DIGESTIVNI SISTEM digestija-varenje

GASTROINTESTINALNI SISTEM (Želudac, creva)

Digestivni sistem

Digestivni sistem - funkcija

• Unos hrane (organske, neorganske materije)

vode i elektrolita

• Prerada – varenje (digestija) hrane

• Resorpcija svarene hrane, vitamina, vode, i

elektrolita

• Izlučivanje nesvarenih materija i produkata

koje jetra putem žuči uklanja iz organizma

Digestivni sistem

Žljezde

– čiji se sekreti ulivaju u digestivni tubus

• Pljuvačne (glandule salivatorie)

• Jetra (hepar)

• Gušterača (pancreas)

Mišićni sloj

Spontana i kontinuirana električna aktivnost (Ca2+, kalcijumsko - natrijumski kanali), koja

rezultira

• Toničkim kontrakcijama; kontinuirane

• Ritmičkim kontrakcijama, svaki deo ima svoju

frekvencu ( 3/min u želucu,12/min u duodenumu, 8-9/min u ileumu)

Sudovi mukoze tankog creva

Inervacija digestivnog tubusa

Parasimpaticus

vagus (X kranijalni) i

sakralna postganglijska vlakna

– Vagus: jednjak, želudac, pankreas i prva polovina debelog creva

– Sakrlani parasimpaticus: sigma, rectum i analna regija

• Stimulacija parasimpatikusa → aktivacija enteričkog plaksusa (povećanje motorike i sekrecije)

Inervacija digestivnog tubusa

Simpaticus

postganglijska vlakna od Th5 - L2

Inerviše sve delove GIT (manje one blizu usne duplje i anusa)

• Inhibicija enteričkog sistema, i direktna inhibicija aktivnosti digestivnog

sistema adrenalinom

VARENJE (DIGESTIJA) HRANE

Osnovna funkcija digestivnog sistema

unos i korišćenje hranljivih supstanci, vitamina, minerala i vode

Varenje (digestija) hrane

Varenje (digestija) hrane

Varenjem se hranljive materije

fizičkim

i hemijskim uticajima

razlažu na proste i rastvorljive oblike

pogodne za apsorpciju

Varenje

Fizička dejstva

žvakanje

kvašenje

mešanje Otapanje

gutanje

maceracija

peristaltika i eliminacija nesvarenih ostataka

Varenje

Hemijska dejstva

hemijsko razlaganje uz pomoć

enzima

HCl

žučnih soli

Varenje

Tanko crevo je

glavni deo

u kome se vrši digestija

i apsorpcija

Varenje

Usta: stvaranje bolusa

Sitnjenje hrane,

mešanje sa pljuvačkom

koja osim sluzi sadrži i ptijalin (alfa-amilaza),

kad hrana ostane dovoljno dugo u ustima

započinje razlaganje skroba na maltozu

Varenje

Ždrelo

gutanje

refleksna radnja

Jednjak

transport hrane u želudac

peristaltičkim pokretima

Varenje

Želudac

Mišićni sloj želudca ima tri sloja Pravi, cirkularni i kosi

mešanje hrane i sokova stvaranje himusa

transport himusa

kroz pilorički sfinkter u tanko crevo.

Varenje

Želudac

Deponovanje hrane

u obliku koncentričnih krugova

Lučenje

– HCl - parijetalne ćelije

– Pepsinogena - glavne ćelije

– Mukusa - ćelije mukoze

Varenje

Želudac

HCl

pretvara pepsinogen u pepsin

uništava mikroorganizme (pH 1-2),

pretvara tro- u dvovalentno gvoždje. pepsin

razlaže belančevine na polipeptide.

Mukus kvasi i otapa

Varenje

Faze lučenja želudačnog soka

Cefalička

Gastrička faza

Intestinalna faza

Faze lučenja želudačnog soka

Cefalička

Miris, pomisao na hranu→aktivacija

parasimpatikusa →aktivacija enteričkog n.sistema →oslobađanje acetil holina →lučenje gastrina i histamina (gastrične ćelije) →aktiviraju receptore parijetalnih ćelija → lučenje HCl.

H+ aktivnim transportom H+/K+-ATP-aza,

joni Cl-olakšanom difuzijom.

Lučenje želudačnog soka

Gastrička faza

hrana u želudcu→rastezanje zidova → sekrecija gastrina → sekrecija HCl → aktivacija pepsinogena u pepsin →

razlaganje belančevina na PEPTIDE → povećanje pH → stimulacija sekrecije HCl.

Lučenje želudačnog soka

Intestinalna faza

kiselost, rastezanje zida tankog creva,

hipertoničnost sadržaja creva → aktivacija

refleksa tankog creva

koji INHIBIŠE lučenje želudačnih sokova

Lučenje želudačnog soka

regulacija

Uspostavljanje balansa između sekretorne funkcije želudca

i digestivne i apsorptivne sposobnosti tankog

creva

(Intestinalna faza)

Inhibicija lučenja želudačnih sokova u Intestinalnoj fazi

1. putem kratkih i dugih enteričnih REFLEKSNIH

lukova

Kratki - enterički n.sistem

Dugi - vagus

2. INTESTINALNI HORMON i: enterogastrini

Sekretin, holecistokinin i dr.

Varenje u tankom crevu

Varenje se upotpunjuje u

tankom crevu, a krajnji produkti

se apsorbuju

Varenje u tankom crevu

Ugljeni hidrati do

Monosaharida

(glukoza, fruktoza i galaktoza)

Belančevine do

aminokiselina

Masti do

glicerola i masnih kiselina

Varenje u tankom crevu

• U lumen tankog crevа se sekretuje oko 1500ml

tečnosti dnevno, mešovit sekret, voda sluz i elektroliti

• Na+ HCO3- i Cl- sekretuju trepljaste ćelije, za

njima se kreće voda

• Himus u tankom crevu svojom osmolarnošću stimuliše dalju sekreciju

Varenje u tankom crevu

• Egzokrine ćelije crevnih resica luče:

peptidaze, saharazu, izomaltazu, laktazu,

crevnu amilazu i crevnu lipazu).

• pH crevnog soka 6.5 - 7.5

• Regulacija lučenja: lokalni nadražaj i hormoni digestivnog trakta (sekretin...)

jetra

U varenju

učestvuje njen sekret ŽUČ

Lučenje žuči stimuliše

Holecistokinin

(hormon duodenuma)

Žuč

Žučne soli emulguju trigliceride

Holesterol zajedno sa fosfolipidima

pomaže žučnim solima (uloga

deterđženta).

žučne kiseline se reapsorbuju u distalnom delu ileuma

Žuč

Žučne boje

Degradacioni produkti hemoglobina,

ekskret boji crevni sadržaj Bikarbonatni joni

neutrališe pH (dospelog himusa)

Krajnji produkti metabolizma i štetne materije (metali)

JETRA

Laborarorija organizma

Funkcije jetre

• U metabolizmu

• U hemostazi

• U endokrinom sistemu

F.Jetre u metabolizmu

Pretvaranje glikoze u glikogen

S glikoneogeneza

Sinteza lipoproteina

R Aminokiselina u masne kiseline

Sinteza uree, krajnjeg produkta

katabolizma belančevina

F.Jetre u hemostazi

Sinteza faktora koagulacije

Protrombin, fibrinogen

apsorpcija (žuč) K vitamina

F.Jetre u endokrinom sistemu

Sinteza faktora rasta sličanog insulinu (pod

dejstvom hormona rasta)

Stvara trijod tironin iz tiroksina

Sintetizuje angiotenzinogen

Sintetizuje citokine

Učestvuje u aktivaciji D vitamina

Pankreas

Egzokrini deo

Endokrini deo

Egzokrini deo pankreasa

Enzimi koji vare sve tri vrste hranljivih

materija

Bikarbonati (neutralizacija himusa)

Stimulacija sekrecije pankreasnog soka

sekretin i holecistokinin

Egzokrini deo pankreasa

Pankreasna amilaza

skrob→maltoza

Pankreasna lipaza

EMULGOVANE masti → glicerol i masne kiseline

Tripsinogen se aktivira u duodenumu (enterokinaza i već stvoreni tripsin)

u tripsin

polipeptide → aminokiseline

Apsorpcija

Apsorpcija

• Najveći deo apsorpcije u TANKOM CREVU

• Prstoliki nabori mukoze - vili

• Ćelije sa membranskim produžecima-

mikrovili→ ogromna apsorpciona povšina

Apsorpcija

monosaharida,

aminokiselina,

katjona i

hidrosolubilnih vitamina (C i B)

u krvne sudove vila (resica).

Transportuju se u jetru (portni krvotok)

pa u sistemski krvotok.

Apsorpcija

masnih kiselina i

liposolubilnih vitamina (A, D, E, K)

u limfne sudove vila

po apsorpciji m. kiseline se spajaju sa glicerolom

u trigliceride, zajedno sa holesterolom i

proteinima→ hilomikroni. Transportuju se u srce.

Crevne resice-vili

Mehanizmi apsorpcije

• Monosaharidi, aminokiseline, katjoni i

hidrosolubilni vitamini se apsorbuju

AKTIVNIM TRANSPORTOM i

KOTRANSPORTOM

• Voda - OSMOZOM

• Monogliceridi i masne kiseline

DIFUZIJOM

Mehanizmi apsorpcije

Specijalizovana apsorpcija

• vitamina B12 uz pomoć nosača-unutrašnjeg faktora koga luči sluzokoža želudca;

• kalcijuma uz pomoć parathormona

Apsorpcija u debelom crevu

1. APSORPCIJA VODE I NEORGANSKIH SOLI

2. sinteza K vitamina uz pomoć normalne bakterijske flore.

F.Debelog creva

U debelom crevu nema varenja

Mukoza nema resice, luči mukus-sluz

Eliminacija fecesa

Unutrašnji analni sfinkter (glatki mišić) Spoljašnji sfinkter- skeletni mišić

EIKOSANOIDIEIKOSANOIDI

��PROSTAGLANDINIPROSTAGLANDINI

��LEUKOTRIENILEUKOTRIENI

��TROMBOKSANTROMBOKSAN

Eikosanoide produkuju skoro sve ćelije. U ćeliji se ne akumuliraju

već se po sintezi iz nje i sekretuju. Njihovo dejstvo je uglavnom

l k l ć lij k j ih i di ( t k i ) i j j dlokalno, na samu ćeliju koja ih proizvodi (autokrino) i njoj susedne

ćelije (parakrino).

U eikosanoide spadaju prostaglandini, tromboksani i leukotrijeni.

Najčešći izvor iz koga se sintetišu eikosanoidi je arahidonska

kiselina (eikoza tetra-enoična kiselina).

Arahidonska kiselina

To je esencijalna, polinezasićena masna kiselina sa 20C atoma i 4

dvostruke veze. Prisutna je u lipidima ćelijske membrane i iz lipidnog

dvosloja se odlobađa aktivacijom membranski vezanih enzima-j j

fosfolipaze A2 ili fosfolipaze C.

Oslobađanje arahidonske kiseline iz Oslobađanje arahidonske kiseline iz

membranskih lipidamembranskih lipidaAktivacija ovih enzimaAktivacija ovih enzima

nastaje kao odgovor na

odgovarajući stimulus-

histamin ili citokin;

agonisti koji se vezuju za

odgovarajući receptor nastimulus

vezivanje

fosfatidilholin Ćelijska

Fosfatidilinozitol

bisfosfat

Receptor

odgovarajući receptor na

plazma membrani

Fosfolipaza A2

Ca++1 2 Diacilglicerol

Fosfolipaza C

Ćelijska

membrana

bisfosfat

Fosfolipaza C katališe

Arahidonska

kiselina

A hid k Monoacilglicerol

DAG lipaza

1,2 Diacilglicerolhidrolizu fosfatidil-

inozitol 4,5-bisfosfata

pri čemu nastaje

diacilglicerol (DAG) ili

inozitol 1 4 5-trifosfatArahidonska

kiselina

Monoacilglicerol

Monoacilglicerol

lipaza

Fosfolipaza A2 katališe

raskidanje estarske

veze između OH grupe

glicerola i arahidonske

inozitol 1,4,5-trifosfat

(IP3). IP3 sadrži

arahidonsku kiselinu

koja se oslobađa

dejstvom

Arahidonska

kiselinakiseline u položaju 2

fosfoacilglicerola

odgovarajućih lipaza

Hrana(esencijalne masne

kiseline)

Linoleat

Pregled metabolizma Pregled metabolizma

eikosanoidaeikosanoida

Arahidonska kiselinaNjihov najznačajniji prekursor

koji se unosi hranom je

LINOLEINSKA kiselina. Membranski

fosfolipid

Fosfolipaza A2

U jetri se, delimično, procesima

elongacije i desaturacije, ona

prevodi u arahidonsku kiselinu.

