蛋白质-核酸相互作用

蛋白提取| DNA电泳迁移率实验（EMSA）| 染色质免疫沉淀（ChIP）| RNA EMSA | RNA pull-down| 生物素和脱硫生物素核酸标记

2

目录

简介 3

蛋白质-DNA相互作用研究 4

NE-PER核蛋白和胞浆蛋白抽提试剂盒 5

蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 6

Pierce DNA 3´末端生物素标记试剂盒 7

LightShift 化学发光EMSA试剂盒 8

染色质免疫沉淀（ChIP）系统 9

蛋白质-RNA相互作用研究 10

M-PER哺乳动物蛋白质抽提试剂 11

T-PER组织蛋白质抽提试剂 11

Pierce RNA 3´末端生物素标记试剂盒 12

LightShift 化学发光RNA EMSA试剂盒 13

Pierce RNA 3´末端脱硫生物素标记试剂盒 15

Pierce磁珠RNA-蛋白 Pull-Down试剂盒 16

订购信息 18

3

蛋白质和核酸均不作为独立实体在生物系统内运

转。正常细胞功能所必需的多个过程都涉及到蛋白

质-核酸相互作用。一旦这种相互作用遭到破坏，就

会对细胞系统内部产生严重且深远的后果。

蛋白质-核酸相互作用参与了多个关键的细胞进程，包括转

录、翻译、基因表达调控、识别、复制、重组、修复、核酸包

装、染色质重塑和细胞器形成（如核糖体）等。作为信息遗传

存储库，DNA需要与蛋白质发生相互作用来提取信息，以便

这些信息在细胞中及时使用。

核酸结合蛋白的共同特性是具有识别和操纵DNA/RNA结构

的能力。蛋白质以序列特异性或二级结构依赖性方式与主

要或次要螺旋槽中的核酸发生相互作用，通常诱导核酸发生

巨大结构变化。明确序列特异性相互作用有助于开发高亲和

力核酸适配体，可成为DNA或RNA结合蛋白的纯化工具。此

外，序列特异性相互作用还为基因调控和药物发现研究提供

了关键信息。

简介

表1. 用于研究蛋白质-核酸相互作用的Thermo Scientific 试剂盒

产品 LightShift™ EMSA试剂盒 ChIP试剂盒（琼脂糖或磁珠） LightShift™ RNA EMSA试剂盒

Pierce™磁性RNA-蛋白质Pull-Down试剂盒

技术 电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay ,EMSA）

染色质免疫沉淀（ChIP） RNA EMSA RNA免疫沉淀（RIP）

检测目标 蛋白质-DNA相互作用 蛋白质-DNA相互作用 蛋白质-RNA相互作用 蛋白质-RNA相互作用

相互作用情况 体外 体内 体外 体外

核酸标记方法 生物素 无需 生物素 脱硫生物素（包含在试剂盒中）

填料基质 无需 ChIP级别Protein A/G plus琼脂糖，ChIP级别Protein A/G磁珠

无需 Pierce™核酸相容型链霉亲合素磁珠

检测方法 基于膜，使用链霉亲合素-HRP化学发光法

qPCR或二代测序（NGS） 基于膜，使用链霉亲合素-HRP化学发光法

免疫印迹或质谱

目标 鉴定与DNA序列结合的蛋白质

监测转录调控（qPCR）或鉴定靶序列（NGS）

鉴定与RNA序列结合的蛋白质 富集低丰度靶标

制备和样品处理时间 4.5-5小时 5.5小时 7-8小时 3小时（仅手动操作时间）

更多信息请点击前往 thermofisher.com/protein-nucleic-interactions

4

蛋白质-DNA相互作用研究

图1. 两种蛋白质-DNA相互作用的工作流程图

蛋白质-DNA相互作用的一项主要功能是调控细胞遗传物质

的长度。染色体是DNA浓缩成的紧致物理结构，这是由复杂

的蛋白-DNA相互作用调节形成的。染色体结构也对转录具有

一定作用。在染色质重塑过程中，基因调控区域选择性部分

解开，使DNA可用于基因转录，或变为紧密结构以完全沉默

基因的转录。

基因与基因之间间隔的序列可作为转录调控区域，这些序列

通过与蛋白质结合而发挥作用：包括启动子、增强子、隔离子

和间隔物。增强子序列处于距离基因起始位点几千碱基的位

置，其结合蛋白并发出转录信号。转录主要有两个步骤组成，

并涉及蛋白质-DNA相互作用。首先，转录因子的DNA结合

区域与基因转录起始位点相邻的特异性DNA启动子序列结

合。然后，通过蛋白质-蛋白质相互作用，转录因子的反式激

活结构域结合并定位RNA聚合酶II，RNA聚合酶II启动并产生

mRNA、大多数snRNA和microRNA前体。

科研工作者先后研发了若干用于研究这些复杂相互作用的实

验室技术——每一种技术都拥有独特的历史、不同的用途以

及不同的优缺点。这些技术包括DNA EMSA或凝胶迁移率实

验、转录因子分析、ChIP分析和NGS分析。我们将具体介绍

EMSA和ChIP分析。

B

PA/G P

EBNA Oct-1 API

ExtractCompetitor

– – –

+ ++

– – –

+ ++

– – –

+ ++

* 在细胞分级分离前进行DNA交联

加入细胞核提取物或纯化蛋白质，确定DNA结合亲和力

在细胞核提取物中加入蛋白酶抑制剂

消化含交联蛋白质-DNA复合物的染色质

免疫沉淀复合物使用蛋白酶K消化并

纯化DNA

在体内监测转录调控*

在体外鉴定蛋白质和DNA序列的结合

电泳分离生物素标记复合物并转印到尼龙膜上

形成蛋白质-DNA复合物

使用3´末端标记试剂盒对DNA探针进行生物素标记，并加入到细胞核提取物中

EMSA（凝胶迁移实验）

使用链霉亲和素-HRP和化学发光底物检测

染色质免疫沉淀（ChIP）

使用qPCR检测

5

Thermo Scientific™ NE-PER™核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒

