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はじめに　「放線菌」は伝統的に，Streptomyces 属を代表とする「菌糸を伸張させ，胞子を形成する高 G＋C 含量グラム陽性細菌群」として知られている．一方，高 G＋C 含量グラム陽性細菌のなかには，菌糸状の形態を示さないもの，あるいは特定の培養条件によってのみ菌糸状に生育する分類群も存在する．このような菌群は

「アクチノバクテリア」と総称されることが多く，伝統的に菌糸状の放線菌とは区別して考えられてきた．しかしながら，16S rRNA 遺伝子塩基配列による分子系統学的研究の進歩により，菌糸状に増殖する放線菌とアクチノバクテリアは系統的に近縁で，かつ，混在することが明らかとなったため（Stackebrandt et al., 1997），現在では Actinobacteria 門に含まれる菌群全体を広義の「放線菌」と定義することが一般的となっている．　アクチノバクテリアには，結核菌やジフテリア菌を代表とする多くの病原菌が含まれ，医学上きわめて重要な菌群であるが，その一方でグルタミン酸生産菌のようなアミノ酸や酵素，ビタミン等の有用物質の生産菌や，難分解性物質分解菌なども数多く見つかっており，産業上有用な菌群としても知られている（Rosen-berg et al., 2014; Goodfellow et al., 2012）．未知の機能や物質は，未知の菌株から得られると考えるのが合理

的であるため，新規性の高いアクチノバクテリアを探索し，その多様性を解明していくことは，分類学的知見が広がるのみならず，さまざまな分野における産業上の応用が広がる可能性も大いに秘めている．しかしながら，アクチノバクテリアの選択分離に関する報告はないに等しく，多様なアクチノバクテリアを効率的に分離することは困難であるため，分類学的あるいは生態学的多様性の解明が遅れている分類群が数多く存在している．アクチノバクテリアをターゲットとして分離を行うことが困難である背景には，この分類群の自然界における分布密度の低さが挙げられる．さらに，形態的に他の一般細菌と区別がつきにくい，すなわち球菌や桿菌状に生育するものがほとんどであり，コロニーの形状もこれといった特徴がないため，分離培地上に出現したコロニーや細胞形態を目視で選別して分離を行うことがきわめて困難である点も要因の一つといえる．　本稿では，筆者がこれまで行ってきたアクチノバクテリアの選択分離手法の構築，国内外で収集した試料からの分離，そして得られた新規性の高いアクチノバクテリアの分類学的研究について概要を紹介する．

アクチノバクテリアの選択分離法の構築　現在，アクチノバクテリアとみなされている主要な分 類 群 と し て，Corynebacteriales 目，Micrococcales目，Propionibacteriales 目の 3 つが挙げられる．その

非菌糸状放線菌の選択分離法の構築と分類学的研究（平成 30 年度日本微生物資源学会奨励賞受賞）

浜田盛之

独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター 〒292-0818　千葉県木更津市かずさ鎌足 2-5-8

Development of a selective isolation method for non-filamentous actinobacteria and their taxonomic studies

Moriyuki HamadaBiological Resource Center, National Institute of Technology and Evaluation

2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu, Chiba 292-0818, Japan

受 賞 総 説

E-mail: hamada-moriyuki@nite.go.jp

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浜田盛之非菌糸状放線菌の分離手法の構築と分類研究

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なかで Micrococcales 目は，現在 16 科を擁する分類学的に最も多様性に富んだ分類群であるが，有効な選択分離法が存在しないため，狙って分離したというよりは偶然分離された株を用いて新種提唱が行われているケースが大半を占めている．それ故，これまでに 1 属1 種 1 株のみしか報告されていないような分類群が多数存在しているのが現状であり，本分類群の分類学的多様性は未知の部分が多い．そこで筆者らは，Micro-coccales 目を中心としたアクチノバクテリアを，特定の属などの分類群に絞ることなく，広く分離できる手法の開発を目的として研究を行った．　まず，多様な Micrococcales 目の株が生育可能な基礎培地を詳細に検討したところ，5 倍希釈した NBRC 802 培地に抗真菌剤としてシクロヘキシミド（50 mg/l）， 抗 グ ラ ム 陰 性 細 菌 剤 と し て ナ リ ジ キ シ ン 酸