- glukokortikoidi

Arahidonska kiselina

Epoksidi

lipooksigenaza

Eikosanoidi nastaju iz masnih

kiselina koje se oslobađaju iz

membranskih fosfolipida Arahidonska kiselinalipooksigenaza

Leikotrieni

Ciklooksigenaza

- aspirin i drugi nesteroidni

antiinflamatorni lekovi

membranskih fosfolipida.

Tromboksani

Antiinflamatorni steroidi-

glukokortikoidi-

Prostaglandini

Indukuju sintezu proteina

koji deluju inhibitorno na

fosfolipazu A2

Pošto se arahidonska kiselina odlobodi u citosol, ona se prevodi u

eikosanoide dejstvom enzima čija aktivnost varira u različitim

tkivima. To objašnjava zašto neke ćelije, npr ćelije vaskularnog

d t l i t tiš t l di E2 i I2 (PGE2 i PGI2) d kendotela, sintetišu prostaglandine E2 i I2 (PGE2 i PGI2) dok

trombociti sintetišu uglavnom tromboksan A2 (TXA2) i 12-

hidroksieikozatetraenoičnu kiselinu (12-HETE).

Tri glavna puta metabolizma arahidonske kiseline su prisutna u

različitim tkivima.

U citoplazmi se arahidonska kiselina prevodi u eikosanoide i to:

1. CIKLOOKSIGENAZNIM PUTEM- u prostaglandine i tromboksane

2 LIPOOKSIGENAZNIM PUTEM l k t ij hid k i ik2. LIPOOKSIGENAZNIM PUTEM- u leukotrijene, hidroksieikoza-

tetraenoičnu kiselinu (HETE) i lipoksine

3. Pomoću CITOHROMA P450- u epokside, HETE i diHETE

Metabolički putevi arahidonskeMetabolički putevi arahidonskeMetabolički putevi arahidonske Metabolički putevi arahidonske

kiselinekiseline

Arahidonska kiselina

Citohrom P450ciklooksigenaza

lipooksigenaza

Citohrom P450

PGG2 HPETE Epoksidi

Prostaglandini Tromboksani Leukotrijeni HETE Lipoksini Di HETE HETE

SINTEZA PROSTAGLANDINA I SINTEZA PROSTAGLANDINA I

TROMBOKSANATROMBOKSANATROMBOKSANATROMBOKSANA

Inkorporira četiri atoma kiseonikaInkorporira četiri atoma kiseonika

i formira interni petočlani prsteni formira interni petočlani prsten

Sinteza prostaglandina i tromboksana iz Sinteza prostaglandina i tromboksana iz

arahidonske kiselinearahidonske kiseline

Arahidonska

kiselina

ciklooksigenazaciklooksigenaza

peroksidaza

PGD

TXA sintazaPGI

sintaza

PGE

sintaza

PGD

sintaza

reduktaza

Prostaciklin PGI2

Nastaje u vaskularnom

Tromboksan TXA2

Nastaje u trombocitimaNastaje u vaskularnom

endotelu

Inhibira agregaciju trombocita

Dovodi do vazodilatacije

astaje u t o boc t a

Stimuliše agregaciju trombocita

Dovodi do vazokonstrikcije

Struktura biološki aktivnog prostaglandinaStruktura biološki aktivnog prostaglandina

Jedinjenje ima 20 C atoma,

COOH

C atomi na poziciji 8-12 formiraju petočlani

prsten koji je supstituisan (najčešće sa OH ili

keto grupom) na poziciji C9 (X) ili C11 (Y).

sa COOH grupom na

poziciji 1.

C atom u poziciji 15 sadrži OH grupu, dok

se trans dvostruka veza nalazi između C13

i C14.Dvostruke veze takođe mogu da

budu prisutne između C5 i C6 kao i

između C17 i C18.

Poluživot eikosanoida je kratakPoluživot eikosanoida je kratak--nekoliko sekundi nekoliko sekundi

do minutado minutado minutado minuta

Inaktivacija prostaglandina

Oredukcijom

oksidacijom OH grupe

na poziciji C15dvostruke veze

između C13 i C14.

Posle redukcije dvostruke veze linearan deo molekulaPosle redukcije dvostruke veze, linearan deo molekula

ulazi u β i ω oksidaciju pri čemu nastaju dikarboksilne

kiseline koje se ekskretuju urinom.

ProstaglandiProstaglandini serije 1ni serije 1-- 22-- ili 3ili 3-- i njihovi i njihovi

prekursoriprekursori

Broj u subskriptu označavaPrekursor

ω 6

8,11,14-

Eikozatrienoična

kiselina

pp

Broj u subskriptu označava

broj dvogubih veza u van-

prstenastom delu molekula

prostaglandina.

ω 6

Trans dvoguba veza se

nalazi na poziciji 13, a cis

na poziciji 5 i 17.

Arahidonska

kiselinaPrekursor

ω 6

Serija 1

Hidroksilna grupa na

poziciji 15 je neophodna za

biološku aktivnost.

Prekursor

ω 3

Eikozapentaenoi

čna kiselina Serija 2

Serija 3

Struktura aktivnog TromboksanaStruktura aktivnog Tromboksanagg

Za razliku od prostaglandina koji sadrže 5C prsten, tromboksan u svojoj

strukturi ima 6C prsten koji sadrži atom kiseonika. Supstituenti su vezani za C

atome koji ulaze u strukturu prstena, C9 i C11. j p ,

U strukturi TXA2, atom kiseonika povezuje C9 i C11.

Poluživot eikosanoida je kratakPoluživot eikosanoida je kratak--nekoliko nekoliko

sekundi do minutasekundi do minutasekundi do minutasekundi do minuta

Tromboksan A2 se inaktivira raskidanjem kiseoničnog mosta

između C9 i C11 pri čemu se na odgovarajućim pozicijama

formiraju dve OH grupe. Na ovaj način nastaje Tromboksan B2

koji nema biološk akti nostkoji nema biološku aktivnost

Eik idi č t j i i i fl tEikosanoidi učestvuju u mnogim procesima, pre svega u inflamatornom

odgovoru nakon infekcije ili povrede. Inflamatorni odgovor predstavlja

napor organizma da popravi nastalo oštećenje:

�Kontrola krvarenja formiranjem krvnog ugruška�Kontrola krvarenja formiranjem krvnog ugruška

�Bol, crvenilo i temperatura

�Eikosanoidi regulišu kontrakciju glatkih mišićag j g

�Takođe, eikosanoidi učestvuju u regulaciji kontrakcije glatkih mišića

(digestivni trakt i uterus). Utiču i na promet vode i Na+ u bubrezima čime

učestvuju u regulaciji krvnog pritiska.

�Učestvuju u regulaciji bronhokonstrikcije i bronhodilatacije

Nesteroidni antiinflamatorni lekovi (npr acetilsalicilna kiselina) inhibiraju

ciklooksigenazu i tako smanjuju simptome upale.

Poznata su dva izoenzima ciklooksigenaze COX-1 i COX-2. COX-

1 se smatra konstitutivnom formom koja je široko rasprostranjena u

skoro svim tkivima i uključena je u sintezu PG i TX za normalnu

fiziološku funkciju. COX-2 je inducibilna forma koja je regulisana

citokinima, faktorima rasta. U fiziološkom stanju, iRNK za COX-2 je

l b k i i li t k ij ć t kslabo eksprimirana, ali se ta ekspresija povećava u toku

inflamatornog procesa.

Nesteroidni antiinflamatorni lekovi uglavnom deluju na oba COXNesteroidni antiinflamatorni lekovi uglavnom deluju na oba COX

izoenzima.

Povoljno je imati selektivan inhibitor COX-2, koji bi delovao kao

antiinflamatorni lek bez neželjenih gastrointestinalnih efekata iantiinflamatorni lek bez neželjenih gastrointestinalnih efekata i

poremećaja aktivnosti trombocita (smatra se nastaju kao rezultata

aktivnosti COX-1). Ovakav selektivni inhibitor je Celebrex

Delovanje aspirina i drugih nesteroidnih Delovanje aspirina i drugih nesteroidnih

antiinflamatornih lekovaantiinflamatornih lekova

Acetilsalicilna kiselina

(aspirin)Aspirin ireverzibilno

inhibira ciklooksigenazuinhibira ciklooksigenazu

acetilacijom enzima.

Aktivna

ciklooksigenazaNeaktivna

ciklooksigenaza

Salicilat

Acetaminofen

Drugi nesteroidni

antiinflamatorni lekovi

(acetaminofen, ibuprofen)

deluju kao reverzibilni

i hibi i ikl k i

Ibuprofen

inhibitori ciklooksigenaze

LIPOOKSIGENAZNI PUTLIPOOKSIGENAZNI PUT

Aktivnost lipooksigenaza u nastankuAktivnost lipooksigenaza u nastankuAktivnost lipooksigenaza u nastanku Aktivnost lipooksigenaza u nastanku

HPETE i HETEHPETE i HETE

Arahidonska kiselina

Lipooksigenaze dodaju

hidroperoksi grupu na poziciju

5, 12 ili 15 uz rearanžiranje

dvogubih veza.

5-lipooksigenaza

12-lipooksigenaza

15-lipooksigenaza

HPETE su nestabilni i

brzo se redukuju u

stabilnije HETE ili se

d l k t ij iprevode u leukotrijene i

lipoksine

Natanak leukotriena i njihovih glutation Natanak leukotriena i njihovih glutation

d i td i t

Arahidonska kiselina

derivataderivata

5-lipooksigenaza

Glutamat

Glicin

Nastanak lipoksinaNastanak lipoksina

15- lipooksigenaza

Arahidonska kiselina

Lipoksini nastaju aktivnošću 15- p g

5- lipooksigenaza

Lipoksini nastaju aktivnošću 15-

lipoksigenase i 5-lipooksigenase

na arahidonsku kiselinu.

RedukcijeU seriji redukcija ovako

nastalih hidroperoksi grupa

nastaju trihidroksilni derivati

arahidonske kiseline-arahidonske kiseline

lipoksini.

Lipoksin A4

Ova jedinjenja imaju 3

OH grupe

Lipoksini indukuju

hemotaksu i stimulišu

produkciju Lipoksin A4

(LXA4)

p j

superoksidnog anjona

u leukocitima.

Jedinjenja koja nastaju iz arahidonske Jedinjenja koja nastaju iz arahidonske

kiseline aktivnošću Citohroma P450kiseline aktivnošću Citohroma P450kiseline aktivnošću Citohroma P450kiseline aktivnošću Citohroma P450

Treći mehanizam oksigenacije

arahidonske kiseline uključuje citohrom

Epoksid

(5,6- EET)

P450. Aktivnost monooksigenaze ovog

mikrozomalnog sistema dovodi do sinteze

epoksida, HETE i diHETE.

Biološka aktivnost ovih jedinjenja obuhvata

aktivnost na očni, vaskularni, endokrini i

bubrežni sistem. Neki od efekata nastaju

k lt t i hibi ij N /K ATP

Dihidroksid

(5 6- di HETE)

kao rezultat inhibicije Na/K ATP-aze.

Fiziološka uloga ovih jedinjenja još uvek

nije u potpunosti okarakterisana i

definisana. (5,6- di HETE)

EFEKTI EIKOSANOIDAEFEKTI EIKOSANOIDA

S j f kt ik idi t j i j tSvoje efekte eikosanoidi ostvaruju vezivanjem za receptor na

plazma membrani:

�PGE, PGD i PGI2 (prostaciklin)- sistem adenilat ciklaze i

cAMP

�PGF2α, tromboksan A2 i leukotrieni- porast koncentracije

Ca++ u citosolu ciljne ćelijej j

EIKOSANOIDEIKOSANOID PovećavaPovećava SmanjujeSmanjuje

PGI2 PGE2 PGD2 Vazodilataciju nivo cAMP Agregaciju Tro LeuPGI2, PGE2, PGD2 Vazodilataciju, nivo cAMP Agregaciju Tro, Leu,

migraciju limfocita,

proliferaciju T ćelija

PGFα2 Vazokonstrokciju

Bronhokonstrikciju

Kontrakciju glatkih mišića

TXA2 Vazokonstrikciju

Bronhokonstrikciju

Agregaciju Tro

Proliferaciju limfocitaProliferaciju limfocita

LTB4 Permeabilnost krvnog suda

Proliferaciju T ćelija

Agregaciju limfocitaAgregaciju limfocita

Koncentraciju IFN- γ , IL-1,

IL-2

LTC4, LTD4 Permeabilnost krvnog suda4 4 g

Bronhokonstrikciju

Koncentraciju IFN- γ

Sinteza izoprostanaSinteza izoprostana

Izoprostani nastaju iz arahidosnke kiseline procesom lipidne peroksidacije,

koju iniciraju slobodni kiseonični radikali.

