Diagnostic des infections à gonocoque par techniques

moléculaires

H. Hochard, C. Delamare

CHR Metz Thionville

Diagnostic des infections à Diagnostic des infections à gonocoque et à gonocoque et à Chlamydia Chlamydia trachomatistrachomatis par techniques par techniques

moléculairesmoléculaires

mardi 11 septembre 2012

H. Hochard, C. Delamare

CHR Metz-Thionville

EPIDEMIOLOGIE

Renago, 2008

• Plus de déclaration obligatoire depuis 2000

pas de données de prévalence

• Estimation de l’incidence grâce aux réseaux :

RENAGO de laboratoires, dont les patients consultent majoritairement en médecine de ville

RésIST de cliniciens, dont les patients consultent quasi-exclusivement dans des structures spécialisées (CIDDIST et CDAG)

Neisseria gonorrhoeae (NG)

Réseaux de surveillance

• augmentation des infections gonococciques

• population homosexuelle masculine, mais aussi hétérosexuelle masculine et féminine

• médiane âge femmes infectées 24 ans vs 27 ans pour les hommes

• portage asymptomatique (plus fréquent +++ chez la femme :50-90 % vs < 1 % chez l’homme), favorise la transmission

• augmentation des résistances

Évolution du nombre moyen de gonocoques isolés par laboratoire actif et par an selon le sexe

(réseau Rénago)

Augmentation de la fréquence de l’infection chez l’homme (+26%) comme chez la femme (+33%) entre 2008 et 2009

Évolution du nombre moyen de gonococcies par site participant et par an selon le sexe

(réseau RésIST)

• Absence de recommandations de dépistage en France• Recommandations européennes (IUSTI - OMS, 2001, actualisées 2008)

En présence de symptômes En l’absence de symptômes

symptômes ou signes d’écoulements urétraux chez l’homme

jeune adulte dépisté pour une IST

orchi-épididymite chez l’homme de moins de 40 ans

partenaire sexuel d’une personne ayant une IST ou une atteinte

inflammatoire pelvienne

écoulement vaginal avec facteurs de risque d’IST

nouveaux ou multiples partenaires

cervicite mucopurulente

inflammation pelvienne aiguë

Chlamydia trachomatis (CT)

• 1er agent bactérien responsable d’IST dans les pays industrialisés

• Réseau de surveillance : RENACHLA (laboratoires)

incidence ≈ 4 % infections asymptomatiques chez 75 % des femmes

et 50 % des hommes prévalence varie en fonction :

― des populations étudiées (lieu de recrutement)― de l’âge : maximale chez les femmes de 18 à 24 ans

et chez les hommes de 25 à 30 ans

Réseau Rénachla

HOMMES

Augmentation du nombre de diagnostics de 19 % chez l’hommeentre 2008 et 2009

Chlamydia trachomatis (CT)

Réseau Rénachla

FEMMES

Augmentation du nombre de diagnostics de 25 % chez la femmeentre 2008 et 2009

Estimation de la prévalence en France des infections à CT dans la population générale

• 2 580 personnes testées• 18 - 44 ans• Auto-prélèvement vaginal (femmes) ou urine (hommes) : à domicile

– 18 - 44 ans : • Hommes = 1,4%• Femmes = 1,6%

– 18 - 29 ans : • Hommes = 2,5%• Femmes = 3,2%

Prevalence of Chlamydia trachomatis: results from the first national population-based survey in France.Goulet V, de Barbeyrac B, Raherison S, Prudhomme M, Semaille C, Warszawsk J; CSF group.

Sex Transm Infect. 2010 Aug;86(4):263-70.

• HAS 2003

• personne symptomatique• CIDDIST, CDAG : dépistage systématique chez les femmes de

15 à 25 ans et les hommes < 30 ans • quels que soient l’âge et le sexe si >1 partenaire dans l’année • un ou une partenaire infecté(e) à C.trachomatis

DIAGNOSTIC

• Diagnostic direct– détection de Neisseria gonorrhoeae dans les

différents milieux accessibles à un prélèvement (urètre, endocol, urines…)

• par cultureculture• détection du génome bactérien par biologie biologie

moléculairemoléculaire

• Diagnostic indirect : sérologique, qui met en évidence les anticorps – inapproprié dans le cadre d’un dépistage et d’un

diagnostic

Neisseria gonorrhoeae

Chlamydia trachomatis

• Détection du génome bactérien par biologie moléculaire avec amplification génique – Sensibilité > 95%– Spécificité > 99%

• Adaptée dans toute situation clinique et pour tout type de prélèvement

• Les techniques de détection directe de CT par identification des inclusions intracellulaires sur culture ne sont plus recommandées.