（20 mg/l）をそれぞれ添加したものが適していることを見出した．そして，Micrococcales 目の株の多くが高い NaCl 耐性を有している点に着目し，高濃度のNaCl を基礎培地に添加することで分離効率を高めることができるか検討するために，3％，5％，7％（w/v）NaCl を基礎培地に添加したものを分離培地として，海洋堆積物試料から希釈平板法を用いて分離を行った．その結果，5％ NaCl（w/v）を添加した分離培地が Micrococcales 目のアクチノバクテリアの出現頻度を高めるとともに，得られる分離株の多様性も高まることが明らかとなった（表 1）．よって，本培地をMicrococcales 目のアクチノバクテリアに対する選択分離培地として設定し，「SPPY Agar」と命名した

（表 2）．　次に，SPPY Agar の有効性の確認，および新規アクチノバクテリアの取得を目的として，インドネシアのジャワ島およびバリ島，沖縄県の西表島，千葉県の房総半島の海岸環境において採集した 65 試料（海洋堆積物，マングローブ根圏土壌等）からアクチノバクテ リ ア の 分 離 を 行 っ た． 計 759 株 を 分 離 し，16S rRNA 遺伝子塩基配列に基づく同定を行った結果，いずれの採集地の試料においても，分離株中 63〜89％がMicrococcales 目に属する株であり，効率的な分離が可能であることが確認された．得られた Micrococ-cales 目の分離株は多様性に富んでおり，約 3 割が新種と推定される株であるなど，これまで未知であった海岸環境中のアクチノバクテリアの分布および多様性を明らかにすることができた．一方で，今回全く分離株を得られなかった Micrococcales 目の科もいくつか存在しているため，今後さらに多様なアクチノバクテ

リアが得られるような分離手法・培地の考案や，海岸環境試料以外の分離源への適用等に研究を展開し，未知のアクチノバクテリアの探索を続けていきたいと考えている．

アクチノバクテリアの分類学的研究　16S rRNA 遺伝子塩基配列に基づく分子系統解析のみならず，形態や培養性状，生理・生化学的性状，化学分類学的性状など，さまざまな表現性状も詳細に調べ，それらのデータを総合的に解釈することによって分類を行う手法を「多相分類」と呼ぶ．アクチノバクテリアは菌糸状放線菌のような形態的多様性には乏しいが，化学分類学的性状については菌糸状放線菌を上回る多様性があり，表現型に基づいた特徴付けがしやすい分類群といえる．しかし，前述のとおりアクチノバクテリアの選択分離が困難であるため，偶然得られた 1 株を用いて新属あるいは新種が提唱されているケースが非常に多い．それ故，科や属，種といった各分類階級において，特徴となる表現性状やその多様性が明確でない分類群が数多く存在する．　筆者は，海洋環境を中心としたさまざまな試料から分離した Micrococcales 目に属するアクチノバクテリアの分類研究を行い，これまでに Arenivirga 属（Hama-da et al., 2017a），Austwickia 属，Mobilicoccus 属，Piscicoccus 属（Hamada et al., 2010a），Luteimicrobi-um 属（Hamada et al., 2010b），Lysinimicrobium 属

（Hamada et al., 2012a），Sediminihabitans 属（Hama-

表 1　 分離培地に添加する NaCl濃度による分離効率および多様性の違い

NaCl 濃度

Micrococcales分離株の割合

分離株が属する分類群の数科 属 種

3％ 62.9％ 5 11 205％ 82.3％＊ 8 9 197％ 83.3％＊ 4 5 10

＊ t-test，p<0.01

表 2　SPPY Agarの組成Sodium chloride 50 gPolypepton (Nihon Pharmaceutical) ＊ 2 gYeast extract 0.4 gMgSO4・7H2O 0.2 gCycloheximide 50 mgNalidixic acid 20 mgAgar 15 gDistilled water 1 l

pH 7.0＊現在は HIPOLYPEPTON に名称変更

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da et al., 2012b），Serinibacter 属（Hamada et al., 2009），Tropicihabitans 属（Hamada et al., 2015a）の9 新属と，Micrococcales 目の 19 属にわたる計 34 新種を提唱することで，各分類群の多様性を明らかにするとともに，いくつかの科については分類学的再編を行ってきた．これらの分類学的研究では，伝統的な分類手法に加えて，in silico DNA-DNA ハイブリダイゼーション等の全ゲノム塩基配列を用いた解析や，細胞壁アミノ酸の異性体分析，MALDI-TOF MS を用いたミコール酸分析等の最新の分析手法を取り入れることで，より明確な分類群の定義付けを行った．本稿では Demequinaceae 科，Dermatophilaceae 科，Beu-tenbergiaceae 科の 3 科における新規性の高い分離株を用いた分類研究と，Mycobacteriaceae 科の既知属に関する再分類について紹介する．

