1

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Dijana Stanić

Polimorfizam gena za -podjedinicu receptora GABAA u

osoba ovisnih o alkoholu

Diplomski rad

Zagreb, 2011. godina

2

Ovaj rad, izraĎen na Institutu RuĎer Bošković, Zagreb, u Laboratoriju za molekularnu

neurofarmakologiju, Zavoda za molekularnu medicinu, pod vodstvom dr.sc. Dubravke Švob

Štrac, znanstvene suradnice IRB, predan je na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-

matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra eksperimentalne

biologije.

3

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

POLIMORFIZAM GENA ZA PODJEDINICU RECEPTORA GABAA U OSOBA

OVISNIH O ALKOHOLU

Dijana Stanić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb

GABAA receptori posreduju akutne i kronične učinke alkohola uključujući toleranciju,

ovisnost, te sindrom ustezanja. Noviji rezultati upućuju na povezanost alkoholizma i gena

GABRA2 koji kodira 2 podjedinicu GABAA receptora, smještenom na kromosomu 4, a

posebice na polimorfizme u blizini susjednog gena GABRG1 koji kodira 1 podjedinicu. Cilj

istraţivanja bio je ispitati povezanost polimorfizma rs567926, smještenog izmeĎu gena

GABRA2 i GABRG1 sa alkoholizmom i povezanim ponašanjima, poput pušenja, početka

zlouporabe alkohola, agresivnog ponašanja i pokušaja samoubojstva. U istraţivanju je

genotipizirano 335 ovisnika o alkoholu i 230 kontrolnih ispitanika iz hrvatske populacije. Iako

nije pronaĎena povezanost biljega rs567926 sa ovisnošću o alkoholu i nikotinu, niti sa

ponašanjem povezanim sa alkoholizmom, utvrĎena je haplotipska povezanost biljega

rs567926 i rs279858, kao i povezanost pojedinih haplotipova sa specifičnim fenotipovima

unutar skupine ispitanika s alkoholizmom. U svrhu razjašnjavanja uloge gena GABRA2 u

razvoju ovisnosti o alkoholu i u ponašanju povezanim sa alkoholizmom, potrebna su daljnja

istraţivanja.

(52 stranica, 18 slika, 22 tablice, 102 literaturna navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici

Ključne riječi: alkoholizam; GABRA2; GABRG1, genetika; polimorfizam; rs567926;

haplotip

Voditelj: dr.sc. Dubravka Švob Štrac, znanstvena suradnica IRB

Suvoditelj: Doc. dr. sc. Domagoj Đikić, PMF

Ocjenitelji:

Rad prihvaćen:

4

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Division of Biology Graduation thesis

GABAA RECEPTOR -SUBUNIT GENE POLYMORPHISM IN ALCOHOL-

DEPENDENT INDIVIDUALS

Dijana Stanić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb, Croatia

GABAA receptors mediate acute and chronic effects of alcohol, including alcohol tolerance,

dependence and withdrawal. The results suggested the association of alcoholism with

GABRA2 gene encoding the GABAA receptor 2 subunit located on chromosome 4,

especially with polymorphisms near the neighboring GABRG1 gene, which encodes the 1

subunit. The aim of this study was to examine the association of polymorphism rs567926,

located between GABRG1 and GABRA2 genes, with alcoholism and related behavior,

including smoking, onset of alcohol abuse, aggressive behavior and suicide attempt. We

genotyped 335 alcohol-dependent and 230 control subjects from Croatian population.

Although the results demonstrated no association of marker rs567926 with alcohol and

nicotine addiction or alcoholism-associated behaviour, we found haplotypic association

between markers rs567926 and rs279858, and association of some haplotypes with specific

phenotypes of alcohol-dependent patients. Further research is needed in order to elucidate the

role of GABRA2 gene in alcohol dependence and alcoholism-associated behavior.

(52 pages, 18 figures, 22 tables, 102 references, original in Croatian)

Thesis deposited in Central biological library

Keywords: alcoholism; GABRA2; GABRG1, genetics; polymorphism; rs567926; haplotype

Supervisor: Dubravka Švob Štrac, PhD, Research Associate, IRB

Co-supervisor: Asst. Prof. Domagoj Đikić, PhD, PMF

Reviewers

Thesis accepted:

5

POPIS KRATICA

ABI – Applied Biosystems

ACD – dekstroza citratne kiseline (acid citrate dextrose)

ADH – alkohol-dehidrogenaza

ALDH – aldehid-dehidrogenaza

ANOVA – jednostruka analiza varijance (one-way analysis of variance)

CRH – kortikotropni oslobaĎajući hormon

DA – dopamin

DSM-IV - Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th. Edition

EDTA – etilen-diamin-tetraoctena kiselina

EEG – elektroencefalogram

FRET – energetski transfer tipa Förster (Förster-type energy transfer)

GABA - -amino-maslačna kiselina

GABRA1, GABRA2, GABRA5, GABRA6, GABRB1, GABRB2, GABRB3, GABRG1,

GABRG2 - geni za podjedinice GABAA receptora

5 – HT – serotonin

HPA – hipotalamus-hipofiza-nadbudreţna ţlijezda

HRSD - Hamilton Rating Scale for Depression

HWE – Hardy-Weinbergova ravnoteţa (Hardy-Weinberg equilibrium)

LD – neravnoteţa udruţivanja (linkage disequilibrium)

MGB – ligand manjeg utora DNA (minor groove binder)

mRNA – glasnička ribonukleinska kiselina

NAC – nucleus accumbens

NCBI – National Center for Biotechnology Information

NFQ – nefluorescencijski prigušivač (nonfluorescent quencher)

NMDA – N-metil-D-aspartat

PCR – lančana reakcija polimerazom (polymerase chain reaction)

RCLB – pufer za lizu eritrocita (red cell lysis buffer)

RPM – okretaj u minuti (rotation per minute)

RT-PCR – lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (real time polymerase chain

reaction)

SCID – strukturirani klinički intervju (Structured Clinical Interview)

6

SDS – natrij-dodecil sulfat

SE pufer – natrij-EDTA pufer

SNP – polimorfizam jednog nukleotida (single nucleotide polymorphism)

SŢS – središnji ţivčani sustav

TE pufer – tris-EDTA pufer

VTA – ventralno tegmentalno područje

WHO – Svjetska zdravstvena organizacija (World Health Organisation)

7

SADRŽAJ POPIS KRATICA ...................................................................................................................... 5

1. Uvod ................................................................................................................................... 8

1.1. Ovisnost o alkoholu .................................................................................................... 8

1.2. Djelovanje alkohola na središnji ţivčani sustav ......................................................... 8

1.3. γ-aminomaslačna kiselina (GABA) i GABAA receptori .......................................... 10

1.4. Alkohol i GABAA receptori ..................................................................................... 11

1.5. Stres, neurosteroidi i alkoholizam ............................................................................ 13

1.6. Genetska komponenta alkoholizma ......................................................................... 13

1.7. Povezanost gena podjedinica GABAA receptora s alkoholizmom ........................... 14

2. Cilj istraţivanja ................................................................................................................ 16

3. Materijali i metode ........................................................................................................... 17

3.1. Ispitanici ................................................................................................................... 17

3.2. Izolacija DNA iz krvi ............................................................................................... 19

3.3. OdreĎivanje genotipova ........................................................................................... 20

3.4. OdreĎivanje haplotipova .......................................................................................... 25

3.5. Statistička obrada podataka ...................................................................................... 25

4. Rezultati ........................................................................................................................... 26

4.1. Rezultati odreĎivanja genotipova ............................................................................. 27

4.2. Rezultati odreĎivanja haplotipova ............................................................................ 36

5. Rasprava ........................................................................................................................... 39

6. Zaključak .......................................................................................................................... 43

7. Literatura .......................................................................................................................... 45

8

1. Uvod

1.1. Ovisnost o alkoholu

Iako je umjerena upotreba alkohola sveprisutna, ovisnost o alkoholu predstavlja

ozbiljan medicinski, socijalni i ekonomski problem. Stoga je Svjetska zdravstvena

organizacija (WHO) 1952. godine definirala alkoholizam kao bolest, a ovisnika o alkoholu

kao bolesnika kod koga se zbog prekomjerne i dugotrajne primjene alkoholnih pića pojavljuje

psihička i fizička ovisnost, zdravstveni problemi, te obiteljski i društveni poremećaji.

Alkoholizam se prije svega očituje kroz snaţnu ţelju za pićem, gubitak kontrole nad

konzumacijom alkohola, povećanu toleranciju na alkohol, simptome fizičkog odvikavanja, te

kontinuiranu primjenu alkohola unatoč znanju o negativnom učinku na zdravlje i socijalnim

posljedicama. Dugotrajna konzumacija alkohola uzrokuje cijeli niz ozbiljnih zdravstvenih

problema poput ciroze jetre, fetalnog alkoholnog sindroma, srčanih i bubreţnih bolesti, kao i

cijelog niza psihičkih poremećaja, koji mogu rezultirati preranom smrću. Osim trovanja

alkoholom, veliki problem predstavlja i interakcija alkohola i drugih droga čiji ishodi mogu

biti fatalni (27). U čimbenike rizika za razvoj alkoholizma ubrajaju se spol (muških

alkoholičara je više nego ţena), obiteljska sklonost, odreĎena zanimanja (konobari, pisci,

glumci, radnici u tvornicama alkohola), kao i odreĎeni religijski, etnički i geografski

čimbenici (Muslimani i Ţidovi piju rijetko, dok Francuzi, Finci i ŠveĎani mnogo češće).

UtvrĎeno je takoĎer da su osobe s niţom razinom serotonina sklonije alkoholizmu, te da

ovisnost o alkoholu ovisi i o razini aktivnosti enzima alkohol-dehidrogenaze (ADH) i aldehid-

dehidrogenaze (ALDH) (2).

1.2. Djelovanje alkohola na središnji živčani sustav

Primijenjen akutno, alkohol izaziva anksiolitičke, sedativno-hipnotične, ataksične,

antikonvulzivne i anestetične učinke, te uzrokuje pomanjkanje koordinacije i slabljenje

kognitivnih funkcija, dok produljeno izlaganje alkoholu rezultira u razvoju ovisnosti i

tolerancije na njegove učinke (27). Za razliku od drugih aktivnih supstanci koje djeluju

specifičnije, alkohol ima široko djelovanje na središnji ţivčani sustav (SŢS). Naime, alkohol

za svoj cilj djelovanja ima niz mjesta u staničnoj membrani i prijenosu unutarstaničnih

signala, izazivajući učinke na niz neurotransmitorskih i neurohormonalnih membranskih

ionotropnih receptora, te naponom aktiviranih receptora i ionskih kanalića u mozgu. Tako je

9

poznato da alkohol utječe i na neurotransmitorske sustave serotonina (5-HT), γ-

aminomaslačne kiseline (GABA) i dopamina (35). Pokazano je da alkohol u središnjem

ţivčanom sustavu povećava promet dopamina i noradrenalina, smanjuje neurotransmisiju

acetilkolina, povećava GABAergičnu neurotransmisiju, te povećava produkciju beta-

endorfina u hipotalamusu (2). OdreĎena istraţivanja utvrdila su da alkohol takoĎer povećava

funkciju glicinskih receptora, a inhibira aktivnost NMDA i drugih glutamatnih receptora. Ovi

pronalasci upućuju da kratkotrajna konzumacija alkohola prije svega mijenja ravnoteţu

izmeĎu inhibicijske i ekscitacijske neurotransmisije u mozgu, iako se djelovanjem pojedinih

neurotransmitora i njihovih receptora ne moţe u potpunosti objasniti sindrom kompleksan kao

što je alkoholizam. S druge strane, dokazi upućuju da mozak pokušava uspostaviti ravnoteţu

nakon dugotrajnog unosa alkohola, te da dugotrajna primjena alkohola moţe izazvati suprotne

učinke u mozgu (101).

Dopaminski (DA) mezolimbički put nagrade u mozgu igra vaţnu ulogu kako u razvoju

ovisnosti općenito, tako i u razvoju ovisnosti o alkoholu. Ovaj put “nagrade“ uključuje

moţdane regije kao što su ventralno tegmentalno područje (VTA) srednjeg mozga, nucleus

accumbens (NAC), limbički sustav, orbitofrontalni korteks, amigdalu, hipokampus i medijalni

prefrontalni korteks. Uzimanje sredstava ovisnosti rezultira u povećanju sinaptičnog

dopamina u putu nagrade, što je popraćeno kompleksnim promjenama u mnogim

neurotransmitorima uključujući GABA-u, glutamat, serotonin (5-HT), opioidne peptide i

kanabinoide. Istraţivanja su pokazala da akutna primjena alkohola pobuĎuje DA neurone

izravno, ali i neizravno smanjujući aktivnost GABAnergičnih neurona u VTA, te utječujući na

ekscitaciju posredovanu NMDA receptorima. Kronična izloţenost alkoholu povećava

osnovnu aktivnost GABA neurona i izaziva toleranciju na inhibiciju GABAergičnog sustava

alkoholom (35).