Ne postoji enzimski mehanizam kojim oni mogu da budu sintetisaniNe postoji enzimski mehanizam kojim oni mogu da budu sintetisani.

Arahidonska kiselina, kao komponenta fosfolipida u ćelijskoj membrani

postaje supstrat za oštećenje slobodnim kiseoničnim radikalima i tada

fosfolipaza A2 uklanja izmenjeni eikozanoid iz fosfolipida i oslobađa ga ufosfolipaza A2 uklanja izmenjeni eikozanoid iz fosfolipida i oslobađa ga u

cirkulaciju.

Nivo izoprostana u urinu se može koristiti kao biohemijski pokazateljNivo izoprostana u urinu se može koristiti kao biohemijski pokazatelj

oksidativnog stresa pacijenata i pouzdan je biološki parametar kojim se prati

nivo oksidativnog stresa kod različitih poremećaja.

Nastanak izoprostana

Oštećenjem slobodnim j

kiseoničnim radikalima

arahidonske kiseline na

poziciji 2 fosfolipida, nastaje

izoprostan koji se zatimizoprostan koji se zatim

oslobađa iz fosoflipida

delovanjem fosfolipaze A2.

HORMONIHORMONIHORMONI HORMONI

GASTROINTESTINALNOG GASTROINTESTINALNOG

TRAKTATRAKTATRAKTATRAKTA

Svi su polipeptidi

Mogu imati neurokrino, endokrino i parakrino dejstvo

Neurokrino-lokalni neuromodulatori i neurotransmiteri

Ćelije koje ih sintetišu i sekretuju su rasute po GIT-u

(nisu lokalizovane)(nisu lokalizovane)

RASPODELARASPODELA

Gastrin- G ćelije (antrum želudca)

Holecistokinin- J ćelije (duodenumm jejunum)

Sekretin- S ćelije (duodenumm jejunum)

G (G ) ć ( )Gastrointestinalni peptid (GIP)- K ćelije (tanko crevo)

Vazointestinalni peptid (VIP)- D ćelije (pankreas)

Motilin- EC2 ćelije (tanko crevo)Motilin EC2 ćelije (tanko crevo)

Supstanca P- EC1 ćelije (čitav GIT)

Enkefalini – (želudac i duodenum)

Somatostatin – D ćelije (želudac, duodenum, pankreas)

Samo sekretin ima jedan oblik ostali su prisutni u multiplim oblicimaSamo sekretin ima jedan oblik, ostali su prisutni u multiplim oblicima

ULOGAULOGA EFEKATEFEKATULOGAULOGA

Gastrin-endokrino, neurokrino

CCK endokrino neurokrino

Lučenje HCl i pepsina

Sekrecija amilaze iz pankreasa

EFEKATEFEKAT

CCK- endokrino, neurokrino

Sekretin- endokrino

GIP- endokrino

Sekrecija amilaze iz pankreasa

Lučenje HCO3 iz pankreasa

↑ glukozom izazvano lučenje insulina,

↓ lučenje HCl

R l k ij l tkih išić HCO3VIP- neurokrino

Motilin-endokrino

Somatostatin-neuro i parakrino

Relaksacija glatkih mišića, ↑HCO3

↑ pokretljivost creva

Inhibitorni efektiSomatostatin neuro i parakrino Inhibitorni efekti

MEHANIZAM DELOVANJAMEHANIZAM DELOVANJA

PIP2- Ach, CCK, gastrin, supstanca P

cAMP- sekretin, VIP

Receptori izolovani na acinusnim čelijama pankreasa:

1. Muskarinski

2. Gastrin, CCK

3. Bombezin i srodni peptidi

4 Supstranca P4. Supstranca P

5. Sekretin i VIP

6. Kolera toksin

SEKRETIN FAMILIJASEKRETIN FAMILIJA

1. SEKRETIN (27ak), S ćelije duodenuma. Pepti koji sadrži 4Arg i

1Hist-bazan peptid. Strukturno je sličan glukagonu, GIP i VIP. Za

stimulaciju HCO3 iz pankreasa (biološka aktivnost) je neophodno

svih 27 ak

G ( ) S2. GIP (43ak)- iz duodenuma i jejunuma. Stimuliše lučenje insulina,

smanjuje pokretljivost želuca i lučenje želudačnog soka

3. VIP (28ak)- uloga nije potpuno definisana. Ima ga u nervnim

š i b k l k k ih d Sti lišzavršecima submukoznog pleksusa, krvnih sudova. Stimuliše

sekreciju pankreasa i tankog creva, neurotransmiter u perifernom

autonomnom nervnom sistemu

VIP d ti li i ↓K+ ( l k ij l tk k l t k ihVIP-om: vodenasti prolivi, ↓K+. (relaksacija glatke muskulature krvnih

sudova; povećana sekrecija vode i elektrolita iz pankreasa)

4. GLUKAGON

GASTRIN HOLECISTOKININ FAMILIJAGASTRIN HOLECISTOKININ FAMILIJAGASTRIN HOLECISTOKININ FAMILIJAGASTRIN HOLECISTOKININ FAMILIJA

1. GASTRIN – g ĆELIJE ANTRUMA, DUODENUMA. Veoma heterogena

grupa Svaki od oblika postoji u sulfatisanom i nesulfatisanom oblikugrupa. Svaki od oblika postoji u sulfatisanom i nesulfatisanom obliku

G-17: lučenje želudačnog soka (negativna povratna sprega na antrum).

Lučenje pepsina, hipertrofija sluznice želudca. Za biološku aktivnost je

značajan COOH krajznačajan COOH kraj

2. Homologija između gastrina i CCK je izražena na C-terminalnom delu

(identično je 5ak); sulfatisani tirozin imaju i gastrin i CCK. Ovaj sulfatisani

tirozin i C terminalni kraj sa 7ak su neophodni za aktivnost CCKtirozin i C terminalni kraj sa 7ak su neophodni za aktivnost CCK

GASTRINOM- ↑HCl, ulkus

3. Ima najmanje 5 oblika CCK. Najzastupljeniji je CCK-8. Proizvode ga I ćelije

duodenuma i proksimalnog jejunuma. Njegovo lučenje stimulišu AK,

peptidi, masne kiseline. CCK izaziva kontrakciju želuca i lučenje enzima

pankreasa i kontrakciju ćučne kese

Supstranca P (11ak)- 5 ak sa C terminalnog kraja je neophodno za

biološku aktivnost Stimuliše kontrakciju glatkih mišića u crevu sprovodibiološku aktivnost. Stimuliše kontrakciju glatkih mišića u crevu, sprovodi

bol

M tili (22 k) l č j HCl i ti liš k t ktil t l tkMotilin (22ak)- lučenje HCl, pepsina, stimuliše kontraktilnost glatke

muskulature creva

Hormoni koji utiču na apetitj p

Grelin je peptidni hormon (28 amino kiselina) koji se stvara u ćelijama

sluzokože želuca. Deluje kao snažan stimulator apetita u kraćim

vremenskim intervalima (između obroka).

Receptori za grelin se nalaze u hipofizi (gde ostvaruju dejstvo naReceptori za grelin se nalaze u hipofizi (gde ostvaruju dejstvo na

oslobađanje hormona rasta) i Nc. arcuatus-u hipotalamusa (uticaj na

apetit) kao i u srčanom mišiću i masnom tkivu. Ovi membranski receptori

su vezani sa G proteinom.

Najveći pik lučenja grelina se javlja neposredno pred uzimanje obroka, a

ti l di št d d h k i j b kzatim sledi oštar pad odmah nakom uzimanja obroka.

Hormoni koji utiču na apetit

Leptin je protein (167 amino kiselina) koji se stvara u adipocitima ip j p ( ) j p

putem krvi dolazi do mozga gde, pre svega, deluje na receptore Nc.

Arcuatus-a hipotalamusa i utiče na smanjenje apetita. Takođe deluje

stimulativno na simpatički nervni sistem, povećava krvni pritisak, puls i

termogenezu tako što prekida spregu respiracije i fosforilacije u

mitohondrijama adipocitamitohondrijama adipocita.

Postoji 6 tipova membranskih receptora za leptin. U jedrima hipotalamu

sa je prisutna izoforma koja prenosi signal preko Jak-Stat i MAPK

signalnih puteva.

Hormoni koji utiču na apetit

PYY (34 amino kiseline) je hormon koji se luči od stranePYY (34 amino kiseline) je hormon koji se luči od strane

endokrinih ćelija sluzokože tankog i debelog creva, kao

odgovor na ulazak hrane iz želuca Nivo PYY u krvi rasteodgovor na ulazak hrane iz želuca. Nivo PYY u krvi raste

posle obroka i ostaje povišen tokom nekoliko sati. Putem

cirkulacije, PYY dospeva do Nc. Arcuatus-a hipotalamusaj , p p

gde delije na oreksigeničke neurone (neuroni koji stimulišu

apetit) inhibira oslobađanje neuropeptida Y (NPY) i

smanjuje osećaj gladi.

Neuroni Nc. Arcuatus

Oreksigenički- stimulišu apetit

stvaranjem i oslobađanjem NPY

A k i ički i i j titAnoreksigenički- suprimiraju apetit.

Proizvode α-MSH iz POMC.

Leptin i insulin iz masnog tkiva i

pankreasa deluju na anoreksigene

neurone i smanjuju apetit a

delovanjem na oreksigene neuronedelovanjem na oreksigene neurone

inhibiraju oslobađanje NPY čime

takođe redukuju apetit.

Grelin stimuliše apetit aktivirajućiGrelin stimuliše apetit aktivirajući

ćelije koje eksprimiraju NPY;

Svaki stimulus koji aktivira

oreksigene ćelije inaktiviraoreksigene ćelije inaktivira

anoreksigene i obrnuto.

METABOLIČKA AKTIVNOST JETRE

METABOLIZAM ETANOLA

Reaktivni kisikovi radikali

!1-

BIOHEMIJA VIDABIOHEMIJA VIDA

Svetlost prolazi kroz :

�Korneu

�Prednju očnu komoru koja je ispunjena očnom vodicom

�Sočivo

S kl l�Staklasto telo

�I dolazi do retine koja sadrži sistem za vizualizaciju

I suze i očna vodica su izoosmotske tečnosti koje sadrže soli, albumine, globuline, glukozu i druge komponente.

Uloga očne vodice je da snabdeva korneu i sočivo sa nutricijentima kao i da od njih uklanja njihove proizvode metabolizma.

KORNEA DOBIJA ATP ANAEROBNIM METABOLIZMOMMETABOLIZMOM

�Glavno gorivo oka je glukoza

�30% glukoze u kornei se iskoriti u procesu glikolize a 65% ulazi u

pentozofosfatni šant (najveća aktivnost od svih tkiva)p ( j )

�Izuzetno je visoka aktivnost GSH reduktaznog sistema (NADPH)-

zaštita od slobodnih radikala obzirom da je epitel kornee

permeabilan za kiseonik

SOČIVO JE IZGRAĐENO NAJVEĆIM DELOM OD VODE I PROTEINA

�Nema snabdevanja krvlju

�Proteini sočiva: α, β i γ - kristalini

�Ostali albuminoidi enzimi i transmembranski proteini se sintetišu u epitelu sočivaOstali albuminoidi, enzimi i transmembranski proteini se sintetišu u epitelu sočiva

�Ovi proteini moraju da se održavaju u nativnom obliku

�Veoma su osetljivi na promenu oks/red stanja, promenu osmolarnosti, povećanu

koncentraciju metabolita, UV zračenje...koncentraciju metabolita, UV zračenje...

�Održavanje integriteta strukture pomažu: Na/K ATP-aza, GSH reduktaza, sinteza

proteina

Glukoza:

85%- glikoliza

10% t f f t i š t10%- pentozofosfatni šant

3%- ciklus trikarboksilnih

kiselina (ćelije na periferiji)

METABOLIZAM SOČIVA

RETINA PROIZVODI ATP ANAEROBNOM GLIKOLIZOMGLIKOLIZOM

�Kao i sočivo i rezina zavisi od anaerobne glikolize ali za razliku od�Kao i sočivo, i rezina zavisi od anaerobne glikolize ali za razliku od

sočiva retina je prokrvljena međutim krvni sudovi se ne nalaze u

zonama koje su odgovorne za vizuelizaciju- fovea centralis

�I u štapićima i u čepićima se nalaze mitohondrije osim u njihovim�I u štapićima i u čepićima se nalaze mitohondrije osim u njihovim

spoljašnjim segmentima gde je lokalizovan vizuelni pigment

�NADH koji nastaje u glikolizi može da se iskoristi za redukciju

piruvata u laktat Laktat DH retine može da koristi i NADH i NADPHpiruvata u laktat. Laktat DH retine može da koristi i NADH i NADPH

PRENOS VIDNOG SIGNALA OBUHVATA FOTOHEMIJSKE, BIOHEMIJSKE I ELEKTRIČNE DOGAĐAJE

Kada svetlosni fotoni uđu u

oko i kada ih apsorbuju

fotoreceptori u spoljašnjem

segmentu čepića i štapića,

dolazi do izomerizacije

retinala iz 11-cis u 11-trans

oblik.