提供了高效的细胞裂解和抽提方法，可在两个小时之内完成

胞质蛋白与核蛋白的分离操作。

该试剂盒是一种高效的核蛋白抽提方法，只需使用台式微量

离心机、离心管和移液器即可进行简单的分步式细胞裂解及

核蛋白与胞质蛋白离心分离。NE-PER试剂能够高效地将胞

质蛋白与核蛋白溶解和分离为不同组分，并将交叉污染和基

因组DNA（gDNA）/mRNA的干扰均降到最低。一旦经过脱

盐或稀释，分离后的蛋白即可用于免疫分析和蛋白相互作用

实验，如迁移率分析（EMSA）、免疫共沉淀（Co-IP）和pull-

down实验。

优势:• 快速—在2小时内获得细胞核与胞浆内的可溶性蛋白组分

• 可靠—NE-PER试剂盒已被超过万篇已发表论文引用

• 通用—适用于培养细胞或组织（仅适用于新鲜样本）的核蛋白抽提

• 可扩展—两种试剂盒规格，满足从细胞和组织中抽提样本的应用需求

• 方便—操作简单，无需超速梯度离心

• 兼容性好—所得样本适用于多种下游应用，包括免疫印迹、凝胶迁移率分析、蛋白质分析、报告基因分析以及酶活性分析等

• 稳定—经过心脏、肺、肾、肝脏组织以及HeLa、NIH 3T3、 A549、C6、COS-7和Hepa哺乳动物培养细胞的验证。

制备良好的核蛋白提取物是许多基因调控研究成功的关键。

使用核提取物代替全细胞裂解物核提取物的原因如下：首

先，全细胞裂解物中的细胞组分可对许多基因调控领域的实

验产生不利影响；其次，全细胞裂解物中大量的胞质蛋白会

稀释目标核蛋白的浓度。最后，全细胞裂解物的组分因存在

gDNA和mRNA而非常复杂。

分离细胞核和制备核蛋白提取物的方法有很多，但大多数方

法都很耗时，并且需要机械匀浆、冻融循环、反复离心或透

析，而这些都可能影响脆弱核蛋白的完整性。NE-PER核蛋白

和胞质蛋白抽提试剂盒能够分步裂解细胞，并分离出完整的

胞质和细胞核蛋白组分，这一过程通常可在2小时内完成。

NE-PER核蛋白和胞浆蛋白抽提试剂盒简单、快速获得浓缩的核蛋白抽提物，与下游应用均可兼容货号：78833/78835

图2.四种不同DNA-蛋白质复合物的化学发光EMSA。复合物是使用20 fmol生物素标记的DNA双链（每条链标记1个生物素）和2μL（6.8μg）NE-PER核提取物（来自HeLa细胞）。在含有特定竞品DNA的反应中，使用超过200倍（摩尔量）未标记特异性双链。

Extract – + +Competitor – – +

– + +– – +

– + +– – +

– + +– – +

EBNA Oct-1 AP1

技术贴士

• 如何避免交叉污染？1、无论你是细胞还是组织，务必要新鲜，冻存过的细胞或组织中，冰晶会破坏核膜，核内容物释放，造成交叉污染。

2、每一步加入细胞裂解液后可在镜下观察细胞形态的改变，以确定是否裂解充分。

3、分离得到细胞核后可多用buffer冲洗几次，减少交叉污染。

• 核蛋白内参蛋白如何选择？建议内参蛋白：DDX3，HDAC1，MCM2，MHS2，P53，Oct-1 ，RAN，TOP2beta；不太建议Histone3作为核内参，因为H3与核酸结合紧密，为了保证核蛋白

的活性结构，NE-PER裂解较温和，不容易将两者分开，因而在提取核蛋白后的沉淀中仍然含有大量的未溶解的H3，核蛋白裂解液中只有很少一部分。

• 胞浆蛋白内参如何选择？不建议选用actin。因为这些结构蛋白要么与细胞核锚定，要么与细胞核结构蛋白交联，抽提到的核蛋白中会有残留。建议使用胞浆中代谢通路的酶或者蛋

白作为胞浆内参。

6

蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液和片剂可在原代细胞、哺乳动

物培养细胞、动物组织、植物组织、酵母或细菌细胞的提取或

裂解过程中有效保护蛋白质。各种抑制剂包装规格多样，无

EDTA配方可用于二价阳离子敏感性试验。

Halt系列蛋白酶、磷酸酶以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物

是即用型100X浓度的溶液。这种溶液方便易用，仅需用移液

器向裂解液或样品中加入合适体积的抑制剂即可避免蛋白

降解，并且每种配方都有四种包装规格供选择，分别为：24

X100uL、1mL、5mL和10mL。

Pierce系列蛋白酶、磷酸酶以及蛋白酶和磷酸酶复合型抑制

剂片剂，采用棕色瓶装，可快速溶解为澄清溶液，能够完全

兼容所有Thermo ScientificTM Pierce蛋白质定量试剂。每片

蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物广谱混合液和片剂可全面保护蛋白质

具体货号信息请参见第18页货号索引

表2. Thermo Scientific™ Halt™蛋白酶抑制剂混合液和Pierce™蛋白酶和磷酸酶抑制剂片剂中的成分

抑制剂成分 靶点（机制） 蛋白酶混合液和片剂 磷酸酶混合液和片剂 蛋白酶和磷酸酶复合型混合

液和片剂AEBSF·HCl 丝氨酸蛋白酶（不可逆） ●

抑肽酶 丝氨酸蛋白酶（可逆） ● ●

乌苯美司 氨肽酶（可逆） ● ●

E-64 半胱氨酸（不可逆） ● ●

亮肽素 丝氨酸与半胱氨酸蛋白酶 （可逆） ● ●

胃蛋白酶抑制剂 天冬氨酸蛋白酶 （可逆） ●

EDTA* 金属蛋白酶（可逆） ● ●

氟化钠 丝氨酸/苏氨酸以及酸性磷酸酶 ● ●

原钒酸钠 酪氨酸以及碱性磷酸酶 ● ●

β-甘油磷酸盐 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 ● ●

焦磷酸钠 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 ● ●

* 无EDTA配方中不含EDTA

Pierce抑制剂片剂足够用于处理10mL（mini片剂）或50mL（

大片剂）蛋白样品。

蛋白酶抑制剂cock ta i l、蛋白酶和磷酸酶复合型抑制剂

cocktail，都可以提供含有或者不含有EDTA的两种配方。

优势:• 方便—即用型、完全公开的广谱配方具有液体混合物或片剂形式，包装规格多样，保质期最短1年

• 全面保护—多合一配方的复合型混合液同时含有蛋白酶与磷酸酶抑制剂

• 兼容性—可直接与Thermo Scientific™ Pierce™细胞裂解液或其他市售或自制去污剂类裂解试剂合用

图3. 比较市售的蛋白酶抑制剂混合液和片剂。

在添加或不添加市售蛋白酶抑制剂（含EDTA，蓝色；无EDTA，紫色）的情况下，胰腺提取物（50 μL，1 μg/μL蛋白质）或胰蛋白酶（25 μL，0.1 单位/μL）与淬灭荧光的半胱氨酸

（A）或丝氨酸蛋白酶（B）裂解底物一起孵育。在37 °C下孵育2小时，并在指定的发射光下测定荧光。图片显示了各种蛋白酶抑制剂相应的蛋白酶抑制百分比。

A. B.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

92 92 94

79

94 93

80

17

70

9494 91

7779

HaltPierceMini Pierce Mini

Thermo Scientific

EDTA

EDTA

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

HaltPierceMini Pierce Mini

Thermo Scientific

77 77

85

59

82

75

61

9796

8781 81

69 68

EDTAEDTA

7

Thermo Scientific™ Pierce™DNA 3´末端生物素标记试剂盒经

过优化，使用脱氧核苷酸末端转移酶（TdT），可将1-3个生物

素标记的核糖核苷酸（生物素-11-UTP）整合到DNA链的3’

末端，用于非放射性EMSA和其他核酸检测方法。这种标记方

法的优点在于可以将生物素定位于探针的3’末端，从而减少

了对杂交反应或序列特异性蛋白结合的干扰。

优势:• 非同位素标记可以消除放射性同位素的危险和废物难处理问题

• 生物素标记的探针可稳定保存超过1年

• 快速、高效的标记只需30分钟

• 可应用于多种非同位素检测应用，包括EMSA、Southern /Northern blot、菌落杂交或原位杂交

由于TdT更倾向于选择单链DNA作为底物，但它也可以标记3´

悬垂尾巴的双链DNA和平末端双链DNA，只是催化效率相对

较低，我们也提供关于将标记后的DNA单链退火成双链的技

术贴士。

Pierce DNA 3´末端生物素标记试剂盒DNA 3´末端进行生物素标记的完整试剂盒货号：89818

EBNA Oct-1 API SPI NF-κB NF-κB

ExtractCompetitor

(TNF-α induced) (uninduced)