Slika 1. Alkohol aktivira mezolimbički put nagrade u mozgu (slika sa interneta:

http://www.med.unc.edu/alcohol/molpharm.html)

10

1.3. γ-aminomaslačna kiselina (GABA) i GABAA receptori

γ-aminomaslačna kiselina (GABA) glavni je inhibicijski neurotransmitor središnjeg

ţivčanog sustava (SŢS) sisavaca. GABA modulira gotovo sve aspekte funkcije mozga, a

ključna je za odrţavanje ravnoteţe izmeĎu ekscitacije i inhibicije neurona (40). Sinteza

GABA-e odvija se iz glutamata, a sintetizirana GABA-a pohranjuje se u sinaptičnim

mjehurićima ţivčanih završetaka GABAnergičnih neurona. Širenje akcijskog potencijala u

presinaptičnim stanicama uzrokuje depolarizaciju plazmatske membrane i fuziju sinaptičnih

mjehurića sa staničnom membranom ţivčanog završetka, pri čemu se GABA procesom

egzocitoze oslobaĎa u sinaptičnu pukotinu. GABA difundira do ciljnih neurona, gdje se veţe

na postsinaptične GABA receptore smještene na površini membrane i tamo ostvaruje svoje

inhibicijsko djelovanje (45). Vezanjem GABA-e aktiviraju se tri glavne klase receptora,

GABAA, GABAB i GABAC receptori. GABAA i GABAC receptori su ionotropni, dok su

GABAB receptori metabotropni. GABAA receptori su kloridni ionski kanalići koji posreduju

brzu sinaptičnu inhibiciju. Ovi receptori imaju pentamernu strukturu nastalu povezivanjem pet

strukturalno homolognih polipeptidnih podjedinica, unutar koje sadrţe poru propusnu za

kloridne ione (81, 100). Svaka od 5 podjedinica od kojih su graĎeni GABAA receptori ima

nekoliko izoformi (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π, ρ1-3). Glavne kombinacije podjedinica su α1β2γ2

(60%), α2β3γ2 (15%), α3β3γ2 (10%). Ekspresija izoformi podjedinica receptora razlikuje se u

različitim područjima mozga, kao i tijekom razvoja. O sastavu podjedinica receptora ovise

farmokološka i elektrofiziološka svojstva receptora (35). Osim veznog mjesta za GABA-u, na

GABAA receptoru nalaze se i vezna mjesta za benzodiazepine, barbiturate, konvulzive,

neuroaktivne steroide, anestetike, alkohol i mnoge druge spojeve (59).

Slika 2. GABAA receptor sa veznim mjestima za brojne ligande (slika sa interneta:

http://www.sonicplastic.com/wp-content/uploads/2011/05/gaba_receptor.gif)

11

1.4. Alkohol i GABAA receptori

Istraţivanja pokazuju da kratkotrajno izlaganje alkoholu dovodi do povećanja

inhibicijskog učinka GABA-e putem GABAA receptora, koje za posljedicu ima inhibiciju

aktivnosti mnogih moţdanih regija, što se očituje i u ponašanju. Naime, utvrĎeno je da

alkohol primijenjen akutno povećava provodljivost iona klora potaknutu GABA-om, kao i

GABAergičnu inhibiciju. Alkohol povećava frekvenciju otvaranja kloridnih kanalića, kao i

trajanje otvorene konformacije, pa je u prisutnosti GABA-e i alkohola povećan protok iona

klora kroz otvoreni kanalić (60). Alkohol se spominje i kao pozitivni modulator vezanja

velikog broja liganda na GABAA receptoru (58). TakoĎer, i učinci alkohola mogu se

potencirati pozitivnim modulatorima GABAA receptora (benzodiazepinima i barbituratima) i

smanjiti obrnutim agonistima i antagonistima (17, 98). Osim toga, djelovanje alkohola na

GABAA receptore ovisi i o brojnim endogenim modulatorima, ponajviše neuroaktivnim

steroidima (97). S druge strane, odreĎena istraţivanja pokazuju da alkohol ne povećava

funkciju GABAA receptora u pojedinim regijama mozga, te pod odreĎenim eksperimentalnim

okolnostima. Najnovija istraţivanja upućuju, da alkohol djeluje putem izvansinaptičnih

GABAA receptora koji sadrţe δ podjedincu i koji moduliraju toničku inhibiciju (52). Tako je

podjedinica δ, oko tri puta osjetljivija na alkohol od γ2 podjedinice, dok je β3 podjedinica

osjetljivija i do 10 puta od β2 podjedinice na povećanje učinka GABA-e izazvano alkoholom.

α4β3δ i α6β3δ izoforme GABAA receptora, smještene ekstrasinaptično, najosjetljivije su na

alkohol, a eksprimirane su u malom mozgu, hipokampusu, talamusu, dakle onim moţdanim

regijama, koje se povezuju s učinkom alkohola na ponašanje (102). I receptori koji sadrţe α5

podjedinicu, a smješteni su u hipokampusu, takoĎer vjerojatno sudjeluju u regulaciji

djelovanja alkohola (24).

Veliki broj kliničkih i eksperimentalnih istraţivanja pokazuje da produljena primjena

alkohola (77, 80) u ţivotinja i ljudi, rezultira u razvoju funkcionalne tolerancije i fiziološke

ovisnosti. Osim toga, dugotrajno izlaganje alkoholu dovodi i do razvoja unakrsne tolerancije

na pojedine učinke benzodiazepina, barbiturata i neurosteroida (22). Posebno su brojna

istraţivanja koja pokazuju da kronična primjena alkohola smanjuje funkciju GABAA

receptora, kao i sposobnost alkohola, barbiturata, benzodiazepina i neurosteroida da

potenciraju djelovanje GABA-e, ali i da uzrokuje pojačanu osjetljivost receptora na obrnute

benzodiazepinske agoniste, kao i na antikonvulzivne i anksiolitične učinke neurosteroida (9,

20, 22, 27, 43, 47, 55, 80, 96). Usprkos tome, istraţivanja stupnja alosteričke povezanosti

veznih mjesta za GABA-u i benzodiazepine, pokazala su da dugotrajna primjena alkohola

12

moţe proizvesti, osim slabljenja (30) i pojačavanje funkcionalnih interakcija (82), ili pak da

nema nikakav učinak (20, 90). Osim toga, nakon kroničnog izlaganja alkoholu opisano je

smanjenje toka iona klora izazvanog GABA-om u nekim (75, 80), ali ne u drugim

istraţivanjima (20). No, funkcionalne promjene GABAA receptora nakon dugotrajne primjene

alkohola, ipak su najviše povezane s promjenama u ekspresiji mRNA i proteina podjedinica

GABAA receptora, kao i s postranslacijskim modifikacijama receptora (22, 43, 47). Naime,

produljeno izlaganje alkoholu, kao i njegovo ustezanje izaziva dugotrajne promjene u

ekspresiji podjedinica GABAA receptora na staničnoj površini, koje mogu biti posljedica,

promijenjenog prometa receptora, stanične ili sinaptične lokalizacije receptora, promijenjenih

odgovora steroida na alkohol, a moguće i promijenjenog sastava GABAA receptora (60, 61).

Iako su rezultati vrlo raznoliki, većina istraţivanja utvrdila je da je pad ekspresije α1

podjedinice primjećen nakon dugotrajne primjene alkohola popraćen porastom ekspresije

drugih podjedinica poput α4, α6 β2/3, γ1 i γ2 podjedinica, i to i na razini mRNA i proteina (28,

38, 44, 75, 76, 96). Brojna istraţivanja takoĎer upućuju da su promjene u ekspresiji

podjedinica GABAA receptora nakon dugotrajne primjene alkohola regionalno i spolno

specifične (29, 71,76, 78, 79).

Slika 3: Potencijalni mehanizmi prilagodbe GABAA receptora nakon dugotrajne primjene alkohola (prema

Grobin i sur. 1998, ref. 43)

13

1.5. Stres, neurosteroidi i alkoholizam

Smatra se da stres u velikoj mjeri utječe na konzumaciju alkohola i sklonost razvoju

alkoholizma, jer prekomjerno uzimanje alkohola vrlo često predstavlja jedan od načina

nošenja sa stresom. Tako se brojni emocionalni i psihološki stresovi, te seksualno

zlostavljanje povezuju sa povećanim rizikom pojave alkoholizma. S druge strane,

promijenjena homeostaza tijekom ovisnosti o alkoholu moţe rezultirati stresom tijekom

ustezanja. GABAergična neurotransmisija vaţna je u stresu povezanim s ovisnošću, jer

GABA modulira i emocije i odgovor na stres. Naime, GABA inhibira odgovor osi

hipotalamus-hipofiza-nadbubreţna ţlijezda (HPA) na stres. Receptori za kortikotropin

oslobaĎajući hormon (CRH), primarni medijator neuroendokrinog odgovora na stres,

posreduju stimulaciju GABAergične neurotransmisije alkoholom. UtvrĎeno je da stres moţe

rezultirati promjenama u ekspresiji podjedinica GABAA receptora u hipokampusu i amigdali,

područjima mozga uključenim u razvoj ovisnosti. GABAA receptori su in vivo izloţeni

djelovanju endogenih neurosteroida, poput progesterona i njegovih metabolita

alopregnanolona i alotetrahidroksikortikosterona. Ovi neurosteroidi veţu se za GABAA

receptore i stimuliraju GABAergičnu transmisiju. Pokazano je da i alkohol i stres stimuliraju

sintezu neurosteroida iz kolesterola u mozgu. Neuroaktivni steroidi doprinose osjetljivosti na

alkohol i na taj način mogu utjecati na razvoj ovisnosti o alkoholu (43). Istraţivanja upućuju

da neurosteroidi, sintetizirani kao odgovor na konzumaciju alkohola, djelujući primarno

putem GABAA receptora, umanjuju neke od negativnih učinaka alkohola, posebice tijekom

ustezanja. Učinci neurosteroida, razvoj i ekspresija alkoholizma, kao i manifestacija simptoma

ustezanja razlikuju se izmeĎu spolova, što se meĎu ostalim povezuje i sa spolnim razlikama u

sintezi i prijenosu GABA-e, utvrĎenim nakon dugotrajnog izlaganja alkoholu (5).

1.6. Genetska komponenta alkoholizma

Na razvoj ovisnosti o alkoholu utječu brojni genetski i okolišni čimbenici koji djeluju

pojedinačno i u meĎusobnoj interakciji (16). Pojedina istraţivanja su pokazala da se ovisnost

općenito nasljeĎuje u 40 do 70% slučajeva, dok u slučaju ovisnosti o alkoholu ovaj postotak

iznosi oko 50%. Prema tome, smatra se da genetski i okolišni čimbenici imaju podjednaku

ulogu u razvoju alkoholizma, iako mogu postojati odreĎene razlike izmeĎu populacija (35).

Nadalje, procjenjuje se da nasljedni utjecaj objašnjava oko 50-80% individualnih razlika u

podloţnosti razvoju alkoholizma. Tako, razni genetski čimbenici utječu na razlike u reakciji

na alkohol, različitu osjetljivost mozga i drugih tjelesnih sustava na alkohol, brzinu

14

eliminacije alkohola iz organizma, kao i na razvoj tolerancije i fizičke ovisnosti o alkoholu.

Nepostojanje klasičnog obrasca nasljeĎivanja alkoholizma upućuje na uključenost brojnih

gena i njihovu interakciju s okolišem (72). S obzirom da alkohol djeluje putem različitih

ciljeva u mozgu, sklonost razvoju alkoholizma vjerojatno je rezultat djelovanja brojnih gena

različitih neurotransmitorskih sustava i signalnih staničnih puteva (35). Do sada, osim gena

uključenih u metabolizam alkohola, geni kandidati za razvoj ovisnosti o alkoholu uključuju

gene dopaminskog, GABA, glutamatnog, opioidnog, kolinskog i serotoninskog

neurotransmitorskog sustava (49, 53, 54, 57, 84). Genotipiziranje gustog seta SNP-ova kroz

genom pomaţe u otkrivanju gena uključenih u biološke puteve vezane uz razvoj ovisnosti o

alkoholu.

1.7. Povezanost gena podjedinica GABAA receptora s alkoholizmom

Sve podjedinice GABAA receptora produkti su homolognih, ali zasebnih gena.

MeĎutim, geni podjedinica ovih receptora organizirani su u skupine (klastere), smještene na

različitim kromosomima, što vjerojatno omogućava njihovu usklaĎenu razvojnu i/ili tkivno-

specifičnu ekspresiju (95). Tako se geni koji kodiraju za podjedinice GABAA receptora nalaze

u klasterima smještenim na kromosomskim regijama 4p13-q11 (2, 4, 1, 1), 5q34-q35 (1,

6, 2, 2) i 15q11-q13 (5, 3, 3), kao i Xq28 (3, 4, 1) (5, 7, 8). Ekspresija pojedinih

podjedinica GABAA receptora, odreĎena je i prostorno i vremenski, te uvjetovana

biofizikalnim pravilima koja odreĎuju kvartarnu strukturu funkcionalnih receptora. MeĎutim,

usprkos različitoj raspodjeli i zastupljenosti podjedinica u pojedinim moţdanim regijama,

smatra se da većina receptora nastaje kombinacijom α, β i γ podjedinice u omjeru 2:2:1 (13,

94), te da je α1β2γ2 najzastupljeniji podtip GABAA receptora u mozgu (73). Ove podjedinice

kodirane su genima smještenim u klasteru na kromosomu 5.

Novija istraţivanja uputila su na povezanost razvoja alkoholizma i gena koji kodiraju

podjedinice GABAA receptora (1, 6, 7, 8). Iako u početku nije pronaĎena veza izmeĎu gena

kromosoma 5 i alkoholizma, kasnije studije utvrdile su povezanost gena GABRA1, GABRA6

i GABRG2 s ovisnošću o alkoholu. Istraţivanja su takoĎer pokazala i povezanost ovisnosti o

alkoholu i gena GABRG3, GABRA5 i GABRB3 s kromosoma 15. MeĎutim, geni za

podjedinice GABAA receptora koji se nalaze na kromosomu 5 (1,6,2,2) i 15 (5,3,3)

izgleda nisu tako jaki kandidati za razvoj alkoholizma kao što je to klaster gena smješten na

kromosomu 4 (70, 92). Geni koji se nalaze u klasteru na kromosomu 4p12 (2,4,1,1),

visoko su eksprimirani u hipokampusu i većini dopaminskih neurona supstancije nigre i

15

ventralnog tegmentalnog područja, odnosno u područjima mozga za koja se zna da su

uključena u razvoj ovisnosti. Rezultati istraţivanja najviše upućuju na povezanost

alkoholizma i gena GABRA2 koji kodira 2 podjedinicu GABAA receptora i to posebice na

polimorfizme u blizini susjednog gena GABRG1 koji se takoĎer povezuje s rizikom razvoja

ovisnosti o alkoholu (1,6,7). Naime, nedavna istraţivanja pokazala su značajnu povezanost

alkoholizma s haplotipskim blokom biljega koji se proteţe od intergenske regije izmeĎu gena

GABRA2 i GABRG1 sve do introna 3 gena GABRG1. Stoga je moguće da je primijećena

povezanost gena GABRA2 s alkoholizmom posljedica neravnoteţe vezanosti (LD) biljega

gena GABRA2 i gena GABRG1. MeĎutim, do sada nikakav funkcionalni polimorfizam nije

pronaĎen u ovim genima. Gen GABRG1 kodira 1 podjedinicu GABAA receptora, koja je

takoĎer primarno eksprimirana u područjima mozga uključenim u razvoj ovisnosti, kao što su

amigdala, striatum i substancija nigra (86).

