Difusin doble bidimensional (mtodo de Ochterlony)

Difusin doble bidimensional (mtodo de Ochterlony)Este mtodo es utilizado para la deteccin deantgenosoanticuerposen una muestra biolgica.Consiste en colocar en una placa de Petri agar (agarosa) 1-1,5% al cual luego de solidificar se le realizan perforaciones en forma de pocillos a distancia conveniente y en dichas perforaciones se colocan pequeas cantidades de Ag. (en los pocillos exteriores) yAc. (en el pocillo del centro, ejemplo: el suero sanguneo contiene anticuerpos).

la placa se deja por 48 horas para su revelado. Durante este tiempo, los antgenos y los anticuerpos migrarn de maneraradialhacia afuera de sus respectivos pocillos. Al encontrarse ambos a mitad de camino y, de haber anticuerpos en contra de los antgenos se unirn en una red de enlaces llamado complejo inmune, el cual precipita en el gel revelando una lnea blanquecina.

cuando las concentraciones colocadas en los pocillos estn cerca de la equivalencia la banda se formar a mitad de distancia entre ellos.

Permite tener idea de los PMde cada reactivo ya que al tratarse de una difusin radial, la concavidad de la banda estar hacia el lado del pocillo donde se halla colocado el reactivo de mayor PM,y viceversa,si ambos PM son semejantes la banda ser recta.

Es posible determinar la existencia o no de epitopes comunes entre Ag.segnlas caractersticas de las bandas formadas.

Los dos Ag tienen los mismo epitopes.

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Los dos Ag comparte un epitope, pero uno de ellos tiene un epitope extra que es reconocido por el suero y se forma un arco de precipitacin al que le sale un espoln.

8Difusin simpleen placaoinmuno-difusin radial(Mancini).

Consiste en una placa de agar o agarosa al 3% en solucin salina,en el que se encuentra disuelto el Ac. Sobre el agar se realizan perforaciones en las que se colocan las muestras.

La distancia a la que difunde un Ag.hastaalcanzar la relacin de equivalencia con su correspondiente Ac.yprecipitar, es proporcional a la concentracin delmismo. Entonces, cuando los sistemas son equivalentes, aparece alrededor del pocillo uncirculode precipitacin.

Debido a que la concentracin del reactivo disuelto en el agar es constante,el dimetro del crculo descripto por la banda de precipitacin ser directamente proporcional a la concentracin del reactivo que difunde.

Es necesario medir el dimetro del circulo obtenido y ubicarlo en una curva estndar que se construye de la siguiente manera:

se colocaran en una serie de pocillos cantidades conocidas de un estndar del Ag.se incuba la placa a temperatura ambiente hasta que el dimetro de los halos no se modifique (48-72 hs).Se mide el dimetro de los halos y se construye una curva de calibracin relacionando la superficie de los mismos (elr2od2) con la concentracin.

Existen kits comerciales que traen la placa con el Ac.yaincluido en ella , un estndar de concentracin conocida y una tabla de concentracin en funcin de los dimetros o radios; de manera que no se necesita realizar la curva estndar.