– + + – + + – + + – + + – + + – + +– – + – – + – – + – – + – – + – – +

技术贴士

• 生物素标记后如何退火？核酸互补链的退火方法有很多。在所有情况下，目标是使互补链变性以除去所有二级结构，然后实现链的杂交。参见技术贴士45：“寡核苷酸互补对的退火”。

• DNA探针标记指南我们建议11-59bp的DNA双链可直接合成标记生物素，价格比较合适，可点击http://primer.thermofishermall.com/进行查询。分子量过大的DNA探针建议采用试剂盒进行标记，更加便捷。

更多信息和实用的技术贴士请见 thermofisher.com/protein-nucleic-interactions

图4. 使用测序凝胶来分析标记效率。使用Pierce DNA 3´末端生物素标记试剂盒，标记10个不同的寡核苷酸片段（长度为21-25nt）。使用T4多核苷酸激酶（PNK）和[γ32P]ATP对TdT反应产物进行放射性标记。PNK反应产物在20%丙烯酰胺/8M尿素/TBE中进行电泳。起始寡核苷酸的位置（无生物素）被标记为“n”。使用TdT在每条DNA链上整合1-2个生物素标记的核糖核苷酸（位置分别为“n+1”和“n+2”）。标记效率为72%（ENBA正义链）至94%（Oct-1正义链）。试剂盒对照寡核苷酸的标记效率为88%-94%。

图5.3´末端生物素标记DNA双链的EMSA结果。使用生物素3´末端DNA标记试剂盒标记正义链和反义链，然后在室温杂交4小时，形成含有图中转录因子结合位点的双链。使用Thermo Scientific™ LightShift™化学发光EMSA试剂盒进行凝胶迁移率实验，每个结合反应使用20 fmol双链DNA。转录因子来自于使用Thermo Scientific NE-PER核蛋白和胞质蛋白抽提试剂（货号78833）制备的HeLa细胞核提取物（每个反应使用2μl或6-7μg蛋白）。在NF-κB体系中，核提取物来自于经过TNF-α处理或未经处理的HeLa细胞。竞争反应含有200倍的非标记双链，以此确定蛋白-DNA相互作用的特异性。

EBNA Oct-1 API SPI NF-κB Kit control

S A S A S A S A S A A A A

s = sense strand a = antisense strand

n

n+1

n+2

n

n+1

n+2

n

n+1

n+2

n

n+1

n+2

n

n+1

n+2

n

n+1

n+2

试剂盒对照品

正义链 反义链

8

LightShift化学发光EMSA试剂盒是一种非常强劲且灵敏的检测系统，通过电泳迁移率实验（EMSA）检测蛋白质-DNA结合相互作用。该试剂盒包括用于建立和定制蛋白质-DNA结合反应的试剂，用于验证体系的阳性对照，稳定的链霉亲和素-HRP偶联物（作为探针用于识别生物素标记的DNA），以及极其灵敏的化学发光底物等。

优势:• 对照系统：Epstein-Barr病毒核抗原（EBNA）阳性对照系统，可帮助新用户摸索检测体系，了解用于确定结合相互作用特异性的方法

• 高灵敏度：灵敏度超越放射性和地高辛检测法，检测细胞核提取物中低丰度蛋白的理想选择

• 高兼容性：兼容之前建立的常规DNA-蛋白质相互作用结合条件

DNA EMSA检测试剂盒的原理与蛋白免疫印迹类似。3´末端生物素标记的双链DNA与细胞核提取物或纯化的转录因子共同孵育，之后进行非变性凝胶电泳。然后，将DNA快速（30分钟）转印至带正电的尼龙膜上，进行紫外交联，再结合链霉亲和素-HRP偶联物，最后与底物孵育。从标记到获得结果的整个实验流程可以在一天内完成。

整个实验中，只需实验人员准备末端生物素标记的纯化目标DNA、待检测的蛋白提取物、尼龙膜和基本电泳设备。目标DNA可在合成的同时进行5’或3’端生物素标记，或者片段化之后使用生物素3’末端DNA标记试剂盒（产品货号89818）进行标记。用户可通过不同方法获得细胞核、细胞质或全细胞蛋白提取物，包括NE-PER核蛋白和胞浆蛋白抽提试剂盒（产品货号78833）。

LightShift化学发光EMSA试剂盒

识别和鉴定蛋白质-DNA结合相互作用的强大工具货号：20148

图6.四种不同DNA-蛋白质复合物的化学发光DNA EMSA。生物素标记的目标双链体大小范围为21至25 bp。EBNA反应中添加了2.5%甘油和0.05% NP-40，AP1反应中添加了10%甘油。Oct-1、AP1和NF-κB转录因子均来自HeLa细胞核提取物。试剂盒提供EBNA-1提取物作为对照。未标记的特异性竞品序列（在使用的情况下）比标记靶标多出200倍摩尔量。EBNA、Oct-1和AP1体系的X射线胶片曝光时间为2分钟，NF-κB为5分钟。

图7. LightShift EMSA试剂盒适用于超迁移实验。图示为使用22 bp Oct-1特异性双链体和HeLa细胞提取物的LightShift EMSA。在结合反应中加入兔抗Oct-1抗体（1μg），并在室温下孵育20分钟，然后上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶上。曝光时间为2分钟。

ExtractCompetitor

EBNA

– + +– – +

Oct-1

– + +– – +

AP1

– + +– – +

NF-κB

– + +– – +

– – – +Competitor– – + –Antibody– + + +Extract

Oct-1 超迁移

Oct-1 迁移

了解更多信息访问 thermofisher.com/emsa

技术贴士

• 关于超迁移实验并非所有的EMSA都可以进行超迁移实验，如果蛋白与DNA结合位点恰好为蛋白与识别抗体的结合位点，该结合位点已经与DNA结合，抗体极有可能识别不了蛋白，导致超迁移实验失败。为了确保超迁移实验结果，1. 确保抗体必须是能够识别天然构想的抗体 2. 确保抗体结合位点与DNA结合位点不重合。

我们提供超过74,000种经过严格验证的Invitrogen一抗和二抗，覆盖了蛋白质组中超过85%的靶点蛋白。超过200,000 篇引用文献确保可靠的实验结果。访问thermofisher.com/antibodies，了解更多信息

• EMSA实验使用哪种转印膜由于核酸带有负点，建议使用正电尼龙膜（货号77016）

9

图8.Pierce 磁珠ChIP试剂盒具有更好的富集率。LNcaP前列腺癌细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养24小时。其中一半细胞使用5 µM喜树碱处理16小时（喜树碱可抑制DNA拓扑异构酶I活性）。1%甲醛进行固定10分钟后，使用四种不同来源的ChIP试剂盒，并按照试剂盒中的操作步骤，检测p53与1.5kb长CDKN1A（p21）启动子的结合，之后使用QPCR进行定量测定。Pierce磁珠ChIP试剂盒可富集更大的DNA片段。