Slika 4. Geni za podjednice GABAA receptora uključeni u razvoj ovisnosti o alkoholu (modificirana slika

sa interneta: http://www.biomedcentral.com/1471-2164/8/203/figure/F1?highres=y)

16

2. Cilj istraživanja

Cilj istraţivanja je utvrĎivanje moguće povezanosti polimorfizma rs567926 (hCV

7537087), smještenog u intergenskoj regiji izmeĎu gena GABRA2 i GABRG1, s rizikom

razvoja ovisnosti o alkoholu i povezanog ponašanja na uzorku ispitanika iz hrvatske

populacije. U tu svrhu odreĎena je raspodjela genotipova i alela spomenutog biljega gena za

podjedinicu GABAA receptora u osoba ovisnih o alkoholu, koja je usporeĎena s

raspodjelom u odgovarajućih kontrolnih ispitanika. U istraţivanju su takoĎer istraţene

moguće razlike u frekvenciji genotipova i alela navedenog biljega gena GABRA2 izmeĎu

skupina ispitanika različitog spola, pušačkog statusa i početka zlouporabe alkohola, te u

ispitanika ovisnih o alkoholu podijeljenih s obzirom na prisutnost agresivnog i suicidalnog

ponašanja. TakoĎer je istraţena i haplotipska povezanost polimorfizama rs567926 i rs279858

s alkoholizmom i povezanim ponašanjima. Dobiveni rezultati trebali bi pridonijeti boljem

razumijevanju genetskih čimbenika uključenih u razvoj ovisnosti o alkoholu.

17

3. Materijali i metode

3.1. Ispitanici

Istraţivanje je obuhvatilo 355 osoba (280 muškaraca i 75 ţena) ovisnih o alkoholu i

230 zdravih osoba (203 muškarca i 27 ţena), hrvatskog podrijetla (Tablica 1).

Tablica 1. Informacije o ispitanicima

Muškarci Žene Ukupno Dob

Kontrola 203 (88.26%) 27 (11.74%) 230 (100%) 40.47 ± 0.81

Alkoholičari 280 (78.87%) 75 (21.13%) 355 (100%) 49.82 ± 0.54

Sudionici istraţivanja bili su bijelci koji su potjecali iz iste geografske regije

Republike Hrvatske, odnosno iz Zagrebačke ţupanije. Svi ispitanici pristali su dati uzorak

krvi i sudjelovati u istraţivanju, što su i potvrdili svojim pismenim informativnim pristankom.

Demografske i kliničke osobine osoba uključenih u kontrolnu skupinu i u skupinu ovisnika o

alkoholu navedene su u Tablicama 2 i 3.

Osobe ovisne o alkoholu primljene su na liječenje u Psihijatrijsku bolnicu Vrapče zbog

sindroma ustezanja koji je povezan s alkoholizmom, a koji se javlja nakon prekida

konzumiranja alkohola. Simptomi ustezanja bili su ne-psihotičnog tipa, čiji je intenzitet

dosegao najveću razinu oko tjedan dana prije prijema u bolnicu. Mnogo ispitanika prilikom

prijema u bolnicu bilo je akutno intoksificirano alkoholom. Stoga su se intervju i uzimanje

uzoraka krvi primjenjivali najmanje 12 sati nakon prijema na bolnički odjel, tj. kada su

ispitanici bili trijezni, te prije nego što primili terapiju psihoaktivnim lijekovima. S

ispitanicima je napravljen Strukturirani klinički intervju (Structured Clinical Interview;

SCID), a dijagnoza ovisnosti o alkoholu postavljena je prema DSM-IV (eng. Diagnostic and

Statistical Manual of Mental Disorders, 4th. Edition) dijagnostičkim kriterijima Američke

Psihijatrijske Udruge (eng. American Psychiatric Association, 1994) (10).

Ispitanici ovisni o alkoholu razvrstani su u ne-suicidalne (koji nikada nisu pokušali

izvršiti samoubojstvo) i suicidalne (koji su pokušali samoubojstvo). Pokušaj suicida utvrĎivan

je primjenom dvaju mjerila: primjenom pitanja 4 stavke 3 Hamiltonove ocjenske ljestvice za

depresiju (eng. Hamilton Rating Scale for Depression, HRSD 17-item scale) (46) i primjenom

strukturiranog psihijatrijskog intervjua, s pitanjem koje se odnosi na pokušaj samoubojstva

tijekom ţivota.

Uz primjenu Strukturiranog kliničkog intervjua (SCID) i psihijatrijskog intervjua,

simptomi agresije tijekom ţivota procjenjivani su primjenom Brown-Goodwinove skale (eng.

Brown–Goodwin Scale) (19). Primjenjivani upitnik prilagoĎen iz Brown-Goodwinove skale i

18

preveden na hrvatski jezik sastojao se od sedam bihevioralnih kategorija (19): problemi s

disciplinom u vojsci; problemi s disciplinom na poslu; napadi na druge osobe; uništavanje

imovine (vlasništva, nekretnine); uhićenje radi napadačkog ponašanja; uhićenje radi drugih

zločina; zločini koji nisu rezultirali uhićenjem. Ove kategorije procijenjene su skalom od 0 do

4 (0, bez problema; 1, jedan problematični dogaĎaj; 2, dva ili malo problematičnih dogaĎaja;

3, tri ili nekoliko odnosno česti problematični dogaĎaji; 4, četiri ili više odnosno brojni

problematični dogaĎaji). Ukupni maksimalni zbroj bodova bio je 28, i prema Buydens-

Branchey et al. (1989) (21), granični zbroj od 8 bodova označen je kao agresivno ponašanje.

Osobe ovisne o alkoholu takoĎer su grupirane prema dobi u kojoj su započele piti

alkohol, na osobe s ranim početkom konzumacije alkohola odnosno prije 25 godine starosti

ispitanika i na osobe s kasnijim početkom alkoholizma koji se javlja nakon 25 godine ţivota.

Osobe ovisne o alkoholu s kombinacijom ranog početka konzumacije alkohola i s prisutnim

agresivnim ponašanjem imaju osobine alkoholizma podtipa 2, dok ispitanici s kasnijim

početkom zlouporabe alkohola i bez agresije odgovaraju osobama s alkoholizmom podtipa 1,

prema Cloningeru (41).

Tablica 2. Informacije o ispitanicima ovisnim o alkoholu

Muškarci Žene Ukupno

Ovisnost o pušenju 162 42 204

Bez ovisnosti o pušenju 118 33 151

Rani početak konzumiranja alkohola

(< 25 godine života)

105 16 121

Kasniji početak konzumiranja alkohola

(> 25 godine života)

175 59 234

Prisutnost agresivnog ponašanja 82 6 88

Odsutnost agresivnog ponašanja 198 69 267

Alkoholizam tipa I 238 72 310

Alkoholizam tipa II 42 3 45

Pokušaj samoubojstva tijekom života 38 17 55

Bez pokušaja samoubojstva tijekom života 242 58 300

Ispitanici kontrolne skupine sakupljani u periodu izmeĎu 2005. i 2009. godine u

Kliničkom Bolničkom Centru Zagreb. Sve osobe kontrolne skupine ispunile su upitnik kojime

odgovaraju na pitanja o svojoj povijesti bolesti, te navikama pušenja i konzumacije alkohola.

Kriteriji za uključivanje u istraţivanje bili su: da osobe trenutno ne primaju nikakvu

medicinsku terapiju, da su bez trenutnih i prijašnjih psihijatrijskih poremećaja, da nisu

zloupotrebljavale alkohol ili sredstva ovisnosti, da nisu pokušale samoubojstvo, da u njihovim

obiteljima nije bilo psihijatrijskih poremećaja (što je utvrĎeno odgovorima sudionika o

mentalnom zdravlju njihovih roditelja, baka i djedova, braće i sestara, te djece,) da nisu u

19

srodstvu s drugim ispitanicima, te da pripadaju nativnoj etničkoj grupi, odnosno da

predstavljaju najmanje treću generaciju koja ţivi o ovoj regiji. Osobe kontrolne skupine, kao i

osobe ovisne o alkoholu, takoĎer su grupirane i prema pušačkom statusu u pušače i nepušače.

Tablica 3. Informacije o kontrolnim ispitanicima

Muškarci Žene Ukupno

Ovisnost o pušenju 65 10 75

Bez ovisnosti o pušenju 138 17 155

Istraţivanje je provedeno u skladu s Helsinškom deklaracijom, te je odobreno od

strane Etičkog povjerenstva Psihijatrijske bolnice Vrapče i Etičkog povjerenstva Kliničkog

Bolničkog Centra Zagreb.

3.2. Izolacija DNA iz krvi

Uzorci krvi (8 ml) osobama kontrolne skupine kao i osobama ovisnim o alkoholu

izvaĎeni su u plastične šprice s 2 ml ACD (engl. acid citrate dextrose) antikoagulansa. Uzorci

krvi su se pohranjivali u plastičnim epruvetama u zamrzivaču na - 20°C. Izolacija genomske

DNA iz leukocita periferne krvi napravljena je primjenom metode isoljavanja. U tu svrhu bile

su potrebne slijedeće kemikalije:

Pufer za lizu eritrocita (eng.Red cell lysis buffer, RCLB) 5 M NaCl

10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, pH=7.6

Natrij-EDTA pufer (eng. Sodium EDTA, SE-buffer) Proteinaza K (20 mg/kg)

75 mM NaCl, 25 mM Na2EDTA, pH=8.0

Natrij dodecil sulfat (SDS), 10 %, pH=7.2 Etanol, 96 % i 70%

Tris-EDTA pufer (eng. TE buffer) Izopropanol

10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH=8.0

Epruvete sa smrznutim uzorcima krvi izvana se dobro obrišu etanolom. Nakon

odmrzavanja uzorci krvi miješaju se na valjkastoj miješalici oko 20 minuta. 300 l krvi odvoji

se u sterilnu Eppendorf mikroepruvetu od 1.5 ml, doda se 900 l hladnog pufera za lizu

eritrocita (eng. red cell lysis buffer, RCLB), dobro promiješa na vorteks miješalici i ostavi 10

minuta stajati na ledu. Nakon toga slijedi postupak centrifugiranja (2 minute, 13 400 x g, 4°

C) pri čemu lizirani eritrociti ostanu u supernatantu, dok se netaknuti leukociti istaloţe.

Mikropipetom se supernatant odvoji i baci. Talog se pročišćava tako da se navedeni postupak

resuspendiranja u puferu za lizu eritrocita i centrifugiranja ponovi još 3 puta. Na dovoljno

20

pročišćeni talog doda se 300 l natrij-EDTA pufera (eng. sodium EDTA, SE-buffer), 30 l 10

% SDS-a, lagano promiješa te doda 1.5 l proteinaze K. Nakon laganog miješanja, slijedi

inkubacija uzoraka 1.5 do 2 h na 56° C uz miješanje (700 rpm) (u termomikseru), pri čemu se

liziraju leukociti i membrana jezgre. Nakon inkubacije i hlaĎenja uzoraka na sobnu

temperaturu, doda se 160 l 5 mM NaCl i sve se promiješa na vorteks miješalici 10 s. Slijedi

centrifugiranje (5 minuta, 13 400 x g, 20 °C), nakon kojeg se DNA nalazi u supernatantu, a

ostali dijelovi stanične strukture u talogu. Supernatant se prelije u novu sterilnu

mikroepruvetu od 1.5 ml i doda se 800 l hladnog izopropanola. Pri laganom miješanju dolazi

do zgušnjavanja DNA, te ona postaje vidljiva u obliku netopivog spleta. Slijedi

centrifugiranje (2 minute, 12 000 x g, 20 °C), nakon čega se odlije supernatant, a na talog se

doda 250 l 75% etanola. Nakon još jednog centrifugiranja (2 minute, 12 000 x g, 20 °C)

supernatant se odlije, a talog se suši na zraku 15-30 minuta. Na talog se zatim dodaje 100 l

Tris-EDTA pufera (eng. TE buffer), te se ostavi oko sat vremena na 37° C uz trešnju (u

termomikseru) kako bi se DNA dobro otopila. Nakon toga uzorci DNA se pohranjuju u

hladnjak na 4° C.

3.3. Određivanje genotipova

Prisutnost baze A ili G na mjestu polimorfizma rs567926 smještenog u intergenskoj

regiji izmeĎu gena GABRA2 i GABRG1 na kromosomu 4p12, a koji kodiraju za 2, odnosno

1 podjedinicu GABAA receptora (Tablica 4) utvrĎivana je pomoću ureĎaja «ABI Prism 7000

Sequencing Detection System apparatus» (ABI, Foster City, SAD) prema protokolu koji

predlaţe Applied Biosystems.