• Il est préconisé de ne plus utiliser la technique de détection directe par méthode immunologique.

• Aucun intérêt de la sérologie dans les infections bassesDIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L’INFECTION Á CHLAMYDIA TRACHOMATIS HAS Juillet 2010

Les prélèvements

• Culture (NG)

endocol urètre écoulement

urétral anal pharyngé

• Tests moléculaires endocol vagin (auto-

prélèvement) urètre sperme urine anal pharyngé

• Tests moléculaires (1 seul écouvillon pour NG et CT )

matériel de prélèvement avec milieux de transport spécifiques aux différents tests de diagnostic moléculaire

non interchangeables important d’adresser au laboratoire le

milieu en adéquation avec la technique de diagnostic

à titre d’exemple :– milieu Abbott contient du thiocyanate de

guanidium qui inhibe la PCR Cobas Roche,car la libération des acides nucléiques associée a cette technique est une lyse et non une extraction n’élimine pas le thiocyanate

• Culture (NG)

milieu de transport gélosé

! inhibition PCR

Les milieux de transport

• réalisée en systématique pour toute demande de culture

• visualisation directe du gonocoque sous la forme de diplocoques à Gram négatif intracellulaires « en grain de café »

• sensibilité :– élevée en cas d’urétrite aiguë chez l’homme (sensibilité > 95 %)– mauvaise chez les hommes asymptomatiques (50 à 75 %) et chez la

femme à partir des prélèvements endocervicaux et urétraux (respectivement 45 à 65 % et 20 %)

• non adaptée aux localisations anorectales et pharyngées– présence de cocci à Gram négatif appartenant à d’autres espèces

bactériennes– sensibilité ≤ 40 %

NG : La microscopie(coloration de Gram)

• Patients symptomatiques : méthode de référence {IUSTI/WHO 2008}

• Milieu de culture (gélose chocolat) sélectif contenant des antibiotiques (VCN) // Milieu non sélectif

• Avantages : – faible coût– sensibilité : 90% (80 à 96 % selon les études) pour les prélèvements

d’urètre, ≈ 80-90 % pour les prélèvements cervicaux– permet la réalisation d’un antibiogramme et d’un typage pour les études

épidémiologiques

• Inconvénients : – nécessité d’effectuer des prélèvements invasifs– transport rapide vers le laboratoire – délai d’obtention des résultats de 2 à 3 jours– sensibilité faible pour pharynx et anus (respectivement < 50 % et < 60 %)

NG : La culture

• Détection des acides nucléiques du génome bactérien (ADN ou ARN)

• Différentes techniques :

– ( hybridation moléculaire )

– techniques d’amplification génique

• PCR• TMA • SDA

Les tests de biologie moléculaire

PCR( Polymerase chain reaction )

• Amplification cyclique d’un segment d’ADN cible

• 3 températures :

– 95°C : dénaturationdénaturation de l’ADN– entre 50 et 65°C : hybridationhybridation

des amorces oligonucléotidiques complémentaires à leurs régions cibles

– 70°C : élongationélongation dans le sens 5’→ 3’ des amorces par Taq polymérase

40 cycles : 106 fois la cible

SDA ( Strand Displacement Amplification ou amplification par déplacement de brin )

• Amplification isothermique d’ADN

• 2 enzymes thermorésistantes :– une enzyme de restriction– une ADN polymérase

• 2 couples d'amorces

• ADN cible possédant ce site de restriction est généré à l'aide de la polymérase

TMA(Transcription Mediated Amplification)

• Amplification isothermique d’ARN(via un intermédiaire ADN)

• 2 enzymes :– ARN polymérase– transcriptase inverse (+ RNAse)

• synthèse d’un ADN double brin transcriptible en ARN par la transcriptase inverse

• amplification par l’ARN polymérase : transcription d’une série d’ARNs (50 à 100 copies)

• Les ARNs synthétisés servent à leur tour de matrice pour la synthèse d’un ADNdb.