Thermo Scientific染色质免疫沉淀系统是一种简单的优化方法，我们提供两种树脂基质的ChIP试剂盒：琼脂糖ChIP和磁珠ChIP，用以捕获、富集染色质/蛋白质复合物和回收DNA。分离的DNA可立即用于下游分析，如PCR或qPCR测定、大规模平行DNA测序等。

琼脂糖ChIP试剂盒和磁珠ChIP试剂盒的共同特性优势:• 完善—试剂盒包含ChIP工作流程所需的所有组分

• 快速—可在8小时内完成样品制备

• 完整—含有阳性对照，（RNA聚合酶II抗体和 GAPDH PCR引物）方便优化实验

• 高重复—均采用Micrococcal Nuclease酶切方式，用以保证实验结果的重复性

• 低背景—Protein A/G琼脂糖和磁珠均经过优化，为ChIP级别填料

• 灵活—免疫沉淀所得DNA适用于PCR或qPCR测定以及NGS

染色体免疫沉淀（ChIP）系统方便、完整的琼脂糖/磁珠ChIP试剂盒具体货号信息请参见第18页货号索引

了解更多信息访问 thermofisher.com/chip

表3. 与传统ChIP方案的比较

工作流程步骤 Thermo Scientific ChIP时间表 传统ChIP时间表

预清洁 无需 1-2小时

抗体/染色质孵育 2小时

低丰度蛋白建议过夜

过夜

树脂pull down 1小时 2小时

洗涤 30分钟（用缓冲液洗涤2次）

1-3小时（用缓冲液洗涤4次）

解交联

1.5小时

过夜

蛋白酶K消化 2小时

洗脱DNA 15-30分钟

DNA纯化 2小时-过夜

平均时间 5-8小时 36-48小时

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究某些蛋白质与基因组特定区域的关联性的强大技术。这些序列特异性DNA结合蛋白被认为在DNA复制、重组、修复和隔离，染色体稳定性，细胞周期进展以及表观遗传学沉默等细胞过程中发挥作用。在标准ChIP测定中，使用甲醛处理固定细胞；使用高度特异性的抗体对染色质进行剪切和免疫沉淀。随后，研究者分析DNA，鉴定染色质相关蛋白在体内与染色质结合的基因组区域。

Thermo Scientific ChIP试剂盒，无论是琼脂糖基质还是磁珠基质，均比传统ChIP工作流程所需的起始样品量更少，从而能够节约珍贵样品。相比传统ChIP测定需要2-3天，我们的试剂盒能够在一天内完成实验。此外，这两类试剂盒可以与我们经过ChIP验证的抗体套装一起使用，并且能够与Applied Biosystems™ MethylCode™和NCode™产品互补用于下游表观遗传学研究。

依据科研工作者的不同需求，我们还提供ChIP级别Protein A/G plus 琼脂糖和ChIP级别Pierce Protein A/G磁珠，均可单独购买。

10

蛋白质-RNA相互作用在mRNA翻译为蛋白质和调控非编码RNA中发挥着重要作用。越来越多的科研工作者关注于非编码RNA的研究，包括mRNA的5’和3’非翻译区（UTR）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA）家族。

最近，一些小RNA已被认为与原癌基因有关联，并在各种疾病（包括癌症）中担任角色。由于使用放射性成分、高背景和高实验变异性，蛋白质和RNA相互作用研究极具挑战。mRNA的UTR区域含有调控元件，可与RNA结合蛋白相结合，并用于转录后调控和蛋白质翻译。此外，这些调控元件可促进转录本的稳定或协助降解，还可以引导RNA在亚细胞结构中定位。这些RNA调控元件的长度取决于RNA-蛋白质复合物形成的一级和二级结构。3’UTR还含有miRNA的识别元件，其作用是抑制目标mRNA翻译成蛋白质。

miRNA普遍存在，其中一大类是非编码RNA，它们可启动目标mRNA转录后沉默。在大多数情况下，可通过降解、脱腺苷化或P-bodies胞浆复合体（P小体）抑制mRNA；但在某些

情况下，也可能上调mRNA的表达。已有多种mRNA抑制和降解模型被提出，但均有争议。为进一步了解miRNA在细胞生长、分化和癌变过程中的作用，关于microRNA的研究迅速扩增，调控microRNA的关键蛋白质的研究也已经展开。

lncRNA是长度在200-100000 nt之间的RNA分子，不编码蛋白，参与细胞内多种重要过程调控，包括X染色体沉默，染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等。近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，主要集中在挖掘新的lncRNA和已知lncRNA功能研究上，lncRNA的研究成为了RNA基因组研究非常吸引人的一个方向。

对蛋白质-RNA相互作用的分析鉴定是非常繁琐的。RNA和蛋白质都必须正确折叠才能正确结合，并且必须注意不要在反应中引入其他蛋白酶和核酸酶。EMSA、pull-down实验、荧光原位杂交（FISH）/ISH共定位研究、Southern/Northern分析和RNase保护实验已被用于鉴定蛋白质-RNA相互作用。本节将介绍RNA EMSA和蛋白质- RNA pull-down实验。

图9. 两种蛋白质-RNA相互作用方法流程图

蛋白质-RNA相互作用研究

RNA EMSA

B

RNA pull-down

OO

HN

NH

O

OH

OP

O

OH

OPOHO

HO

Cytidine BiotinO5´

未标记的不相关RNA - - - + - - - + 未标记的IRE RNA - - + - - - + -

肝脏提取物 - + + + - + + + 标记 IRE RNA + + + + + + + +

生物素标记的IRE

RNA蛋白质复合物

32P-IRE

OO

HN

NH

加入分离的细胞/组织提取物或纯化蛋白质，确定RNA结合亲和力

在裂解物中加入蛋白酶抑制剂

使用T4 RNA连接酶标记RNA

体外鉴定蛋白质和RNA序列的结合

体外富集低丰度靶标或完整复合物

使用链霉亲和素磁珠捕获标记RNA

使用3 ´末端标记试剂盒对RNA探针进行生物素标记，并加到蛋白质提取物中

形成蛋白质-RNA复合物

蛋白质与RNA结合

洗脱

在凝胶上分离生物素标记的复合物并转印到尼

龙膜上

检测方法：链霉亲和素-HRP化学发光法

检测方法：蛋白质免疫印迹或质谱

11

M-PER哺乳动物蛋白质抽提试剂非变性去垢剂配方更加温和，可在短短5分钟内抽提总可溶性细胞蛋白。货号：78501/78503

T-PER组织蛋白质抽提试剂专利去垢剂配方，最大程度抽提哺乳动物组织中的蛋白货号：78510

Thermo ScientificTM M-PER哺乳动物细胞总蛋白质抽提试剂是一种基于去垢剂配方的完全细胞裂解试剂，该试剂在低浓度下即能溶解细胞膜，不会引起蛋白质变性，并且与下游分析兼容。利用M-PER抽提得到的蛋白量高于反复冻融法或者超声法，且抽提的效率极高，无需将贴壁细胞从细胞培养皿刮下，能轻松地裂解和分析在24孔和96孔板中生长的细胞。