Tablica 4. Informacije o markeru

Broj SNP-a

(NCBI baza

podataka)

Broj SNP-a

(Celera baza

podataka)

Položaj SNP-a

(GenBank baza

podataka)

Smještaj SNP-a

na kromosomu 4p

Promjena

nukleotida

u SNP-u

rs567926 hCV7537087 46,082,697 izmeĎu GABRA2 i GABRG1 gena A/G

U tu svrhu primjenjivana je tzv. alelna diskriminacija polimorfizama u slučaju jedne

promijenjene baze (tzv. SNP; eng. single nucleotide polymorphism) uz pomoć tzv. 5'

nukleazne reakcije (eng. 5' nuclease assay). Primjenom flourogenih proba ova metoda (Slika

1) kombinira umnaţanje specifičnih odsječaka DNA lančanom reakcijom polimeraze (PCR,

eng. polymerase chain reaction) i detekciju u jednom jedinom koraku.

21

Slika 5. Prikaz principa alelne diskriminacije SNP-ova 5' nukleaznom reakcijom (99)

U ovoj metodi, kao što su to prvi opisali Holland i suradnici (1991) (50),

hibridizacijska proba uključena u lančanu reakciju polimeraze cijepa se 5’ nukleaznom

aktivnošću Taq DNA polimeraze samo u slučaju kada se umnaţa ciljana sekvenca probe.

Korištenjem flourogene probe, koju su prvi sintetizirali Lee i suradnici (1993) (66), cijepanje

probe moţe se utvrditi bez naknadne obrade rezultata PCR-a. Fourogena proba sastoji se od

oligonukleotida označenih s fluorescencijskom obiljeţavajućom bojom (eng. reporter) i

prigušujućom bojom (eng. quencher), koji se nalaze na suprotnim stranama probe. U intaktnoj

probi, blizina prigušujuće boje smanjuje fluorescencijski signal koji daje obiljeţavajuća boja,

kao rezultat energetskog transfera Förster-tipa (eng. Förster-type enery transfer, FRET) (39,

63). Cijepanje flourogene probe tijekom lančane reakcije polimerazom oslobaĎa

obiljeţavajuću boju i uzrokuje povećanje u intenzitetu njezine fluorescencije. «ABI Prism

7000 Sequencing Detection System» mjeri pojačanje u fluorescenciji tijekom ciklusa lančane

reakcije polimerazom, detektirajući akumulaciju PCR produkata u realnom vremenu (eng.

real-time PCR) izravno u PCR reakcijskim jaţicama. Za sustav u kojem postoje 2 alela, probe

22

specifične za svaki alel obiljeţene su različitim fluorescentnim obiljeţavajućim bojama.

Nepodudaranje izmeĎu probe i ciljne sekvence značajno smanjuje efikasnost hibridizacije i

cijepanja probe. Prema tome, značajno povećanje u FAM ili VIC fluorescentnim signalima

upućuje na homozigotnost za FAM- ili VIC-specifične alele, dok povećanje u oba signala

upućuje na heterozigotnost.

Za odreĎivanje genotipa u slučaju jedne promijenjene baze (SNP) u ovom istraţivanju

korišteni su predizajnirani Taqman uzorci (eng. Taqman SNP Genotyping assay,) (99). Svaki

takav uzorak sadrţi kombinaciju dvaju početnica za umnaţanje ciljane polimorfne sekvence i

dvaju Taqman MGB proba za razlikovanje izmeĎu dvaju alela. Svaka od Taqman MGB proba

sastoji se od obiljeţavajuće VIC boje na 5' kraju probe za alel 1 i obiljeţavajuće FAM boje na

5' kraju probe za alel 2. MGB (eng. minor groove binder) na 3' kraju svake probe je

modifikacija koja povećava temperaturu mekšanja (Tm) za danu duţinu proba (3, 62) koja

dozvoljava dizajn kraćih proba. Kraće probe rezultiraju u većim razlikama u vrijednostima

temperatura mekšanja izmeĎu odgovarajućih i neodgovarajućih proba, proizvodeći jasnu

alelnu diskriminaciju. Čak i nepodudarnost u samo 1 nukleotidu izmeĎu probe i ciljane

sekvence smanjuje efikasnost hibridizacije probe, što zauzvrat smanjuje količinu

obiljeţavajuće boje koja se odcjepljuje od stišavajuće probe. TakoĎer, AmpliTaq Gold DNA

polimeraza vjerojatnije zamjenjuje neodgovarajuću probu bez cijepanja. Svaki od tih

čimbenika smanjuje proizvodnju nespecifičnih fluorescencijskih signala. Na 3' kraju svake

probe nalazi se i neflourescencijski prigušivač (eng. nonflourescent quencher, NFQ).

Sam postupak genotipizacije prikazan je na slici 2, a započinje odmrzavanjem uzoraka

genomske DNA i pripremom odgovarajućih razrjeĎenja u destiliranoj vodi, kako bi u

konačnici u PCR reakciji bilo izmeĎu 1-20 ng DNA. Nakon toga, u jaţice reakcijske pločice

(eng. 96-well reaction plate) odpipetira se po 4.5 l tako pripremljenih uzoraka DNA. Zatim

se u jaţice odpipetira po 5.5 l reakcijske mješavine u kojoj se nalazi po 5 l TaqMan glavne

univerzalne mješavine i 0.5 l 40 x Taqman mješavine za genotipizaciju ciljanog SNP-a

(Tablica 5).

Nakon zatvaranja reakcijske pločice i centrifugiranja 1-2 minute na oko 5000 rpm,

odreĎivanje genotipova provodi se primjenom ureĎaja «ABI Prism 7000 Sequencing

Detection System apparatus».

Uvjeti lančane reakcije polimerazom navedeni su u Tablici 6.

23

Tablica 5. Kemikalije potrebne za genotipizaciju SNP-ova

Sastojci reakcije Volumen u jažici Konačna koncentracija

TaqMan glavna univerzalna mješavina 5 l 1 x

40 x Taqman mješavina za genotipizaciju

ciljanog SNP-a

0.5 l 1 x

Genomska DNA razrijeđena u dH2O1 4.5 l /

Ukupni reakcijski volumen 10 l

1 1-20 ng genomske DNA

Slika 6. Prikaz postupka genotipizacije SNP-ova (99)

Tablica 6. Uvjeti PCR reakcije

Vrijeme i temperatura pojedine faze reakcije

Početni korak Denaturacija Vezanje/Produžavanje

40 ciklusa

10 min 95°C 15 sec 92°C 1 min 60°C

24

Tijekom lančane reakcije polimerazom odvijaju se slijedeći koraci:

1. Svaka Taqman MGB proba veţe se specifično za svoju komplementarnu sekvencu izmeĎu

mjesta za «forward» i «reverse» početnice.

2. Kada je oligonukleotidna proba intaktna, blizina obiljeţavajuće (eng. reporter) boje

prigušivačkoj boji rezultira u prigušivanju fluorescencije obiljeţavajuće boje primarno

putem energetskog transfera Förster-tipa (FRET) (39, 63).

3. AmpliTaq Gold DNA polimeraza produţava početnice vezane uz kalup DNA.

4. AmpliTaq Gold DNA polimeraza cijepa samo one probe koje su hibridizarale s metom.

5. Cijepanjem se odvaja obiljeţavajuća od prigušujuće boje što rezultira u pojačanoj

fluorescenciji obiljeţavajuće boje.

6. Pojačanje fluorescencijskog signala dogaĎa se kada su pocijepane probe koje su

hibridizirale s komplementarnom sekvencom. Fluorescencijski signal nastao umnaţanjem

lančanom reakcijom polimeraze ukazuje na alele prisutne u uzorku (Tablica 7 i Slike 3 i 4).

Slika 7. Primjer prikaza amplifikacijskih krivulja (izvorna slika)

Tablica 7. Korelacija izmeĎu fluorescencijskih signala i sekvenca u uzorku

Značajan porast u ... Upućuje na...

Fluorescenciji samo VIC-boje Homozigotnost za alel 1

Fluorescenciji samo FAM-boje Homozigotnost za alel 2

Fluorescenciji i VIC- i FAM-boje Alel 1- alel 2 heterozigotnost

25

Slika 8. Primjer prikaza rezultata genotipizacije SNP-ova (izvorna slika)

3.4. Određivanje haplotipova

Program «Haploview version 4.2» (12) korišten je za izradu LD (eng. linkage

disequilibrium) matrice i utvrĎivanje haplotipskog bloka polimorfizma rs567926 s

polimorfizmom rs279858 s minimalnom D' vrijednošću podešenom na 0.80. Ovaj program

upotrebljavan je takoĎer i za usporedbu procijenjenih frekvencija haplotipova u osoba ovisnih

o alkoholu i zdravih osoba, kao i utvrĎivanje razlika u frekvencijama procijenjenih

haplotipova izmeĎu pojedinih podskupina osoba ovisnih o alkoholu.

3.5. Statistička obrada podataka

Za statističku obradu podataka korišten je računalni program «GraphPad Prism

version 4.00 for Windows» (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Skupine uključene u

istraţivanje usporeĎivane su prema dobi primjenom jednostruke analize varijance (eng. One-

way analysis of variance, ANOVA) i Newman-Keuls testa. Značajnost odstupanja raspodjele

genotipova i alela od očekivane (Hardy-Weinbergova ravnoteţa) odreĎena je pomoću χ2-

testa. Razlike u raspodjeli genotipova i alela u osoba ovisnih o alkoholu i zdravih osoba, kao i

izmeĎu podskupina ovisnika o alkoholu, odreĎivane su pomoću χ2 test-a ili Fisher-ovog testa

(eng. Fischer exact test). Statistički značajnim smatrane su one razlike kod kojih je

vjerojatnost p bila manja od 0.05.

26

4. Rezultati

U istraţivanju je analizirano ukupno 355 uzoraka ispitanika ovisnih o alkoholu, od

kojih 280 muškaraca i 75 ţena, te 230 uzoraka kontrolnih ispitanika, od kojih 203 muškarca i

27 ţena. Obje skupine ispitanika podijeljene su s obzirom na ovisnost o nikotinu, na pušače i

nepušače, dok je grupa alkoholičara podijeljena još i s obzirom na dob početka konzumacije

alkohola, prisutnost agresivnog ponašanja i pokušaj samoubojstva. Skupina osoba ovisnih o

alkoholu s kombinacijom ranog početka zlouporabe alkohola i agresivnog ponašanja

odgovarala je skupini alkoholičara tipa II prema Cloningeru, dok je skupina pacijenata s

alkoholizmom s kasnijim početkom alkoholizma i bez agresije odgovarala skupini s

alkoholizmom tipa I prema Cloningeru. Informacije o ispitanicima prikazane su u tablici 8.

Tablica 8. informacije o kontrolnim ispitanicima i ispitanicima ovisnim o alkoholu

Muškarci Žene Ukupno

Kontrolni ispitanici 203 (88.26%) 27 (11.74%) 230 (100%)

Dob 40.19 ± 0.86 42.59 ± 2.56 40.47 ± 0.81

Ovisnost o pušenju 65 10 75

Bez ovisnosti o pušenju 138 17 155

Ispitanici ovisni o alkoholu 280 (78.87%) 75 (21.13%) 355 (100%)

Dob 49.49 ± 0.58** 51.03 ± 1.35* 49.82 ± 0.54 ***

Ovisnost o pušenju 162 42 204

Bez ovisnosti o pušenju 118 33 151

Rani početak konzumiranja alkohola

(< 25 godine života)

105 16 121

Kasniji početak konzumiranja alkohola

(> 25 godine života)

175 59 234

Prisutnost agresivnog ponašanja 82 6 88

Odsutnost agresivnog ponašanja 198 69 267

Tip I po Cloningeru: 238 72 310

Tip II po Cloningeru: 42 3 45

Pokušaj samoubojstva tijekom života 38 17 55

Bez pokušaja samoubojstva tijekom života 242 58 300

*p < 0.01; **p < 0.001 ili p < 0.004; ***p < 0.0001 u odnosu na kontrolu

Usporedba ispitivanih skupina prema dobi utvrdila je da je grupa ispitanika ovisnih o

alkoholu bila statistički značajno starija od kontrolne grupe (p < 0,0001; Student’t-test).

Jednostruka analiza varijance (ANOVA; p < 0,0001), te Newman-Keuls test pokazali su da su

i muškarci (p < 0,001) i ţene (p < 0,01) u skupini ovisnika o alkoholu bili značajno starije

dobi od pripadajućih kontrolnih ispitanika. Analiza ispitanika prema spolu pokazala je da iako

su u obje skupine prevladavali muškarci (u skupini alkoholičara muškarci su sačinjavali

88,26%, a u kontrolnoj skupini 78,87%), u grupi ovisnika o alkoholu bilo je značajno više

27

ţena nego u grupi zdravih ispitanika (p < 0,004; Fisherov test). Nadalje, ustanovljena je i

značajna razlika u frekvenciji pušača i nepušača izmeĎu alkoholičara i zdravih ispitanika (p <

0,0001, Fisherov test). Naime, u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu utvrĎen je veći broj

pušača nego u skupini kontrolnih ispitanika. Unutar grupe ovisnika o alkoholu, većina

ispitanika nije zlorabila alkohol prije navršene 25. godine ţivota (65,92%), nije pokazivala

znakove agresivnog ponašanja (75,21%), te nije nikada tijekom ţivota pokušala izvršiti suicid

(84,51%).

4.1. Rezultati određivanja genotipova

Genotip svih ispitanika odreĎen je za biljeg rs567926 (hCV7537087) koji se nalazi u

intergenskoj regiji izmeĎu gena GABRA2 i GABRAG1 na kromosomu 4p. I u skupini

ovisnika o alkoholu i u kontrolnoj skupini učestalosti opaţenih genotipova bile su u skladu s

Hardy-Weinberg ravnoteţom (Tablica 9.).

Tablica 9. Dobivene i očekivane vrijednosti za genotipove polimorfizma rs567926

Genotipovi AA AG GG 2 test

Kontrolni

ispitanici

Dobiveno 86 117 27 p = 0.177

Očekivano 90,8 107,4 31,8

Ispitanici ovisni

o alkoholu

Dobiveno 112 185 58 p = 0.207

Očekivano 117,8 173,4 63,8

*ukoliko je p<0,05 rezultat nije u skladu sa HW ravnoteţom

Učestalost opaţenih genotipova i alela za polimorfizam rs567925 u skupinama

ispitanika ovisnih o alkoholu i zdravih ispitanika u odnosu na spol navedena je u tablici 10.i

grafički prikazana na slici 9, dok je raspodjela nosioca alela u kontrolnoj skupini i skupini

osoba s alkoholizmom navedena u tablici 11, a prikazana na slici 10.