1）Demequinaceae 科　Demequinaceae 科は Demequina 属（Yi et al., 2007）の 1 属のみを含む科として提唱され（Ue et al., 2011），イソプレノイドキノンとして放線菌では希少なデメチルメナキノンをもつという特徴が知られている．SPPY Agar を用いた国内のマングローブ環境からのアクチノバクテリアの分離の過程で，Demequinaceae科に近縁な分離株を複数得た．これらの株の表現性状を詳細に調査した結果，すべての株がデメチルメナキノンを有していたが，Demequina 属とはペプチドグリカンに含まれるジアミノ酸が異なる株が 1 株存在し，それは系統的にも Demequina 属のクラスターからは独立することが明らかとなった．これらの結果から，この分離株を新属新種 Lysinimicrobium mangro-vi として提唱した（Hamada et al., 2012a）．その後，類似の海岸環境試料からさらに分離を進めたところ，L. mangrovi に近縁な分離株が 13 株得られ，それらは系統的にクラスターを形成することが明らかとなった．各株の化学分類学的性状を調査したところ，先に提唱した Lysinimicrobium 属の特徴と完全に一致したが，生理・生化学的性状については多くの違いが見られた．さらに，Demequinaceae 科の既知種と各分離株のドラフトゲノム解析を実施し，in silico DNA-DNA ハイブリダイゼーションや Multilocus Sequence Analy-sis（MLSA）を行ったところ，これらの分離株は Ly-sinimicrobium 属の 9 新種に分類すべきことが示された（Hamada et al., 2015b）．その後さらに 1 新種を追加し（Hamada et al., 2017b），当初 1 属 1 種で提唱した Lysinimicrobium 属は 11 種を擁する属となり（図

1），属を定義した化学分類学的特徴も適切であったことが立証された．

2）Dermatophilaceae 科　Dermatophilaceae 科は Austwick（1958）によって提唱された科で，Dermatophius 属と Kineosphaera 属の 2 属 3 種から構成されている．Dermatophius 属は，Dermatophilus congolensis（基準種）と Dermatophi-lus chelonae の 2 種がこれまでに報告されているが，D. chelonae は多相分類学的手法を用いずに提唱されていた種であったため（Masters et al., 1995），その分類学的位置については以前から疑問がもたれていた．筆者らは，房総半島沿岸で採集した魚の腸管から，Dermatophilaceae 科に近縁で新規性の高い 2 株を分離した．そこで，これらの株と D. chelonae を併せて詳細な分類学的特徴付けを行ったところ，分離株 2 株と D. chelonae は，メナキノン，リン脂質，脂肪酸といった主要な化学分類学的性状においてそれぞれ違いが見られるとともに，系統的にもそれぞれが独立することが明らかとなった．また，この科に属する株はそれぞれが特徴的な細胞形態をしており（図 2），この点においても識別が可能であることが明らかとなった．そこで，両分離株を新属新種 Mobilicoccus pelagius および Piscicoccus intestinalis として提唱するとともに，D. chelonae は新属新組み合わせ Austwickia che-lonae として再分類した（Hamada et al., 2010a）．これにより，Dermatophilaceae 科は 5 属 5 種の科となり，分類学的混乱は解消することができたが，各属の多様性を明らかにするためには，さらなる近縁株の取得が必要である．

3）Beutenbergiaceae 科　Beutenbergiaceae 科は Zhi et al.（2009）によってBeutenbergia 属，Salana 属，Georgenia 属 を 包 含 する科として提唱された．また，系統的に近縁な分類群として Bogoriella 属が知られており，1 属のみで Bo-goriellaceae 科として提唱されている（Stackebrandt & Schumann, 2000）．筆者らは，房総半島沿岸で採集した魚の腸管から，Beutenbergiaceae 科に近縁で新規性の高い 1 株を分離した．詳細な特徴付けの結果，本株はペプチドグリカンのジアミノ酸が近縁の既知属とは異なっており，さらにペプチドサブユニットの 1 位が L-serine という珍しい特徴を有することも明らかとなった．これらの特徴に基づき，本株を新属新種Serinibacter salmoneus として提唱した（Hamada et

浜田盛之非菌糸状放線菌の分離手法の構築と分類研究

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al., 2009）．このペプチドグリカンの特徴は，これまでにほとんど報告がなかったが，筆者らはその後，ほかにもいくつかの属が同様の性状を有していることを明らかにした．この結果は，当初希少と思われたこの性状が実際はアクチノバクテリアには比較的広く分布しており，属または科レベルにおける新たな分類指標となりうることを示唆している．さらに，Beutenbergia-ceae 科と Bogoriellaceae 科に含まれる属の間の系統関係を詳細に検討した結果に基づき，Georgenia 属をBeutenbergiaceae 科から Bogoriellaceae 科へ移行するという科レベルの再編も併せて行った．