• Hybridation directe à l’aide de sondes ADN

– Gen-Probe PACE 2® (sonde ADN qui s’hybride à l’ARN ribosomal du gonocoque)

• peu utilisée en France pour NG : moins sensible et moins spécifique que la culturepas utilisée pour CT

Sonde d’hybridation

Roche Cobas Amplicor CT/NG®

Abbott RealTimeCT/NG®

BD ProbeTecCT/NG®

Gen-Probe Aptima Combo 2 CT/NG®

Automatisation oui oui oui oui

Technique d’amplification

PCR PCR SDA TMA

Système de détection

colorimétrie fluorescence fluorescence chemiluminescence

Prélèvements acceptés

UrineUrétralEndo-cervical

UrineUrétralEndo-cervicalVaginal

UrineUrétralEndo-cervical

UrineUrétralEndo-cervicalVaginal

Sensibilité des techniques

• NG : sensibilité = 96,0 à 97,8 % spécificité = 98,1 à 98,9 %• CT : sensibilité = 88,9 à 95,9 % spécificité = 96,6 à 98,9 %

Performance des tests moléculaires

• Sensibilité et spécificité élevées

– varient en fonction de la technique d'amplification utilisée et du site de prélèvement

• Sensibilité sur les prélèvements cervicaux > urine(Sensibilité sur les prélèvements urétraux légèrement > urine)

• Chez les individus asymptomatiques : performance des tests moléculaires supérieure à celle de la culture (NG)

NG : Nécessité de confirmer les résultats du test initial par une autre technique d’amplification ?

• Existence de résultats faux-positifs, quelle que soit la technique d’amplification

Contrôle des positifs par une autre technique, ciblant une séquence différente du génome

• CHR Metz-Thionville, laboratoire de Metz :collaboration avec Dr Patricia Franck

Responsable Filière Biologie médicaleMaternité régionale universitaire de Nancy

Avantages des techniques moléculaires

• détection possible dans des prélèvements inadaptés à la culture (urine, prélèvements vaginaux)

• ne requièrent pas la viabilité des bactéries

• milieux de transport stables plusieurs jours

• délai de rendu des résultats plus court

• automatisation adaptation aux grandes séries

Mise en place de la méthodeAbbott RealTime CT/NG®

au laboratoire de Metz

• Etude réalisée en 2010 (6 mois)

• 1085 prélèvements :- 36 reçus (31 patients) pour recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae- 1049 reçus pour recherche de Chlamydia trachomatis

• Origine des prélèvements :

dont 12% vagin

• Recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae :

31 patients CIDDIST (9 femmes et 22 hommes)

Age médian : 25 ans

Symptomatiques : 3 femmes (33%) et 10 hommes (45%)

Positifs NG : 3 patients (1 femme, 2 hommes) = 9.7%

Résultats

• Recherche systématique de Neisseria gonorrhoeae :

1049 patients

322 CIDDIST- Age médian : 22 ans- Symptomatiques : 11 (3,4%)- Facteurs de risque : 159 (49%)- Positifs NG : 0

727 Gynécologie-Obstétrique- 164 grossesses asymptomatiques

• Positifs NG : 2 (0,19%)- 563 UGO dont 468 symptomatiques

• Positifs NG : 0

Résultats

• Fréquence chez les sujets asympto = 0,34 % (2/588)

• Fréquence chez les sujets sympto = 0,61 % (3/492)

Au total : 5/1080 soit 0,46 %

Conclusion

• 6251 prélèvements• recherche de NG sur prescription : 361

– 291 CIDDIST– 45 UGO– 18 extérieurs– 7 prison

• Positifs CT : 4,7 % (293)• Positifs NG : 0,66 % (41) (0,46 % en 2010)

– recherche sur prescription (18/361) : 4,99 %– recherche systématique (23/5889) : 0,39 %

2011 - août 2012

CONCLUSION

• Patient symptomatique : culture = gold standard– homme : écoulement, urètre– femme : sécrétions endocol

SAUF localisations anales et pharyngées : biologie moléculaire (sensibilité >> culture)

La culture peut être associée à la biologie moléculaire si les conditions de transport risquent d’affecter la survie de NG (délai d’acheminement, température).

Neisseria gonorrhoeae

• Personne asymptomatique (dépistage) : biologie moléculaire (tests multiplex NG/CT)

performance > culture prélèvements non invasifs (meilleure acceptabilité)

– homme : 1er jet urine– femme : auto-prélèvement vaginal– si positif :

• confirmer par 2ème technique de biologie moléculaire ciblant une séquence différente (taux prévalence population dépistée < 5%)

• reprélever pour culture et antibiogramme

• Toutes les recherches s’effectuent par techniques moléculaires.

– homme sympto/asympto : 1er jet urine (urètre)

– femme symptomatique : endocol (+ urètre ou vagin) asymptomatique : auto-plvt vaginal (1er jet urine)

Chlamydia trachomatis

Merci de votre attention…Merci de votre attention…