28

Tablica 10. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs567926 po spolu u skupini kontrolnih

ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu

Broj i frekvencije (%) genotipova Broj i frekvencije (%) alela

AA AG GG A G

Kontrola

muškarci

79

(38.92%)

103

(50.74%)

21

(10.34%)

261

(64.29%)

145

(35.71%)

Kontrola

žene

7

(25.93%)

14

(51.85%)

6

(22.22%)

28

(51.85%)

26

(48.15%)

Alkoholičari

muškarci

90

(32.14%)

146

(52.15%)

44

(15.71%)

326

(58.21%)

234

(41.79%)

Alkoholičari

žene

22

(29.33%)

39

(52.00%)

14

(18.67%)

83

(55.33%)

67

(44.67%)

Kontrola

ukupno

86

(37.39%)

117

(50.87%)

27

(11.74%)

289

(62.83%)

171

(37.17%)

Alkoholičari

ukupno

112

(31.55%)

185

(52.11%)

58

(16.34%)

409

(57.61%)

301

(42.39%)

muški ženski0

50

100

150AA

AG

GG

a

bro

j ko

ntro

lnih

oso

ba

s p

oje

din

im g

en

otip

om

muški ženski0

50

100

150

200AA

AG

GG

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

otip

om

muški ženski0

50

100

150

200

250

300

350A

G

a

bro

j ko

ntro

lnih

oso

ba

s p

oje

din

im a

leli

ma

muški ženski0

50

100

150

200

250

300

350

400

450A

G

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

Slika 9. Raspodjela genotipova (lijevo) i alela (desno) po spolu u skupini kontrolnih ispitanika (a) i ispitanika

ovisnih o alkoholu (b)

29

Tablica 11. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G i nosioca genotipa GG u

odnosu na nosioce alela A po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnika o alkoholu

Broj i frekvencije (%) nosioca alela i homozigotnih genotipova

AA G GG A

Kontrola

žene

79

(38.92%)

124

(61.06%)

21

(10.35%)

182

(89.65%)

Alkoholičari

muškarci

7

(25.93%)

20

(74.07%)

6

(22.22%)

21

(77.78%)

Alkoholičari

žene

90

(32.14%)

190

(67.86%)

44

(15.71%)

236

(84.29%)

Kontrola

ukupno

22

(29.33%)

53

(70.67%)

14

(18.67%)

61

(81.33%)

Alkoholičari

ukupno

86

(37.39%)

144

(62.61%)

27

(11.74%)

203

(88.26%)

muški ženski0

50

100

150AA

G

a

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

no

sio

ca g

en

oti

pa A

A n

asp

ram

G

muški ženski0

50

100

150

200

250GG

A

cb

ro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

no

sio

ca g

en

oti

pa G

G n

asp

ram

A

muški ženski0

50

100

150

200

250

AA

G

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa A

A n

asp

ram

G

muški ženski0

50

100

150

200

250

300GG

A

d

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa G

G n

asp

ram

A

Slika 10. Raspodjela nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G (a i b) odnosno nosioca genotipa GG u

odnosu na nosioce alela A (c i d) po spolu u skupini kontrolnih ispitanika (gore) i ispitanika ovisnih o alkoholu

(dolje)

30

Nisu pronaĎene značajne razlike u raspodjeli genotipova, alela i nosioca alela s obzirom

na spol, niti u kontrolnoj grupi, niti u grupi ovisnika o alkoholu, te stoga spomenute ispitanike

nismo dijelili prema spolu u daljnjim analizama. TakoĎer dobiveni rezultati pokazali su da

nema statistički značajnih razlika u raspodjeli pojedinih genotipova, alela i nosioca alela

polimorfizma rs567926 u skupini ispitanika s alkoholizmom u odnosu na kontrolne zdrave

ispitanike (Tablice 10 i 11 i Slika 11).

kontrola alkohol0

100

200

300AA

AG

GG

a

bro

j o

so

ba n

osio

ca

po

jed

inih

gen

oti

po

va

kontrola alkohol0

100

200

300

400

500

600A

G

b

bro

j o

so

ba

no

sio

ca p

oje

din

ih a

lela

kontrola alkohol0

100

200

300

400AA

Ga

bro

j o

so

ba n

osio

ca

gen

oti

pa A

A n

asp

ram

G

kontrola alkohol0

100

200

300

400

500GGbA

bro

j o

so

ba n

osio

ca

gen

oti

pa G

G n

asp

ram

A

Slika 11. Raspodjela genotipova i alela (a i b lijevo), te nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G,

odnosno nosioca genotipa GG u odnosu na nosioce alela A (a i b desno) u skupini kontrolnih ispitanika i

ispitanika ovisnih o alkoholu

Podaci o brojnosti i frekvencijama genotipova i alela, te nosioca alela u kontrolnoj

skupini i skupini ovisnika o alkoholu s obzirom na pušački status prikazani su u tablicima 12 i

13, dok se njihov grafički prikaz moţe vidjeti na slikama 12 i 13.

31

Tablica 12. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs567926 kod pušača i nepušača unutar skupina

kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu

Broj i frekvencije (%) genotipova Broj i frekvencije (%) alela

AA AG GG A G

Kontrola

pušači

32

(42.67%)

36

(48.00%)

7

(9.33%)

100

(66.67%)

50

(33.33%)

Kontrola

nepušači

54

(34.84%)

81

(52.26%)

20

(12.90%)

189

(60.97%)

121

(39.03%)

Alkoholičari

pušači

67

(32.84%)

108

(52.94%)

29

(14.22%)

242

(59.31%)

166

(40.69%)

Alkoholičari

nepušači

45

(29.80%)

77

(50.99%)

29

(19.21%)

167

(55.30%)

135

(44.70%)

Pušači

ukupno

99

(35.49%)

144

(51.61%)

36

(12.90%)

342

(61.29%)

216

(38.71%)

Nepušači

ukupno

99

(32.35%)

158

(51.64%)

49

(16.01%)

356

(58.17%)

256

(41.83%)

pušaći nepušaći0

50

100

150AA

AG

GG

a

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m

pušaći nepušaći0

50

100

150AA

AG

GG

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m

pušaći nepušaći0

50

100

150

200

250A

G

a

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

s p

oje

din

im a

leli

ma

pušaći nepušaći0

50

100

150

200

250

300

350A

G

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

Slika 12. Raspodjela genotipova (lijevo) i alela (desno) izmeĎu pušača i nepušača u skupini kontrolnih ispitanika

(a) i ispitanika ovisnih o alkoholu (b)

32

Tablica 13. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G i nosioca genotipa GG u

odnosu na nosioce alela A po pušačkom statusu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnika o alkoholu

Broj i frekvencije (%) nosioca alela i homozigotnih genotipova

AA G GG A

Kontrola

pušači

32

(42.67%)

43

(57.33%)

7

(9.33%)

68

(90.67%)

Kontrola

nepušači

54

(34.84%)

101

(65.16%)

20

(12.90%)

135

(87.10%)

Alkoholičari

pušači

67

(32.84%)

137

(67.16%)

29

(14.22%)

175

(85.78%)

Alkoholičari

nepušači

45

(29.80%)

106

(70.20%)

29

(19.20%)

122

(80.80%)

Pušači

ukupno

99

(35.48%)

180

(64.52%)

36

(12.90%)

243

(87.10%)

Nepušači

ukupno

99

(32.35%)

207

(67.65%)

49

(16.01%)

257

(83.99%)

pušaći nepušaći0

50

100

150AA

Ga

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

no

sio

ca g

en

oti

pa A

A n

asp

ram

G

pušaći nepušaći0

50

100

150

200GG

Ac

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

no

sio

ca g

en

oti

pa G

G n

asp

ram

A

pušaći nepušaći0

50

100

150

200AA

G

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa A

A n

asp

ram

G

pušaći nepušaći0

50

100

150

200

250GG

A

d

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa G

G n

asp

ram

A

Slika 13. Raspodjela nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G (a i b) odnosno nosioca genotipa GG u

odnosu na nosioce alela A (c i d) izmeĎu pušača i nepušača u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o

alkoholu

33

Rezultati koji su dobiveni nisu utvrdili statistički značajne razlike u frekvencijama

genotipova, alela i nosioca alela izmeĎu alkoholičara i zdravih kontrola u ovisnosti o tome da

li su pušači ili nepušači. TakoĎer nije bilo značajnih razlika u frekvencijama genotipova, alela

i nosioca alela izmeĎu pušača i nepušača, bez obzira da li su oni ovisni o alkoholu ili nisu.

Brojnost i frekvencije genotipova, alela i nosioca alela ispitanika u skupini ovisnika o

alkoholu, podijeljenoj prema početku konzumiranja alkohola, prisutnosti agresivnog

ponašanja, te pokušaja samoubojstva navedeni su u tablicama 14. i 15, dok se njihov grafički

prikaz moţe vidjeti na slikama 14, 15 i 16. Dobiveni rezultati ukazuju da izmeĎu navedenih

skupina alkoholičara nije bilo statistički značajnih razlika u raspodjeli genotipova i alela i

nosioca alela polimorfizma rs567926.

Tablica 14. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs567926 u različitim podskupinama ispitanika

ovisnih o alkoholu

Broj i frekvencije (%) genotipova Broj i frekvencije (%) alela

AA AG GG A G

Rani početak zlorabe

alkohola

32

(26.45%)

70

(57.85%)

19

(15.70%)

134

(55.37%)

108

(44.63%)

Kasniji početak zlorabe

alkohola

80

(34.19%)

115

(49.14%)

39

(16.67%)

275

(58.76%)

193

(41.24%)

Prisutnost agresivnog

ponašanja

26

(29.55%)

51

(57.95%)

11

(12.5%)

103

(58.52%)

73

(41.48%)

Odsutnost agresivnog

ponašanja

86

(32.21%)

134

(50.19%)

47

(17.60%)

306

(57.30%)

228

(42.70%)

Alkoholizam tipa I prema

Cloningeru

97

(31.29%)

160

(51.61%)

53

(17.10%)

354

(57.10%)

266

(42.90%)

Alkoholizam tipa II prema

Cloningeru 15

(33.33%)

25

(55.56%)

5

(11.11%)

55

(61.11%)

35

(38.89%)

Pokušaj samoubojstva

tijekom života

23

(41.82%)

25

(45.45%)

7

(12.73%)

71

(64.55%)

39

(35.45%)

Bez pokušaja samoubojstva

tijekom života

89

(29.67%)

160

(53.33%)

51

(17.00%)

338

(56.33%)

262

(43.67%)

34

Tablica 15. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G i nosioca genotipa GG u

odnosu na nosioce alela A u različitim podskupinama ispitanika ovisnim o alkoholu

Broj i frekvencije (%) nosioca alela i homozigotnih genotipova

AA G GG A

Rani početak zlorabe

alkohola

32

(26.45%)

89

(73.55%)

19

(15.70%)

102

(84.30%)

Kasniji početak zlorabe

alkohola

80

(34.19%)

154

(65.81%)

39

(16.67%)

195

(83.33%)

Prisutnost agresivnog

ponašanja

26

(29.55%)

62

(70.45%)

11

(12.50%)

77

(87.50%)

Odsutnost agresivnog

ponašanja

86

(32.21%)

181

(67.79%)

47

(17.60%)

220

(82.40%)

Alkoholizam tipa I prema

Cloningeru

97

(31.29%)

213

(68.71%)

53

(17.10%)

257

(82.90%)

Alkoholizam tipa II prema

Cloningeru

15

(33.33%)

30

(66.67%)

5

(11.11%)

40

(88.89%)

Pokušaj samoubojstva

tijekom života

23

(41.82%)

32

(58.18%)

7

(12.73%)

48

(87.27%)

Bez pokušaja samoubojstva

tijekom života

89

(29.67%)

211

(70.33%)

51

(17.00%)

249

(83.00%)

rani početak kasni početak0

50

100

150

200AA

AG

GG

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m

rani početak kasni početak0

100

200

300

400A

G

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

rani početak kasni početak 0

100

200

300AA

G

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa A

A n

asp

ram

G

rani početak kasni početak0

100

200

300GGbA

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa G

G n

asp

ram

A

Slika 14. Raspodjela genotipova i alela (a i b lijevo), te nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G (a),

odnosno nosioca genotipa GG u odnosu na nosioce alela A (a i b) desno prema početku konzumiranja alkohola u

skupini ispitanika ovisnih o alkoholu

35

agresija bez agresije0

50

100

150

200

250AA

AG

GG

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m

agresija bez agresije0

100

200

300

400A

G

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

agresija bez agresije0

100

200

300AA

G

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa A

A n

asp

ram

G

agresija bez agresije0

100

200

300

400

GG

A

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa G

G n

asp

ram

A

Slika 15. Raspodjela genotipova i alela (a i b lijevo), te nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G,

odnosno nosioca genotipa GG u odnosu na nosioce alela A (a i b desno) s obzirom na prisutnost agresivnog

ponašanja u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu

suicid bez suicida0

100

200

300AA

G

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa A

A n

asp

ram

G

suicid bez suicida0

100

200

300

400GG

A

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa G

G n

asp

ram

A

suicid bez suicida0

100

200

300

AA

AG

GG

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m

suicid bez suicida0

100

200

300

400

500A

G

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

Slika 16. Raspodjela genotipova, alela (a i b lijevo), te nosioca genotipa AA u odnosu na nosioce alela G

odnosno nosioca genotipa GG u odnosu na nosioce alela A (a i b desno) s obzirom na pokušaj suicida u skupini

ispitanika ovisnih o alkoholu

36

4.2. Rezultati određivanja haplotipova

Kako bi se odredila struktura haplotipskog bloka unutar GABRA2 regije i haplotipska

povezanost polimorfizama gena GABRA2 s ovisnosti o alkoholu, uz biljeg rs567926

analiziran je i polimorfizam rs279858 koji je smješten u središnjem dijelu gena GABRA2

(ekson 5) na kromosomu 4p (slika 17).