优势:• 作用温和—温和的去垢剂裂解，产生的非变性蛋白质抽提物可立即用于蛋白质测定、报告基于分析、免疫印迹、免疫沉淀和亲和纯化

• 易于使用—不含胺基并且可完全透析，使其能够兼容后续分析系统

• 方便—贴壁细胞直接在板上裂解或者在剥离和洗涤后悬浮于溶液中

• 可靠—对原代和培养哺乳动物细胞的蛋白产量和提取效率经过验证

Thermo Scientific™ T-PER™织蛋白质抽提试剂使用专利去垢剂裂解组织内的细胞，其缓冲体系为25mM N-二甘氨酸和150mM 氯化钠（pH 7.6），通过匀浆最大程度溶解哺乳动物组织样本中的蛋白质。该试剂成分简单，可兼容蛋白酶抑制剂、盐、还原剂和螯合剂等试剂，适用于多种不同样品类型和裂解应用。利用T-PER试剂制备的裂解物可直接用于报告基因分析（如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶）、蛋白激酶分析（如PKA、PKC、酪氨酸激酶）、免疫分析（如蛋白质免疫印迹、ELISA、放射免疫分析（RIA））以及蛋白纯化实验等下游分析。

优势:• 步骤简单—仅需按照1:20（w/v）将组织样品与T-PER试剂混合，匀浆，然后离心沉底细胞或组织碎片

• 易于使用—去垢剂配方温和，并且可通过透析快速去除

• 通用—可以与其他成分一起使用（如蛋白酶抑制剂、盐、还原剂、螯合剂等）

• 兼容性强—裂解物可兼容蛋白定量试剂，如Thermo Scientific™ Pierce™ Coomassie Plus（Bradford）蛋白质测定（货号23236）和Thermo Scientific™ Pierce™ 600nm蛋白质测定（货号22660）；还可用于报告基因分析、蛋白激酶分析、免疫分析、ELISA、蛋白质免疫印迹和蛋白纯化

• 可靠—对心、肝、肾、肺和脾脏组织的蛋白产量和提取效率经过验证

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

蛋白质产量（

µg）

/10

6 个细胞

HeLa CHO Jurkat NIH 3T3 心脏细胞 神经细胞

原代细胞

图10. 使用M-PER哺乳动物蛋白质抽提试剂抽提各种细胞的蛋白质产量。收获生长至85%的细胞，洗涤2次，收集并加入冷PBS，计数。取1 x 106个细胞以2,000 x g离心5分钟，加入1 mL M-PER孵育5分钟。将细胞裂解液以14,000 x g离心10分钟，收集上清液，并使用Thermo Scientific™ Pierce™ BCA蛋白质测定（货号23227）检测蛋白质浓度（μg/106个细胞）。

12

Pierce RNA 3´末端生物素标记试剂盒一种非放射性、对RNA二级结构干扰极小的标记方法货号：20160

细胞功能的调控有赖于关键RNA与蛋白质以及其他RNA（包括miRNA）的相互作用。这些相互作用难以分离，并且高度依赖于RNA二级结构的维持。为了富集这些相互作用，通常需要标记RNA，生物素标记的RNA探针可作为研究RNA与其他分子相互作用的诱饵。

优势:• 非放射性—生物素标记，检测灵敏度与放射性方法相当

• 快速—RNA标记通常可在0.5-2小时内完成，下游处理极少

• 简单易用—包含RNA连接酶和经过优化的反应缓冲液

• 单一标记—对RNA二级结构的干扰极小

• 灵活—可标记22-450bp长度的合成或者体外转录的RNA

图11.末端标记的RNA与合成标记的RNA具有相近的灵敏度。 使用Pierce 3´末端生物素标记试剂盒（RNA pol和IRE RNA）和合成生物素标记RNA探针（合成RNA）制备的两个末端标记RNA探针，在10%丙烯酰胺/8M尿素凝胶上电泳，并转印到尼龙膜上，经过UV交联，再使用化学发光核酸检测模块（货号89880）进行检测。RNA探针浓度表示为（nM）。曝光时间5秒。

Synthetic RNA

RNA pol

IRE RNA

2.5 5 10 25 50 nM

表4. 不同来源和不同长度的RNA标记效率

RNA 类型 RNA来源 长度（bp） 效率（%）* 方法说明 参考文献

IRE（铁效应元件） 3´或5´UTR元件 合成 28 76 2小时，16°C Leibold, et al.

RNA聚合酶模板 RNA 合成 42 80** 2小时，16°C McKinley, et al.

Mir-16-1 miRNA 成熟的microRNA 合成 22 70 过夜，16°C www.mirbase.org

TNF ARE 3´ UTR元件 合成 37 77 2小时，16°C Hall-Pogar, et al.

Let-7 miRNA前体 miRNA前体 体外转录 ~70 70 过夜，16°C Piskounova, et al.

hTR（端粒酶RNA） 催化RNA 体外转录 350 74 过夜，16°C O’Connor, et al.

* 将探针进行连续梯度稀释，并进行三次独立的生物素标记和斑点实验，使用光密度测定法对标记效率进行分析。合成的生物素标记RNA可用作对照，并将浓度归一化。

**RNA聚合酶模板RNA可以在37℃连接30分钟，效率> 80℃。

技术贴士

• 常见RNA生物素标记时间通常，该反应需要50 pmol RNA，与超过其含量20倍的生物素标记核苷酸在16°C连接2小时；但是，短RNA的二级结构复杂性最小，可在37°C连接30分钟（如，RNA聚合酶RNA模板）。较大的或结构复杂的RNA需要更长的孵育时间（如Let-7和hTR）。通过改变连接比例、延长孵育时间或使用DMSO松弛RNA结构，可进一步优化。生物素标记完成后，获得标记RNA沉淀并以除去反应副产物。然后，可将获得的探针用于下游应用，如RNA EMSA（LightShift化学发光RNA EMSA，货号20158）、RNA pull-down实验和miRNA分析。

• 评估RNA生物素标记效率为监测RNA生物素标记的有效性，使用两种方法评估对照RNA标记效率，即使用Thermo Scientific™化学发光核酸检测模块（货号89880）进行斑点印迹，以及使用Thermo Scientific™荧光生物素定量试剂盒 （货号46610）进行光谱分析。生物素末端标记的IRE和RNA聚合酶RNA模板与合成的生物素标记RNA的灵敏度相当（图14）。50 pmol反应可为EMSA提供足够的RNA，并且RNA可以稀释至少25-50倍（5-10 nM）。

更多信息和实用的技术贴士请见 thermofisher.com/protein-nucleic-interactions

Thermo Scientific™ Pierce™ RNA 3´末端生物素标记试剂盒可以实现快速RNA标记，此外还含有一个作为阳性对照的未标记RNA，以及一个用于定量标记效率的生物素标记RNA探针。为提高生物素标记效率和RNA稳定性，试剂盒还包含RNase抑制剂、糖原和连接增强剂。

标记的RNA长度可以从18-22个核苷酸（miRNA）到具有多种二级结构的数百个碱基。表4所示，使用T7 RNA聚合酶合成和体外转录生物素标记的RNA探针。我们使用的RNA具有不同的二级结构和长度。四种合成的和两种体外转录的RNA都具有高于70%的连接效率，表明该试剂盒可对不同长度、二级结构和来源的RNA进行灵活、高效的生物素标记。

