser encaminhados a:Brazilian Journal of Veterinary Researchand Animal ScienceSetor de PublicaçãoAv. Prof. Dr. Orlando de MarquesPaiva, 87Cidade Universitária “Armando deSalles Oliveira”CEP 05508-270 – São Paulo – SP -BrasilTelefone: 0055 11 3091 1472/ 30917636Fax: 0055 11 3091 7636e-mail: [email protected]

Artigo completo1 - Limitar-se ao máximo de dez páginasdigitadas, dentro da estrutura do itemcinco, não sendo contadas as páginasonde constem tabelas e ilustrações. 2 -Ser escrito em língua portuguesa ou emlíngua inglesa. 3 - Usar somentenomenclaturas oficiais e abreviaturasconsagradas, não empregandoabreviaturas no título do artigo. 4 – Serestruturado dentro dos seguintes itens: a)Introdução; b) Materiais e Métodos; c)Resultados; d) Discussão; e) Conclusões;f) Referências; g) Resumo/Palavras-chave;Abstract/Key-words. 5 - Apresentar,obrigatoriamente, dois resumos, nosidiomas inglês e português, não devendoultrapassar 250 (duzentas e cinqüenta)palavras, seguidos das palavras-chave,limitadas a cinco, que correspondem apalavras ou expressões que identificam oconteúdo do artigo.

Nota prévia

1 - Limitar-se ao máximo de três páginasdigitadas. 2 - Ser escrita em línguaportuguesa ou em língua inglesa. 3 - Usarsomente nomenclaturas oficiais eabreviaturas consagradas, nãoempregando abreviaturas no título do

artigo. 4 - Não devem ser subdivididosem seções separadas (Introdução,Materiais e Métodos etc.), mas devemapresentar, obrigatoriamente, doisresumos, com palavras-chave, conformedescrito na apresentação de Artigocompleto, além de referências.

Artigos de revisãoSó poderão ser publicados porespecialistas de renome a convite daComissão Editorial. Não devem sersubdivididos em seções separadas(Introdução, Materiais e Métodos etc.),mas devem apresentar, obrigatoriamente,dois resumos, com palavras-chave,conforme descrito na apresentação deArtigo completo, além de referências.

Apresentação dos trabalhos

1 - Digitação : original em CD,devidamente identificado com o títulodo artigo e nome do(s) autor(es) e trêscópias impressas, inclusive suas tabelase referências; deve ser digitado,obrigatoriamente, em formato A4 (21,0 x29,7cm), espaço duplo, em uma só facede papel, margens de 2,5cm, fonte TimesNew Roman tamanho 10 e numeraçãoconsecutiva das páginas. Ilustrações elegendas devem ser relacionadas emfolhas separadas. O texto dos artigos deveser apresentado utilizando-se o editor detexto Microsoft Word. 2 - Página de rosto:elemento obrigatório, onde deve contero título do artigo, nome(s) do(s) autor(es)e instituição de origem. Observar queunicamente nesta página conste aidentificação dos autores, para o devidosigilo e imparcialidade. No rodapé dapágina deve-se mencionar o endereçocompleto (inclusive e-mail) do autor paracorrespondência. Se o artigo forsubvencionado, mencionar a instituiçãoque o patrocinou, assim como osagradecimentos; 3 - Tabelas: devem sernumeradas em algarismos arábicos eencabeçadas pelo título, seguido de locale data. Na montagem das tabelas seguir:IBGE. Normas de apresentação tabular.3. ed. Rio de Janeiro: IBGE, 1993. 61 p.O limite de tabelas por trabalho é decinco. Em casos excepcionais, conhecidaa opinião da Comissão Editorial, estenúmero poderá ser ultrapassado. No textodevem ser indicadas pela palavra Tabela(por extenso). 4 - Ilustrações (fotografias,gráficos, quadros, desenhos ouesquemas): devem ser numeradasconsecutivamente com algarismosarábicos e citadas como figuras no texto.As fotografias devem ser identificadassomente com o título do artigo, além deconter no verso a indicação de seu corretoposicionamento. Fotos fornecidas empapel fotográfico devem ter ótimaresolução, em CD com a extensão .TIF eresolução mínima de 300 dpi’s. Aslegendas de ilustrações coloridas devemestar referenciadas somente por setas,símbolos e pontos quando publicadasem preto e branco. Gráficos, desenhosou esquemas devem ser fornecidos noCD, impressos em folha à parteidentificada somente com o título doartigo, além das respectivas legendas.Todas as ilustrações devem ser fornecidas

em três vias. Os gráficos devem trazersempre os valores numéricos que lhesderam origem. Desenhos e esquemasdevem apresentar boa qualidade técnicae artística. Aceitar-se-á um númeromáximo de nove ilustrações por artigo,sugerindo-se a seguinte distribuição: trêsfotografias, três gráficos e três desenhos/esquemas. Acima deste limite, asdespesas com reprodução correrão porconta do autor. Ilustrações coloridas,independentemente do número, serãocobradas. No texto devem ser indicadaspela palavra Figura (por extenso). Indicarjunto ao título da ilustração o local edata. 5 - Referências : devem sernumeradas, ao final do artigo, de formaconsecutiva de acordo com a ordem emque forem sendo citadas no texto. Ostítulos de periódicos devem sermencionados de maneira uniforme, depreferência todos por extenso. Asreferências seguem a normalização daAssociação Brasileira de Normas Técnicas(ABNT) NBR 6023, que deve serconsultada para outros tipos dedocumentos aqui não exemplificados.