Slika 17. Poloţaj polimorfizama rs567926 i rs279858 unutar gena GABRA2 (25)

Za gore navedene markere unutar središnje i 3’ regije gena GABRA2 zabiljeţen je

visok stupanj neravnoteţe udruţivanja (eng. linkage disequilibrium, LD) (slika 17), što je u

skladu s dosadašnjim podacima iz literature. LD vrijednosti za kontrolnu grupu i grupu

ovisnika o alkoholu dobiveni su pomoću programa Haploview (12) (Slika 18) i nisu se

značajno razlikovale. U oba slučaja LD vrijednost bila je ≥ 90, što ukazuje da se ova dva

markera nasljeĎuju zajedno u bloku.

kontrolni ispitanici ispitanici ovisni o alkoholu

Slika 18. Prikaz LD vrijednosti izmeĎu dva GABRA2 SNP-a (rs567926 i rs279858) dobiven pomoću programa

Haploview za kontrolnu skupinu i skupinu ovisnika o alkoholu (izvorna slika)

37

Ova dva SNP-a analizirani su kao haplotipovi čija je raspodjela utvrĎena za kontrolnu

skupinu i skupinu ovisnika o alkoholu. Programom Haploview utvrĎena su četiri najčešća

haplotipa u ispitivanom uzorku (Tablica 16), a njihove frekvencije nisu bile značajno različite

izmeĎu kontrolne skupine i skupine ispitanika ovisnih o alkoholu (Tablica 17).

Tablica 16. Frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 u ukupnom uzorku ispitanika

hrvatskog podrijetla

Haplotipovi Frekvencija

AT 0.582

GC 0.363

GT 0.038

AC 0.016

Tablica 17. Frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 unutar skupina kontrolnih ispitanika i

ovisnika o alkoholu

Haplotipovi Frekvencija χ2; p Kontrolni ispitanici Alkoholičari

AT 0.615 0.561 χ2 = 3.256; p = 0.071

GC 0.338 0.380 χ2 = 2.041; p = 0.153

GT 0.040 0.037 χ2 = 0.047; p = 0.828

AC 0.007 0.022 χ2 = 3.781; p = 0.052

Nadalje, kada su ispitanici podijeljeni s obzirom na pušački status na pušače i

nepušače, izmeĎu ovih skupina takoĎer nisu utvrĎene značajne razlike u raspodjeli

haplotipova (Tablica 18).

Tablica 18. Frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 unutar skupina nepušača i pušača,

Haplotipovi Frekvencija χ2; p Nepušači Pušači

AT 0.564 0.604 χ2 = 1.898; p = 0.168

GC 0.384 0.339 χ2 = 2.599; p = 0.107

GT 0.035 0.040 χ2 = 0.254; p = 0.614

AC 0.017 0.017 χ2 = 0.000; p = 0.999

Kao što je prikazano u tablicama 19 i 20, takoĎer nisu utvrĎene statistički značajne

razlike u frekvencijama haplotipova u ispitanika ovisnih o alkoholu, a podijeljenih s obzirom

na početak konzumiranja alkohola i agresivno ponašanje.

38

Tablica 19. Frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 unutar skupine alkoholičara u osoba s

ranim i kasnijim početkom zlouporabe alkohola

Haplotipovi Frekvencija χ2; p Alkoholičari s ranim

početkom alkoholizma

Alkoholičari s kasnim

početkom alkoholizma

AT 0.540 0.574 χ2 = 0.761; p = 0.383

GC 0.372 0.381 χ2 = 0.056; p = 0.812

GT 0.054 0.029 χ2 = 2.870; p = 0.090

AC 0.034 0.016 χ2 = 2.362; p = 0.124

Tablica 20. Frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 u osoba ovisnih o alkoholu s i bez

agresivnog ponašanja

Haplotipovi Frekvencija χ2; p Neagresivni alkoholičari Agresivni alkoholičari

AT 0.563 0.556 χ2 = 0.026; p = 0.872

GC 0.385 0.363 χ2 = 0.277; p = 0.598

GT 0.035 0.046 χ2 = 0.513; p = 0.474

AC 0.018 0.035 χ2 = 1.843; p = 0.175

Statistički značajna razlika utvrĎena je u raspodjeli haplotipova izmeĎu skupine

ispitanika ovisnih o alkoholu s kombinacijom ranog početka zlouporabe alkohola i agresivnog

ponašanja koja odgovara alkoholičarima tipa II po Cloningeru i skupine ovisnika o alkoholu s

kasnijim početkom konzumacije alkohola i bez agresije (alkoholičari tipa I po Cloningeru).

Ove dvije grupe značajno se razlikuju u frekvenciji GT haplotipa (χ2=4.814; p = 0.028), koji

je značajno češći u skupini alkoholičara tipa II po Cloningeru (Tablica 21). Isto tako rezultati

haplotipske analize pokazali su da se ne-suicidalni i suicidalni alkoholičari značajno razlikuju

(χ2 = 5.342; p = 0.021) u frekvenciji haplotipa GC (Tablica 22).

Tablica 21. Frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 unutar skupine alkoholičara u osoba

ovisnih o alkoholu tipa I i II prema Cloningeru

Haplotipovi Frekvencija χ2; p Alkoholičari tipa I Alkoholičari tipa II

AT 0.557 0.556 χ2=0.305; p=0.581

GC 0.391 0.363 χ2=2.815; p=0.093

GT 0.032 0.046 χ2=4.814; p=0.028

AC 0.020 0.034 χ2=0.703; p=0.402

Tablica 22. Frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 unutar skupine alkoholičara u osoba

ovisnih o alkoholu s i bez pokušaja suicida

Haplotipovi Frekvencija χ2; p Nesuicidalni alkoholičari Suicidalni alkoholičari

AT 0.547 0.636 χ2=2.938; p=0.086

GC 0.397 0.281 χ2=5.342; p=0.021

GT 0.033 0.064 χ2=2.598; p=0.107

AC 0.023 0.019 χ2=0.058; p=0.809

39

5. Rasprava

Povezanost gena GABRA2 i ovisnosti o alkoholu naĎena je u nekoliko istraţivanja

koja su uključivala pripadnike različitih populacija (25, 37, 64, 65). MeĎutim, rezultati nekih

istraţivanja pokazali su i značajnu povezanost alkoholizma s blokom polimorfizama koji se

proteţe od intergenske regije izmeĎu gena GABRA2 i GABRG1 do introna 3 gena GABRG1,

te općenito za biljege smještene u 5' području gena GABRG1 (26, 33, 35, 91). Autori

pretpostavljaju da bi primijećena povezanost gena GABRA2 s alkoholizmom mogla biti i

posljedica neravnoteţe vezanosti (LD) biljega gena GABRA2 i gena GABRG1. Mnoge od tih

studija uključivale su i polimorfizam rs567926 (25, 26, 95), analiziran i u ovom istraţivanju.

MeĎutim, za razliku od navedenih studija, u našem istraţivanju nismo utvrdili

povezanost alkoholizma s polimorfizmom rs567926, što je pak u skladu s drugim

istraţivanjima (26, 32, 68, 83, 93, 95). Razlika naših rezultata u odnosu na pronalaske autora

koji su našli povezanost gena GABRA2 s alkoholizmom moţe se pripisati genetskim

razlikama izmeĎu ispitivanih populacija. Naime, koliko nam je poznato ovo je prva studija

koja istraţuje povezanost alkoholizma i biljega gena GABRA2, te općenito gena koji kodiraju

za podjedinice GABAA receptora u hrvatskoj populaciji. I druga su ranija istraţivanja

povezanosti gena GABRA2 s rizikom razvoja alkoholizma (26, 34) takoĎer utvrdila razlike u

dobivenim rezultatima u ovisnosti o rasnoj i etičkoj pripadnosti ispitanika. Nadalje, moguće

je da u našem istraţivanju nismo primjetili značajnu razliku u raspodjeli genotipova i alela

izmeĎu osoba ovisnih o alkoholu i zdravih osoba zbog premale snage uzorka, odnosno

nedovoljno velikog broja ispitanika ili moţda zbog nedovoljno reprezentativnog uzorka

populacije. Stoga bi bilo dobro ovo istraţivanje ponoviti na još većem broju ispitanika. Spolni

dimorfizam takoĎer se spominje u literaturi kao jedan od mogućih razloga razlika u

dobivenim rezultatima izmeĎu provedenih istraţivanja (33, 34). No, u našem istraţivanju ovaj

čimbenik se vrlo vjerojatno moţe isključiti, s obzirom da su u našoj kao i u nekim drugim

studijama (68), jednaki rezultati dobiveni u oba spola. Osim toga, genetička stratifikacija

populacije takoĎer bi mogla biti uzrokom artefakta.

Pušenje i alkoholizam često se javljaju zajedno, te je poznato da su oba ponašanja

odreĎena dijelom i genetskim utjecajem. Pušači, uključujući one koji su ovisni o nikotinu,

imaju povišen rizik ovisnosti o alkoholu. Slično tome, ovisnici o alkoholu pokazuju povećani

rizik za pušenje od osoba koje nisu ovisne o alkoholu. To potvrĎuju i rezultati našeg

istraţivanja koji su pokazali značajno veću učestalost pušenja u skupini alkoholičara u odnosu

40

na skupinu zdravih ispitanika. Pojedina istraţivanja su utvrdila odreĎene zajedničke genske

čimbenike koji utječu i na ovisnost o alkoholu i nikotinu (14, 15).

Osim povezanosti s alkoholizmom, u literaturi je pokazana i povezanost

polimorfizama i haplotipskih blokova gena GABRA2 s ovisnošću o nikotinu (4). TakoĎer

pojedini rezultati sugeriraju da bi pojačavanje odreĎenih učinaka kronične konzumacije

alkohola pušenjem, moglo biti povezano sa sintezom GABA-e i gustoćom GABAA receptora

koji dijele strukturalnu i funkcionalnu homologiju s nikotinskim acetilkolinskim receptorima.

Nadalje, poznato je da nikotin stimulira aktivnost GABAergičnog sustava (35). MeĎutim,

usprkos brojnih pronalazaka koji upućuju na moguću ulogu gena koji kodiraju za podjedinice

GABAA receptora, u našem istraţivanju nije utvrĎena različita raspodjela genotipova i alela u

skupini alkoholičara i kontrolnih ispitanika u ovisnosti o tome jesu li pušači ili nepušači, kao

niti izmeĎu pušača i nepušača, neovisno o tome jesu li alkoholičari ili ne. Dakle, osim što u

našem uzorku ispitanika nije utvrĎena značajna povezanost biljega rs567926 s ovisnošću o

alkoholu, nije utvrĎena uključenost ovog polimorfizma niti u razvoju ovisnosti o nikotinu.

Različite studije takoĎer su utvrdile povezanost gena koji kodiraju podjedinice

GABAA receptora sa subjektivnim odgovorom na alkohol (48, 85), osjetljivošću na akutne

učinke alkohola (69), β-frekvencijom elektroencefalografa, koja predstavlja neurobiološki

endofenotip alkoholizma, te s rizikom odreĎenih psihijatrijskih poremećaja, uključujući

poremećaje ponašanja (31) i anksioznost (34). Istraţivanja upućuju da su isti biljezi za koje je

utvrĎena povezanost gena GABRA2 s β-EEG endofenotipom, takoĎer povezani i s DSM-IV

dijagnozom ovisnosti o alkoholu, zloupotrebom drugih supstanci, antisocijalnim i drugim

poremećajima ponašanja (89)

I u našem istraţivanju pratili smo povezanost polimorfizma rs567926 s ponašanjem

povezanim s alkoholizmom. MeĎutim, nismo utvrdili značajne razlike u frekvencijama

genotipova i alela u ispitanika ovisnih o alkoholu s obzirom na početak zlouporabe alkohola,

prisutnost agresivnog ponašanja, niti pokušaj samoubojstva. TakoĎer, nismo utvrdili ni

značajne razlike u raspodjeli varijanti ovog biljega u skupini alkoholičara s kombinacijom

ranog početka zlouporabe alkohola i agresivnog ponašanja (alkoholizam tipa II prema

Cloningeru) u odnosu na skupinu ovisnika o alkoholu s kombinacijom kasnijeg početka

alkoholizma i bez agresije (alkoholizam tipa I prema Cloningeru).

Nadalje, naša analiza haplotipova polimorfizama rs567926 i rs279858 utvrdila je

visoki stupanj «neravnoteţe udruţivanja» (LD) za spomenute biljege smještene unutar 3’ i

središnje regije gena GABRA2 i u kontrolnoj skupini i u skupini ispitanika s alkoholizmom,

upućujući na postojanje SNP bloka unutar kojeg se navedeni biljezi vrlo vjerojatno nasljeĎuju

41

zajedno. To je u skladu s istraţivanjima koja pokazuju postojanje visokog stupnja LD koji se

proteţe od središnjeg područja gena GABRA2 do intergenskog područja gena izmeĎu gena

GABRA2 i GABRG1 (25, 26, 36, 51, 91). Nadalje, iako su biljezi gena GABRA2 i gena

GABRG1 smješteni u različitim haplotipskim blokovima, izmeĎu biljega ova dva bloka

takoĎer postoji umjerena neravnoteţa vezanosti gena (LD), što upućuje na mogućnost

povezanosti oba gena s ovisnosti o alkoholu. Tako su analize haplotipova koji su uključivali i

polimorfizam rs567926 (25, 37, 95) utvrdile povezanost pojedinih haplotipova gena

GABRA2 s alkoholizmom, pri čemu je največa povezanost uvrĎena za područje od biljega

rs279837 u intronu 3 preko polimorfizma rs567926 u 3' nizvodnoj regiji (51).