13

Thermo Scientific™ LightShift™化学发光RNA EMSA试剂盒利在DNA-EMSA试剂盒的基础上进行了优化，专门针对RNA-蛋白质相互作用，并为其研究提供了一种非放射性解决方案。将生物素标记的RNA探针与蛋白质样品孵育，形成复合物，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品。RNA-蛋白质复合物的迁移速度比不结合RNA探针的蛋白更慢，从而改变了迁移模式。通过竞争结合可确定特异性，因为在结合反应中孵育过量的未标记RNA，降低了特异性相互作用的信号强度。

优势:• 灵敏—化学发光检测的灵敏度与放射性检测相当

• 省时—检测全程可在1天内完成

• 灵活—兼容多种RNA标记方法

• 简单—兼容细胞裂解物

• 非放射性—消除了放射性废物处理问题，实验者也更加安全

化学发光RNA EMSA试剂盒包含富集和检测蛋白质-RNA相互作用所需的全部试剂，此外，还含有阳性对照用于系统检测和实验优化。RNA EMSA的阳性对照系统是IRE（铁效应元件）/ IRP（铁效应蛋白），IRP对细胞的铁状态进行响应。在缺乏铁的条件下，IRP与IRE RNA结合，抑制储铁蛋白、铁蛋白和转铁蛋白的翻译；在富含铁的条件下，IRE失去结合活性，铁蛋白和转铁蛋白被翻译。该体系是普遍存在的，并且可产生稳定的条带迁移。将阳性对照反应与超过200倍摩尔量的未标记IRE RNA一起孵育，可将条带迁移信号降低70%，从而表明特异性；但是，将对照反应与相似倍数的不相关RNA孵育，不会显著降低条带迁移信号（图14，见上页）。这些结果表明，IRE/IRP阳性对照具有可靠性、灵敏性和特异性。

为了进行RNA EMSA，需要来自细胞裂解物或体外翻译的目标生物素标记RNA探针和蛋白质。生物素标记RNA探针的获取方式包括购买市售产品、通过生物素标记核苷酸的转录生成或使用Thermo Scientific™ Pierce™ RNA 3´末端生物素标记试剂盒（货号20160）标记。末端标记RNA探针有助于将对RNA二级结构和蛋白质相互作用的干扰降至最低。

除了不会产生放射性标记核苷酸之外，生物素标记RNA探针还具有与放射性方法相当的灵敏度，同时检测速度更快。通过使用不同探针浓度进行RNA EMSA，对生物素标记RNA探针和放射性标记探针的灵敏度进行比较。对于生物素标记和放射性标记的探针，条带迁移都具有稳定性和特异性（图15）；但是，当与32P标记探针的条带迁移信号和曝光时间（使用增光屏曝光16小时）相比，生物素标记IRE-RNA在短时间曝光（20分钟）后即扩增信号。两种标记方法均对埃摩尔范围灵敏（图15）。

图12. IRE/IRP RNA EMSA阳性对照具有灵敏性和特异性。生物素标记的IRE：用于结合缓冲液反应，使用含5%甘油和2μg tRNA的1XREMSA结合缓冲液，将5nM（5.1fmol）生物素标记的IRE RNA与4μg细胞质肝脏提取物（含有IRP）在室温下孵育30分钟。加入未标记的RNA（1μM）用于竞争反应，并加入未标记的不相关RNA（端粒酶RNA）用于证明特异性。使用0.5X TBE和非变性6%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳并转印到尼龙膜上。使用化学发光检测模块检测条带迁移率。32P-IRE：使用32P末端标记的IRE（5nM）、肝细胞提取物（5μg）和与上述相同的生物素标记IRE结合缓冲液条件，进行功能性凝胶迁移率实验。在扫描凝胶上进行密度测定。

LightShift化学发光RNA EMSA试剂盒快速、灵敏、非放射性检测RNA-蛋白质相互作用的方法货号：20158

RNA IRE RNA

IRE RNA

IRE

IRE-RNA

32P-IRE

–

– – – – –

–

+ + +++ +

++

+

–

– – – – –

–

+ + +++ +

++

+

14

为了证明优化缓冲液和测定系统的灵活性，对三种已知蛋白质-RNA相互作用进行检测：1）具有端粒酶逆转录酶（TERT）的端粒酶RNA（hTR；451个核苷酸）；2）Let-7 miRNA（100个核苷酸）和Lin28蛋白质；以及3）RNA聚合酶（42个核苷酸）和细菌RNA聚合酶核心酶的RNA模板。hTR和Let-7 RNA在转录过程中使用生物素化UTP进行标记。对于RNA聚合酶结合反应，使用Pierce RNA 3’-末端生物素标记试剂盒（货号：20160）对RNA模板进行末端标记。通过过表达（OriGene Technologies）获得TERT和Lin28蛋白。从细菌中纯化RNA聚合酶。所得到的条带迁移（图14）表明，结合缓冲液、辅助组分和检测模块适用于使用不同RNA标记方法和蛋白质来源的多种RNA-蛋白质相互作用。

对LightShif t化学发光RNA EMSA试剂盒和放射性标记EMSA进行比较。LightShift化学发光RNA EMSA试剂盒的优点在于具有灵活性、灵敏性、特异性和使用非放射性标记的RNA。该试剂盒可稳定用于各种系统，包括编码和非编码RNA-蛋白质相互作用、各种RNA长度和标记方法以及纯化蛋白质和细胞裂解物。

图13.化学发光检测与放射性检测的灵敏性相当。将生物素标记的IRE RNA探针稀释至50 amol。为获得32P-IRE，使用T4多核苷酸激酶将γ-32P ATP标记到IRE（200 pmol）上，然后稀释至与生物素标记RNA相同的浓度。

生物素标记IRE探针

32P-IRE探针滴定

fmol1 0.75 0.68 0.5 0.38 0.25 0.1 0.05 1 0.75 0.68 0.5 0.38 0.25 0.1 0.05fmol

曝光16小时

曝光1分钟

图14. 化学发光RNA EMSA适用于不同RNA和蛋白质来源。转录标记：构建质粒载体，使用的生物素-11-UTP或未标记UTP在转录时对hTR和Let-7进行标记。3´末端标记：使用T4 RNA连接酶和修饰的生物素标记胞嘧啶对RNA聚合酶的RNA进行末端标记。纯化RNA探针，并与裂解物（TERT，Lin28）或纯化RNA聚合酶在1X结合缓冲液中孵育。对于Let-7/Lin-28，额外添加DTT和KCl，hTR/TERT的甘油浓度为2.5%。使用超过50-100倍摩尔量的未标记RNA进行竞争反应。（A）hTR/TERT；（B）Let-7/Lin28；（C）RNA/RNA聚合酶。

A BUnlabeled RNA

Extract

C– – +

– + +

hTR/TERT

– – +

– + +

Let-7/Lin28

– – +

– + +

RNA/RNAPolymerase

技术贴士

在DNA和RNA印迹曝光后，研究人员通常希望洗脱第一个探针和检测试剂，以便可以重新探测相同或不同的靶标。技术贴士中描述了几种常用条件可用于洗脱探针，同时保留膜上的核酸靶标。

参见技术贴士#28：“DNA和RNA印迹的洗脱”