To dovodi do promene

konformacije proteina kao i

promene mirovnog

membranskog potencijalamembranskog potencijala

ćelije i stvaranja električnog

signala koji se putem očnog

nerva prenosi u mozak.

FOTORECEPTORSKE ĆELIJE- ŠTAPIĆI I ČEPIĆI

Ob ti d ž i l i i t d i�Oba tipa sadrže vizuelni pigment-rodopsin.

�Rodopsin je u štapićima crven i zelen dok je u čepićima plave boje

�Rodopsin je transmembranski protein za koji je vezana prostetična grupa-p j p j j p g p

11-cis-retinal (opsin ukoliko mu se ukloni prostetična grupa)

RODOPSINRODOPSIN

Protein koji ima 7 o e oj a

transmembranskih α-heliksa.

11-cis-retinal je preko

protonovane Shiffove baze p

vezan za lizin na 7. heliksu. On

se nalazi negde između dve

naspramne strane membrane.

RODOPSINRODOPSIN

Kriomikroskopija pokazuje da je o os op ja po a uje da je

veći deo heliksa perpendikularan u

odnosu na površinu membrane.

Nije poznato da li je ovakav j p j

aranžman u vezi sa

pozicioniranjem i vezivanjem 11-

cis-retinala.

Nastanak 11-cis-retinala i rodopsina iz β- karotena

11-cis-retinal nastaje iz vitA ili iz β-j βkarotena koji se unosi hranom. Oni se

transportuju pomoću specifičnih

transportnih prtoteina do odgovarajućeg

mestamesta.

Razlaganjem β-karotena nastaju dva

molekula all-trans retinola. U

pigmentisanim epitelnim ćelijama retinepigmentisanim epitelnim ćelijama retine

se nalazi enzim koji vrši izomerizaciju all-

trans u 11-cis retinol.

Oksidacija 11-cis-retinola u 11-cis-retinal iOksidacija 11-cis-retinola u 11-cis-retinal i

njegovo vezivanje za opsin se dešava u

spoljašnjem segmentu štapića.

Apsorpcioni spektar 11-cis-retinala i četiri vizuelna pigmentavizuelna pigmenta

P t ji j k iPostoji pomeraj maksimuma

apsorbance po vezivanju 11-cis

retinala za opsin i proteinsku

komponentu spoljašnjeg p p j j g

vizuelnog pigmenta.

Promena potencijala membrane štapića po izlaganju svetlostig j

Mirovni potencijal je oko -30mV

nasuprot -70mV kod neurona.

Ekcitacija štapića dovodi do

hiperpolarizacije membrane na

oko -35mV.

Potrebno je oko stotinak msek da

bi potencijal dostigao maksimum

hiperpolarizacije.

Brojni biohemijski događaji se

upravo dešavaju u ovom kratkom

vremenskom intervalu.

Aktivacija rodopsina pomoću svetlosti

I i ij l i d đ ji ijInicijalni događaji, apsorpcija

fotona svetlosti i posledična

izomerizacija 11-cis retinala su

veoma brzi- red veličine piko sek.p

Po tome, dolazi do serije promena

rodopsina, što dovodi do različitih

konformacionih oblika kratkog g

poluživota od kojih svaki ima

specifične apsorpcione

karakteristike.

Na kraju, rodopsin disosuje na

opsin i all-trans-retinal

Spoljašnji segment štapića

Pigmentirani epitel

Spoljašnji segment štapića

Kaskada biohemijskih događaja koja je uključena u proces vida (prevođenje energije svetlosti u nervni impuls)

Na+ kanali su ligand zavisni- u otvorenom stanju ih održava cGMP

Aktivni rodopsin (metarodopsin II) formira kompleks sa transducinom

Transducin je klasičan tip G proteina

Akti i bj di i T kti i f f di t k j hid li j GMPAktivirana subjedinica Tα aktivira fosfodiesterazu koja hidrolizuje cGMP

u GMP, čime se smanjuje broj otvorenih Na+ kanala i dolazi do

hiperpolarozacije

F f di t (PDE) j h t t t i t i k ji t ji dFosfodiesteraza (PDE) je heterotetramerni protein koji se sastoji od po

jedne α i β katalitičke subjedinice i dve γ regulatorne subjedinice. Tα-GTP

formira kompleks sa γ regulatornom subjedinicom fosfodiesteraze što

dovodi do njene disocijacije od katalitičke subjedinice, oslobađajući sada j j j j , j

katalitički aktivan α β-dimer fosfodiesteraze. Pošto GTP hidrolizuje na

GDP, Tα se odvaja od fosfodiesteraze i regeneriše se kompleks njenih

regulatornih i katalitičkih subjedinica a time inhibira dalja aktivnost

fosfodiesterazefosfodiesteraze.

U čepićima se katalitička subjedinica fosfodiesteraze sastoji samo od

dve α subjedinice.

Koncentraciju cGMP reguliše nivo unutarćelijskog Ca2+.

U mraku Ca2+ ulazi u štapiće kroz Na+ kanale čime se povećava njegovaU mraku Ca2+ ulazi u štapiće kroz Na+ kanale, čime se povećava njegova

koncetracija na oko 500nM. Na ovoj koncentraciji, aktivnost guanilat ciklaze

je mala. Kada se zatvore Na+kanali, i ulazak Ca2+ je inhibiran ali je

njegovo iznošenje pomoću Na+/Ca2+/K+ transportera neizmenjeno. Ovo

dovodi do smanjenja koncentracije unutarćelijskog Ca2+ a time i do

aktivacije guanilat ciklaze i povećane sinteze cGMP-a.

Aktivirani rodopsin se fosforiliše pomoću rodopsin kinaze u prisustvu

ATP-a. Tako fosforilisani rodopsin ima veliki afinitet prema citosolnom

proteinu arestinu. Nastali kompleksa arestin-R-Pi nije više u mogućnosti da

reaguje sa transducinom. Time arestin u in vivo uslovima prekida ovu

kaskadnu reakcijukaskadnu reakciju.

Za vizuelizaciju boja su odgovorni čepići

Postoje tri tipa čepića koji su podeljeni prema vrsti vizuelnog pigmenta koji

sadrže- plavi, zeleni i crvenip

Normalno se jedna vrsta pigmenta nalazi u jednom čepiću

Plavi pigment ima maksimum apsorbance na 420nm, zeleni na 535nm a crveni

na 565nmna 565nm.

Svaki od ovih pigmenata ima 11-cis-retinal kao prostetičnu grupu i pošto se

ekcitira svetlošću, kao i u štapićima, on izomerizuje u all-trans retinal.

Boje koje ne pripadaju ovoj osnovnoj paleti boja nastaju podražavanjem

kombinacija različitih čepiča koji sadrže različite pigmente- trihromatski vid.

Diskriminacija boja od strane štapića je karakteristika proteina vizuelnog

pigmenta za koji je vezan 11-cis-retinal. Ova veza je protonovana Shiff-ova baza.

Konjugovana dvostruka veza 11-cis-retinala utiče na apsorpcioni spektar

pigmenta. Kada je 11-cis-retinal vezan za različite vizuelne proteine, lokalne

amino kiseline oko protonovane baze utiču na energetski status i daju različiteamino kiseline oko protonovane baze utiču na energetski status i daju različite

apsorpcione spektre i različite maskimume apsorbance.

Glavni proteini koji su uključeni u kaskadu f t

PROTEIN ODNOS PREMA

prenosa fotona

PROTEIN ODNOS PREMA MEMBRANI

Rodopsin Unutar

Transducin (α, β, γ) Periferno/rastvoren

Fosfodiesteraza Periferno

Rodopsin kinaza Rastvoren

Arestin Rastvoren

Guanilat ciklaza Vezan za citoskelet

cGMP-aktivirani kanali Unutar

DRUGE FIZIKO-HEMIJSKE RAZLIKE IZMEĐU ŠTAPIĆA I ČEPIĆAŠTAPIĆA I ČEPIĆA

Senzitivnost i vreme odgovora:

Apsorpcija pojedinačnog fotona fotoreceptorom u štapićima generišeApsorpcija pojedinačnog fotona fotoreceptorom u štapićima generiše

jaču struju (1-3 pA)

Vreme odgovora čepića je oko 4 puta brže od štapića.

Zbog toga su čepići bolji za brzu vizuelizaciju brzih promena a štapići

su bolji za vizuelnu osetljivost slabe svetlosti.

PATOLOGIJA VIDA

Degeneracija makule

Retinitis pigmentosa

Poremećaj u percepciji boja

Molekularno-biološke tehnike

Osnovni principi

Osnovni principi:

� metoda koja se koriste u analizi ćelija

�molekularno bioloških tehnika

� imunohemijskih metoda

Šta je protočna citofluorimetrija?

• Istovremeno odreñivanje i merenje multiplihkarakteristika pojedinačne ćelije

Ora

nge

Time

FSC

Green

SS

C

pojedinačne ćelije

• Merenja se izvode po ćeliji sa uobičajenom brzinom od 500 do 4000 ćelija po sekundi

Time

Time

Time

FSC

Green

SSC

TimeRed

Data Data ProcesProces

sorsor

FSC

Orange

Šta nam protočni citometar može reći o ćeliji?

• Njenu relativnu veličinu (rasipanje svetla unapred – engl. Forward Scatter—FSC)

• Njenu relativnu granuliranost ili unutrašnju složenost (rasipanje u stranu – engl. Side Scatter—SSC)

• Relativni intenzitet fluorescence date ćelije(FL1, FL2, FL3, FL4, i FL5)

������������ ���������������

Zavisi od granuliranosti ćelije i njene unutrašnje kompleksnosti

Registruje se pod uglom od90° u odnosu na laserski zrak

Detektor rasipanja pod uglomkompleksnost ćelije

Detektor rasipanja unapred =Oblast površine ćelije

Izvor fotona

�������������������������������

Zavisi od veličine ćelijeRegistruje se duž ose upadnog zraka u smeru unapred

Šta je fluorescenca?

λ = 488 nm

Energija emitovanogfluorescentnog zraka

Antitelo

Energija upadnog

zraka svetlosti MoleculFluoresceina

λ ≅ 530 nmHO

CO2H

O

C

• Fluorohrom apsorbuje energiju od lasera

• Fluorohrom oslobaña apsorbovanu energiju:– Vibriranjem i rasipanjem toplote

– Emisijom fotona duže talasne dužine

Fluorescenca

Emitovani intenzitet fluorescence ∝ veznim mestima

FITCFITC

FIT

CFIT

Laminarni tok tečnosti

Fluorescent Intensity

FITC

FIT

C

FIT

FIT

C

Num

ber

of

Eve

ntsLaminar

Flow

Tečnost Tečnost

Razdvajanje leukocita periferne krvi na subpopulacije na osnovu rasipanja svetlosti

(��������

Propidijum jodid

Struktura Vezan za DNK

DNDNKK HistogramHistogram

150

200

250ounts

G0/G1

0 200 400 600 800 10000

50

100Counts

FL2=Area

S G2/M

Primena protočne citometrije

• HIV imunofenotipizacija• Apsolutan broj CD4 pozitivnih

ćelija• Imunofenotipizacija leukemija i

limfoma• Analiza ćelijskog ciklusa i

• Odreñivanje funkcije Imunskog sistema

• Hematopoetične stem ćelije

• Stiduje multiple rezistencije na lekove (kancer)

• Kinetičke studije (ćelijska• Analiza ćelijskog ciklusa i

analiza ploidije tumora• Odreñivanje broja retikulocita• Odreñivanje unakrsne

podudarnosti (transplantacija organa)

• Odreñivanje stem ćelija

• Kinetičke studije (ćelijskafunkcija)

• Analiza trombocita (koronarnabolest)

• Detekcija mikroorganizama (bakterije, paraziti)

• FISH and Flow

Osnovni principi

molekularno bioloških tehnika

Brz napredak molekularne biologije je uneo revolucionarne promene u laboratorijsku praksu.

Mogućnosti primene ovih tehnika u dijagnostici i terapiji su velike.