Iako rezultati našeg istraţivanja nisu pokazali haplotipsku povezanost biljega

rs567926 i rs279858 s ovisnošću o alkoholu i nikotinu, skupina ispitanika ovisnih o alkoholu

s kombinacijom ranog početka zlouporabe alkohola i agresivnog ponašanja (alkoholičari tipa

II po Cloningeru) značajno se razlikovala od skupine ovisnika o alkoholu s kombinacijom

kasnijeg početka konzumacije alkohola i bez agresije (alkoholičari tipa I po Cloningeru) u

frekvenciji GT haplotipa, koji je značajno češći u skupini alkoholičara tipa II. UtvrĎene

razlike nisu iznenaĎujuće ako se zna da je oblik alkoholizma kojeg karakterizira kasniji

početak i neurotička obiljeţja (tip I alkoholizma) umjereno nasljedan (manje od 40%), dok je

drugi, teţi podtip alkoholičara s ranijim početkom i povišenom razinom antisocijalnog

ponašanja (tip II alkoholizma) jako nasljedan s procijenjenom nasljednošću na 90%.

U našem istraţivanju takoĎer je utvrĎeno da se ne-suicidalni i suicidalni alkoholičari

značajno razlikuju u raspodjeli haplotipa GC, čija je veća frekvencija naĎena u ispitanika

ovisnih o alkoholu koji nisu pokušali samoubojstvo tijekom ţivota. Općenito se smatra da je

stopa pokušaja samoubojstva u korelaciji s konzumacijom alkohola i brojem alkoholičara u

pojedinim populacijama (18). Rezultati istraţivanja takoĎer upućuju na moguću ulogu

GABAA receptora i gena koji za njih kodiraju u suicidalnom ponašanju (42). Naime,

odreĎene studije pokazuju da bi poremećena funkcija GABAergičnog neurotransmitorskog

sustava mogla biti uključena u neurobiologiju suicidalnog ponašanja (23, 67, 74). OdreĎene

specifične promjene u mozgu utvrĎene su u ekspresiji i metilaciji gena GABA sustava (56,

87, 88), iako neki autori nisu pronašli povezanost ovih gena sa samoubojstvom (11). S druge

strane, koliko nam je poznato ovo je prva studija koja se je bavila istraţivanjem povezanosti

biljega gena GABRA2 s rizikom samoubojstva kod alkoholičara. S obzirom da je ovo

ispitivanje provedeno samo na skupini ispitanika ovisnih o alkoholu, potrebna su daljnja

istraţivanja kako bi se utvrdilo da li postoji haplotipska povezanost varijacija gena GABRA2

sa suicidom, ne samo u alkoholičara već i općenito.

42

Provedeno istraţivanje na polimorfizmu rs567926 smještenom u intergenskom

području izmeĎu gena GABRA2 i GABRG1 trebalo bi olakšati razumijevanje uključenosti

gena koji kodiraju za podjedinice GABAA receptora u razvoj ovisnosti o alkoholu. MeĎutim,

u budućnosti ovo istraţivanje trebalo bi proširiti i na biljege gena GABRG1. Naime,

povezanost varijanti gena GABRA2 s ovisnošću o alkoholu mogla biti i posljedica

neravnoteţe vezanosti (LD) biljega gena GABRA2 i susjednog gena GABRG1, te odreĎenih

funkcionalnih genetskih varijacija u oba gena. Nadalje, razlike u genskoj arhitekturi izmeĎu

različitih populacija mogle bi pomoći u utvrĎivanju još ne-definiranih funkcionalnih

promjena gena GABRA2 i GABRG1 vezanih uz alkoholizam. Prema tome, potrebna su

daljnja genetska istraţivanja na većem broju ispitanika, koja će obuhvatiti različite populacije

i različite karakteristike ispitanika ovisnih o alkoholu, kako bi se proširila dosadašnja znanja o

biološkoj podlozi alkoholizma.

43

6. Zaključak

1. U ovom istraţivanju nije utvrĎena povezanost polimorfizma rs567926, smještenog u

intergenskom području izmeĎu gena koji kodira za 2 podjedinicu GABAA receptora

(GABRA2) i gena koji kodira za podjedinicu GABAA receptora (GABRG1), s

rizikom razvoja ovisnosti o alkoholu, na uzorku ispitanika iz hrvatske populacije.

Naime, dobiveni rezultati istraţivanja nisu pokazali značajne razlike u frekvenciji

genotipova i alela polimorfizma rs567926 izmeĎu ispitanika ovisnih o alkoholu i

zdravih ispitanika.

2. Nije utvrĎena statistički značajna razlika u raspodjeli genotipova i alela polimorfizma

rs567926 s obzirom na spol ispitanika, u skupini ispitanika s alkoholizmom, kao ni u

kontrolnoj skupini.

3. Razlike u raspodjeli varijacija genotipova i alela za polimorfizam rs567926 gena

GABRA2 nisu utvrĎene izmeĎu pušača i nepušača, niti u skupini ovisnika o alkoholu,

kao ni u skupini kontrolnih ispitanika. Rezultati istraţivanja nisu pokazali povezanost

navedenog biljega s pušenjem niti u slučaju kada su svi ispitanici podijeljeni samo

prema pušačkim statusu.

4. Kada je skupina ispitanika ovisnih o alkoholu podijeljena na podskupine s obzirom na

početak konzumacije alkohola, prisutnost agresivnog ponašanja, te pokušaj

samoubojstva, analiza genotipova i alela polimorfizma rs567926 nije utvrdila

statistički značajne razlike izmeĎu ispitivanih skupina.

5. Značajne razlike u raspodjeli varijanti biljega rs567926 nisu utvrĎene niti u skupini

alkoholičara s kombinacijom ranog početka zlouporabe alkohola i agresivnog

ponašanja (alkoholizam tipa II prema Cloningeru) u odnosu na skupinu ovisnika o

alkoholu s kombinacijom kasnijeg početka konzumacije alkohola i bez agresije

(alkoholizam tipa I prema Cloningeru).

6. Analiza haplotipova polimorfizama rs567926 i rs279858 utvrdila je visoki stupanj

«neravnoteţe udruţivanja» (eng. linkage disequilibrium, LD) za spomenute biljege

smještene unutar 3’ i središnje regije gena GABRA2 i u kontrolnoj skupini i u skupini

44

ispitanika s alkoholizmom, upućujući na postojanje SNP bloka unutar kojeg se

navedeni biljezi vrlo vjerojatno nasljeĎuju zajedno.

7. Rezultati istraţivanja nisu pokazali haplotipsku povezanost biljega rs567926 i

rs279858 s ovisnošću o alkoholu i nikotinu.

8. Haplotipska analiza utvrdila je da se skupina ispitanika ovisnih o alkoholu s

kombinacijom ranog početka zlouporabe alkohola i agresivnog ponašanja

(alkoholičari tipa II po Cloningeru) značajno razlikuje od skupine ovisnika o alkoholu

s kombinacijom kasnijeg početka konzumacije alkohola i bez agresije (alkoholičari

tipa I po Cloningeru) u frekvenciji GT haplotipa, koji je značajno češći u skupini

alkoholičara tipa II.

9. U istraţivanju je takoĎer utvrĎeno da se ne-suicidalni i suicidalni alkoholičari

značajno razlikuju u raspodjeli haplotipa GC, čija je veća frekvencija naĎena u

ispitanika ovisnih o alkoholu koji nisu pokušali samoubojstvo tijekom ţivota.

10. U svrhu razjašnjavanja uloge gena GABRA2 u razvoju ovisnosti o alkoholu, kao i u

ponašanju povezanim s alkoholizmom, potrebna su daljnja opširnija istraţivanja.

45

7. Literatura

1. Abraham JH, Seiler N, Schousboe A (1994) Induction of low-affinity GABAA

receptors by the GABA-agonist THIP (4,5,6,7-tetrahydroisoxazolo[5,4-c]pyridin-3-ol)

in cultured rat cerebellar granule cells is prevented by inhibition of polyamine

biosynthesis. J. Neurosci. Res. 39: 656-662

2. Ader R (2007) Psychoneuroimmunology. 4th ed. New York: Elsevier Academic Press,

poglavlje 26: 549-561

3. Afonina I, Zivarts M, Kutyavin I et. al. (1997) Efficient priming of PCR with short

oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic. Acids. Research. 25:

2657–2660

4. Agrawal A, Pergadia ML, Saccone SF et. al. (2008) Gamma-aminobutyric acid

receptor genes and nicotine dependence: evidence for association from a case-control

study. Addiction. 103: 1027-1038

5. Alele PE, Devaud LL (2005) Differential adaptations in GABAergic and

glutamatergic systems during ethanol withdrawal in male and female rats. Alcohol.

Clin. Exp. Res. 29: 1027-1034

6. Alexander BE, Roller E, Klotz U (1992) Characterization of peripheral-type

benzodiazepine binding sites on human lymphocytes and lymphoma cell lines and

their role in cell growth. Biochem. Pharmacol. 44: 269-274

7. Ali NJ, Olsen RW (2001) Chronic benzodiazepine treatment of cells expressing

recombinant GABAA receptors uncouples allosteric binding: studies on possible

mechanisms. J. Neurochem. 79: 110-1108

8. Alkon DL, Sanchez-Andres J-V, Ito E et. al. (1992) Long-term transformation of an

inhibatory into an excitatory GABAergic synaptic response. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 89: 862-866

9. Allan AM, Harris RA, (1989) Acute and chronic ethanol treatments alter GABA

receptor-operated chloride channels. Pharmacol. Biochem. Behav. 27: 665-670

10. American Psychiatric Association (1994) Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders. 4th ed. American Psychiatric Press, Washington DC.

11. Baca-Garcia E, Vaquero-Lorenzo C, Perez-Rodriguez MM et. al.(2010) Nucleotide

variation in central nervous system genes among male suicide attempters. Am. J. Med.

Genet. B. Neuropsychiatr. Genet. 153B: 208-213

46

12. Barrett JC, Fry B, Maller J et. al. (2005) Haploview: analysis and visualization of LD

and haplotype maps. Bioinformatics. 21: 263-265

13. Baumann SW, Baur R, Sigel E (2001) Subunit arragement of γ-aminobutyric acid type

A receptors. J. Biol. Chem. 276: 36275-36280

14. Bierut LJ, Schuckit MA, Hesselbrock V et. al. (2000) Co-occurring risk factors for

alcohol dependence and habitual smoking. Results from the collaborative study on the

genetics of alcoholism. Alcohol Res. Health. 24: 233-241

15. Bierut LJ, Rice JP, Goate A et al. (2004) A genomic scan for habitual smoking in

families of alcoholics: common and specific genetic factors in substance dependence.

Am. J. Hum. Genet.124: 19–27

16. Bierut LJ, Agrawal A, Bucholz KK et al. (2010) A genome-wide association study of

alcohol dependence. PNAS 107: 5082-5087

17. Bonetti EP, Burkard WP, Gabl M et. al. (1989) Ro 15-4513: partial inverse agonism at

the BZR and interaction with ethanol. Pharmacol. Biochem. Behav. 31: 733-749

18. Borges G, Loera CR (2010) Alcohol and drug use in suicidal behaviour. Curr.

Opin.Psychiatr. 23: 195– 204

19. Brown GL, Goodwin FK, Ballenger JC et. al. (1979) Aggresion in humanst correlates

with cerebrospinal fluid amine metabolites. Psychiatr. Res. 1: 131-139

20. Buck KJ, Harris RA (1990) Benzodiazepine agonist and inverse agonist actions on

GABAA receptor-operated chloride channels II. Chronic effects of ethanol. J.

Pharmacol. Exp. Ther. 253: 706-712

21. Buydens-Branchey L, Branchey MH, Noumair D (1989) Age of alcoholism onset I:

relationship to psychopathology. Archives of General Psychiatry 46: 225–230

22. Cagetti E, Liang J, Spigelman I et. al. (2003) Withdrawal from chronic intermittent

ethanol treatment changes subunit composition, reduces synaptic function, and

decreases behavioral responses to positive allosteric modulators of GABAA receptors.

Mol. Pharmacol. 63: 53-64

23. Cheetham SC, Crompton MR, Katona CLE et. al. (1988) Brain 5-HT2 receptor

binding site sin depressed suicide victims. Braun. Res. 443: 272-280

24. Cook JB, Foster KL, Eiler WJA et. al. (2005) Selective GABAA α5 benzodiazepine

inverse agonist antagonizes the neurobehavioral actions of alcohol. Alcohol. Clin.

Exp. Res. 29: 1390-1401

47

25. Covault J, Gelernter J, Hesselbrock V et. al. (2004) Allelic and haplotypic association

of GABRA2 with alcohol dependence. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet.

129: 104–109

26. Covault J, Gelernter J, Jensen K et. al. (2008) Markers in the 5' region of GABRG1

associate to alcohol dependence and are in linkage disequilibrium with markers in the

adjacent GABRA2 gene. Neuropsychopharmacol. 33: 837–848

27. Davies M (2003) The role of GABAA receptors in mediating the effects of alcohol in

the central nervous system. J. Psychiatry. Neurosci. 28: 263-274

28. Deavud LL, Fritschy J-M, Seighart W et. al. (1997) Bidirectional alterations of

GABAA receptor subunit peptide levels in rat cortex during chronic ethanol

consumptions and withdrawal. J. Neurochem. 69: 126-130

29. Devaud LL, Matthews DB, Morrow AL (1999) Gender impacts behavioral and

neurochemical adaptations in ethanol-dependent rats. Pharmacol. Biochem. Behav.

64: 841-849

30. DeVries DJ, Johnston GAR, Ward LC et. al. (1987) Effects of chronic ethanol

inhalation on the enhancement of benzodiazepine binding to mouse brain membranes

by GABA. Neurochem. Int. 10: 231-235

31. Dick DM, Plunkett J, Wetherill LF et al. (2006) Association between GABRA1 and

drinking behaviors in the collaborative study on the genetics of alcoholism sample.