更多信息及其它实用的技术要点请见 thermofisher.com/protein-nucleic-interactions

15

优势:• 非放射性—单个生物素标记的检测灵敏度与放射性方法相当

• 简单—包含RNA连接酶和经过优化的反应缓冲液

• 末端标记—对RNA二级结构是干扰极低

• 灵活—脱硫生物素标记可用于检测或与链霉亲合素树脂进行亲和连接

Pierce RNA 3´末端脱硫生物素标记试剂盒经过优化，可使用T4 RNA连接酶标记单链RNA的3´末端。每个标记反应可标记50 pmol RNA；可根据需要对反应进行放大（已经对1 pmol至1 nmol进行过测试）。该反应使用超过20倍的脱硫生物素标记核苷酸，需要在37°C下孵育30分钟（复杂性相对较低的RNA）或在4–16°C下孵育过夜（较长或较复杂的RNA）。通过改变RNA-核苷酸比例、延长孵育时间或加入DMSO来松弛RNA结构，可优化对复杂RNA结构的标记效率。经过有机萃取和乙醇沉淀后，得到的脱硫生物素标记RNA可立即用于下游应用。

标记后，RNA可作为凝胶迁移EMSA反应、RNA印迹和蛋白质-RNA相互作用实验的探针或靶标。脱硫生物素标记的RNA也可以结合链霉亲和素树脂富集RNA结合蛋白（RBP），因为脱硫生物素标签与链霉亲合素的结合方式使核糖核蛋白复合物能够被温和洗脱。该试剂盒包含脱硫生物素标记的胞苷二磷酸、T4 RNA连接酶和缓冲液、用作阳性对照的未标记RNA寡核苷酸、生物素标记RNA探针标准品、RNase抑制剂、糖原和用于标记的连接增强剂。该标记试剂盒也是Thermo Scientific™ Pierce™ Magnetic RNA-Protein Pull-Down 试剂盒中的一个组件。

应用:• Northern blotting

• EMSA

• 富集RNA结合蛋白 (RBP)

Pierce RNA 3´末端脱硫生物素标记试剂盒可与链霉亲和素结合并温和洗脱，替代抗体富集RNA结合蛋白货号：20163

表5. RNA脱硫生物素标记效率。将RNA加热至90°C并在该温度下保持5分钟，在连接反应之前快速冷却。每个反应含有50 pmol RNA，根据产品说明书进行连接反应。使用斑点印迹和浓度测定法测定相对连接效率，并与合成生物素标记RNA对照（100%）进行对比。每个连接反应重复两次，并重复印迹三次。

RNA 长度（nt） 效率（%）

对照RNA 42 92

Poly(A)25 25 56

雄激素受体 51 75

U1 RNA 46 70

Tat外显子 57 90

Let-7调节环 40 50

O

OH

OP

O

HO OH

OP

OHO

HO

O

OH

OP

O

OH

OP

OHO

HO

胞嘧啶 脱硫生物素

胞嘧啶 脱硫生物素

RNA 脱硫生物素标记的胞嘧啶二磷酸

（pCp-脱硫生物素）

3´ 脱硫生物素标记的RNA

T4 RNA 连接酶(+ ATP)

OH5´

O5´

图15. T4 RNA连接反应流程图。使用T4 RNA连接酶进行RNA连接需要一个3´-OH（形成所需RNA）和一个3 ,́ 5´核苷酸（二）磷酸。Pierce RNA 3´末端脱硫生物素标记试剂盒含有T4 RNA连接酶，以及一个具有生物脱硫素标记的胞嘧啶（二）磷酸核苷酸以用于标记反应。

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Pierce磁珠RNA-蛋白 Pull-Down试剂盒

可靠，简单，用于捕获蛋白质-RNA相互作用货号：20164

Pierce 磁珠RNA-蛋白 Pull-Down 试剂盒让研究人员能够以末端标记的RNA作为诱饵，轻松富集蛋白质-RNA的相互作用。

优势:• 直接—直接利用末端标记的RNA捕获核糖核蛋白复合物；不需要使用抗体进行pull-down

• 简单—RNA结合蛋白富集过程无需离心，步骤简化，在RNA标记反应后手工操作不到3小时

• 灵活—可对不同复杂程度和长度的体外转录RNA或合成RNA进行标记，可成功富集内源性、过表达和体外翻译裂解液中的蛋白

• 特异性—磁珠背景低；不相关RNA或突变RNA不会大量富集与目的RNA特异结合的蛋白

• 完整—包含标记、富集以及分析所需缓冲液，也包含阳性对照RNA、阴性对照RNA和RNA结合蛋白抗体

Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit可使用末端标记脱硫生物素的RNA和链霉亲和素磁珠高效富集RNA结合蛋白。核苷酸和脱硫生物素之间的间隔臂长经过优化，可有效地附着于磁珠，同时不损害RNA与蛋白质的接近。完整的

试剂盒包含Pierce RNA 3´末端脱硫生物素试剂盒、阳性和阴性RNA对照、核酸兼容的链霉亲和素磁珠，以及用于RNA结合蛋白富集和洗脱的缓冲液，足够20次RNA标记反应和20次蛋白质-RNA pull-down实验使用。此方法可取代使用抗体或半掺入核酸富集蛋白质-RNA复合物。该试剂盒的另一个优势在于提供了经过验证的对照品，适用于标记检测和pull-down实验优化。该试剂盒捕获的蛋白也适用于多个下游应用，包括蛋白质免疫印迹和质谱（MS）。

整个试剂盒已经过优化，使用方便。脱硫生物素RNA首先被磁珠捕获，随后，使用蛋白质-RNA结合缓冲液平衡RNA结合磁珠，再加入蛋白质裂解物。洗涤后，使用非变性生物素洗脱缓冲液或SDS-PAGE上样缓冲液洗脱样品。洗脱样品可立即用于多种下游应用，包括蛋白质免疫印迹和质谱分析。

对照系统采用雄激素受体（A R）3’非翻译区R N A （poly(A)25 RNA）和哺乳动物细胞裂解物。雄激素受体RNA的近端3’非翻译区（UTR）富含UC，可结合HuR和Poly(C) 结合蛋白（CP1和2），这些蛋白用于调控mRNA的稳定（HuR）和转录和翻译（CP1和2）。阴性对照RNA，即poly(A)25 RNA，不包含HuR-或poly(C)结合蛋白结合位点。

图16. RNA蛋白 Pull-down流程图

T4 RNA链接酶标记RNA

1

使用链霉亲和素标记的磁珠捕捉标记的RNA Wash 冲洗

2 捕获与RNA相互作用的蛋白

3

洗脱4

检测5

17

应用• 突变分析

• 结构功能分析

• RNA-蛋白质相互作用的鉴定

• 未知RNA-蛋白质结合对或复合物的MS分析

WT:5´-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3´

Mutant:5´-CUGGGCUUGUGUGUUCUCUGUCUCUCCUGUCUGGGUCUGCGUCCCUCCCUA-3´

HuR Poly(C)BP

雄激素受体 3´ UTR RNA 序列A

磁珠 pull-down 结果

L FT E FT E FT E

WT Mutant BeadsFT E FT EL

WT MutantHuR Poly(C)BP

B

RNA: AR 3´ UTRRBP: HuR

RNA: Tat 外显子 2RBP: hnRNPA1

RNA: Let-7 loopRBP: Lin28

RNA: Poly(A)25RBP: PABP1

L FT E FT E FT E

Target Unrelated None

添加到反应中的 RNA

图19. 末端脱硫生物素标记RNA富集特定结合蛋白。根据试剂盒说明，对AR 3´ UTR对照系统（上图）和三个实验系统的RBP进行富集。L=裂解物；FT-穿柱液；E=洗脱液。将A431裂解物与标记AR UTR RNA（靶标）一起孵育可富集HuR RBP，而与阴性对照poly(A) RNA（不相关）或仅与磁珠（无）孵育不能富集HuR RBP（对比洗脱泳道）。与实验系统结果相同，证明试剂盒功能正常。对样品体积进行归一化处理，并使用Thermo Scientific™ SuperSignal™ West Pico PLUS Substrate（货号34580）曝光2分钟进行条带检测。靶标RNA序列如下：