Molekularno biološke tehnike su se najpre koristile isključivo u istraživanju, u svrhu ispitivanja funkcije pojedinih gena.pojedinih gena.

Danas se koriste za

• identifikovanje oštećenih gena koji se mogu dovesti u vezu sa pojavom bolesti ,

• u sudskoj medicini

• za dijagnostiku virusnih infekcija

• sintezu rekombinantnih preparata

Dobijanje različitih uzoraka iz ćelija centrifugiranjem

Mala brzina (1000g, 10 min) – cele ćelije, jedra, citoskelet

Srednja brzina (20 000g, 20 min) – mitohondrije, lizozomi, peroksizomi

Velika brzina (80 000g, 1 sat), mikrozomi, male vezikule

Veoma velika brzina (150 000g, 3 sata) – ribozomi, virusi, veliki makromolekuli

Rekombinantne DNK tehnike (analiza fragmenata DNK)

Rekombinantne DNK tehnike omogućavaju spajanje DNK sekvenci u nove kombinacije (rekombinantna DNK)

Nakon početne primene u istraživanju, danas se Nakon početne primene u istraživanju, danas se koristi za identifikaciju oštećenih gena i popravljanje genetskih defekata.

Prvi korak podrazumeva izolaciju kompletne DNK (ili RNK), izolovanje fragmenata DNK (jednog ili više gena) koji sadrže varijabilne sekvence i to u dovoljnoj količini

Principi ekstrakcije DNK/RNK

Priprema uzorka (ekstrakcija DNK/RNK) često ključni korak od kojeg zavisi validnost analize

Veliki broj različitih tehnnika, komercijalni kitovi.

Opasnost od kontaminacije “stranim” nukleinskim Opasnost od kontaminacije “stranim” nukleinskim kiselinama.

Princip ekstrakcije:

1. Liziranje ćelija

2. Precipitacija oslobođenih molekula nukleinskih kiselina (izopropanol, etanol)

Postoji veliki broj različitih protokola

Izbor protokola zavisi od:

• Vremena potrebnog za izdvajanje NK

• Dijagnostičke pouzdanosti• Dijagnostičke pouzdanosti

• Rizika od kontaminacije

• Prinosa ekstrahovane nukleinske kiseline

Ekstrakcija DNK podrazumeva:

• Liziranje ćelija u rastvoru deterdženta uz enzimsku digestiju

• Ekstrakciju pomoću organskih rastvarača

• Precipitaciju alkoholom • Precipitaciju alkoholom

• Rastvaranje izolovane DNK u vodi ili puferima kao i spektrofotometrijsko određivanje čistoće i količine izolovane DNK

Ekstrakcija RNK

Veća osetljivost molekula RNK zahteva primenu posebnih protokola (posebno važna eliminacija ribonukleaza).

Metoda za ekstrakciju RNK mora da zadovolji Metoda za ekstrakciju RNK mora da zadovolji dva kriterijuma:

1. Omogućava da se sačuva intaktna RNK

2. Dobijene RNK ne sadrže inhibitore reverzne transkriptaze.

Tehnike

Tehnike za izolovanje i amplifikaciju gena i proučavanje i manipulaciju

sekvencama DNK uključuju primenu:

• restrikcionih enzima,

• vektora za kloniranje,

• lančanu reakciju umnožavanja (polymerase chain reaction - PCR),

• elektroforezu na gelu,

• imunoblot i• imunoblot i

• pripremu obeleženih proba koje hibridizuju za odgovarajuću ciljnu sekvencu DNK.

Genska terapija uključuje izolovanje normalnih gena i njihovo uključivanje u obolele ćelije tako da se eksprimiraju normalni geni, omogućavajući oboleloj ćeliji da se vrati u fiziološko stanje.

Rekombinantna DNK tehnologijaRekombinantne DNK tehnologija uključuje niz tehnika, od kojih su

najvažnije:1. Prekidanje DNK na specifičnim mestima restrikcionim nukleazama, što značajno olakšava izolaciju i manipulaciju pojedinačnim genima.

2. Kloniranje DNK uz primenu vektora za kloniranje ili lančane reakcije umnožavanje (polymerase chain reaction –PCR), čime sepojedinačni molekul DNK ili deo DNK može umnožiti nekoliko biliona puta.

3. Hibridizacija nukleinskih kiselina, što omogućava pronalaženje specifične sekvence DNK ili RNK sa velikom preciznošću i osetljivošću na osnovu sposobnosti da veže komplementarnu sekvencu.

4. Određivanje sekvence svih nukleotida u fragmentu prečišćene DNK, što omogućava identifikaciju gena odakle se može odrediti sekvenca AK u proteinu koji taj fragment kodira.

5. Istovremeno praćenje nivoa ekspresije svakog gena u ćeliji, korišćenjem mikročipova koji omogućavaju istovremeno odvijanje desetina hiljada reakcija hibridizacije

Elektroforeza DNK na gelu agaroze

• Gel elektroforeza je metod koji se koristi za razdvajanje makromolekula (na osnovu njihove veličine/oblika i/ili naelektrisanja) na gelu kroz koji se propušta jednosmerna električna propušta jednosmerna električna struja.

• Elektroforeza na gelu agaroze omogućava razdvajanje fragmenata u opsegu od 0.1-50Kb. Moć razdvajanja zavisi od veličine pora u gelu čija je veličina određena koncentracijom agaroze.

1Kb

5Kb

Napajač i kadica za elektroforezu

Elektroforeza na gelu agaroze

Nakon završetka elektroforeze DNK se vizualizuje pomoću određenih boja koje se određenih boja koje se interkaliraju u DNK. Najčešće se koristi etidijum bromid (ekscitacija na 302nm) a ređe SYBR green (ekscitacija na 365nm).

Gel agaroze nakon bojenja etidijum bromidom

Dobijanje DNK reverznom transkripcijom

Ukoliko izolujemo iRNK, ona može biti matrica za enzim reverznu transkriptazu, koja sa njega kopiju DNK (cDNA). Ova DNK ne sadrži introne

Tehnike za identifikaciju sekvence DNK

1. HibridizacijaPrimena proba – jednolančane DNK ili RNK sekvence koje se vezuju za

komplemetarnu sekvencu na većem jednolančanom DNK ili RNK molekulu (hibridizacija).

Proba može biti sačinjena od cDNK, fragmenata genomske DNK ili hemijski sintetisanih oligonukleotidasintetisanih oligonukleotida

Proba je uvek obeležena (radioaktivnim fosforom, fluorohromom)

2. Elektroforeza na gelu

Molekuli (fragmenti) se razdvajaju u električnom polju na osnovu veličine. DNK se kreće ka pozitivnoj elektrodi

3. Detekcija specifičnih DNK sekvenci

1. Elektroforeza NK

2. Transfer na čvrstu podlogu

3. Hibridizacija

Southern blot= uzorak je DNK

Northern blot= uzorak je RNK

������������� �������������������

1. kloniranje

2. Reakcija lančanog umnožavanja (engl. polymerase chain reaction, PCR)

• Tehnika koja se koristi za enzimsko umnožavanje DNK fragmenata in vitro.

• Tokom umnožavanja DNK fragment se eksponencijalno umnožava tako da se od početnih nekoliko kopija dobija fragment koji je umnožen nekoliko miliona puta.

• Enzimi koji se koriste za umnožavanje su termostabilne DNK • Enzimi koji se koriste za umnožavanje su termostabilne DNK polimeraze koje kao gradivni materijal koriste dezoksinukleotid trifosfate (dNTP).

• Početak sinteze komplementarnog lanca je određen oligonukleotidom koji se vezuje za taj lanac a termostabilna DNK polimeraza ga zatim izdužuje ugrađujući nukleotide tako da se dobija komplementarni lanac DNK.

• Da bi se oligonukleotidi (prajmeri) vezali za komplementarne sekvence DNK molekula, neophodno je molekul DNK denaturisati, odnosno prevesti ga u jednolančani oblik. To se postiže zagrevanjem reakcione smeše i zbog toga je neophodno korišćenje termostabilnih polimeraza.

• Za uspešan PCR veoma je važan

– sastav reakcione smeše (sadrži oligonukleotide, dNTP, DNK – sastav reakcione smeše (sadrži oligonukleotide, dNTP, DNK polimerazu, ciljne DNK sekvence koje se umnožavaju kao druge dodatke od kojih je najvažniji Mg2+) kao i

– temperaturni ciklus kroz koji reakciona smeša prolazi i

– broj njegovih ponavljanja.

Lančana reakcija umnožavanja (PCR)

standardstandard

Pretraživanje baza podataka u cilju pronalaženja sekvence željenog gena

• Da bi umnožili određeni gen moramo da znamo njegovu sekvencu kako bi mogli da dizajniramo i/ili proverimo da li se i kako prajmeri vezuju za tu sekvencu. tu sekvencu.

• Najbolji način za pribavljanje sekvenci je sa sajta NIH baze http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Nucleotide&itool=toolbar

• Prajmeri se mogu dizajnirati pomoću softvera koji imaju ugrađene algoritme za selekciju oligonukleotida prema zadatim kriterijumima.

Real time PCR

Postupak odgovara prinicipima PCR-a sa razlikom što se amplifikacija DNK prati tokom vremena i kvantifikuje posle svakog ciklusa amplifikacije. Dva

Real time PCR, ili kvantitativni PCR ili kinetski PCR je tehnika koja se bazira na PCR metodologiji koja se koristi za umnožavanje i simultanu kvantifikaciju ciljanog molekula DNK. Ona omogućava i detekciju i kvantifikaciju (kao apsolutan broj kopija ili relativnu količinu normalizovanu prema količini DNK na početku reakcije ili nekog house keeping gena) specifične sekvence uzorka DNK.

kvantifikuje posle svakog ciklusa amplifikacije. Dva metoda koja se koriste za kvantifikaciju su upotreba fluorescentih boja koje interkaliraju sa dvostrukim heliksom DNK ili modifikovane ologonukleotidne probe koje emituju fluorescencu pošto se vežu za komplementarnu DNK.

Nekada se kombinuje sa reverznim PCR (RT PCR) (kvantifikacija relativne ekspresije gena u određenom vremenu).

Real time PCR

Gel=elektroforeza krajnjeg proizvoda umnožavanja dobijenog u analizi

Amplifikacione krive real time PCR=a

umnožavanja dobijenog u analizi

Specifičnost analize: proba korišćena u analizi emituje fluorescencu vezana za specifičnu ciljnu sekvencu dok nema emitovanja signala u slučaju nekomlementarnog povezivanja.

PCR i real time PCRTradicionalni PCR detektuje krajnju tačku reakcije dok real time PCR detektuje ceo tok reakcije amplifikacije.

Real-Time proces omogućava detekciju tokom ranih faza amplifikacije a obezbeđuje i upoređivanje i razlikovanje veoma finih razlika u ekspresiji (tradicionalni PCR na agaroznom gelu- uočljiva razlika mora biti veoma velika).

Primena u lečenju i prevenciji bolesti

Primena u proizvodnji vakcina (hepatitis B)

Dobijanje proteina koji se koriste u terapiji (insulin, hormon rasta, faktor VIII, tkivni aktivator plazminogena, eritropoetin, faktori aktivator plazminogena, eritropoetin, faktori rasta u hematologiji, rekombinantni interferoni)

Genetsko savetovanje

Genska terapija

Transgene životinje

Klinička primena

Polimorfizmi, nasleđene razlike u redosledu baza u DNK, su vrlo brojni u ljudskoj populaciji, i mnoge alteracije u sekvenci DNK se povezuju sa različitim oboljenjima.

• Testovi na varijacije u sekvenci DNK su osetljiviji od većine drugih tehnika (npr. enzimskih eseja) i omogućavaju prepoznavanje oboljenja u ranijem stadijumu. prepoznavanje oboljenja u ranijem stadijumu.

• Ovim testovima se takođe mogu identifikovati nosioci naslednih bolesti tako da im se može pružiti genetičko savetovanje.

• DNK “fingerprinting” (analiza razlika u sekvencama DNK) se može koristiti da bi se odredio stepen srodstva ili u identifikaciji.

• Nasledne bolesti predstavljaju fenotipske posledice oštećenih gena.

• Oštećenje gena može biti posledica novonastale mutacije ili, mnogo češće, nasleđivanjem od ranije mutacije ili, mnogo češće, nasleđivanjem od ranije prisutnih mutiranih genskih alela.

• Prvi korak u odgonetanju uzroka naslednog poremećaja je identifikacija gena koji je odgovoran, kao i proteina koji je njegov proizvod.