Alcohol. Clin. Exp. Res. 30: 1101–1110

32. Drgon T, D'Addario C, Uhl GR (2006) Linkage disequilibrium, haplotype and

association studies of a chromosome 4 GABA receptor gene cluster: candidate gene

variants for addictions. Am. J. Med. Genet. B Neuropsychiatr. Genet. 141: 854 –860

33. Edenberg HJ, Dick DM, Xuei X et al. (2004) Variations in GABRA2, encoding the α2

subunit of the GABAA receptor, are associated with alcohol dependence and with

brain oscillations. Am. J. Hum. Genet. 74: 705–714

34. Enoch MA, Schwartz L, Albaugh B et. al. (2006) Dimensional anxiety mediates

linkage of GABRA2 haplotypes with alcoholism. Am. J. Med. Genet. B

Neuropsychiatr. Genet. 141: 599–607

35. Enoch MA (2008): The role of GABAA receptors in the development of alcoholism.

Pharmacol. Biochem. Behav. 90: 95 –104

36. Enoch MA, Hodgkinson CA, Yuan Q et al. (2009) GABRG1 and GABRA2 as

independent predictors for alcoholism in two populations. Neuropsychopharmacol.

34: 1245–1254

48

37. Fehr C, Sander T, Tadic A et al. (2006) Confirmation of association of the GABRA2

gene with alcohol dependence by subtype-specific analysis. Psychiatr. Genet. 16: 9–

17

38. Follesa P, Serra M, Cagetti E et. al. (2000) Allopregnanolone synthesis in cerebellar

granule cells: roles in regulation of GABAA receptor expression and function during

progesterone treatment and withdrawal. Mol. Pharmacol. 57: 1262-1270

39. Förster VT (1948) Zwischenmolekulare energiewanderung und fluoreszenz. Ann.

Phys. Annalen der Physik 437: 55–75

40. Fritschy J-M, Brünig I (2003) Formation and plasticity of GABAergic synapses:

physiological mechanisms and patophysiological iplications. Pharmacol. Therap. 98:

299-323

41. Gilligan, C, Ward J, Taylor J (1988) Mapping the moral domain. Cambridge: Harvard

University Press. 111-138

42. Gorwood P (2001) Biological markers for suicidal behavior in alcohol dependence.

Eur. Psychiatry. 16: 410-417

43. Grobin AC, Matthews DB, Devaud LL et. al. (1998) The role of GABAA receptors in

the acute and chronic effects of ethanol. Psychopharmacol. 139: 2-19

44. Grobin AC, Fritchy J-M, Morrow AL (2000) Chronic ethanol administration alters

immunoreactivity for GABAA receptor subunits in rat cortex in a region-specific

manner. Alcohol. Clin. Exp. Res. 24: 1137-1144

45. Haefely WE (1989) The GABAA-benzodiazepine receptor: Biology and

pharmacology. Eur. Arch. Psychiatry. Neurolo. Sci. 238: 294-301

46. Hamilton M. (1960): A rating scale for depression. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr.

23: 56–62

47. Harris RA, Vlenzuela CF, Brozowski S et. al. (1998) Adaptation of γ-aminobutyric

acid type A receptors to alcohol exposure: studies with stably transfected cells. J.

Pharmacol. Exp. Ther. 284: 180-188

48. Haughey HM, Ray LA, Finan P et. al. (2008) Human γ-aminobutyric acid A receptor

α2 gene moderates the acute effects of alcohol and brain mRNA expression. Genes2B.

7: 447–454

49. Heinz A, Braus DF, Smolka MN et. al. (2004) Amygdala-prefrontal coupling depends

on a genetic variation of the serotonin transporter. Nature. Neuroscience. 8: 20 – 21

49

50. Holland PM, Abramson RD, Watson R et. al. (1991) Detection of specific polymerase

chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of Thermus

aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 7276-7280

51. Ittiwut C, Listman J, Mutirangura A et. al. (2007) Interpopulation linkage

disequilibrium patterns of GABRA2 and GABRG1 genes at the GABA cluster locus

on human chromosome 4. Genomics. 91: 61–69

52. Johnston JD, Bristow DR (1998) Regulation of GABAA receptor α1 protein is a

sensitive indicator of benzodiazepine agonist efficacy. Eur. J. Pharmacol. 348: 321-

324

53. Kalsi G, Prescott CA, Kendler KS et. al. (2009) Unraveling the molecular mechanisms

of alcohol dependence. Trends. Genet. 25: 49-55

54. Kimura M, Higuchi S (2011) Genetics of alcohol dependence. Psychiat. Clin. Neuros.

65: 213-225

55. Klein RL, Harris RA (1996) Regulation of GABAA receptor structure and function by

chronic drug treatments in vivo and with stably transfected cells. Jpn. J. Pharmacol.

70: 1-15

56. Klempan TA, Sequeira A, Canetti L et. al. (2009) Altered expression of genes inolved

in ATP biosynthesis and GABAergic neurotransmission in the ventral preforntal

cortex of suicides with and whithout major depresion. Mol. Psychiatr. 14: 175-189

57. Köhne MD (2008) Approach to the genetics of alcoholism: A review based on

pathophysiology, Biochem. Pharmacol. 75: 160-177

58. Korpi ER (1994) Role of GABAA receptor sin actions of alcohol and aloholism: recent

advances. Alcoholi. 29: 115-129

59. Korpi ER, Gründer G, Lüddens H (2002) Drug interactions at GABAA receptors.

Progr. Neurobiol. 67: 113-159

60. Kumar S, Fleming RL, Morrow AL (2004) Ethanol egulation of gamma-aminobutryc

acid A receptors: genomic and nongenomic mechanisms. Pharmacol. Ther. 101: 211-

226

61. Kumar S, Kralic JE, O'Buckley TK et. al. (2003) Chronic ethanol consumption

enhances internalization of α1 subunit-containing GABAA receptors in cerebral cortex.

J. Neurochem. 86: 700-708

62. Kutyavin IV, Lukhtanov EA, Gamper HB et. al. (1997) Oligonucleotides with

conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base composition and backbone effects

on hybrifization. Nucleic. Acids. Res. 25: 3718-3723

50

63. Lakowicz JR (1983) Energy transfer. In principles of fluorescent spectroscopy. New

York, Plenum Press. 303-339

64. Lappalainen J, Krupitsky E, Remizov M et. al. (2005) Association between alcoholism

and gamma-amino butyric acid alpha2 receptor subtype in a Russian population.

Alcohol. Clin. Exp. Res. 29: 493–4 98

65. Le Strat Y, Ramoz N, Schumann G et. al. (2008) Molecular genetics of alcohol

dependence and related endophenotypes. Curr. Genomics. 9: 444–451

66. Lee LG, Connell CR, Bloch W (1993) Allelic discrimination by nick-translation PCR

with fluorogenic probes. Nucleic. Acids Res. 21: 3761-3716

67. Lee W, Price A, Rayner L et. al. (2009) Survey of doctors' opinions of the legalisation

of physician assisted suicide. BMC Medical. Ethics. 10: 2

68. Lind PA, Macgregor S, Agrawal A et. al. (2008) The role of GABRA2 in alcohol

dependence, smoking and illicit drug use in an Australian population sample. Alcohol.

Clin. Exp. Res. 32: 1721-1731

69. Lobo IA, Harris RA (2008) GABAA receptors and alcohol. Pharmac. Biochem.

Behavior. 90: 90-94

70. Long JC, Knowler WC, Hanson RL et. al. (1998) Evidence for genetic linkage to

alcohol dependence on chromosomes 4 and 11 from an autosome-wide scan in an

American Indian population. Am. J. Med. Genet. 81: 216-21

71. Matthews DB, Devaud LL, Fritschy JM et. al. (1998): Differential regulation of

GABA(A) receptor gene expression by ethanol in the rat hippocampus versus cerebral

cortex. J. Neurochem. 70: 1160 –1166

72. McGue M (1999). Phenotyping alcoholism. Alcohol. Clin. Exp. Res. 23: 757-758

73. McKernan RM, Whiting PJ (1996) Which GABAA-receptor subtypes really occur in

the brain. Trends. Neurosci. 19: 139-143

74. Merali Z, Lisheng D, Hrdina P et. al. (2004) Dysregulation in the suicide brain:

mRNA expression of corticotropin-releasing hormone receptors and GABAA receptor

subunits in frontal cortical brain region. J. Neurosc. 24: 1478-1485

75. Mhatre MC, Pena G, Sieghart W et. al. (1993) Antibodies specific for GABAA

receptor α subunits reveal that chronic alcohol treatment down-regulates α-subunit

expression in rat brain regions. J. Neurochem. 61: 1620-1625

76. Mhatre M, Ticku MK (1994) Chronic ethanol treatment upregulates the GABA

receptor β subunit expression. Mol. Brain. Res. 23: 246-252

51

77. Mhatre MC, Mehta AK, Ticku MK (1988) Chronic ethanol administration increases

the binding of the benzodiatepine inverse agonist and alcohol antagonist [3H]Ro 15-

4513 in rat brain. Eur. J. Pharmacol 153: 141-145

78. Mhatre MC, Ticku MK (1992) Chronic ethanol administration alters γ-aminobutyric

acidA receptor gene expression. Mol. Pharmacol. 42: 415-422

79. Montpied P, Morrow AL, Karanian JW et. al. (1991) Prolonged ethanol inhalation

decreases γ-aminobutyric acidA receptor α subunit mRNAs in the rat cerebral cortex.

Mol. Pharmacol. 39: 157-63

80. Morrow AL, Suzdak PD, Karanian JW et. al. (1988) Chronic ethanol administration

alters γ-aminobutyric acid, pentobarbital and ethanol-mediated 36

Cl- uptake in cerebral

cortical synaptoneurosomes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 246:158-164

81. Nayeem N, Green TP, Martin IL et. al. (1994) Quaternary structure of the native

GABAA receptor determinated by electron microscopic image analysis. J. Neurochem.

62: 825-818

82. Negro M, Chinchetru MA, Fernández-López A et. al. (1992) Effect of chronic ethanol

treatment on the γ-aminobutyric acid-mediated enhancement of [3H]flunitrazepam

binding in rat cortex and hippocampus. J. Neurochem. 58: 1916-1922

83. Onori N, Turchi C, Solito G et. al. (2010) GABRA2 and alcohol use disorders: no

evidence of an association in an Italian case-control study. Alcohol Clin. Exp. Res. 34:

659-68

84. Oroszi G, Goldman D (2004) Alcoholism: genes and mechanisms.Pharmacogenomics.

5: 1037-1048

85. Pierucci-Lagha A, Covault J, Feinn R et al. (2005): GABRA2 alleles moderate the

subjective effects of alcohol, which are attenuated by finasteride.

Neuropsychopharmacol. 30: 1193 –1203

86. Pirker S, Schwarzer C, Wieselthaler A et. al. (2000) GABAA receptors:

immunocytochemical distribution of 13 subunits in the adult rat brain. Neuroscience.

101: 815-850

87. Poulter MO, Du L, Weaver IC et al. (2008) GABAA receptor promoter

hypermethylation in suicide brain: Implications for the involvement of epigenetic

processes. Biol. Psychiat. 64: 645-652

88. Poulter MO, Du L, Zhurov V et. al. (2010). Altered organization of GABAA receptor

mRNA expression in the depressed suicide brain. Front. Mol. Neurosci. 3: 1-10

52

89. Rangaswamy M, Porjesz B (2008) Uncovering genes for cignitive (dys)function and

predisposition for alcoholism spectrum disorders: A review of human brain

oscillations as effective endophenotypes. Brain. Res. 1235: 153-71

90. Rastogi SK, Thyagarajan R, Clothier J et. al. (1986) Effect of chronic treatment of

ethanol on benzodiazepine and picrotoxin sites on the GABA receptor complex in

regions of the brain of the rat. Neuropharmacol. 25: 1179-1184.

91. Ray LA, Hutchinson KE (2009) Associations among GABRG1, level of response to

alcohol, and drinking behaviors. Alcohol. Clin. Exp. Res. 33: 1382–1390

92. Reich T, Edenberg HJ, Goate A et al (1998) Genome-wide search for genes affecting

the risk for alcohol dependence. Am. J. Med. Genet. 81: 207–215.

93. Roh S et al. (2011) Role of GABRA2 in moderating subjective responses to alcohol.

Alcohol. Clin. Exp. Res. 35: 400-407.

94. Sieghart W (1995) Structure and pharmacology of γ-aminobutyric acidA receptor

subtypes. Pharmacol. Rev. 47: 181-234

95. Soyka M, Preuss UW, Hesselbrock V et. al. (2008) GABA-A2 receptor subunit gene

(GABRA2) polymorphisms and risk for alcohol dependence. J. Psychiatr. Res. 42:

184 –191

96. Steiger JL, Russej SJ (2004) GABAA receptors: building the bridge between subunit

mRNAs, their promoters, and cognate transcription factors. Pharmacol. Ther. 101:

259-281

97. Sundstrom-Poromaa I, Smith DH, Gong QH et. al. (2002) Hormonally regulated α4β2δ

GABAA receptors are a target for alcohol. Nat. Neurosci. 5: 721-722

98. Suzdak PD, Glowa JR, Crawley JN et. al. (1986) A selective imidazobenzodiazepine

antagonist of ethanol in the rat. Science. 234: 1243-1247

99. TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol (2006) Applied Biosystems, 1-50

100. Unwin N (1989) The structure of ion channels in membranes of excitabile cells.

Neuron. 3: 665-676

101. Valenzuela CF (1997) Alcohol and neurotransmitter interactions Alcohol Health Res.

W. 21: 144-148.

102. Wallner M, Hanchar HJ, Olsen RW (2003) Ethanol enhances alpha α4β3δ and α6β3δ

gamma-aminobutyric acid type A receptors at low concentrations known to affect

humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 15218-15223