4）Mycobacteriaceae 科　NBRC カルチャーコレクションにおける基準株の収集・保存の過程で，近年提唱された Mycobacteria-ceae 科に属する 2 つの属の基準種，Hoyosella altami-rensis と Amycolicicoccus subflavus がきわめて高い16S rRNA 遺伝子塩基配列の相同性を有していることを見出した．筆者らは同一条件下で両属の化学分類学的特徴を精査したところ，両者の特徴はきわめて類似していた．一方，Hoyosella 属と Amycolicicoccus 属の原記載論文では，両属ともミコール酸含有菌群として知られる Corynebacteriales 目に含まれるにもかかわらず，ミコール酸は検出されないと報告されていたが（Jurado et al., 2009; Wang et al., 2010），筆者らは

図 1　16S rRNA遺伝子塩基配列に基づく Demequinaceae科の系統樹

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MALDI spiral-TOF MS を用いた高感度分析により，両株とも総炭素数 32 から 36 のミコール酸を含有していることを明らかにした（図 3）．この結果は，Cory-nebacteriales 目に含まれるにもかかわらず，例外的にミコール酸を含まないと報告されている他の分類群においても，高感度分析を行うことで実際は検出される可能性があることを示唆しており，分類指標としてのミコール酸の価値を再確認するものであった．以上の結果から，Hoyosella 属と Amycolicicoccus 属は同一属に所属させるべきであることが示され，属名の優先権は Hoyosella 属にあることから，細菌命名規約に基づき，Amycolicicoccus subflavus を新組み合わせ Hoyo-sella subflava として再分類した（Hamada et al., 2016）．

おわりに　DNA シーケンサーの進歩により，全ゲノムの解読が今後ますます容易になるのは確実であるが，そこから得られる膨大なデータをどう分類に活用していくかは，これからの分類学者に課せられた共通の課題であろう．今後ゲノム情報全盛の時代になると，表現性状

をおろそかにする分類学者が増えていくことが危惧される．しかし，生物を分類する以上は系統を考慮しつつも，可能な限り表現性状によって裏づけられた多相分類を心掛けていくべきだと筆者は考えている．放線菌は，豊富な表現性状を有する，分類学者にとって非常に興味深い分類群である．これらの豊富な表現性状の分類学における重要性は，ゲノム情報から得られる，より正確な系統解析の結果と組み合わせることによって，さらにその価値が高まるであろう．分類学は体系も指標も確立され，固定されたものではないため，さらなる有用な指標に基づく分類体系の構築を目指して，これからも研究を進めていきたい．

謝　辞　本研究は（独）製品評価技術基盤機構・NBRC において行われたものであります．本研究を行うにあたり，数多くのご指導ご高配を賜りました鈴木健一朗博士（現・東京農業大学教授），田村朋彦博士，小牧久幸博士ならびに NBRC の同僚諸氏に厚く御礼申し上げます．また，本研究の遂行にあたり多大なるご指導ご

図 2　Dermatophilaceae科に属する株の形態的多様性a：Piscicoccus intestinalis NBRC 104926T，b：Mobilicoccus pelagius NBRC 104925T，c：Dermatophilus congolensis NBRC 105199T，d：Austwickia chelonae NBRC 105200T，スケールバー＝5 μm

a

c

b

d

浜田盛之非菌糸状放線菌の分離手法の構築と分類研究

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協力を賜りました山梨大学大学院 早川正幸教授，山村英樹准教授，DSMZ の Dr. Peter Schumann に深く感謝いたします．最後に，本研究に対して日本微生物資源学会奨励賞を賜りましたことを，学会長をはじめ，学会員の皆様に厚く御礼申し上げます．

文　献Austwick, P.K.C. 1958. Cutaneous streptothricosis,

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Hamada, M., Shibata, C., Saitou, S., Tamura, T., Komaki, H., Ichikawa, N., Oguchi, A., Hosoyama,

図 3　MALDI spiral-TOF MSを用いたミコール酸のマススペクトルa：Hoyosella altamirensis NBRC 109631T，b：Amycolicicoccus subflavus NBRC 109087T

a b

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Microb. Resour. Syst. Dec. 2018 Vol. 34, No. 2

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