Exemplos de Apresentação dos Autoresnas Referências:BONAGURA, J. D. (um autor)SANTOS, J. A.; MELLO, M. R. (doisautores)BENNETT, B. T.; ABEE, C. R.;HENRICKSON, R. (três autores)VILELA, D.; MARTINS, C. E.; BRESSAN,M.; CARVALHO, L. A. [...] (quatroautores ou mais) ou VILELA, D. et al.(sem itálico).

Exemplo de periódico1 KOTZEKIDOV, P.; BLOUKAS, J. G.Effect of protective cultures andpackaging film permeatibility onshelflife of sliced vacuum-pockedcooked ham. Meat Science, v. 42, n. 3,p. 333-345, 1996.

Exemplo de livro2 HALLIWELL, R. E. W.; GORMAN, N.T. Veterinary clinical immunology.London: W. B. Saunders, 1989. 548 p.

Exemplo de autor diferente para o livroe capítulo3 FENNER, W. R. Avaliaçãoneurológica dos pacientes. In:ETTINGER, S. J. Tratado de medicinainterna veterinária. 3. ed. São Paulo:Manole, 1992. p. 577-606.

Exemplo de mesmo autor para o livro ecapítulo4 THORTON, H. Deleterius changes inmeat. In: THORTON, H. Aspects ofmeat inspection. London: Thindall &Cassel, 1973. p. 63-72.

Exemplo de tese5 BIRGEL, E. H. Estudo do quadroeritrocitário de caprinos (Capra hircus,L.) normais criados no Estado de SãoPaulo: influências de fatores raciais,sexuais, etários e alimentares. 1973. 92f. Tese (Livre Docência) - Faculdade deMedicina Veterinária e Zootecnia,Universidade de São Paulo, São Paulo,1973.

Exemplo de evento6 OLIVEIRA, C. A. Hormonoterapia emcadelas e gatas. In: CONGRESSOBRASILEIRO DE REPRODUÇÃOANIMAL, 9., 1991, Belo Horizonte.Anais... Belo Horizonte: ColégioBrasileiro de Reprodução Animal,1991. p. 100-111.

Exemplo de livro eletrônico7 POORE, M. H. Alternative feeds forbeef cattle. North Carolina: NorthCarolina Corporative Extension Service,1994. Disponível em: <http://www.ces.ncsu.edu/drought/dro-28.html>. Acesso em: 23 abr. 2007.

Exemplos de artigos de periódicoseletrônicos8 MENDONÇA JR., C. X.; MARTINS, A.P.; MORI, A. V.; SILVA, A. B.; MORI, C.S. Efeito da adição de óleo de peixe àdieta sobre o desempenho e níveis delípides plasmáticos e de colesterol noovo de galinhas poedeiras. BrazilianJournal of Veterinary Research andAnimal Science, v. 37, n. 1, 2000.Disponível em: <http://www.scielo.br/cgi_bin/wxis.exe/iach/scielo>. Acessoem: 31 jan. 2001

6 - Citações: utilizar o Sistema Numérico.As citações devem ser feitas pornumeração única e consecutiva emsobrescrito, utilizando-se algarismosarábicos, remetendo à lista de referênciasna mesma ordem em que aparecem notexto. Quando indispensável para acompreensão do texto, combinar o(s)sobrenome(s) do(s) autor(es) com aindicação do número. Neste caso, acitação será pelo sobrenome de cada autorou pelo nome da entidade responsávelque aparece na respectiva referência.Quando se tratar de três autores, todosdevem ser citados. No caso de mais detrês autores, a citação deve seracompanhada pelo sobrenome doprimeiro autor seguido da expressão etal. (sem itálico). Se a citação estiverinserida no texto utilizar letras maiúsculase minúsculas; se estiver entre parêntesesutilizar somente letras maiúsculas.Exemplos:Um autorSegundo Yanaguita9 ou (YANAGUITA9)

Dois autoresSoares e Alves13 ou (SOARES; ALVES13)

Três autoresBennett, Abee e Henrickson12 ou(BENNETT; ABEE; HENRICKSON12)

Quatro ou mais autoresVilela, Martins, Bressan e Carvalho26 ouVilela et al.26

(VILELA; MARTINS; BRESSAN;CARVALHO26 ) OU (VILELA et al. 26)

Tarifa de publicação: A tarifa depublicação de R$ 40,00, por páginaimpressa, será cobrada do autor indicadopara correspondência, por ocasião daprova final do artigo. Se houvernecessidade de impressão em cores, asdespesas correrão por conta dos autores.

Efeitos de diferentes sistemas de cultivo in vitro sobre o ...

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