Primeri oboljenja koja nastaju kao posledica genetskog oštećenja

Bolest Molekulski (ćelijski)

deficit

Incidenca

Anemija srpastih ćelija Abnormalni hemoglobin 1/625 u sub=Saharskoj Africi

Cistična fibroza Oštećenje kanala za hloride u epitelnim ćelijama

1/2500 u Evropi

Fenilketonurija Deficit tirozin hidtoksilaze 1/10000 u Evropi

Tay=Sachs= ova bolest Deficit heksozaminidaze –nagomilavanje sfingolipida

1/1000 u jevrejskoj populaciji u istočnoj Evropi

Primeri oboljenja koja nastaju kao posledica genetskog oštećenja

Bolest Molekulski (ćelijski)

deficit

Incidenca

Hantingtonova bolest Oštećenje hantingtina, što 1/10000 u Evropidovodi do nastajanja njegovih agregata

Hiperholesterolemija Deficit receptora za LDL 1/122 kod frankofonskepopulacije u Kanadi

Dišenova distrofija Oštećenje sitoskeletnog proteina distrofina

1/3500 kod muškaraca

Hemofilija A Deficit faktora VIII 1=1/10000 kod muškaraca

Osnovni principi imunohemijskih metoda u laboratorijskoj

dijagnosticidijagnostici

IMUNOTESTOVI SA OBELEŽENIM ANTITELOM ILI ANTIGENOM

Antigen i antitelo mogu se koristiti za međusobnu detekciju i merenje primenom širokog spektra raznih imunotestova za koje je karakteristično da se merenje rezultata testa zasniva na upotrebi reagensa (antigena ili antitela) za koji je vezan odgovarajući obeleživač čija se količina može precizno meriti.

Koriste se različiti obeleživači, kao što su radioaktivni izotopi i enzimi. Radioaktivni izotopi (naročito 125I) su već dugo u širokoj upotrebi, ali se sve Radioaktivni izotopi (naročito 125I) su već dugo u širokoj upotrebi, ali se sve manje koriste, pre svega zbog rizika po zdravlje i mogućeg radijacijskog oštećenja komponenata u testu.

Sve više se kao obeleživači koriste enzimi. Reč je o enzimima kao što su npr peroksidaza ili fosfataza, koji dejstvom na specifične supstrate daju obojene produkte razgradnje čija se količina može brzo i lako kolorimetrjski meriti. U poslednje vreme se u procesu obeležavanja enzimom sve više koristi sistem avidin-biotin. Avidin je glikoprotein koji se sa izuzetno visokim afinitetom vezuje za biotin (vitamin H). Zbog tako visokog afiniteta, avidin za koji je vezan enzim koristi se za veoma efikasno obeležavanje antitela za koje je vezan biotin.

KVALITATIVNE METODE

Imunoelektroforeza= omogućava razdvajanje i identifikaciju različitih proteina koji su prisutni u istom uzorku (mešavina Ag)

Western Blot (Imunoblot)� ispitivanje proteina razdvojenih elektroforezom

1. Elektroforeza1. Elektroforeza

2. Transfer na nitroceluloznu/najlon membranu (elektroblot)

3. Inkubacija membrane sa primarnim At za protein od interesa

4. Inkubacija sa sekundarnim At koje je obeleženo enzimom/fluorohromom/luminiscentnim supstratom radi detekcije proteina

Western Blot ili Imunoblot: Western Blot ili Imunoblot:

ZaZaššto analiza proteina?to analiza proteina?

DNK DNK -- geni geni

•• Oko 20,000 gena + regulaOko 20,000 gena + regulatornihtornih elementelementaa•• ŠŠta ta to govori to govori o funkciji i o funkciji i iinterakcijinterakciji•• Kako gen vrKako gen vršši funkciju?i funkciju?

RNK RNK -- medimedijjator informacije izmedju gena i proteinaator informacije izmedju gena i proteina

PROTEIN PROTEIN –– krajni krajni proizvodproizvod genske ekpresijegenske ekpresije

•• Broj? Broj? �� Sigurno preko 100,000 mozda i 200,000Sigurno preko 100,000 mozda i 200,000•• IIzzoforme, postoforme, post--translatranslaccionionee modifimodifikkaacciijeje, kovalentne i , kovalentne i nekovalentne, nekovalentne, reverzibilne reverzibilne i i ireverzibilne (permenantne)ireverzibilne (permenantne)

RNK RNK -- medimedijjator informacije izmedju gena i proteinaator informacije izmedju gena i proteina

•• Broj? Broj? •• ŠŠta ta to govorito govori o funkciji i Interakcijio funkciji i Interakciji•• Kako taj mediKako taj medijjator vrator vršši funkciju?i funkciju?

1.1. Manje manipulacije uzorkom pre analizeManje manipulacije uzorkom pre analize

2.2. Nema potrebe za amplifikacijom poNema potrebe za amplifikacijom poččetnog uzorka etnog uzorka (m(mali rizik ali rizik od kontaminacijeod kontaminacije))

Prednost analize proteina u poredjenju sa Prednost analize proteina u poredjenju sa analizom DNK ili RNKanalizom DNK ili RNK

3.3. Dobijeni podaci su na nivou supstrata, koji Dobijeni podaci su na nivou supstrata, koji je obično predmet je obično predmet deldelovanjaovanja farmakolofarmakološškikih h agenagenaasasa

4.4. U zavisnosti od primenjene tehnike, moU zavisnosti od primenjene tehnike, možže se istovremeno e se istovremeno analizirati od 1 do 20,000 proteina i njihovih modifikacijaanalizirati od 1 do 20,000 proteina i njihovih modifikacija

Uopsteno, za analizu proteina Uopsteno, za analizu proteina se se mogu mogu koristiti koristiti tri vrste tri vrste uzorka:uzorka:

1.1. Eksperimentalni sistem Eksperimentalni sistem ććelijske kultureelijske kulture

UzorciUzorci::

1.1. Eksperimentalni sistem Eksperimentalni sistem ććelijske kultureelijske kulture

2.2. MikrobioloMikrobiološški uzorakki uzorak

3.3. Uzorak od pacijentaUzorak od pacijenta

WESTERN BLOT

Western Blot- je tehnika koja se koristi za dokazivanje prisustva određenog

proteina u uzorku a zasniva se na Ag-At reakciji (koriste se At specifična prema

željenom proteinu koji predstavlja Ag) kao i kvantifikaciju proteina u uzorku

(upotrebom odgovarajućih softverskih denzitometrijskih tehnika).

ZajedniZajedniččkoko imeime zaza nizniz elektroforetskihelektroforetskih proceduraprocedura kojekoje::ZajedniZajedniččkoko imeime zaza nizniz elektroforetskihelektroforetskih proceduraprocedura kojekoje::

•• vrvršše e razdvajanje razdvajanje proteinaproteina popo veliveliččiniini

•• posleposle razdvajanja razdvajanja omoguomoguććavajuavaju identifikacijuidentifikaciju poznatihpoznatihii nepoznatihnepoznatih proteinaproteina odod interesainteresa

•• omogućavaju omogućavaju kvantifikacijukvantifikaciju poznatihpoznatih proteinaproteina

•• omogućavaju omogućavaju identifikacijuidentifikaciju nepoznatihnepoznatih proteinaproteina

PrPripremaiprema UzorkaUzorka

• Liziranje ćelija – hipotoni pufer sa deterdžentom (NP40 ili Triton X-100)

• izdvajanje citoplazme centrifugiranjem

Opšti principi iOpšti principi izolacijzolacijee pproteina:roteina:

• izdvajanje citoplazme centrifugiranjem

• merenje koncentracije proteina (Bradford ili Lowry Assay)

• rastvaranje proteina u puferu

�� ZatimZatim separacija proteina separacija proteina na na akrilamidakrilamidnom nom gelgeluu

Razdvajanje Razdvajanje proteina: proteina: PPolioliAAkrilamid krilamid GGel el EElektroforeza (PAGE)lektroforeza (PAGE)

Primarna struktura: Linearni niz amino kiselina koje su međusobno povezane peptidnim vezama.

Sekundarna struktura: Ograničena struktura koja nastaje kada se ne-susedne amino kiseline povežu

SDSSDS--PAGE: PAGE: razdvajanje razdvajanje proteina po molekulskoj proteina po molekulskoj masimasi

nastaje kada se ne-susedne amino kiseline povežu vodoničnim vezama.

Tercijerna struktura: Uvijanje jednog polipeptidnog lanca u globularnu strukturu. Nastalo povezivanjem pojedinačnih udaljenih amino kiselina nekovalentnim vezama i jakim disulfidnim mostovima (S-S) .

Kvatenerna struktura: Kada je protein izgrađen od više od jednog polipeptidnog lanca.

SDSSDS--PAGE: PAGE: razdvajanje prazdvajanje proteina roteina ppoomolekulskoj masi molekulskoj masi 11

SDS: SDS:

Deterdžent: Natrijum dodecil sulfat (SDS) se koristi da obloži proteine u rastvoru.

Jedan SDS molekul se vezuje za dve AK u Jedan SDS molekul se vezuje za dve AK u rastvoru.

SDS ima negativno naelektrisanje kojim se neutrališe naelektrisanje proteina tako da razdvajanje proteina zavisi isključivo od njihove mase.

SDSSDS--PAGE: PAGE: razdvajanje prazdvajanje proteina roteina ppo o molekulskoj masi molekulskoj masi 22

ββ--Merkaptoetanol Merkaptoetanol

• Služi kao redukciono sredstvo za disulfidne mostove

• Neophodno sredstvo kad se vrši analiza denaturisanih polipeptida

• Bez β-Merkaptoetanola dimeri spojeni disulfidnim mostovima bi migrirali kao jedan protein čija je masa veća od mase ispitivanog proteina

SDSSDS--PAGE: PAGE: razdvajanje prazdvajanje proteina roteina ppo o molekulskoj masi molekulskoj masi 33

KLJUKLJUČČNI KONCEPT:NI KONCEPT:

•• Zbog SDSZbog SDS--a i a i ββ--Merkaptoetanola, SDSMerkaptoetanola, SDS--PAGE vrPAGE vršši i

A BA B

Merkaptoetanola, SDSMerkaptoetanola, SDS--PAGE vrPAGE vršši i separaciju proteina iskljuseparaciju proteina isključčivo na ivo na osnovu osnovu molekulske masemolekulske masepojedinačnihpojedinačnih polipeptidapolipeptida

ViVizzuueelizacija proteinalizacija proteina

Popularne i jednostavne tehnike za viPopularne i jednostavne tehnike za vizzuueelliizaciju proteina u gelu: zaciju proteina u gelu: Detekcija svih proteina u uzorkuDetekcija svih proteina u uzorku•• problemproblem: nespecifi: nespecifiččnost i mala sennost i mala senzzitivnostitivnost

CoomasieCoomasie Blue Silver Staining Blue Silver Staining CoomasieCoomasie Blue Silver Staining Blue Silver Staining

ViVizzuueelizacija proteinalizacija proteina

Western Blotting Western Blotting (Immunoblotting):(Immunoblotting):

•• imunodetekcija individualnih imunodetekcija individualnih proteinaproteinaproteinaproteina

•• najsennajsenzzitivnija i itivnija i najnajspecifispecifiččnija nija metodametoda

Western Blot ili Imunoblot: Western Blot ili Imunoblot:

Opšti principOpšti princip: Imunolo: Imunološška detekcija ka detekcija pojedinihpojedinih proteina posle proteina posle separacije uzorka PAGEseparacije uzorka PAGE--om (Nativni PAGE ili SDSom (Nativni PAGE ili SDS--PAGE) PAGE)

•• najnajččeešćšće upotrebe upotrebljljavana tehnika za detekciju specifiavana tehnika za detekciju specifiččnih nih •• najnajččeešćšće upotrebe upotrebljljavana tehnika za detekciju specifiavana tehnika za detekciju specifiččnih nih proteinproteinaa u u ććelijieliji•• prednosti i razlozi velike upotrebe Western Blotprednosti i razlozi velike upotrebe Western Blot--a:a:

•• sensenzzitivnost itivnost -- 5 pg proteina5 pg proteina•• specifispecifiččnost nost –– iizzoforme proteina, lokaoforme proteina, lokalizalizacijacija u ćelijiu ćeliji, post, post--transtranskkripripccionionee modifikacije itd. modifikacije itd.