雄激素受体3´ UTR（试剂盒对照系统）:5´-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3´

Tat 外显子 2:5´-UUACUCAACAGAGGAGAGCAAGAAAUGGAGCCAGUAGAUCCUAGACUAGAGCCCUGG-3´

Let-7 loop:5´-CAGUUUGAGGGUCUAUGAUACCACCGGUACAAGAUAACUG-3´

Poly(A)25:5´-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3´

更多信息请见 thermofisher.com/rna-pulldown

5´-CAGUUUGAGGGUCUAUGAUACCACCGGUACAAGAUAACUG-3´

RNA:Let-7 loop

L FT E FT E FT E

Let-7 loop Unrelated None

添加到反应中的 RNA

RBP:Lin28

图17. Let-7 loop RNA特异性富集NCCIT提取物中的Lin28。利用Pierce 磁珠RNA-蛋白 Pull-Down试剂盒（货号20164），使用脱硫生物素标记的let-7 miRNA（50 pmol）富集Lin28，随后进行蛋白质免疫印迹分析。对样品体积进行归一化处理。L=裂解物；FT-穿柱液；E=洗脱液。不相关：阴性对照poly(A)25 RNA。

图18. RNA-蛋白质pull-down实验实例。突变对雄激素受体3´-UTR RNA结合HuR和Poly(C)BP的能力的影响。根据试剂盒说明，标记野生型和突变型AR 3´-UTR RNA（50 pmol），并用于pull-down实验。对样品体积进行归一化处理。L=裂解物；FT-穿柱液；E=洗脱液。PCBP1抗体（1:1,000）

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订购信息

产品 数量 货号 页码

样品裂解和蛋白质提取

NE-PER核蛋白抽提试剂盒 Kit 78833 5

M-PER哺乳动物蛋白质抽提试剂 500 mL 78501 11

T-PER组织蛋白质抽提试剂 500 mL 78510 11

抑制剂混合液和片剂

Halt蛋白酶抑制剂混合物Cocktail（100X） 1 mL 87786 6

Halt蛋白酶抑制剂混合物Cocktail（100X），无EDTA 1 mL 87785 6

Pierce蛋白酶抑制剂-mini片剂 30片 A32953 6

Pierce蛋白酶抑制剂片剂 20片 A32963 6

Pierce蛋白酶抑制剂-mini片剂，无EDTA 30片 A32955 6

Pierce蛋白酶抑制剂片剂，无EDTA 20片 A32965 6

Halt磷酸酶抑制剂混合物Cocktail（100X） 1 mL 78420 6

Pierce磷酸酶抑制剂-mini片剂 20片 A32957 6

Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物Cocktail（100X） 1 mL 78440 6

Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物Cocktail（100X），无EDTA 1 mL 78441 6

Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂-mini片剂 30片 A32959 6

Pierce蛋白酶和磷酸酶抑制剂-mini片剂，无EDTA 30片 A32961 6

蛋白质-DNA相互作用产品

DNA 3´末端生物素标记试剂盒 Kit 89818 7

LightShift化学发光DNA EMSA试剂盒 Kit 20148 8

MAGnify染色质免疫沉淀系统 24次反应 492024 9

Pierce琼脂糖ChIP试剂盒 30次反应 26156 9

Pierce磁珠ChIP试剂盒 30次反应 26157 9

Pierce ChIP级Protein A/G磁珠 5 mL 26162 9

Pierce ChIP级Protein A/G Plus琼脂糖 0.65 mL 26159 9

Pierce染色质制备模块（ChIP实验使用） Kit 26158 9

蛋白质-RNA相互作用产品

Pierce RNA 3´末端生物素标记试剂盒 Kit 20160 12

Pierce RNA 3´末端脱硫生物素标记试剂盒 Kit 20163 15

LightShift化学发光RNA EMSA试剂盒 Kit 20158 13

Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit Kit 20164 16

Pierce链霉亲和素磁珠 5 mL 88817 用于RNA pull-down

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DynaMag-2磁力架 1 each 12321D 用于手动磁力系统

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NF-κB p65转录因子试剂盒 2 plates/kit 89859 用于ChIP

核酸检测封闭缓冲液 500 mL 89880A 89880中一个组分

tRNA, 10 mg/mL 100 mL 20159 RNA EMSA封闭液

Biodyne B尼龙膜，0.45 μm，8 cm x 12 cm 25片 77016 8

蛋白酶K（20 mg/mL） 0.25 mL 26160 用于ChIP

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细胞和蛋白质分离技术手册

了解如何使用Thermo Scientific™蛋白质生物学产品，优化细胞和组织的蛋白质抽提，以提高产量

并改善下游应用的兼容性。了解如何快速高效地抽提总蛋白，获取亚细胞组分且尽可能避免交叉

污染，并利用复合型蛋白酶和磷酸酶抑制剂实现对蛋白质的最大保护。本手册还介绍了如何利用

高纯度的预稀释去垢剂改善裂解和免疫分析结果，以及快速高效地去除去垢剂干扰的技术。

蛋白质凝胶电泳技术手册

本手册提供了您需要了解的关于蛋白质凝胶电泳工作流程的全部内容，从样品制备到凝胶电泳再

到染色。您将了解到各种凝胶配方的区别，并可获取技术数据、实验方案和常见问题指南。本手

册还包括选择指南，帮助您查找适合您实验的产品。

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本手册提供了您想要了解的关于蛋白质检测流程的实用指南，包括检测技术的介绍和提高蛋白质

免疫印迹检测灵敏度的方法。您可以了解不同的检测系统，获取技术数据、实验方案和常见问题

指南，优化靶点检测结果。本手册还包括选择指南，帮助您查找合适的产品。

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您可以深入了解不同的转印系统、技术数据、实验方案和常见问题指南，以优化蛋白质转印。手

册还包括易于使用的选择指南，帮助您查找所需的合适产品。

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蛋白质检测技术手册

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免疫印迹检测灵敏度的方法。您可以了解不同的检测系统，获取技术数据、实验方案和常见问题

指南，优化靶点检测结果。本手册还包括选择指南，帮助您查找合适的产品。

获取更佳的质谱结果的全新工具

本手册概述了Thermo Scientific™质谱产品，包括我们已经过验证的超大质量范围Pierce™ Triple

Quadrupole校准溶液、Pierce™抗体生物素化试剂盒、免疫沉淀试剂盒、Pierce™高pH反相肽段

分离试剂盒以及荧光法和比色法肽段定量试剂盒。

Molecular Probes手册

《Molecular Probes手册-荧光探针和标记技术指南》为您提供最全面的荧光标记和检测技术指

南，介绍了超过3,000种试剂和试剂盒，涉及各种标记和检测产品。第11版包括大量参考资料、

重新改编的内容、最新技术注释及产品亮点。

Western blotting

Protein gel electrophoresistechnical handbook

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