Western Blot ili Imunoblot: Western Blot ili Imunoblot:

PostupakPostupak::

1.1. Nativni PAGE ili SDSNativni PAGE ili SDS--PAGEPAGE

2.2. ElektroforetElektroforetsski transfer proteina na nitroceluloki transfer proteina na nitrocelulozznu membranunu membranu

3.3. Blokiranje nespefiBlokiranje nespefiččnih interakcija antitela nih interakcija antitela ii membrane mlekommembrane mlekom

4.4. Inkubacija membrane sa primarnim (specifiInkubacija membrane sa primarnim (specifiččnim antitelom)nim antitelom)4.4. Inkubacija membrane sa primarnim (specifiInkubacija membrane sa primarnim (specifiččnim antitelom)nim antitelom)

5.5. Ispiranje viIspiranje višškkaa primarnog antitela sa membraneprimarnog antitela sa membrane

6.6. Inkubacija mInkubacija meembrane sa sembrane sa sekkundarnim antitelom undarnim antitelom za koje je za koje je

““prikaprikaččenen”” enzim koji omoguenzim koji omoguććava vizualizaciju lokacije proteina ava vizualizaciju lokacije proteina

na membranina membrani

7.7. ViVizzuueelizacija produkta enzimlizacija produkta enzimske reakcijeske reakcije posle dodavanja posle dodavanja

susuppstratstrata za enzima za enzim (obi(običčno hemilumno hemilumiinisnisccenencca)a)

KliničkKliničkaa primena Western blotprimena Western blot--aa

U dijagnostici:

•• Potvrda prisustva antiPotvrda prisustva anti--HIV antitela u serumuHIV antitela u serumu

(proteini iz ćelija inficiranih HIV-virusom se razdvoje elektroforezom (proteini iz ćelija inficiranih HIV-virusom se razdvoje elektroforezom

i prenesu na membranu. Ispitivani serumi se zatim nanesu analogno

kao što se na membranu stavlja primarno antitelo; ne-vezano

antitelo će se isprati, i dodaje se sekundarno antitelo na humani

IgG, za koje je vezan enzim. Trake koje su se obojile pokazuju u

kojem od ispitivanih seruma se nalaze antitela na HIV

•• U dijagnostici sepse (prokalcitonin i njegovi razgradni proizvodi) U dijagnostici sepse (prokalcitonin i njegovi razgradni proizvodi) –

mada postoje i komercijalni kitovi (enzimski)

Western Blot ili Imunoblot: Western Blot ili Imunoblot:

Western Blot ili Imunoblot: Western Blot ili Imunoblot:

KliničkKliničkaa primena Western blotprimena Western blot--aa

U dijagnostici:U dijagnostici:

•• Detekcija prisustva C6 peptida Boreliae burgdorferi Detekcija prisustva C6 peptida Boreliae burgdorferi –– Lajmska bolestLajmska bolest

•• Detekcija oligoklonalnih traka porekla imunoglobulina u likvoru Detekcija oligoklonalnih traka porekla imunoglobulina u likvoru (multipla skleroza)(multipla skleroza)

•• Definitivna potvrda dijagnoze za prionske bolesti kao što je Definitivna potvrda dijagnoze za prionske bolesti kao što je spongiformna encefalopatija (BSE, ‘bolest ludih krava'). spongiformna encefalopatija (BSE, ‘bolest ludih krava').

2D2D--SDSSDS--PAGEPAGE: : Razdvajanje Razdvajanje proteina po proteina po iizzoelektrioelektričnčnoojj tačkitački ii molekulmolekulskojskoj masi: 1masi: 1

NajmoNajmoććnija tehnika za nija tehnika za razdvajanjerazdvajanje proteina zato proteina zato ššto:to:

1. Proteini se prvo razdvajaju izoelektričnoj tački (pI)

2. Zatim se proteini razdvajaju pomoću SDS-PAGE po 2. Zatim se proteini razdvajaju pomoću SDS-PAGE po molekulskoj masi

3. Kombinacija te dve tehnike za separaciju proteina daje takvu rezoluciju da može da se simultano vizuelizuje do 20,000 proteina u nekim uzorcima

• Realno oko 1,000

2D2D--SDSSDS--PAGEPAGE: : Razdvajanje Razdvajanje proteina po proteina po iizzoelektrioelektričnoj tačkičnoj tački ii molekulmolekulskojskoj masi: 2masi: 2

ŠŠta je ita je izzoelektrioelektriččnna tackaa tacka (pI)?(pI)?

•• pH na kojoj je protein 100% neutralanpH na kojoj je protein 100% neutralan

•• proteini su komplekproteini su komplekssnnii molekulmolekulii sa posa pozzitivnim i negativniitivnim i negativnimmnabojnabojemem na raznim mestima po duna raznim mestima po dužžini niza amino kiselina (npr. ini niza amino kiselina (npr. serini i glutamati)serini i glutamati)

•• proteini se medjusobno razlikuju po proteini se medjusobno razlikuju po brojbroju i rasporedu u i rasporedu popozzitivnih i negativnih nabojaitivnih i negativnih naboja

•• pri pH koji odgovara pI ukupan zbirpri pH koji odgovara pI ukupan zbir negativnih negativnih ii popozzitivnih itivnih naboja na proteinu je nulanaboja na proteinu je nula

•• naboj specifinaboj specifiččnih amino kistelina zavisi donih amino kistelina zavisi donekle od nekle od pH pH uslovauslova

2D2D--SDSSDS--PAGEPAGE: : Razdvajanje Razdvajanje proteina po proteina po iizzoelektrioelektričnojčnoj tačkitački ii molekulmolekulskojskoj masi: 2 masi: 2

pI u separaciji proteinapI u separaciji proteina: imobilizovani pH gradi: imobilizovani pH gradijjentienti•• npr. Immobilon gel membrane npr. Immobilon gel membrane ii iizzoelektricno fokusiranjeoelektricno fokusiranje•• primer je samo jedan protein, ali naravno u uzorku su primer je samo jedan protein, ali naravno u uzorku su na na 10001000--ee•• svaki sa drugasvaki sa drugaččijijimim pI pI ii molekulskom molekulskom masommasom

IMUNOTESTOVI SA ČVRSTOM FAZOM(RIA i ELISA)

Osnovna karakteristika ovih testova je da je jedan reagens (antigen ili antitelo) nerastvoran, odnosno u čvrstoj fazi (tj. vezan za zid epruvete ili zid bazenčića u polistirenskoj ploči za mikrotitraciju).

Sadržaj antitela u nekom serumu (na primer, autoantitela na DNK kod bolesnika sa sistemskim eritemskim lupusom) može se proceniti na bolesnika sa sistemskim eritemskim lupusom) može se proceniti na osnovu njihove sposobnosti vezivanja za antigen (DNK) koji je prethodno fizički adsorbovan za zid plastične epruvete ili zidoveplastične ploče za mikrotitraciju. Količina vezanih antitela (autoantitela na DNK) može se potom izmeriti dodavanjem radioaktivnim izotopom (125I) ili enzimom obeleženog antitela poreklom od druge vrste (miš, pacov, zec, ovca...), specifičnog za humane imunoglobuline, Imerenjem radioaktivnosti, odnosno aktivnosti enzima.

Enzimski imunotest

Enzimski imunotest - ELISA (engl. enzyme-linked immunosorbent assay) predstavlja metod za detekciju i merenje antigena ili antitela u kome se koristi reakcija enzima sa supstratom, a pri čemu enzim služi kaoobeleživač. Enzimi se najčešće vezuju za antitela, i to za antitela koja su ili specifična za neki antigen ili za antitela na imunogluobuline (Ig).

Količina enzima u antigen-antitelo kompleksu određuje se posredno merenjem količine produkta razgradnje odgovarajućeg supstrata koji se unosi u završnoj fazi testa. Koriste se enzimi čiji supstrati daju obojene produkte razgradnje i čija se količina lako može kolorimetrijski meriti.Na primer, enzim alkalna fosfataza i njen supstrat p-nitrofenil fosfat koji razgradnjom daje p-nitrofenol intenzivne žute boje.

U načelu, ELISA je slična radioimunotestovima sa čvrstom fazom. Varijante ELISA tehnike dele se na tehnike u kojima je antigen u čvrstoj fazi i tehnike u kojima je antitelo u čvrstoj fazi.

Uzorak:

Eksperimentalni uzorak ćelijske kulture

Uzorak pacijenta (Plazma, Serum, Likvor, Urin)

ELISA- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

Izvodi se u ploči sa 96 bunara (mikrotitar pliča)

Biohemijsko/imunološka tehnika koja omogućava detekciju antitela ili antigena u uzorku.

Koristi se u dijagnostici .

U ELISI dolazi do reakcije Antitelo-Antigen-Antitelo kojom se detektuje i kvantifikuje antigen prisutan u uzorku. Ukoliko je sekundarno antitelo vezano za enzim detekcija se završava dodavanjem enzimu specifičnog supstrata kako bi se razvila bolja čija se apsorbanca očitava na automatskom ELISA čitaču (spektrofotometru). Sekundarno apsorbanca očitava na automatskom ELISA čitaču (spektrofotometru). Sekundarno antitelo može biti konjugovano i sa nekim fluorohromom pri čemu se detekcija završava merenjem intenziteta fluorescence.

Izvođenje ELISA testa podrazumeva korišćenje jednog primarnog antitela koje je specifično za ispitivani antigen.

Postupak izvoñenja ELISA metode:

1. Nanošenje uzorka na ploču koja sadrži odgovarajuće primarno antitelo= inkubacija

2. Pranje

3. Nanošenje sekundarnog antitela (obeleženo sa enzimom ili (obeleženo sa enzimom ili fluorohromom)= inkubacija

4. Pranje

5. U slučaju korišćenja sekundarnog antitela obeleženog supstratom, nanošenje odgovarajućeg supstrata= inkubacija za razvijanje boje

6. Prekidanje enzimske reakcije

Shematski prikaz ELISA metode

Programirana ćelijska smrt – značaj, mehanizmi i

metode detekcije

Razvoj koncepta

Razvoj koncepta

Biol. Rev. 26:59-86 (1951)

R. Lockshin and C. Williams, (1965)

Programmed cell death. II. Endocrine

presentation of the breakdown of the

intersegmental muscles of silkworms.

J. Insect Physiol. 11, 803-809.

Razvoj koncepta

Fiziološki signali Patološki signali/uticaji (fizički uticaji, hemijski i

biološki agensi, zračenje…) Razvoj Postnatalni

period

Smrt ćelije

Oštećenje ćelije

Smrt ćelije

Uklanjanje nepotrebnih

ćelija – oblikovanje

organa

Uklanjanje “nekom-

petentnih” ćelija – tkivna

homeostaza

(1010 dnevno!)

Razvoj koncepta

Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821-1902)

“Omnis cellula e cellula”

Nekroza

Nekrobioza

1858. (Predavanje XV)

Hromatoliza

Walter Flemming (1885.)

Razvoj koncepta

Aleksandar Đ. Kostić (1921.)

Razvoj koncepta Br. J. Cancer (1972) 26, 239

APOPTOSIS: A BASIC BIOLOGICAL PHENOMENON WITH WIDE- RANGING IMPLICATIONS IN TISSUE KINETICS

J. F. R. KERR, A.H. WYLLIE AND A. R. CURRIE

From the Department of Pathology, University of Aberdeen

received for publication April 1972

Apoptoza Nekroza

Razvoj koncepta

Razvoj koncepta

Fiksacija

Visoka temperatura

“Živa ćelija”

Glukokortikoidi

“Mrtva ćelija”

Razvoj koncepta

Nekroza • patološki agensi

• grupe ćelija

• rana pojava edema

• liza ćelija, karioliza

• nasumična fragmentacija DNK, nejasno ograničene mase hromatina

• Masivna zapaljenska reakcija

• Mobilizacija nespecifičnog imunskog odgovora

• stvaranje ožiljka

Razvoj koncepta

Apoptoza • fiziološki ili patološki uslovi • pojedinačne ćelije

• rani gubitak ćelijskih veza

• kondenzacija hromatina - jasno ograničene mase, internukleozomska fragmentacija DNK

• dugo očuvan integritet organela

• izražena fagocitoza

• odsustvo zapaljenja i ožiljka

Apoptozu karakteriše niz dramatičnih promena u ćelijskoj arhitektonici koji doprinose ne samo programiranoj smrrti ćelije, već doprinose i pripremi ćelije za uklanjanje fagocitozom i izbegavanju neželjene reakcije imunskog sistema . Mnogi događaji koji se dešavaju tokom efektorske faze apoptoze posredovani su aktivnošću članova enzimske familije cistein proteaza – kaspaza. Ove proteaze mogu da deluju na nekoliko stotina proteina i usmeravaju ih na kontrolisan način u proces kontrolisane proteolize, čime se na najmanju meru svode oštećenja susednih ćelija i izbegava oslobađanje imunostimulatornih molekula.

Razvoj koncepta

Apoptoza

Za razliku od apoptoze, nekrozu (nekontrolisanu smrt ćelije) karakteriše brz gubitak integriteta ćelijske membrane i oslobađanje ćelijskog sadržaja u vanćelijski prostor.

Brojne činjenice ukazuju da imunski sistem suštinski različito reaguje na apoptotične i nekrotične ćelije.

Nekrotične ćelije skoro po pravilu pokreću zapaljensku reakciju neutrofila, makrofaga i ostalih ćelija uključenih u urođeni imunski odgovor i oslobađaju se neki molekuli (danger-associated molecular patterns - DAMPs ili alarmini) koji se vezuju za receptore na makrofagima, dendritičnim i NK ćelijama.

STOGA, JEDNA OD VAŽNIH OSOBINA APOPTOZE JE SPREČAVANJE DEMASKIRANJA SOPSTVENIH ANTIGENA.

Razvoj koncepta

Nekroza – zades

Apoptoza – program/proces

• patološki agensi • grupe ćelija

• rana pojava edema

• liza ćelija, karioliza

• nasumična fragmentacija DNK, nejasno ograničene mase hromatina

• zapaljenska reakcija

• stvaranje ožiljka

• fiziološki ili patološki uslovi • pojedinačne ćelije

• rani gubitak ćelijskih veza

• kondenzacija hromatina - jasno ograničene mase, internukleozomska fragmentacija DNK

• dugo očuvan integritet organela

• izražena fagocitoza

• odsustvo zapaljenja i ožiljka

Morfološke karakteristike

Latentna faza

Kondenzacija

Fragmentacija

Fagocitoza

Digestija

Morfološke karakteristike

Gubitak među-ćelijskih veza

Pupljenje fragmentacija

Morfološke karakteristike

Kolaps hromatina

Morfološke karakteristike

Annexin V

Pojava fosfatidilserina na

spoljnoj strani membrane

Morfološke karakteristike

Profesionalni fagociti

Digestija

Okolne ćelije

Morfološke karakteristike

Normalna ćelija

Stadijum I

Stadijum II

Stadijum III

Morfološke karakteristike

Apoptoza

Onkoza

Paraptoza

Nekraptoptoza

Latiptoza

Autofagocitoza

Programirana ćelijska smrt

Programirana nekroza

Modalitet ćelijske smrti Morfološke karakteristike

Apoptoza (Tip 1)

• Zaokrugljivanje ćelija

• Redukcija volumena (piknoza)

• Fragmentacija

• Male promenen izgleda organela

Autofagija (Tip 2)

• Odsustvo kondenzacije hromatina

• Masivna vakuolizacija citoplazme (autofagne vakuole sa dvostrukom membranom)

Nekroza (Tip 3) • Edem ćelije i organela

• Ruptura plazma membrane

• Umerena kondenzacija hromatina

Mitotska katastrofa • Mikronukleacija

• Multinukleacija

Klasifikacija (Nomenclature Committee on Cell Death)*

* Cell Death Differ , 2005; 12 (Suppl 2): 1463-7

Mehanizmi

Okolnosti Fenotip

Doza Trajanje

Signali citokini, adhezioni

molekuli, metabolički signali

Oštećenje DNK, citotoksički oksidativni stres,

hipoksija, fizički agensi

Adaptacija Reparacija Replikacija Mutacioni defekti

Nekroza (neapoptotska smrt ćelije) Apoptoza

Mehanizmi

Apoptoza je proces!

Indukcija

Prenos signala

Efektori

Smrt Modulacija

signala

Mehanizmi

Receptor

Efektor

Inicijator Adaptor

Modulator Proteini Bcl porodice

Proteini koji inhibiraju apoptozu Kaspaze

Mehanizmi

Pokretanje apoptoze

•preko receptora na ćelijskoj membrani – “receptori smrtonosnih signala”

•unutarćelijski faktori – oštećenje mitohondrijalne membrane, slobodni

radikali, oštećenje DNK ...

Mehanizmi

Kaspaza 3

Apoptoza Ab APP

DP3

Okidački signal

Prokaspaza 9

Kaspaza 9

APAF-1

Citohrom c Prokaspaza 12

Kaspaza 12

Ca2+

Stres endoplazmatskog retikuluma

Prokaspaza 3

Kaspaza 8

Prokaspaza 8

Adaptor

Ligand

Receptor “signala smrti”

Kaspaze – ekipa za “rušenje”

U ćelijama normalno prisutne kao neaktivni proenzimi Pripadaju familji proteaza Imaju obavezno Cys ostatak u aktivnom mestu i zahtevaju Asp ostatak na mestu hidrolize peptidne veze u molekulu supstrata. U procesu otpočinjanja apoptoze, dolazi do aktivacije kaspaza Isključivanje sistema odgovornih za održavanje osnovnih životnih funkcija ćelije

- Proteini koji učestvuju u procesima transkripcije i translacije

- Fragmentacija genomske DNK

-Fragmentacija Goldži aparata i ER

-Fragmentacija mitohondrija

Mehanizmi

Mehanizmi

DR4, DR5

Apo2L FasL

Fas

TNFa

TNFR1

?

DR6 DR3

Apo3L

FADD TRADD TRADD

Kaspaza 8

Kaspaza 3

Apoptoza

?

Mehanizmi

Receptor smrtonosnog signala

FasL

Fas (CD95)

DD

D

D

DD

DD

DD

DED

D

ED

DED

D

ED

Pro-kaspaza 8

FADD

Kaspaza 8

[Smrt]

Mehanizmi FasL

Fas (CD95)

DD

DD

DED

DED

DED

DED

Pro-kaspaza 8

FADD

DcR3

Preživljavanje

DD

DD

DD

Receptori – mamci

Preživljavanje

Mehanizmi

Razdvajanje komponenti respiratornog lanca

Kolaps DYm

prestanak sinteze ATP-a

oslobađanje Ca++

stvaranje slobodnih radikala

oslobađanje malih proteinskih molekula

Nagla promena propustljivosti unutrašnje membrane mitohondrija ¨permeability transition¨

Mehanizmi

Kaspaza 8 Bid

Citochrom c

Apaf-1 dATP

Pro-kaspaza 9

Kaspaza 9 Pro-kaspaza 3

Kaspaza 3

Pro-kaspaza 3 Oštećenje Stres

AIF

Mehanizmi

Kaspaza-3

Kaspaza-9

Bax, Bak Bid Bcl-2/Bcl-XL

Citohrom c

Apaf-1

IAP

Proteini

Kaspaze

Smac

Omi

ROS

EndoG

AIF

Razgradnja DNK

Oksidacija lipida

Ćelijska smrt

Nezavisno od kaspaza Zavisno od kaspaza

Mehanizmi

Proapoptotski Antiapoptotski

BH4

BH3

BH1

BH2

TM Bcl-2 Bcl-XL

Mcl-1 Bcl-w A1

Bax Bak

Bad (-TM)

Bik Hrk

Bid (-TM) Bcl-XS

(+BH4)

Bcl-2

BH2

BH3

Bcl-XL

Bak(72-87)

Mehanizmi

Regulacija Bcl-2 proteina

na nivou genske ekspresije

posttranslacione modifikacije

• fosforilacija

• proteoliza

Bcl-2

P

Bax

IL-3

Kinaze

Apoptoza Preživljavanje

14-3-3

Bad

Mehanizmi

Citohrom C dATP

Pro-kaspaza 9

Kaspaza 9

Apaf-1

Apaf-1

Bcl-2 Bcl-2 Bax

Apaf-1

Mehanizmi

G1 S

Waf1 (p21)

Aktivni p53

Genotoksički stres

IGF-BP3 Ciklin G GADD45 MDM2

E2F

pRB

E2F

pRB

P Cdk

p21

Ciklin

PCNA

Mehanizmi

Aktivni p53

Genotoksički stres

Bax IGF-BP3

Fas

Bcl-2 IGF1R IGFII

TFHII RPA

GADD45

PCNA

p21Waf1

Zavisi od funkcije

p53 u transkripciji

Apoptoza Apoptoza

Ne zavisi od funkcije p53 u transkripciji

Mehanizmi

Aktivni pRB

P

P P

P

P

P

P

Neaktivni pRB

Ciklin-CDK p21 (Waf-1) p53

Geni za popravku DNK

Geni za apoptozu

Oštećenje DNK

Indukcija sinteze Sprečavanje razgradnje

Mehanizmi

Apoptoza

Procesi koji zavise od ATP-a

Signali za ćelijsku smrt

Ne Da ATP

Nekroza Ne Da ATP

Kaspazna kaskada

Cas8 Cas3

Aktivni transport u jedro

(zavisi od ATP-a)

Nekroza

Mehanizmi - primena

U dizajniranju antitumorskih lekova - Poremećaj odnosa

proapoptotskih/antiapoptotskih činilaca

- Protein/protein interakcije

Autofagija (Tip 2)

Autofagija (Tip 2)

Slični stresori mogu da dovedu ili do apoptoze ili do autofagije, što zavisi od konteksta, praga osetljivosti i drugih činilaca.

Pored toga, ova dva procesa u određenom astepenu inhibiraju jedan drugog, ali u nekim slučajevima u istoj ćeliji se mogu uočiti i karakteristike apoptoze i autofagije

Iako se smatra da autofagija uglavnom ćelijama omogućava prilagođavanje na stres, izražena autofagija dovodi do smrti ćelije.

ER

ER

Mt

Nekroza (Tip 3)

Mitotska katastrofa

Mehanizmi

Mehanizmi

Biohemijski procesi

Stimulus Proces Modalitet ćelijske smrti

Aktivacija receptora smrti Oštećenje DNK ER stres

Nedostatak

nutrienata

Osmotska liza ROS Preopterećenje Ca2+

MMP Aktivacija kaspaza

Autofagna

vakuolizacija

Masivna aktivacija litičkih enzima

Apoptoza

Autofagna

smrt ćelija

Nekroza

inhibicija

kaspaza

inhibicija

makroautofagije

Detekcija - morfologija

Detekcija - morfologija

DAPI

Propidijum jodid

Aneksin V

Akridin oranž

Detekcija - mitohondrije

Depolarizacija

mitohondrija

100 101 102 103 104

FL1-H100 101 102 103 104

FL2-H

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8

kontrola

L3 (50 mkroM)

Detekcija – oštećenje membrane

kontrola Annexin PI.001

100 101 102 103 104Annexin V FITC

kontrola Annexin PI.001

100 101 102 103 104Annexin V FITC

M1

Taxol 24h Annexin PI.001

100 101 102 103 104Annexin V FITC

100 101 102 103 104Annexin V FITC

M1

Pojava fosfatidilserina na

spoljnoj strani membrane

Annexin V

Detekcija – aktivni egzekutori Antitelo na aktivisanu

kaspazu 3 (17 kDa) • Novorođeni pacov • 15 min. ishemija

• 3 h reperfuzija

Antitelo na aktivisanu kaspazu 3

• Leukemija

• Razmaz krvi

• Posle citostatika

3’

5’

Detekcija – fragmentacija DNK

TUNEL tehnika

Terminalna

transferaza

dNTP

3’

5’

DNK

Proces apoptoze endonukleaze

Detekcija - fragmentacija DNK

0 200 400 600 800 1000FL2-A

M1 M2 M3M4

0 200 400 600 800 1000FL2-A

M1 M2M3

M4

HL-60, 12,5 µM, 12h

B-16, 25 µM, 24h

The engine driving the ship: metabolic steering of cell proliferation and death

Marisa R. Buchakjian & Sally Kornbluth

doi: 10.1038/nrm2972

September 2010 621 |

Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond

Stephen W. G. Tait & Douglas R. Green

doi: 10.1038/nrm2952

October 2008 781 |

Phagosome maturation: going through the acid test

Jason M. Kinchen & Kodi S. Ravichandran

doi: 10.1038/nrm2515

July 2008 532 |

Cytochrome c: functions beyond respiration

Yong-Ling P. Ow, Douglas R. Green, Zhenyue Hao & Tak W. Mak

doi: 10.1038/nrm2434

January 2008 47 |

The BCL-2 protein family : opposing activities that mediate cell death

Richard J. Youle and Andreas Strasser

doi: 10.1038/nrm2308

September 2007 741 |

Self-eating and self-killing: crosstalk between autophagy and apoptosis

M. Chiara Maiuri, Einat Zalckvar, Adi Kimchi and Guido Kroemer

doi:10.1038/nrm2239

May 2007

405 |

The apoptosome : signalling platform of cell death

Stefan J. Riedl and Guy S. Salvesen

doi:10.1038/nrm2153

February 2006

97 |

Developmental apoptosis in C. elegans: a complex CEDnario

Guillaume Lettre & Michael O. Hengartner

doi:10.1038/nrm1836

Dodatne informacije : Nature Reviews Molecular Cell Biology

Focus on APOPTOSIS